一种血细胞/血小板模拟物及其应用的制作方法

1.本发明属于血细胞计数及检测领域，特别涉及一种血细胞/血小板模拟物及其应用。


背景技术：

2.血液分析仪也称为血细胞自动计数仪，是临床使用最多的检验设备之一，主要用于全血细胞计数及相关项目检测。它检测的关键指标之一，是进行白细胞分类计数。按照计数分类的白细胞种类多少，一般可分为三分类和五分类血液分析仪。三分类血细胞分析仪，可以对中性粒细胞、淋巴细胞和中间细胞进行分类计数，五分类血细胞分析仪可进一步对单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞进行分类计数，五分类血细胞分析仪目前是市场主流。
3.作为医疗检测机构使用最为广泛，使用频率最高的检测仪器之一，血液分析仪的检测质量涉及广泛。为保证检测质量，采用全血质控品进行日常质量监控是最为重要的保障手段。上级质量监督机构，也通过发放全血质控品并回收检验结果，实现对医疗检验机构检验质量的监测与评价。新鲜人血是较为理想的全血质控品原料，但是不能随意获取。我国法律明文禁止血液交易，《血液制品管理条例》和《血站管理办法》等相应法律法规严格限制国内人血液制品的获取和生产。从国外进口血液质控品，不仅费用高昂，保质期也是重要限制。全血制品稳定时间短而订货周期长，加上报关及运输时间，用户得到产品往往接近甚至超过效期。同时，以人血为原料制备质控品，存在伦理风险。寻找合适的人血替代物已成为共识，其中又以白细胞替代物最为关键。相对其他类型血细胞，白细胞包含多种生物酶，容易发生自噬，保存时间短，一般要求新鲜血液制备；白细胞包含多种类型并且各具临床参考价值，是血液分析仪最主要的细胞分类对象。国内外研究者均以寻找合适的白细胞替代物作为全血质控品研发的关键。目前已尝试：乳胶颗粒、鸟类有核红细胞、蹄科动物红细胞以及裸核，国内也有专利使用人红细胞溶胀模拟。其他血细胞类型，则一般使用动物血细胞替代。乳胶颗粒替代血细胞，因适用性较差，目前已基本淘汰。使用动物血细胞材料替代血细胞/血小板也存在固有缺陷，如：猪血小板制备困难，容易聚集；羊红细胞容易出现假白细胞干扰。此外这类产品效期普遍较短，一般不超过三个月左右，同时存在一定生物安全风险，因此这类模拟物均未能获得广泛应用，目前都仅见于研究报道。血液分析仪等质控需求未能获得充分满足。


技术实现要素：

4.针对现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种血细胞/血小板模拟物及其应用。
5.本发明的一种血细胞/血小板模拟物，所述模拟物为微生物细胞，所述微生物细胞用以模拟白细胞及其他类型血细胞/血小板。
6.所述微生物细胞与各类型血细胞/血小板大小基本一致。进一步模拟物，所述微生
物细胞为非致病的微生物细胞。
7.优选地，所述微生物细胞为藻类、真菌、细菌、原生动物细胞中的一种或几种。
8.优选地，所述微生物细胞为单细胞或多细胞制备的单细胞。
9.优选地，所述微生物的为活体微生物、灭活后微生物，或者两者混合物。
10.所述微生物可模拟的血细胞类型主要包括一种或多种类型的血细胞及血小板(血液中有形物)。
11.所述血细胞包括人或动物红细胞、白细胞、血小板及各种血细胞/血小板亚型。
12.本发明还提供了一种分析仪用质控物，所述质控物含所述血细胞/血小板模拟物。
13.所述质控物还包括全血质控品。也即：所述模拟物可以单独使用或添加于现有质控品中使用。
14.本发明还提供了一种所述分析仪用质控物在人血液分析仪质控中的应用。
15.本发明还提供了一种所述分析仪用质控物在兽用血液分析仪质控中的应用。
16.微生物细胞在大小、形态特征以及内容物上多种多样，相较其它模拟物有更丰富的多样性。可以在血液分析仪以及相似检测原理的检测仪器上模拟各种类型血细胞/血小板的检测特征，从而实现模拟多种类型血细胞/血小板目的。同时微生物细胞的多样性，可使其在特定指标上与被模拟血细胞/血小板更为接近，也可以使其同时模拟特定血细胞/血小板的多个检测指标。
17.有益效果
18.微生物制备简单，适合规模化生产，以其作为质控品原料，来源稳定可靠。环境微生物不具有致病性，选择非致病性微生物作为血细胞/血小板替代品，可减少或消除生物安全风险，并且不存在伦理风险。微生物较一般较血细胞/血小板更为稳定，制备的质控品理论上也更为稳定。
19.本发明通过选用合适微生物细胞，模拟部分类型血细胞/血小板在血液分析仪等仪器中的检测特征，满足这些仪器质控、较准等使用需要，减少在这些应用场景中对人或动物血液的需求。微生物模拟的血细胞/血小板，制备方便、稳定性好、生物安全可控，降低成本、减少或消除生物安全风险及伦理风险，适合商业化应用。
附图说明
20.图1为光学显微镜中微生物细胞大小形态(物镜100倍)其中a：小球藻；b：雨生红球藻；
21.图2为sysmex xs-500i血小板直方图；其中a：全血质控品；b：小球藻；
22.图3为sysmex xs-500i散点图；其中a，全血质控品；b，雨生红球藻；c，添加雨生红球藻后全血质控品；
23.图4为添加酿酒酵母后各机型中白细胞计数变化。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定
的范围。
25.实施例中使用的血液分析仪各检测项目及代码对应如下：
26.白细胞，wbc；红细胞，rbc；血小板，plt；中性粒细胞，neut；淋巴细胞，lymph；单核细胞，mono；嗜酸性粒细胞，eo；嗜碱性粒细胞，baso；血红蛋白，hgb；红细胞压积，hct；平均红细胞体积，mcv；平均红细胞血红蛋白量，mch；平均红细胞血红蛋白浓度，mchc
27.实施例1
28.小球藻模拟血细胞/血小板
29.本实施例提供了一种以微生物模拟血细胞/血小板的筛选制备流程，需要说明的是，实施例仅为本技术的部分实施例，其他微生物制备的血细胞/血小板模拟物可以此作为参考。
30.具体如下：
31.1.微生物初步筛选
32.根据文献资料等筛选大小合适，非致病性微生物。本实施例中筛选的微生物为藻类。
33.2.显微镜确认形态、大小
34.将藻类细胞染色并固定，光学显微镜100倍物镜下观察形态，目镜标尺测量细胞大小。主要筛选单细胞藻类，本实施例中优选小球藻(3-7μm)如图1a所示。
35.3.藻液浓度
36.血细胞计数板对原藻液计数，测得小球藻浓度为4.14
×
10
10
/l。
37.4.预处理
38.为防止微生物样本堵塞仪器管道及在管道中生长，本实施例对微生物进行灭活处理，80℃30min使小球藻灭活。取45ml藻液，25μm、8μm筛网逐级过滤，重复2次。6000r/min离心5min收集细胞，重悬于50ml生理盐水，重复以上步骤2次清洗藻液，离心收集细胞，重悬于10ml生理盐水，2-8℃保存(小球藻理论浓度为186
×
109/l)。
39.5.希森美康sysmex xs-500i血细胞分析仪五分类检测，检测结果见表1，图2b。
40.表1 sysmex xs-500i血细胞分析仪检测小球藻样本
[0041][0042][0043]
单位109/l
[0044]
结果表明，血液分析仪主要将小球藻识别为血小板(178/186,～95.7％)，少部分计为红细胞及白细胞，白细胞包含5种亚型。
[0045]
实施例2
[0046]
雨生红球藻细胞模拟中性粒细胞
[0047]
1.按照实施例1筛选并处理雨生红球藻，涂片染色、光学显微镜镜检大小为15-25μm(见图1b)，藻液浓度为9.5
×
107/l。
[0048]
2.取590ml藻液，25μm、8μm筛网逐级过滤并清洗后，重悬于10ml生理盐水后均分为5ml一份。一份用于直接测定(雨生红球藻理论浓度5.6
×
109/l)。另一份离心后收集细胞加入5ml全血质控品(低值，基质为添加抗凝剂和固定剂人血)，温和混匀后2-8℃保存。
[0049]
3.希森美康sysmex xs-500i血细胞分析仪，分别检测雨生红球藻血细胞模拟物，现有全血质控品及添加模拟物后全血质控品。检测结果见表2，图3。
[0050]
表2 sysmex xs-500i血细胞分析仪测定雨生红球藻相关质控品
[0051][0052]
单位109/l
[0053]
结果表明，雨生红球藻可被单独识别为中性粒细胞，添加于全血质控品后显著增加质控品中中性粒细胞含量。
[0054]
实施例3
[0055]
酵母细胞模拟血细胞\血小板用于全血细胞计数
[0056]
1.根据文献资料等筛选微生物细胞用于血细胞\血小板模拟，本实施例筛选酵母细胞用于模拟，并优选酿酒酵母。
[0057]
2.取0.1g酵母(安琪高活性干酵母)，加入20ml生理盐水，121℃20min灭活，离心收集菌液，生理盐水冲洗两遍，35μm筛网过滤两次。6000r/min离心5min，收集细胞。
[0058]
3.加入生理盐水重悬，使600nm吸光度值a
600
＝0.1，希森美康血液分析仪sysmex xe-2100检测发现，酵母主要被识别为白细胞(wbc)。
[0059]
4.加入生理盐水稀释，使用希森美康血液分析仪sysmex xe-2100检测，使wbc约为7*107/l。取10ml离心收集菌体，加入10ml全血质控品(高值，基质为添加抗凝剂和固定剂人血)，温和混匀后，2-8℃保存。
[0060]
5.多种血细胞分析仪(coulter lh750；mindray bc-3000 ；abx micros 60；abbott cd-1800，cd-3200；sysmex xp-100，k-4500，xe-2100；nihon mek-6318k，mek-6410p，mek-7222k)分别测定添加酿酒酵母前后全血质控品。结果见表3，图4。
[0061]
结果表明，酿酒酵母主要被识别为白细胞，添加酿酒酵母后全血质控品，适用于多个品牌多种机型全血细胞计数使用。
[0062]
表3多种血细胞分析仪测定添加酿酒酵母前后全血质控品
[0063][0064]
注：bl为未添加酵母人全血质控品；by为添加酵母人全血质控品
[0065]
上述结果表明，微生物细胞可用于模拟血细胞/血小板。通过筛选，微生物可以单独模拟特定类型血细胞，也可以以某种类型为主同时被识别为多种类型血细胞/血小板。作为模拟物，微生物可以单独使用，也可以添加于现有血液质控品中使用，并且可适用于不同品牌、多种类型血液分析仪。