一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法和培养基与流程

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法和培养基。


背景技术：

2.菊叶薯蓣，为薯蓣科，薯蓣属，多年生缠绕性草本植物，又称为墨西哥薯蓣。菊叶薯蓣大多分布在墨西哥湾沿岸中部与太平洋沿岸南部，适合生长于海拔1000-1500米，年平均气温25-27℃，年相对湿度86％，年降水量1300-1500毫米的地区。菊叶薯蓣以其根状茎中薯蓣皂苷元含量高而闻名。在20世纪70年代，我国首次将其引入云南省西双版纳并且试种获得成功。西双版纳处于热带北部的边缘，因此有着热带季雨林气候，所以该地区平均气温与湿度水平与原产地墨西哥基本相似，具有得天独厚的优势，因此菊叶薯蓣在该地区生长良好，其产量与皂素含量与原产地差异甚微。随后又陆续引入种植到四川攀枝花、陕西安康、海南海口、广西南丹等地，目前已形成一定规模。
3.菊叶薯蓣作为多年生缠绕性草本植物，与根状茎组的盾叶薯蓣不同，属于非根状茎组的菊叶薯蓣，它的块茎垂直向下生长，表皮颇为粗糙且呈现黑褐色，或呈手掌状又或是呈棒状，形状各异。其腹背分明，腹部根系发达，在热带地区终年生长，四季常青。块茎不会随着生长年限增加而发生干瘪皱缩，同时淀粉和纤维素却随之积累，因此老块茎颜色发深，从老块茎上新生的块茎继续向下垂直生长，新块茎十分幼嫩，颜色呈黄白色。块茎的生长情况与其所在土壤环境直接相关，疏松的土壤可以促进菊叶薯蓣块茎的生长，块茎深度和宽度随着种植年限而增长。地上茎则是肉质圆形，缠绕的方式为左旋，直径处于0.4～0.7cm之间，新生茎水分多，柔软鲜嫩，呈绿色，老茎纤维化程度高，挺直粗壮，颜色呈深绿色伴有斑点状紫色。叶片呈心脏楔形、宽卵圆形或椭圆形尖收窄为尾状。单叶互生，叶柄颜色为紫色，深浅不一，侧脉网状。
4.菊叶薯蓣传统繁殖方式主要为：种子繁殖和块茎繁殖。作为雌雄异株的菊叶薯蓣，雌花和雄花花期不同，且种子不够饱满，只适合小面积种植；块茎繁殖，对于块茎需求量较大，成本较高，且生长速率较慢。目前菊叶薯蓣多是以组织培养和扦插两种方式育苗。然而相比于扦插育苗，组培快繁方式具有易操作、不受季节气候限制、繁殖系数高、成活率高等优势，对于菊叶薯蓣的快速繁殖具有十分重要的意义。由于国内外对菊叶薯蓣的需求量的激增，以及野生菊叶薯蓣资源数量的急剧减少，建立一种合适的组织培养体系以实现无性苗的快速繁殖是解决当前资源短缺问题的重要途径。


技术实现要素：

5.为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法和培养基，利用无性组织培养技术，对不同外植体的愈伤组织进行诱导，选择合适的脱分化、增殖、再分化和生根培养基类型建立墨西哥菊叶薯蓣组织快繁体系，为其规模化生产提供充足的良种育苗，也为开展其种质资源遗传变异的改良和后期功能基因的研究以及利用
基因工程定向培育高产优质的新品种提供技术保障。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种菊叶薯蓣组培苗的脱分化培养基，所述脱分化培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1～3mg
·
l-1
，naa 0.1～0.3mg
·
l-1
，蔗糖2～4wt％和琼脂4～5g
·
l-1
，所述脱分化培养基的ph为5～6，所述改良ms培养基的组分包括：kno314～16mmol/l，ca(no3)214～16mmol/l，(nh4)2so47～8mmol/l和kcl 4～6mmol/l。
8.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的增殖培养基，所述增殖培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1～3mg
·
l-1
，naa 0.1～0.3mg
·
l-1
，谷氨酸0.04～0.06wt％，蔗糖2～4wt％和琼脂4～5g
·
l-1
，所述增殖培养基的ph为5～6。
9.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的再分化培养基，所述再分化培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1～3mg
·
l-1
，naa 0.3～0.5mg
·
l-1
，维生素e 0.005～0.015wt％，硒代半胱氨酸0.02～0.03wt％，蔗糖2～4wt％和琼脂4～5g
·
l-1
，所述再分化培养基的ph为5～6。
10.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的生根培养基，所述生根培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：iba 0.5～1.5mg
·
l-1
，naa 0.05～0.15mg
·
l-1
和蔗糖2～4wt％，所述生根培养基的ph为5～6，所述改良ms培养基的组分包括：kno314～16mmol/l，ca(no3)214～16mmol/l，(nh4)2so47～8mmol/l和kcl 4～6mmol/l。
11.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗快繁的培养基组合，包括脱分化培养基、增殖培养基、再分化培养基和生根培养基。
12.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法，包括如下步骤：
13.(1)将菊叶薯蓣根状茎种植于基质土中进行脱菌培养，得菊叶薯蓣外植体；
14.(2)对所述菊叶薯蓣外植体依次进行消毒和水洗，然后置于菊叶薯蓣组培苗脱分化培养基中进行脱分化培养，得菊叶薯蓣胚性愈伤组织；
15.(3)将所述菊叶薯蓣胚性愈伤组织置于菊叶薯蓣组培苗增殖培养基中进行增殖培养，然后置于菊叶薯蓣组培苗再分化培养基中进行再分化培养，得菊叶薯蓣再生苗；
16.(4)将所述菊叶薯蓣再生苗的叶腋转移至菊叶薯蓣组培苗生根培养基中进行生根培养，得菊叶薯蓣完整再生苗；
17.(5)将所述菊叶薯蓣完整再生苗进行炼苗，然后移栽至育苗土中进行育苗培养，得菊叶薯蓣组培苗。
18.优选的，步骤(1)中所述基质土组分包括营养土和蛭石，所述营养土和蛭石的质量比为2～4:1；
19.所述脱菌培养的光照强度为1500～2500lux，所述脱菌培养的光照周期为15～17h/d，所述脱菌培养的温度为25～30℃，所述脱菌培养的时间为8～12min；
20.所述菊叶薯蓣外植体包括茎、叶片、腋芽和顶芽。
21.优选的，步骤(2)中所述消毒包括升汞溶液消毒，所述升汞溶液的质量浓度为0.05～0.15％，所述升汞溶液消毒的时间为5～15min；
22.所述水洗的次数为5～7次；
23.所述脱分化培养的光照强度为1500～2500lux，所述脱分化培养的光照周期为7～9h/d，所述脱分化培养的温度为25～30℃，所述脱分化培养的时间为10～15d。
24.优选的，步骤(3)中所述增殖培养的光照强度为1500～2500lux，所述增殖培养的光照周期为19～21h/d，所述增殖培养的温度为25～30℃，所述增殖培养的时间为18～22d；
25.所述再分化培养的光照强度为1500～2500lux，所述再分化培养的光照周期为15～17h/d，所述再分化培养的温度为25～30℃，所述再分化培养的时间为28～32d。
26.优选的，步骤(4)中所述生根培养的光照强度为1500～2500lux，所述生根培养的光照周期为15～17h/d，所述生根培养的温度为25～30℃，所述生根培养的时间为28～32d；
27.步骤(5)中所述炼苗的时间为1～3d，所述炼苗的温度为20～30℃，所述炼苗的湿度为50～70％；
28.步骤(5)中所述育苗土组分包括草炭土；
29.步骤(5)中所述育苗培养的光照强度为1500～2500lux，所述育苗培养的光照周期为15～17h/d，所述育苗培养的温度为25～30℃，所述育苗培养的时间为8～12d。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
31.本发明利用植物组织培养技术，以墨西哥菊叶薯蓣腋芽为外植体，进行组培快繁，建立了完整的经腋芽形成愈伤组织并经再分化产生组培苗的体系，为墨西哥菊叶薯蓣的工厂化规模育种提供了技术基础，也为其基因工程改良和分子育种奠定了材料和技术基础。
附图说明
32.图1为本发明实施例4墨西哥菊叶薯蓣腋芽愈伤组织的形成、增殖、再分化与移栽苗的生长图片(注：a表示种子萌发后的实生苗；b表示腋芽形成的愈伤组织；c表示生长30d的愈伤组织；d表示愈伤组织再分化出芽点；e表示愈伤组织分化出的再生苗；f表示生长30d的再生苗；g表示生根培养；h表示生根培养60d的小苗；i表示再生苗移栽)。
具体实施方式
33.本发明提供了一种菊叶薯蓣组培苗的脱分化培养基，所述脱分化培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1～3mg
·
l-1
，naa 0.1～0.3mg
·
l-1
，蔗糖2～4wt％和琼脂4～5g
·
l-1
，所述脱分化培养基的ph为5～6，所述改良ms培养基的组分包括：kno314～16mmol/l，ca(no3)214～16mmol/l，(nh4)2so47～8mmol/l和kcl 4～6mmol/l。
34.在本发明中，所述菊叶薯蓣组培苗的脱分化培养基中6-ba的浓度为1～3mg
·
l-1
，进一步优选为2mg
·
l-1
；naa的浓度为0.1～0.3mg
·
l-1
，进一步优选为0.2mg
·
l-1
；蔗糖的浓度为2～4wt％，进一步优选为3wt％；琼脂的浓度为4～5g
·
l-1
，进一步优选为4.5g
·
l-1
；所述脱分化培养基的ph为5～6，进一步优选为5.8；所述改良ms培养基的组分包括：kno314～16mmol/l，ca(no3)214～16mmol/l，(nh4)2so47～8mmol/l和kcl 4～6mmol/l，进一步优选包括：kno315mmol/l，ca(no3)215mmol/l，(nh4)2so47.5mmol/l和kcl 5mmol/l。采用改良ms培养基，能够促进菊叶薯蓣产生胚性愈伤组织。
35.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的增殖培养基，所述增殖培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1～3mg
·
l-1
，naa 0.1～0.3mg
·
l-1
，谷氨酸0.04～0.06wt％，蔗糖2～4wt％和琼脂4～5g
·
l-1
，所述增殖培养基的ph为5～6。
36.在本发明中，所述菊叶薯蓣组培苗的增殖培养基中6-ba的浓度为1～3mg
·
l-1
，进一步优选为2mg
·
l-1
；naa的浓度为0.1～0.3mg
·
l-1
，进一步优选为0.2mg
·
l-1
；谷氨酸的浓
度为0.04～0.06wt％，进一步优选为0.05wt％；蔗糖的浓度为2～4wt％，进一步优选为3wt％；琼脂的浓度为4～5g
·
l-1
，进一步优选为4.5g
·
l-1
；所述增殖培养基的ph为5～6，进一步优选为5.8。
37.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的再分化培养基，所述再分化培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1～3mg
·
l-1
，naa 0.3～0.5mg
·
l-1
，维生素e 0.005～0.015wt％，硒代半胱氨酸0.02～0.03wt％，蔗糖2～4wt％和琼脂4～5g
·
l-1
，所述再分化培养基的ph为5～6。
38.在本发明中，所述菊叶薯蓣组培苗的再分化培养基中6-ba的浓度为1～3mg
·
l-1
，进一步优选为2mg
·
l-1
；naa的浓度为0.3～0.5mg
·
l-1
，进一步优选为0.4mg
·
l-1
；维生素e的浓度为0.005～0.015wt％，进一步优选为0.01wt％，所述维生素e进一步优选为α-生育酚；硒代半胱氨酸的浓度为0.02～0.03wt％，进一步优选为0.025wt％；蔗糖的浓度为2～4wt％，进一步优选为3wt％；琼脂的浓度为4～5g
·
l-1
，进一步优选为4.5g
·
l-1
；所述再分化培养基的ph为5～6，进一步优选为5.8。经研究发现，菊叶薯蓣愈伤组织在增殖过程中会产生大量ros信号分子，该类物质能够作为第二信使调控各类组织的分化发育，因此在培养基中添加了还原性物质维生素e与硒代半胱氨酸，以降低ros的含量。最终发现添加两类物质的ms培养基在特定激素配比下能够大量促使愈伤组织再分化。
39.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的生根培养基，所述生根培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：iba 0.5～1.5mg
·
l-1
，naa 0.05～0.15mg
·
l-1
和蔗糖2～4wt％，所述生根培养基的ph为5～6，所述改良ms培养基的组分包括：kno314～16mmol/l，ca(no3)214～16mmol/l，(nh4)2so47～8mmol/l和kcl 4～6mmol/l。
40.在本发明中，所述菊叶薯蓣组培苗的生根培养基中iba的浓度为0.5～1.5mg
·
l-1
，进一步优选为1mg
·
l-1
；naa的浓度为0.05～0.15mg
·
l-1
，进一步优选为0.1mg
·
l-1
；蔗糖的浓度为2～4wt％，进一步优选为3wt％；所述生根培养基的ph为5～6，进一步优选为5.8；所述改良ms培养基的组分包括：kno314～16mmol/l，ca(no3)214～16mmol/l，(nh4)2so47～8mmol/l和kcl 4～6mmol/l，进一步优选包括kno315mmol/l，ca(no3)215mmol/l，(nh4)2so47.5mmol/l和kcl 5mmol/l。
41.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗快繁的培养基组合，包括脱分化培养基、增殖培养基、再分化培养基和生根培养基。
42.本发明还提供了一种菊叶薯蓣组培苗的快繁方法，包括如下步骤：
43.(1)将菊叶薯蓣根状茎种植于基质土中进行脱菌培养，得菊叶薯蓣外植体；
44.(2)对所述菊叶薯蓣外植体依次进行消毒和水洗，然后置于菊叶薯蓣组培苗脱分化培养基中进行脱分化培养，得菊叶薯蓣胚性愈伤组织；
45.(3)将所述菊叶薯蓣胚性愈伤组织置于菊叶薯蓣组培苗增殖培养基中进行增殖培养，然后置于菊叶薯蓣组培苗再分化培养基中进行再分化培养，得菊叶薯蓣再生苗；
46.(4)将所述菊叶薯蓣再生苗的叶腋转移至菊叶薯蓣组培苗生根培养基中进行生根培养，得菊叶薯蓣完整再生苗；
47.(5)将所述菊叶薯蓣完整再生苗进行炼苗，然后移栽至育苗土中进行育苗培养，得菊叶薯蓣组培苗。
48.在本发明中，步骤(1)中所述基质土组分优选包括营养土和蛭石，所述营养土和蛭
石的质量比优选为2～4:1，进一步优选为3:1。
49.在本发明中，步骤(1)中所述脱菌培养的光照强度优选为1500～2500lux，进一步优选为2000lux，所述脱菌培养的光照周期优选为15～17h/d，进一步优选为16h/d，所述脱菌培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为28℃，所述脱菌培养的时间优选为8～12min，进一步优选为10min。
50.在本发明中，步骤(1)中所述菊叶薯蓣外植体优选包括茎、叶片、腋芽和顶芽，进一步优选为腋芽。
51.在本发明中，步骤(2)中所述消毒优选包括升汞溶液消毒，所述升汞溶液的质量浓度优选为0.05～0.15％，进一步优选为0.1％，所述升汞溶液消毒的时间优选为5～15min，进一步优选为10min。
52.在本发明中，步骤(2)中所述水洗的次数优选为5～7次，进一步优选为6次。
53.在本发明中，步骤(2)中所述脱分化培养的光照强度优选为1500～2500lux，进一步优选为2000lux，所述脱分化培养的光照周期优选为7～9h/d，进一步优选为8h/d，所述脱分化培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为28℃，所述脱分化培养的时间优选为10～15d，进一步优选为14d。
54.在本发明中，步骤(3)中所述增殖培养的光照强度优选为1500～2500lux，进一步优选为2000lux，所述增殖培养的光照周期优选为19～21h/d，进一步优选为20h/d，所述增殖培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为28℃，所述增殖培养的时间优选为18～22d，进一步优选为20d。
55.在本发明中，步骤(3)中所述再分化培养的光照强度优选为1500～2500lux，进一步优选为2000lux，所述再分化培养的光照周期优选为15～17h/d，进一步优选为16h/d，所述再分化培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为28℃，所述再分化培养的时间优选为28～32d，进一步优选为30d。
56.在本发明中，步骤(4)中所述生根培养的光照强度优选为1500～2500lux，进一步优选为2000lux，所述生根培养的光照周期优选为15～17h/d，进一步优选为16h/d，所述生根培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为28℃，所述生根培养的时间优选为28～32d，进一步优选为30d。
57.在本发明中，步骤(5)中所述炼苗的时间优选为1～3d，进一步优选为2d；所述炼苗的温度优选为20～30℃，进一步优选为26℃；所述炼苗的湿度优选为50～70％，进一步优选为60％。
58.在本发明中，步骤(5)中所述育苗土组分优选包括草炭土。
59.在本发明中，步骤(5)中所述育苗培养的光照强度优选为1500～2500lux，进一步优选为2000lux，所述育苗培养的光照周期优选为15～17h/d，进一步优选为16h/d，所述育苗培养的温度优选为25～30℃，进一步优选为28℃，所述育苗培养的时间优选为8～12d，进一步优选为10d。
60.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
61.以下实施例中的菊叶薯蓣为墨西哥菊叶薯蓣，种植地点为广东省湛江市。
62.实施例1
63.(1)将采集的菊叶薯蓣根状茎用蒸馏水简单清洗以除去杂质，然后将菊叶薯蓣根状茎种植于基质土(基质土组分为营养土和蛭石，所述营养土和蛭石的质量比为2:1)中于光照强度为1500lux，光照周期为15h/d，温度为25℃的条件下进行脱菌培养8min，待生长出较强壮的营养器官(茎、叶片、腋芽、顶芽)后，选取茎作为外植体备用；
64.(2)将所述茎经质量浓度为0.05％的升汞消毒5min，无菌水清洗5次，并用无菌滤纸吸干表面水分，平铺于菊叶薯蓣组培苗脱分化培养基(所述脱分化培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba1mg
·
l-1
，naa 0.1mg
·
l-1
，蔗糖2wt％和琼脂4g
·
l-1
，所述脱分化培养基的ph为5，所述改良ms培养基的组分包括：kno314mmol/l，ca(no3)214mmol/l，(nh4)2so47mmol/l和kcl 4mmol/l)中于光照强度为1500lux，光照周期为7h/d，温度为25℃的条件下进行脱分化培养，得菊叶薯蓣胚性愈伤组织；
65.(3)将所述菊叶薯蓣胚性愈伤组织置于菊叶薯蓣组培苗增殖培养基(所述增殖培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1mg
·
l-1
，naa 0.1mg
·
l-1
，谷氨酸0.04wt％，蔗糖2wt％和琼脂4g
·
l-1
，所述增殖培养基的ph为5)中于光照强度为1500lux，光照周期为19h/d，温度为25℃的条件下进行增殖培养18d，然后置于菊叶薯蓣组培苗再分化培养基(所述再分化培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 1mg
·
l-1
，naa 0.3mg
·
l-1
，维生素e 0.005wt％，硒代半胱氨酸0.02wt％，蔗糖2wt％和琼脂4g
·
l-1
，所述再分化培养基的ph为5)中于光照强度为1500lux，光照周期为15h/d，温度为25℃的条件下进行再分化培养，得菊叶薯蓣再生苗；
66.(4)将所述菊叶薯蓣再生苗的叶腋转移至菊叶薯蓣组培苗生根培养基(所述生根培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：iba0.5mg
·
l-1
，naa 0.05mg
·
l-1
和蔗糖2wt％，所述生根培养基的ph为5，所述改良ms培养基的组分包括：kno314mmol/l，ca(no3)214mmol/l，(nh4)2so47mmol/l和kcl 4mmol/l)中于光照强度为1500lux，光照周期为15h/d，温度为25℃的条件下进行生根培养，得菊叶薯蓣完整再生苗；
67.(5)将所述菊叶薯蓣完整再生苗于温度为20℃，湿度为50％的条件下进行炼苗1d，然后将根部的培养基用蒸馏水清洗干净，移栽至湿润的草炭土中于光照强度为1500lux，光照周期为15h/d，温度为25℃的条件下进行育苗培养8d，得菊叶薯蓣组培苗。
68.实施例2
69.(1)将采集的菊叶薯蓣根状茎用蒸馏水简单清洗以除去杂质，然后将菊叶薯蓣根状茎种植于基质土(基质土组分为营养土和蛭石，所述营养土和蛭石的质量比为3:1)中于光照强度为2000lux，光照周期为16h/d，温度为28℃的条件下进行脱菌培养10min，待生长出较强壮的营养器官(茎、叶片、腋芽、顶芽)后，选取叶片作为外植体备用；
70.(2)将所述叶片经质量浓度为0.1％的升汞消毒10min，无菌水清洗6次，并用无菌滤纸吸干表面水分，平铺于菊叶薯蓣组培苗脱分化培养基(所述脱分化培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba2mg
·
l-1
，naa 0.2mg
·
l-1
，蔗糖3wt％和琼脂4.5g
·
l-1
，所述脱分化培养基的ph为5.8，所述改良ms培养基的组分包括：kno315mmol/l，ca(no3)215mmol/l，(nh4)2so47.5mmol/l和kcl 5mmol/l)中于光照强度为2000lux，光照周期为8h/d，温度为28℃的条件下进行脱分化培养，得菊叶薯蓣胚性愈伤组织；
71.(3)将所述菊叶薯蓣胚性愈伤组织置于菊叶薯蓣组培苗增殖培养基(所述增殖培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 2mg
·
l-1
，naa 0.2mg
·
l-1
，谷
氨酸0.05wt％，蔗糖3wt％和琼脂4.5g
·
l-1
，所述增殖培养基的ph为5.8)中于光照强度为2000lux，光照周期为20h/d，温度为28℃的条件下进行增殖培养20d，然后置于菊叶薯蓣组培苗再分化培养基(所述再分化培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba2mg
·
l-1
，naa 0.4mg
·
l-1
，维生素e 0.01wt％，硒代半胱氨酸0.025wt％，蔗糖3wt％和琼脂4.5g
·
l-1
，所述再分化培养基的ph为5.8)中于光照强度为2000lux，光照周期为16h/d，温度为28℃的条件下进行再分化培养，得菊叶薯蓣再生苗；
72.(4)将所述菊叶薯蓣再生苗的叶腋转移至菊叶薯蓣组培苗生根培养基(所述生根培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：iba 1mg
·
l-1
，naa 0.1mg
·
l-1
和蔗糖3wt％，所述生根培养基的ph为5.8，所述改良ms培养基的组分包括：kno315mmol/l，ca(no3)215mmol/l，(nh4)2so47.5mmol/l和kcl 5mmol/l)中于光照强度为2000lux，光照周期为16h/d，温度为28℃的条件下进行生根培养，得菊叶薯蓣完整再生苗；
73.(5)将所述菊叶薯蓣完整再生苗于温度为26℃，湿度为60％的条件下进行炼苗2d，然后将根部的培养基用蒸馏水清洗干净，移栽至湿润的草炭土中于光照强度为2000lux，光照周期为16h/d，温度为28℃的条件下进行育苗培养10d，得菊叶薯蓣组培苗。
74.实施例3
75.(1)将采集的菊叶薯蓣根状茎用蒸馏水简单清洗以除去杂质，然后将菊叶薯蓣根状茎种植于基质土(基质土组分为营养土和蛭石，所述营养土和蛭石的质量比为4:1)中于光照强度为2500lux，光照周期为17h/d，温度为30℃的条件下进行脱菌培养12min，待生长出较强壮的营养器官(茎、叶片、腋芽、顶芽)后，选取腋芽作为外植体备用；
76.(2)将所述腋芽经质量浓度为0.15％的升汞消毒15min，无菌水清洗7次，并用无菌滤纸吸干表面水分，平铺于菊叶薯蓣组培苗脱分化培养基(所述脱分化培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba 3mg
·
l-1
，naa 0.3mg
·
l-1
，蔗糖4wt％和琼脂5g
·
l-1
，所述脱分化培养基的ph为6，所述改良ms培养基的组分包括：kno316mmol/l，ca(no3)216mmol/l，(nh4)2so48mmol/l和kcl 6mmol/l)中于光照强度为2500lux，光照周期为9h/d，温度为30℃的条件下进行脱分化培养，得菊叶薯蓣胚性愈伤组织；
77.(3)将所述菊叶薯蓣胚性愈伤组织置于菊叶薯蓣组培苗增殖培养基(所述增殖培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba3mg
·
l-1
，naa 0.3mg
·
l-1
，谷氨酸0.06wt％，蔗糖4wt％和琼脂5g
·
l-1
，所述增殖培养基的ph为6)中于光照强度为2500lux，光照周期为21h/d，温度为30℃的条件下进行增殖培养22d，然后置于菊叶薯蓣组培苗再分化培养基(所述再分化培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：6-ba3mg
·
l-1
，naa 0.5mg
·
l-1
，维生素e 0.015wt％，硒代半胱氨酸0.03wt％，蔗糖4wt％和琼脂5g
·
l-1
，所述再分化培养基的ph为6)中于光照强度为2500lux，光照周期为17h/d，温度为30℃的条件下进行再分化培养，得菊叶薯蓣再生苗；
78.(4)将所述菊叶薯蓣再生苗的叶腋转移至菊叶薯蓣组培苗生根培养基(所述生根培养基以改良ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：iba 1.5mg
·
l-1
，naa 0.15mg
·
l-1
和蔗糖4wt％，所述生根培养基的ph为6，所述改良ms培养基的组分包括：kno316mmol/l，ca(no3)216mmol/l，(nh4)2so48mmol/l和kcl 6mmol/l)中于光照强度为2500lux，光照周期为17h/d，温度为30℃的条件下进行生根培养，得菊叶薯蓣完整再生苗；
79.(5)将所述菊叶薯蓣完整再生苗于温度为30℃，湿度为70％的条件下进行炼苗3d，
然后将根部的培养基用蒸馏水清洗干净，移栽至湿润的草炭土中于光照强度为2500lux，光照周期为17h/d，温度为30℃的条件下进行育苗培养12d，得菊叶薯蓣组培苗。
80.实施例4
81.除菊叶薯蓣外植体选用腋芽外，其余步骤均与实施例2保持一致。
82.实施例5
83.除菊叶薯蓣外植体选用茎外，其余步骤均与实施例2保持一致。
84.实施例6
85.除菊叶薯蓣外植体选用顶芽外，其余步骤均与实施例2保持一致。
86.对比例1
87.除脱分化培养基中6-ba的浓度为1mg
·
l-1
，naa的浓度为0.2mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
88.对比例2
89.除脱分化培养基中6-ba的浓度为1mg
·
l-1
，naa的浓度为0.4mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
90.对比例3
91.除脱分化培养基中6-ba的浓度为1mg
·
l-1
，naa的浓度为0.6mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
92.对比例4
93.除脱分化培养基中6-ba的浓度为2mg
·
l-1
，naa的浓度为0.4mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
94.对比例5
95.除脱分化培养基中6-ba的浓度为2mg
·
l-1
，naa的浓度为0.6mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
96.对比例6
97.除脱分化培养基中6-ba的浓度为4mg
·
l-1
，naa的浓度为0.2mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
98.对比例7
99.除脱分化培养基中6-ba的浓度为4mg
·
l-1
，naa的浓度为0.4mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
100.对比例8
101.除脱分化培养基中6-ba的浓度为4mg
·
l-1
，naa的浓度为0.6mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
102.对比例9
103.除再分化培养基中6-ba的浓度为1mg
·
l-1
，naa的浓度为0.2mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
104.对比例10
105.除再分化培养基中6-ba的浓度为1mg
·
l-1
，naa的浓度为0.4mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
106.对比例11
107.除再分化培养基中6-ba的浓度为1mg
·
l-1
，naa的浓度为0.6mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
108.对比例12
109.除再分化培养基中6-ba的浓度为2mg
·
l-1
，naa的浓度为0.2mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
110.对比例13
111.除再分化培养基中6-ba的浓度为2mg
·
l-1
，naa的浓度为0.6mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
112.对比例14
113.除再分化培养基中6-ba的浓度为3mg
·
l-1
，naa的浓度为0.2mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
114.对比例15
115.除再分化培养基中6-ba的浓度为3mg
·
l-1
，naa的浓度为0.4mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
116.对比例16
117.除再分化培养基中6-ba的浓度为3mg
·
l-1
，naa的浓度为0.6mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
118.对比例17
119.除生根培养基中iba的浓度为0，naa的浓度为1mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
120.对比例18
121.除生根培养基中iba的浓度为0.5mg
·
l-1
，naa的浓度为0.5mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
122.对比例19
123.除生根培养基中iba的浓度为0mg
·
l-1
，naa的浓度为0.1mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
124.对比例20
125.除生根培养基中iba的浓度为1mg
·
l-1
，naa的浓度为1mg
·
l-1
之外，其余步骤均与实施例4保持一致。
126.实验例1
127.以实施例2、4、5、6为例，研究不同外植体对愈伤组织形成的影响。
128.将上述实施例中的不同外植体经过30min洗净处理后，放入无菌工作台上进行消毒。首先使用75％的乙醇进行30s消毒，期间不停晃动玻璃容器。倒出乙醇后，用无菌蒸馏水清洗一次。然后使用0.1％hgcl2溶液处理10min进行消毒处理。在此期间不间断晃动培养瓶，倒掉hgcl2溶液后，用无菌蒸馏水清洗外植体6次，最后使用镊子将裁好的外植体放入ms(无激素)培养基中黑暗培养一周，进行最适外植体器官的探究。结果表明，在黑暗条件下生长一周后，放入培养基的叶片边缘开始褐化变黑，愈伤组织形成率接近于0；茎段两端发生膨大，培养第二周后出现白色晶体类物质，形成少量愈伤组织；腋芽在暗培养一周后，愈伤组织极少，第二周愈伤分化为腋芽；顶芽在培养一周后即可表现继续生长的状态。从愈伤组
织形成率角度进行比较，腋芽》茎段》叶片＝顶芽。
129.实验例2
130.以实施例4，对比例1～8为例，研究脱分化培养基中不同浓度的6-ba和naa对促使愈伤组织形成的影响。结果如表1所示。
131.表1不同浓度的6-ba和naa对促使愈伤组织形成的影响
[0132][0133][0134]
首先，在空白对照下，腋芽不被促使产生愈伤组织。由表1可知，在添加不同浓度6-ba条件下，愈伤组织形成，随着其浓度的提高，愈伤组织生长速率加快。添加naa后，可显著提高愈伤组织形成率，但随着其浓度的提高，愈伤组织的生长状况并不好，出现褐化，玻璃化，最后死亡。与对比例1～8相比，本技术实施例4也即植物激素为2mg/l 6-ba 0.2mg/lnaa的脱分化培养基为最佳脱分化培养基。
[0135]
实验例3
[0136]
以实施例4，对比例9～16为例，研究再分化培养基中不同浓度的6-ba和naa对促使愈伤组织再分化的影响。结果如表2所示。
[0137]
表2不同浓度的6-ba和naa对促使愈伤组织再分化的影响
[0138][0139]
由表2可知，与对比例9～16相比，本技术实施例4也即再分化培养基中的植物激素为2mg/l 6-ba 0.4mg/lnaa时，腋芽形成为不定芽的效果最佳，愈伤组织再分化率可达96％，且不定芽生长健壮，分化程度较高，由表2还可知，低浓度的naa对不定芽的形成起促进作用。
[0140]
实验例4
[0141]
以实施例4，对比例17～20为例，研究生根培养基中不同浓度的iba和naa对促使叶腋生根的影响。结果如表3所示。
[0142]
表3不同浓度的iba和naa对促使叶腋生根的影响
[0143][0144]
菊叶薯蓣生根后期主根粗壮，侧根纤细发达，且有绒毛状气生根长出。组织培养下菊叶薯蓣叶腋分化处根组织为不定根，与细胞全能性有直接关系。由表3可知，与对比例17～20相比，本技术实施例4也即生根培养基中的植物激素为1mg/l 6-ba 0.1mg/lnaa时，生根情况最佳，出根时间短，约7d，根系生长快且粗壮。
[0145]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。