一种基于光热诱导反向马兰戈尼流的方法及药物集群细胞递送的方法

1.本发明属于药物递送技术领域，具体涉及一种基于光热诱导反向马兰戈尼流的方法及药物集群细胞递送的方法。


背景技术：

2.向细胞递送药物对精准医疗有非常重要的意义。基于不同运动机制(例如，光、化学、磁、声学和生物)具有多种结构和多种组件的微/纳米马达进行药物递送，并且取得了显著进展，但由于复杂的生理条件，基于微/纳米马达集群的输送系统在生物医学应用中仍然受到限制。对于蛋白质、核酸和药物等样品的输送，上述马达机制中的强电场、高强度光或直接将药物与磁性颗粒结合会不可避免地对生物样品的活性产生不可逆转地影响。为了克服这些障碍，已经开发了许多像磁镊、介电泳、光镊这样非接触式操作技术。
3.在这些技术中，光镊可以通过使用高度聚焦的激光束通过光子动量转移以非接触方式捕获和操纵微型物体。该技术已被广泛用于捕获和操纵生物样品，例如病毒、细菌、以及动物细胞。然而，用高强度激光直接照射生物样品会对生物样品造成光损伤并伴随有热损伤，而且装载药物的物体也可能会因激光诱导的光化学或光热反应而失活。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于光热诱导反向马兰戈尼流的方法及药物集群细胞递送的方法，克服光热对细胞造成的损伤，同时精准完成药物细胞递送。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种基于光热诱导反向马兰戈尼流的方法，包括以下步骤：向平铺有硅油膜的玻璃基板上滴加液滴，得硅油环绕的液滴；所述液滴中包含细胞；
7.利用光镊抓取所述硅油环绕的液滴中的悬浮细胞至液滴和硅油的边界处，将光阱照射到硅油里，在水油界面产生反向马兰戈尼流。
8.优选的，所述玻璃基板包括亲水性玻璃基板。
9.优选的，形成所述硅油膜所使用的硅油，黏度为5～300cst。
10.优选的，所述光镊的激光波长为1064nm；所述光镊的激光功率不高于250mw。
11.本发明还提供了利用上述方法诱导的反向马兰戈尼流在制备药物集群细胞递送系统中的应用。
12.本发明还提供了一种基于光热诱导的反式马兰戈尼对流用于对细胞递送药物的集群系统，包括具有亲水性的玻璃基板、硅油和光镊系统。
13.本发明还提供了一种非治疗目的的基于光热诱导反向马兰戈尼流用于药物集群细胞递送的方法，向平铺有硅油膜的玻璃基板上滴加液滴，得硅油环绕的液滴；所述液滴中包含细胞和载药颗粒；
14.利用光镊抓取所述硅油环绕的液滴中的悬浮细胞至液滴和硅油的边界处，将光阱
照射到硅油里，在水油界面产生反向马兰戈尼流，载药颗粒聚集到所述边界处细胞的周围，实现对细胞的药物递送。
15.优选的，所述载药颗粒的制备方法，包括利用1μm介孔二氧化硅颗粒修饰上羧基，载上药物。
16.优选的，所述悬浮细胞距所述边界处的位置＞15μm。
17.优选的，所述悬浮细胞包括悬浮生长在培养基中的细胞，或由贴壁生长得到细胞再悬浮后得到的细胞。
18.有益效果：本发明提供了一种基于光热诱导反向马兰戈尼流的方法，玻璃基板上平铺硅油膜，膜上滴液滴稳定后形成硅油环绕的液滴。其中液滴中含有细胞和载药颗粒，利用光镊的激光照射到硅油中，会在水油的边界处产生稳定的反向马兰戈尼流，使溶液中载有药物的颗粒产生集群，用光镊抓取一个或两个细胞放在水油边界附近，同过控制光阱的移动来控制药物集群细胞递送。所述激光波长与硅油的吸收相匹配。本发明通过将激光照射到硅油里，硅油在对应的光镊的激光波长有很强的吸收，导致在硅油中产热，避免光热对细胞造成损伤。光热诱导水油界面的反向马兰戈尼流使载药颗粒的集群运动到细胞周围，精准的完成药物递送。
附图说明
19.图1为本发明硅油环绕液滴的图像；
20.图2为本发明用染料对细胞进行染色的图像；
21.图3为本发明在激光照射下，在水油边界处产生反向马兰戈尼流集群示意图和实验图；
22.图4为本发明用激光直接照射对细胞的损伤的图像和激光照射到硅油中没有对细胞造成损伤的图像；其中a图激光直接照射到细胞，由于光热对细胞造成损伤，在40分钟内死亡；b图激光照射到硅油中，没有光热对细胞的损伤，在40分钟时细胞正常存活；
23.图5为本发明光热诱导反向马兰戈尼流用于载药集群运动到细胞周围的图像；其中a图是对单个细胞的药物集群递送；b图是对两个及以上的细胞的药物集群递送；
24.图6为本发明中不同的功率导致细胞的死亡时间不同的数据图；
25.图7为本发明中随着时间的变化载药颗粒的聚集数量的数据图。
具体实施方式
26.本发明提供了一种基于光热诱导反向马兰戈尼流的方法，包括以下步骤：向平铺有硅油膜的玻璃基板上滴加液滴，得硅油环绕的液滴；所述液滴中包含细胞；
27.利用光镊抓取所述硅油环绕的液滴中的悬浮细胞至液滴和硅油的边界处，将光阱照射到硅油里，在水油界面产生反向马兰戈尼流。
28.本发明所述玻璃基板优选包括亲水性玻璃基板，实施例中选用3μm厚度的玻璃基板，优选购自广州锂阁科技有限公司。本发明优选向所述玻璃基板上滴加硅油，硅油在玻璃表面快速铺展开形成硅油膜，所述硅油的黏度优选为5～300cst，且所述硅油的体积优选为100μl，形成5μm左右厚度的油膜。
29.本发明向所述硅油膜上滴加液滴，所述滴加时，优选将所述液滴滴加到所述硅油
膜的中心，由于液滴的密度较大，在重力作用下逐渐将硅油排开；液滴在接触到玻璃表面后，由于形成三相接触线，迅速在玻璃表面铺展，稳定时形成硅油环绕的液滴。本发明所述液滴优选为包含所述细胞的去离子水溶液。
30.本发明优选利用光镊抓取一个或两个悬浮细胞放在水油边界附近，利用光镊的激光照射到硅油中，会在水油的边界处产生稳定的反向马兰戈尼流现象。本发明所述光镊所用的光镊系统的光学镊子优选为围绕倒置光学显微镜(nikon eclipse ti-u)使用连续波固态激光器在光波长为1064nm，60倍水浸倒置物镜(数值孔径：1.0)用于激光束聚焦；个人计算机(pc)接口，声光偏转器(aod)系统被用作空间光调制器(slm)来控制光阱。使用pc接口的cmos相机实时捕获图像和视频。本发明所述光波长为对细胞损伤较小。本发明所述光功率优选不高于250mw，更优选为50mw。本发明实施例中优选只设置一个光阱，并且光阱照射在硅油里，最优光功率为50mw。
31.在本发明中，反向马兰戈尼流的产生是由于激光照射到硅油中，硅油对光的吸收诱导热上升液流，同时诱导硅油和空气界面的正向马兰戈尼流，两者方向一致，相互增强。底部的硅油在不断地从两侧补充至热源的同时，部分动量发生转移，带动水溶液从两侧向热源方向收缩，产生反向马兰戈尼流。
32.本发明还提供了利用上述方法诱导的反向马兰戈尼流在制备药物集群细胞递送系统中的应用。
33.本发明中，所述光热诱导的反向马兰戈尼流使溶液中的颗粒产生的集群可以通过改变光镊的光阱的位置和移动光阱的速度，使集群发生运动，精准的控制集群向细胞递送药物。本发明所述光阱位置改变的范围仅在硅油处改变，也即是在水油边界处的硅油一侧。本发明所述光阱的移动速度优选根据移动光阱的速度决定，更优选为10μm/s。在本发明中，基于光热诱导的反向马兰戈尼流操控集群向细胞递送药物，并且可以通过移动光阱从而灵活的改变集群的位置。
34.本发明还提供了一种基于光热诱导的反式马兰戈尼对流用于对细胞递送药物的集群系统，包括具有亲水性的玻璃基板、硅油和光镊系统。
35.本发明所述玻璃基板、硅油和光镊系统优选与上述相同，在此不再赘述。在本发明中，光镊系统的激光镊子围绕倒置光学显微镜使用连续波固态激光器构建工作在1064nm的光波长，用60倍水浸倒置物镜用于光学操作和实时成像。本发明所述的激光优选用1064nm，对细胞损伤小；所述热源是在硅油处，不会改变水溶液的温度，使含有细胞和载药颗粒的溶液处于使细胞正常生长的温度范围(37℃)。
36.本发明还提供了一种非治疗目的的基于光热诱导反向马兰戈尼流用于药物集群细胞递送的方法，向平铺有硅油膜的玻璃基板上滴加液滴，得硅油环绕的液滴；所述液滴中包含细胞和载药颗粒；
37.利用光镊抓取所述硅油环绕的液滴中的悬浮细胞至液滴和硅油的边界处，将光阱照射到硅油里，在水油界面产生反向马兰戈尼流，载药颗粒聚集到所述边界处细胞的周围，实现对细胞的药物递送。
38.本发明所述方法中除液滴的内容物不同外，其余均与上述方法相同，在此不再赘述。
39.本发明所述载药颗粒的制备方法，优选包括利用1μm介孔二氧化硅颗粒修饰上羧
基，载上药物。本发明所述载药颗粒负载的药物优选针对所述细胞的类型确定，当所述细胞为血癌细胞或海拉细胞时，所述药物包括盐酸阿霉素(dox)。在本发明中，所述载药颗粒的浓度优选为0.001mg/ml，并且所述1μm介孔二氧化硅纳米粒子和dox，优选购自西安瑞禧生物科技有限公司。本发明对所述载药的方法并没有特殊限定，优选包括1ml多孔硅球修饰上羧基，加入1ml浓度为5ng/ml盐酸阿霉素，用锡纸包裹，放到室温摇床24h。经所述载药方法进行载药，载药量接近90％。
40.本发明所有悬浮细胞优选包括悬浮生长在培养基中的细胞，或由贴壁生长得到细胞再悬浮后得到的细胞，并且所述悬浮细胞距所述边界处的位置＞15μm。在本发明实施例中，优选在培养细胞的容器中加入完全培养基，进行培养，得到所述悬浮细胞。本发明所述容器优选为培养皿；并且对得到的悬浮细胞进行洗涤，以去除多余的培养基；所述洗涤采用的试剂优选为磷酸盐缓冲液(pbs)；所述磷酸盐缓冲液的ph值优选7.2～7.4。
41.下面结合实施例对本发明提供的一种基于光热诱导反向马兰戈尼流的方法及药物集群细胞递送的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.实施例1
43.步骤1：硅油环绕的液滴的制备
44.首先在水平放置的玻璃基板上滴加少量的硅油(粘度为5)，硅油在玻璃表面快速铺展开，形成5μm左右厚度的油膜。滴加少量(5μl)的水溶液在油膜中心，由于水滴的密度较大，在重力作用下逐渐将硅油排开。水滴在接触到玻璃表面后，由于形成三相接触线，迅速在玻璃表面铺展，稳定时形成如图1所示的硅油环绕的液滴。
45.步骤2：血癌细胞的培养和活死染料对细胞染色
46.用含在添加了10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素/链霉素(pen/strem)的rpmi medium 1640 basic(1x)培养基培养血癌细胞，并将血癌细胞置于37℃的含有5％的co2的恒温培养箱中培养。
47.实验前将细胞取出一些放到离心管中，放到离心机中1000rpm离心5分钟，吸取出离心管内部的完全培养基，然后用pbs缓冲液清洗细胞两次。然后用锡纸包住离心管，将染料加入离心管，对细胞进行染色，判断细胞的损伤情况。细胞染色之后的初始状态如图2所示。
48.步骤3：光热诱导的马兰戈尼对流在水油边界处产生反向马兰戈尼流的集群
49.如图3所示，硅油对光的吸收诱导热上升液流，同时诱导硅油和空气界面的正向马兰戈尼流，两者方向一致，相互增强。底部的硅油在不断地从两侧补充至热源的同时，部分动量发生转移，带动水溶液从两侧向热点方向收缩，产生反向马兰戈尼流。集群在热源对应的位置逐渐聚集，在数量饱和后随着上升液流喷射至液滴中，从而达到动态平衡状态。整个过程，集群完全与光、热源分离开来，从而有效地避免了光的直射损伤或微环境温度升高。
50.步骤4：光热对细胞的损伤程度。
51.如图4中(a)所示，运用光镊的1064nm激光照射在硅油环绕的液滴的pbs溶液中，pbs溶液中的细胞在激光照射下会产生光热损伤，导致细胞在40分钟内死亡。将激光照射到硅油中，硅油在1064nm处有很强的吸收，光产生的热只会在硅油中扩散，最终扩散到油边界，不会使pbs溶液中的细胞受到光热损伤。图4中(b)的实验结果显示细胞在40分钟还正常
存活，直到95分钟细胞才死亡。
52.步骤4：操控药物集群细胞递送。
53.用集群与光热不在溶液避免光对细胞的直接损伤这一特点，将集群用于向细胞递送药物。首先，在光镊的作用下抓取一个细胞，将细胞移动到水油界面附近，然后激光照射到硅油里，产生温度差形成反向马兰戈尼流，使游离在pbs溶液中负载有dox的颗粒带到细胞周围，经过一段时间，dox会从多孔硅球里释放到细胞表面，小分子dox可以迅速扩散到细胞中，完成药物递送。对单个细胞的药物集群递送如图5中(a)所示，对两个及以上的细胞的药物集群递送如图5中(b)所示。图6是不同的功率导致细胞的死亡时间不同的数据图。图7是随着时间的变化载药颗粒的聚集数量的数据图。
54.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。