新癀片中迷迭香酸含量的测定方法与流程

1.本发明属于中药检测领域，具体而言，涉及新癀片中迷迭香酸含量的测定方法。


背景技术：

2.厦门中药厂有限公司的新癀片具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛的功效。随着新癀片销量的逐年增长，产品质量标准的提升对产品质量的稳定性和可持续性发展具有至关重要的意义。
3.近年来，新癀片的化学成分和质量控制研究取得了一些进展。我国2020版药典中通过薄层色谱对新癀片中胆酸、猪去氧胆酸等成分进行鉴别，使用hplc法对异嗪皮啶和吲哚美辛含量进行测定(关斌.新癀片的高效液相色谱-蒸发光散射检测法(hplc-elsd)指纹图谱建立[j].海峡药学,2020,32(09):72-75.)。但目前尚无新癀片中迷迭香酸(rosmarinic acid)含量的测定方法。
[0004]
迷迭香酸是新癀片中的一种有效成分，其含量对新癀片产品质量具有重要影响。它是一种多酚酸，化学式为c
18h16
o8，化学结构为：
[0005][0006]
建立新癀片中迷迭香酸含量的测定方法是提升新癀片质量的关键项目，也对药品质量的稳定性和可持续性发展具有重要意义。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种准确可靠的新癀片中迷迭香酸含量的测定方法，为新癀片中迷迭香酸含量的测定提供技术支持，有效的控制新癀片产品质量。
[0008]
因此，本发明提供了新癀片中迷迭香酸含量的测定方法，所述方法采用高效液相色谱法进行，色谱条件如下：
[0009]
色谱柱：welch aq-c18，4.6
×
250mm，5μm，
[0010]
流动相：乙腈：0.1％磷酸水溶液＝19：81
[0011]
流速：0.8ml/min，
[0012]
检测波长：342nm，
[0013]
柱温：30℃。
[0014]
在具体实施方式中，本发明的测定方法包括以下步骤：
[0015]
s1，对照品溶液的制备：将迷迭香酸对照品用甲醇配制成1ml含10μg的溶液；
[0016]
s2，供试品溶液的制备：取0.5g新癀片粉末；精密加入甲醇25ml；密塞，称定重量；加热回流；放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液；
[0017]
s3，将s1中制备的对照品溶液、s2中制备的供试品溶液按以下色谱条件注入液相色谱仪测定：
[0018]
色谱柱为welch aq-c18(4.6
×
250mm，5μm)，流动相为乙腈：0.1％磷酸水溶液＝19：81，流速为0.8ml/min，进样量为5μl，检测波长为342nm，柱温为30℃，
[0019]
s4，根据测定结果计算新癀片中迷迭香酸含量。本发明方法s1中，所述迷迭香酸对照品可以是市售产品，例如，中国食品药品检定研究院产品(如11871-202007)。
[0020]
优选地，本发明方法s2中，所述新癀片粉末是经四号药典筛的粉末。这里的药典筛指的是根据中国药典规定的标准筛。
[0021]
优选地，本发明方法s2中，加热回流时间为0.5-1小时，优选0.5小时。
[0022]
优选地，本发明方法s3中，使用agilent1260高效色谱仪。
[0023]
本发明方法s4中，对于新癀片中迷迭香酸含量的计算没有特别限定，可以按照本领域中的常规方法进行。例如，可以根据对照品溶液的测定结果制作标准曲线，然后根据标准曲线计算供试品溶液和新癀片中迷迭香酸含量。在一个实施方式中，首先根据对照品溶液的测定结果得到迷迭香酸对照品的峰面积与进样量的线性表达式，然后由线性表达式计算供试品溶液中迷迭香酸含量，并进而换算出新癀片中迷迭香酸含量。
[0024]
本发明中通过对新癀片中的迷迭香酸进行定性和定量分析，对新癀片中迷迭香酸成分的专属性、线性、精密度、准确度、范围等进行含量测定方法学验证，并对提取方式、提取时间、流动相等进行研究，作为建立新癀片中迷迭香酸含量测定方法的实验研究依据，最终建立了新癀片中迷迭香酸含量测定方法。
[0025]
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
[0026]
此外，本发明可以被不同地修改并具有不同形式。考虑到本发明的公开内容，对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本发明精神和实质的情况下对方法进行许多修改。因此，本领域普通技术人员将理解，本发明包括在本发明的精神和技术范围中包括的全部修改、等同或替换。
[0027]
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本技术文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
[0028]
图1为实施例中系统适应性与专属性试验中阴性对照样品、迷迭香酸对照品和新癀片的hplc色谱图。
[0029]
图2为实施例中线性关系试验中迷迭香酸标准曲线。
具体实施方式
[0030]
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031]
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032]
实施例
[0033]
1.材料与方法
[0034]
1.1试剂与药品
[0035]
表1试剂与药品
[0036][0037]
1.2主要仪器
[0038]
表2主要仪器
[0039][0040]
2实验方法
[0041]
2.1高效液相色谱条件
[0042]
除非另有说明，否则高效液相色谱条件条件如下表3所示。
[0043]
表3高效液相色谱条件
[0044][0045]
2.2溶液的制备
[0046]
除非另有说明，否则溶液如下配制。
[0047]
2.2.1对照品溶液的制备：
[0048]
取迷迭香酸对照品适量；精密称取；加甲醇配制成1ml含10μg的溶液。
[0049]
2.2.2供试品溶液的制备：
[0050]
取0.5g新癀片粉末(四号筛)；精密加入甲醇25ml；密塞，称定重量；加热回流0.5小时；放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液。
[0051]
2.2.3阴性样品溶液的制备：
[0052]
除了不用肿节风(含迷迭香酸)以外，按新癀片处方进行制备，得缺迷迭香酸的阴性样品新癀片粉末。
[0053]
取0.5g阴性样品新癀片粉末(四号筛)；精密加入甲醇25ml；密塞，称定重量；加热回流0.5小时；放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液。
[0054]
3.提取条件的考察
[0055]
本次实验探究了提取时间、提取方式、是否浸泡过夜对迷迭香酸的提取效果。
[0056]
3.1提取时间对迷迭香酸提取效果的影响
[0057]
取0.5g新癀片粉末(四号筛)两份；精密加入甲醇25ml；密塞，称定重量；分别加热回流0.5小时和1小时；放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液。
[0058]
结果显示，迷迭香酸的含量无明显区别，表明30min和60min两种提取时间对迷迭香酸提取效果无明显差异，30min加热回流更加简便。
[0059]
3.2提取方式对迷迭香酸提取效果的影响
[0060]
取0.5g新癀片粉末(四号筛)两份；精密加入甲醇25ml；密塞，称定重量；分别加热回流0.5小时和超声提取0.5小时；放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液。
[0061]
结果显示，加热回流迷迭香酸含量为0.3345％，超声提取为0.3201％，表明加热回流提取新癀片中迷迭香酸的含量略高于超声提取迷迭香酸的含量。
[0062]
3.3是否浸泡过夜对迷迭香酸提取效果的影响
[0063]
取0.5g新癀片粉末(四号筛)两份；精密加入甲醇25ml；密塞，称定重量；一份浸泡过夜，再加热回流0.5小时，另一份直接加热回流0.5小时；放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液。
[0064]
结果显示，两者含量几乎一致，表明是否浸泡过夜对迷迭香酸的提取效果无明显差异。
[0065]
综上，选择无需浸泡过夜，加热回流提取，提取时间为30min的提取条件。
[0066]
3.4.供试品溶液稳定性的考察
[0067]
按2.2.2制备新癀片溶液，其放置2小时、8小时、16小时、20小时、24小时后，按2.1色谱条件注入液相色谱仪测定。
[0068]
结果如表4所示，在24小时内新癀片中迷迭香酸的峰面积平均值为111.045，rsd为1.14％，rsd＜2.00％，证明在24小时内新癀片中迷迭香酸稳定性良好。
[0069]
表4稳定性试验结果
[0070][0071]
4.色谱条件的选择
[0072]
4.1流动相的选择
[0073]
配制乙腈-0.1％磷酸水溶液流动相比例分别为(15:85)、(19:81)、(20:80)、(23:77)、(25:75)，进行实验。
[0074]
结果显示，分离度分别为172、1.98、1.82、1.69、1.57，
[0075]
结果表明，流动相为(19：81)的分离效果最好，对称因子最佳，结果稳定，而且重现性良好。
[0076]
4.2色谱柱的选择
[0077]
除了选择三种不同品牌的色谱柱：中谱红aq-c18，welchaq-c18，agilent tc-c18以外，按2.1的色谱条件进行实验。
[0078]
结果表明，welch aq-c18分离度稍好，但三种方法含量结果无明显差异，结果见表5，故可优先选择welch aq-c18色谱柱。
[0079]
4.3柱温的选择
[0080]
除了选择柱温分别为25℃、30℃、35℃以外，按2.1的色谱条件进行实验。
[0081]
结果显示柱温在30℃的分离度稍好于其他柱温，但三种方法含量结果无明显差异，结果见表5，故可优先选择30℃。
[0082]
4.4流速的选择
[0083]
除了选择三种不同的流速分别为0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min以外，按2.1的色谱条件进行实验。
[0084]
结果表明，流速在0.8ml/min的分离度稍好于其他方法，但三种方法含量结果无明显差异，结果见表5，故可优先选择0.8ml/min的流速。
[0085]
表5色谱柱条件选择结果
[0086][0087]
如表5所示，同一新癀片供试品在不同柱温的条件下对迷迭香酸进行测定，rsd为0.52％；在不同流速下对迷迭香酸进行测定，rsd为0.88％；更换不同色谱柱对迷迭香酸进行测定，rsd为0.80％，rsd均＜2.00％。
[0088]
结果表明，微小改变色谱柱条件对迷迭香酸的测定结果无明显的影响。
[0089]
4.5最终确定的色谱条件
[0090]
综合上述实验结果，最终确定的色谱条件如下：色谱柱：welch aq-c18(4.6
×
250mm,5μm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸(19:81)；检测波长342nm；流速0.8ml/min；进样量5μl；柱温30℃。
[0091]
5.方法学验证
[0092]
5.1系统适应性考察和专属性试验
[0093]
按2.2制备迷迭香酸对照品溶液、新癀片供试品溶液、新癀片阴性样品溶液，2.1色谱条件注入液相色谱仪测定。
[0094]
结果如图1所示，在迷迭香酸对照品色谱峰的相同保留时间位置，新癀片阴性样品未有色谱峰，新癀片有相应色谱峰，且色谱峰间分离度良好。表明，本发明方法系统适用性，专属性良好。
[0095]
5.2线性关系试验
[0096]
按2.2.1制备迷迭香酸对照品溶液，按2.1色谱条件分别精密吸取0μl、2μl、5μl、8μl、10μl，注入液相色谱仪测定。
[0097]
结果如图2所示，迷迭香酸对照品的峰面积与进样量的线性表达式为：y＝3062.9x
0.9099，r2＝0.999。迷迭香酸在0.0921mg范围内，迷迭香酸峰面积与进样量有较好的线性关系。
[0098]
5.3精密度试验
[0099]
按2.2.2制备新癀片溶液，按2.1色谱条件连续进样5针注入液相色谱仪测定。
[0100]
如表6所示，连续进样5针新癀片中迷迭香酸的峰面积平均值为110.937，rsd为1.04％，rsd＜2.00％，证明仪器精密度良好。
[0101]
表6精密度试验结果
[0102][0103]
5.4重复性试验
[0104]
按2.2.2制备同一批次的新癀片溶液6份，按2.1色谱条件注入液相色谱仪测定。
[0105]
如表7所示，同一批次6份新癀片中迷迭香酸的峰面积平均值为111.063，rsd为1.49％，rsd＜2.00％，证明本方法具有良好的重复性。
[0106]
表7重复性试验结果
[0107][0108]
5.5加样回收率试验
[0109]
按2.2.2制备已知迷迭香酸含量的新癀片溶液，分别加入取样量已知含量的0.8倍，1.0倍，1.2倍左右迷迭香酸对照品溶液，按2.1色谱条件注入液相色谱仪测定。
[0110]
如表8所示，新癀片中迷迭香酸的平均回收率为103％，rsd为1.56％，rsd＜2.00％，证明本方法回收率良好。
[0111]
表8回收率试验结果
[0112][0113]
5.6重复性范围考察
[0114]
称取新癀片粉末0.25g(用于制备低浓度供试品样品)、0.95g(用于高浓度供试品样品)各三份，按2.2.2制备新癀片溶液，按2.1色谱条件注入液相色谱仪测定。
[0115]
如表9-1所示，称取0.25g(低浓度)和0.95g(高浓度)左右新癀片粉末的迷迭香酸含量平均值为:0.03341，rsd为0.66％，rsd＜2.00％，证明本方法在低高浓度都具有良好的重复性。
[0116]
表9-1重复性范围考察(序号1-3为低浓度样品、序号4-6为高浓度样品)
[0117][0118]
5.7准确度范围考察
[0119]
称取已知迷迭香酸含量的新癀片0.2g，0.8g各三份，按2.2.2制备新癀片溶液，分别加入取样量已知含量的1倍左右迷迭香酸对照品溶液，按2.1色谱条件注入液相色谱仪测定。
[0120]
如表9-2所示，0.2g和0.8g新癀片中迷迭香酸的平均回收率为104.7％，rsd为1.24％，rsd＜2.00％，证明本方法在低高浓度都具有良好的准确度。
[0121]
表9-2准确度范围考察(序号1-3为低浓度样品、序号4-6为高浓度样品)
[0122][0123]
5.8样品含量测定
[0124]
取十批新癀片样品按2.2.2制备新癀片溶液，在按2.1色谱条件连续进样两针注入液相色谱仪测定。
[0125]
如表10所示，十批新癀片样品(210201-210210)含量测定结果：
[0126]
表10样品含量测定
[0127][0128]
从综上方法学验证结果可见本发明建立的迷迭香酸含量测定方法可靠简便，且专属性强，重复性、稳定性、精密度较好，可以作为新癀片迷迭香酸含量测定方法，为新癀片中迷迭香酸含量的测定提供技术支持，用于提高新癀片的产品质量。