一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架及其制造方法

一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架及其制造方法
【技术领域】
1.本发明涉及生物材料和组织工程技术领域，具体是指一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架及其制造方法。


背景技术：

2.肿瘤、外伤、炎症、畸形等各种病因造成的骨缺损是常见的临床问题。修复骨缺损最常见的方式就是使用骨替代材料引导骨再生，其中骨替代材料有自体骨、同种异体骨、异种骨和人工材料。
3.人工材料如钙磷灰石、氧化锆和玻璃陶瓷，是单纯的无机材料，虽然能通过改良制作工艺、3d打印等方式模拟松质骨结构，但缺乏有机成分，成分上与生物骨骼相差较大，并不是完全的仿生材料。临床上普遍使用的是异种生物源性材料，例如牛骨、猪骨、羊骨和珊瑚等，这些材料具有天然的孔隙结构，成分也与人体骨骼相似，有较好的骨传导性和一定的骨诱导性。然而由于异种生物源性材料具有免疫原性，直接将其植入患者体内将诱发免疫排斥，导致植骨失败。为了去除异种生物源性材料的免疫原性，必须通过化学物理方法完全去除生物骨钙磷灰石支架材料中的细胞和基质。
4.目前主要采用加热煅烧方法完全去除生物骨钙磷灰石支架中所有有机物。由于缺乏有机物的编织，单纯的无机物无法承受较大应力，这使得异种生物源性材料失去有机物提供的弹性和韧性，力学性能下降，变得易碎，无法维持原有的孔隙结构。因此市面上常见的异种生物源性材料是粉末状或颗粒状，无法通过自身的作用固定形状，缺乏对骨缺损区域的机械支撑作用，成骨空间不稳定常常会导致成骨效果不佳，即使通过混合血凝块混合或水凝胶固定颗粒状材料形状，这些材料也会在血凝块或水凝胶降解后，也就是骨愈合的早期愈合阶段重新恢复成颗粒状，这些颗粒材料在骨缺损区受到重力或功能负荷作用易移位和/或形成粉末，材料移位导致成骨空间维持的早期失败，导致无菌性炎症，粉末释放后激活局部炎症反应，从而导致骨修复效果不理想。
5.从仿生学角度思考人工材料和异种生物源性材料的应用困境，我们希望能够研发一种成分与结构更接近天然骨的骨替代仿生材料，同时具备一定的力学性能，能够在引导骨再生的同时保证成骨空间的稳定。因此研发骨替代仿生材料时的其中一个策略是重新加入原有有机物，从成分上改善骨替代材料。骨骼中的有机物主要是胶原蛋白，但胶原蛋白往往来源于异种动物，例如猪皮和鼠尾，具有较强的免疫原性，需要复杂的处理才能在保留胶原蛋白完整结构的同时去除免疫原性。因此，胶原蛋白的水解产物明胶是更优的选择，因为天然来源的明胶保留了胶原蛋白的rgd序列，同时与完整的胶原蛋白相比，来源广泛制作简便，免疫原性更低，被普遍认为是安全的，并且能够在体内被广泛存在的基质金属蛋白酶等酶降解。然而，单纯明胶交联后的钙磷灰石支架存在力学性能欠佳、无法维持成骨空间、不能保留天然支架的孔隙等缺陷，尚不能满足临床的使用需求。
6.各类交联剂(包括但不限于京尼平、戊二醛、甲醛和环氧氯丙烷)通过与明胶的氨基和(或)羧基基团发生反应，将多个明胶分子连接成整体，增强了明胶水凝胶的机械强度。
因此，本发明拟在明胶体系中引入各类交联剂，强化明胶水凝胶的机械强度，同时提升生物骨钙磷灰石支架的力学性能，使其具备更优良的空间稳定性与临床可操作性；同时维持支架原有的孔隙率，优化骨替代材料的成骨特性。
7.针对上述问题，我们提出了一种新的技术方案。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是目前钙磷灰石支架力学性能差，无法维持成骨空间，单纯水凝胶孔隙率低，不利于功能细胞迁入等问题，因此提供一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架及其制造方法，该方法将明胶水凝胶添加至去细胞基质的钙磷灰石支架上复合形成，制备的钙磷灰石支架能维持原有的孔隙结构。
9.为了解决上述存在的技术问题，本发明采用下述技术方案：
10.一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架，其由去细胞基质的钙磷灰石支架和水凝胶复合形成。
11.在进一步的改进方案中，所述去细胞基质的钙磷灰石支架是由天然骨去细胞基质后形成，只含钙磷灰石，去除了天然骨的免疫原性。
12.在进一步的改进方案中，其保留了天然松质骨的多孔结构。
13.一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架的制造方法，包括以下步骤：
14.步骤一、制备去细胞基质的钙磷灰石支架：收集异种生物源性支架，包括但不限于牛骨、猪骨等，用剪刀去尽骨面软组织及软骨，然后用10％～30％过氧化氢及无水乙醇各浸泡24h，然后用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，初步脱去动物骨头中的有机物；用线性切割系统将骨块切成需要的形状，然后将切好的骨块放入马弗炉中烧结至400～1000℃，烧制2～6h，用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，得到去细胞基质的钙磷灰石支架；
15.步骤二、配制0.1％～20％水凝胶预聚物溶液：称取明胶0.1g～10g，加入1ml 55℃的pbs缓冲液中溶解，加入0～100mm交联剂，包括但不限于京尼平、戊二醛、甲醛和环氧氯丙烷，混匀，得到明胶水凝胶预聚物溶液；
16.步骤三、将去细胞基质的钙磷灰石支架加入到水凝胶预聚物溶液中浸泡10s～48h，浸泡1～50次，并进行抽真空处理，让水凝胶预聚物溶液进入去细胞基质的钙磷灰石支架孔隙中；
17.步骤四、将去细胞基质的钙磷灰石支架从水凝胶预聚物溶液中捞出，在湿润环境下交联6h～36h，放入干燥箱烘干，制得水凝胶强化生物骨钙钙磷灰石支架。
18.在进一步的改进方案中，所述去细胞基质的钙磷灰石支架可以由多种动物的骨制造形成。
19.在进一步的改进方案中，所述水凝胶为京尼平交联的明胶水凝胶、戊二醛交联的明胶水凝胶、甲基丙烯酰化明胶水凝胶和壳聚糖-明胶复合水凝胶中的一种或多种。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果具体体现在：本发明首先制备得到去细胞基质的钙磷灰石支架，然后浸泡水凝胶预聚物溶液获得具有水凝胶涂层的强化生物骨钙磷灰石支架，其通过控制凝胶含量、浸泡次数和浸泡时间来控制有机物的多少、有机物的分层及复合支架孔径，在不同浓度水凝胶预聚物溶液中浸泡不同时间、不同次数形成的水凝胶层密度和厚度不同，制备技术简单，成本低廉，适用于大批量生产。本发明中的水凝胶强化生
物骨钙磷灰石支架结构具有良好的生物活性、无细胞毒性、低免疫原性、来源广泛，具有较好的应用前景；具有与天然骨相似的成分，保留了天然骨的力学结构，具有良好的力学性能，是较理想的骨替代材料；保留了松质骨天然的多孔结构，为功能细胞提供三维空间结构，利于细胞的黏附、增殖，为细胞的生长提供良好的生长环境，有利于骨缺损修复；可以将包被了药物的脂质体或其他纳米药物载体负载到水凝胶层中，药物载体在水凝胶层溶胀或者降解过程中释放出来，同时可调整不同药物水凝胶的层数、密度和厚度，这样我们就可以实现药物在骨缺损部位的二次释放、分级释放，实现对骨缺损修复的高效、精准治疗，在水凝胶层中可以复合药物载体或直接载药，实现精准治疗。
21.下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细描述：
【附图说明】
22.图1为本发明中水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架的复合效果示意图；
23.图2为本发明中去细胞基质的钙磷灰石支架复合水凝胶前后的光学图；
24.图3为本发明中去细胞基质的钙磷灰石支架复合水凝胶前后的压缩强度比较图；
25.图4为本发明中水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架浸提液的细胞毒性实验结果图。
【具体实施方式】
26.下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
27.实施例一：
28.一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架的制造方法，包括以下步骤：
29.步骤一、制备去细胞基质的钙磷灰石支架：收集异种生物源性支架，包括但不限于牛骨、猪骨等，用剪刀去尽骨面软组织及软骨，然后用30％过氧化氢及无水乙醇各浸泡24h，然后用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，初步脱去动物骨头中的有机物；用线性切割系统将骨块切成需要的形状，然后将切好的骨块放入马弗炉中烧结至800℃，烧制2h，用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，得到去细胞基质的钙磷灰石支架；
30.步骤二、配制明胶水凝胶预聚物溶液：配制5％明胶溶液，加入2mm的京尼平，混匀，得到明胶水凝胶预聚物溶液；
31.步骤三、将去细胞基质的钙磷灰石支架加入到水凝胶预聚物溶液中浸泡10s，浸泡2次，并进行抽真空处理，让水凝胶预聚物溶液进入去细胞基质的钙磷灰石支架孔隙中；
32.步骤四、将去细胞基质的钙磷灰石支架从水凝胶预聚物溶液中捞出，在37℃隔水培养箱中交联24h，放入55℃干燥箱烘干，制得水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架。
33.实施例二：
34.一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架的制造方法，包括以下步骤：
35.步骤一、制备去细胞基质的钙磷灰石支架：收集异种生物源性支架，包括但不限于牛骨、猪骨等，用剪刀去尽骨面软组织及软骨，然后用30％过氧化氢及无水乙醇各浸泡24h，然后用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，初步脱去动物骨头中的有机物；用线性切割系统将骨块切成需要的形状，然后将切好的骨块放入程序控温真空管式炉中烧结至850℃，烧制2h，用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，得到去细胞基质的钙磷灰石支架；
36.步骤二、配制明胶水凝胶预聚物溶液：配制5％明胶溶液，加入4mm的京尼平，混匀，得到明胶水凝胶预聚物溶液；
37.步骤三、将去细胞基质的钙磷灰石支架加入到水凝胶预聚物溶液中浸泡10s，浸泡1次，并进行抽真空处理，让水凝胶预聚物溶液进入去细胞基质的钙磷灰石支架孔隙中；
38.步骤四、将去细胞基质的钙磷灰石支架从水凝胶预聚物溶液中捞出，在37℃隔水培养箱中交联10h，放入55℃干燥箱烘干，制得水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架。
39.实施例三：
40.一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架的制造方法，包括以下步骤：
41.步骤一、制备去细胞基质的钙磷灰石支架：收集异种生物源性支架，包括但不限于牛骨、猪骨等，用剪刀去尽骨面软组织及软骨，然后用30％过氧化氢及无水乙醇各浸泡24h，然后用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，初步脱去动物骨头中的有机物；用线性切割系统将骨块切成需要的形状，然后将切好的骨块放入程序控温真空管式炉中烧结至800℃，烧制2h，用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，得到去细胞基质的钙磷灰石支架；
42.步骤二、配制明胶水凝胶预聚物溶液：配制5％明胶溶液，加入8mm的京尼平，混匀，得到明胶水凝胶预聚物溶液；
43.步骤三、将去细胞基质的钙磷灰石支架加入到水凝胶预聚物溶液中浸泡20s，浸泡1次，并进行抽真空处理，让水凝胶预聚物溶液进入去细胞基质的钙磷灰石支架孔隙中；
44.步骤四、将去细胞基质的钙磷灰石支架从水凝胶预聚物溶液中捞出，在37℃隔水培养箱中交联8h，放入55℃干燥箱烘干，制得水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架。
45.实施例四：
46.一种水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架的制造方法，包括以下步骤：
47.步骤一、制备去细胞基质的钙磷灰石支架：收集异种生物源性支架，包括但不限于牛骨、猪骨等，用剪刀去尽骨面软组织及软骨，然后用30％过氧化氢及无水乙醇各浸泡24h，然后用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，初步脱去动物骨头中的有机物；用线性切割系统将骨块切成需要的形状，然后将切好的骨块放入程序控温真空管式炉中烧结至800℃，烧制2h，用超纯水洗涤后，放入60℃干燥箱中干燥，得到去细胞基质的钙磷灰石支架；
48.步骤二、配制明胶水凝胶预聚物溶液：配制5％明胶溶液，加入16mm的京尼平，混匀，得到明胶水凝胶预聚物溶液；
49.步骤三、将去细胞基质的钙磷灰石支架加入到水凝胶预聚物溶液中浸泡30s，浸泡2次，并进行抽真空处理，让水凝胶预聚物溶液进入去细胞基质的钙磷灰石支架孔隙中；
50.步骤四、将去细胞基质的钙磷灰石支架从水凝胶预聚物溶液中捞出，在37℃隔水培养箱中交联6h，放入55℃干燥箱烘干，制得水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架。
51.样品细胞毒性测试
52.使用消毒后的实例1、2、3、4样品进行浸提液的制备，在相应孔板中加入等量的完全培养基，置于37℃、体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中浸提，24小时、36小时后分别收集至ep管中。取生长良好的raw 264.7细胞制成细胞悬浮液，将细胞等量接种于孔板中，待贴壁后分别加入24小时、36小时浸提液，每组样品浸提液设置6个复孔，置于37℃、体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中培养24小时，从各孔中吸净浸提液，pbs缓冲液洗两次，加入体积分数为10％cck-8溶液的完全培养基，37℃、体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱避
光孵育0.5h，用酶标仪测定每孔在450nm波长处的od值。计算空白组的平均od值，将各组数值除以空白平均od值得到细胞活性百分比。
53.样品力学性能测试
54.使用instron力学万能测试仪对保留细胞基质的天然骨、未强化生物骨钙磷灰石支架和实例1、2、3、4样品进行压缩测试，压缩速率为1mm/min，将获得的数据绘制压力-应变曲线，记录屈服负荷，除以支架表面积，得到压缩强度。每组样品至少有3个及以上支架进行压缩测试。
55.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内，此外本发明所制备的得到的水凝胶强化生物骨钙磷灰石支架，其内部水凝胶含量、密度及水凝胶交联方式、种类都在本发明的保护范围之内。