一种植物乳杆菌在制备对骨性关节炎具有保护作用的药剂中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，涉及一种植物乳杆菌在制备对骨性关节炎具有保护作用的药剂中的应用。


背景技术：

2.骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种由关节之间磨损导致的退行性关节疾病，发病部位包括关节滑膜、半月板、关节软骨和软骨下骨。引发oa的原因可能是由机械损伤、氧化损伤、炎症损伤、免疫功能异常等多种机制导致的关节软骨细胞凋亡和胞外基质降解。其主要表现是关节组织代谢异常，促炎性细胞因子和蛋白酶大量分泌，造成软骨细胞外基质被分解，从而引发软骨层退化及滑膜炎症，导致关节功能丧失等。
3.炎症因子分泌异常和氧化应激oa造成发生发展的重要生理机制。il-1β和tnf-α等是骨关节损伤最重要的炎症介质，可以诱导软骨细胞基质金属蛋白酶(mmps)的合成，改变软骨细胞生存环境，导致软骨细胞凋亡和胞外基质的降解。目前临床上还未找到根治oa的方法，其治疗以改善生活质量为目标，主要采用饮食、药物及手术等方式的组合，以达到镇痛、维持关节功能及缓解临床症状，非必要不进行外科关节置换。鉴于此，近年来许多研究开始研究其他有效、安全及创新的方式来补充oa的治疗方式。益生菌作为一类对宿主有益的活性微生物，具有良好的抗炎、抗氧化等益生功能。开发一种能够有效改善骨关节炎损伤的益生菌，安全有效的缓解骨关节炎，降低治疗的副作用，具有非常重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的就是为了提供一种植物乳杆菌在制备对骨性关节炎具有保护作用的药剂中的应用，所提供的植物乳杆菌ar495可以有效缓解骨关节炎症损伤。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.一种植物乳杆菌在制备对骨性关节炎具有保护作用的药剂中的应用，该植物乳杆菌为ar495菌株，已在2017年3月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.14004。
7.进一步的，所述药剂包括ar495菌株，以及药学上可接受的载体。
8.进一步的，所述药剂为发酵食品。
9.更进一步的，所述发酵食品为ar495菌悬液。
10.更进一步优选的，所述ar495菌悬液由生理盐水、以及重悬于生理盐水中的ar495菌株组成。
11.更优选的，所述的生理盐水的质量浓度为0.8％～1.0％。
12.更优选的，ar495菌株的含量为0.5
×
109～1.5
×
109cfu/ml，具体可为1
×
109cfu/ml。
13.本发明提供的植物乳杆菌ar495对oa大鼠关节软骨损伤和滑膜炎症有较好的改善
效果，可以有效改善oa炎症标志物胶原酶mmp-13、胶原降解物ctx-ii水平，降低促炎因子tnf-α水平，并且缓解关节面骨组织的骨质流失。综上所述，本发明提供的植物乳杆菌ar495可以有效缓解骨关节炎症损伤。
附图说明
14.图1为骨关节炎动物实验流程图，其中，control：对照组大鼠(假手术组)；treated 0.9％nacl：骨关节炎模型组；treated ar495：骨关节炎模型 ar495治疗；
15.图2为大鼠血清胶原酶mmp-13、软骨基质降解物ctx-ii及炎症因子tnf-α含量；
16.图3为大鼠膝关节组织病理切片中胶原酶mmp-13免疫荧光染色图；红色箭头所指的绿色荧光为mmp-13。
17.图4为大鼠膝关节组织番红固绿染色图；分别为放大5倍(5x)与10倍(10x)；黑色箭头所指空白区域为关节滑膜丢失。
18.图5为本发明的实施例5中大鼠膝关节组织he染色示意图；分别为放大5倍(5x)与10倍(10x)；黑色箭头所指深色密级区域为炎症聚集。
19.图6为大鼠关节面micro-ct显微成像图，黑色箭头所指为关节面骨质流失区域。
具体实施方式
20.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
21.以下实施例中所涉及的主要试剂如水合氯醛(tca)和4％多聚甲醛购自国药集团化学试剂公司；大鼠血清胶原酶mmp-13、软骨基质降解物ctx-ii及炎症因子tnf-α的elisa试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司；重组单克隆抗体anti-mmp13以及fitc标记的荧光二抗、dapi染液、免疫荧光封闭液、抗荧光淬灭封片液均购自碧云天生物技术公司；苏木精伊红染色液和骨组织番红固绿染色液购自武汉谷歌生物科技有限公司。
22.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
23.实施例1：大鼠骨关节炎模型(oa)建立和实验分组
24.实验选用雄性wistar大鼠(180g左右，约5-6周)，适应环境1周，不进行任何处置。1周后称重随机分为3组，分别为对照组(control)、模型组(treated 0.9％nacl(w/v，即质量体积比，下同))和益生菌干预组(treated ar495)，每组8只。实验前24小时禁食，不禁水，腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)。对于模型组大鼠的处理是选取大鼠右膝关节，用刀沿髌韧带内侧缘切开皮肤，切口大约1-2cm。切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，用11号手术刀将内侧副韧带切断，用5-0可吸收线单独缝合关节囊，再以5-0丝线间断缝合皮肤。正常组进行假手术造模，以同样的方法打开关节囊，但不进行内侧副韧带切断，用生理盐水清洗伤口后关闭关节囊，缝合手术切口。术后分笼饲养，让其自由活动及进食。
25.图1是本发明的实施例1中动物实验设计示意图。待上述造模后大鼠自然恢复一周后开始进行实验，对照组(control)在假手术一周后，每只大鼠每天给予500μl生理盐水灌胃，连续灌胃六周。模型组(treated 0.9％nacl组)在造模一周后灌胃生理盐水，每只大鼠
每天给予500μl生理盐水灌胃，灌胃六周。益生菌干预组(treated ar495)在造模一周后，每只大鼠每天给予500μl ar495菌悬液(1
×
109cfu/ml，重悬于0.9％生理盐水中)灌胃，连续灌胃六周。
26.实施例2：植物乳杆菌ar495对大鼠骨关节炎缓解效果评价
27.软骨变性是骨关节炎病变的主要特征之一，健康的软骨细胞可以合成软骨基质以维持软骨组织完整性，当炎症发生时，一些炎症因子包括tnf-α和il-1β等能够上调软骨组织和滑膜组织金属基质蛋白酶(mmps)表达，最终导致软骨细胞外基质降解。其中，mmp-13是最重要的一种胶原酶，而ctx-ii(ii型胶原c端肽)是软骨细胞外基质被降解后的主要产物。因此抑制炎症因子的释放是oa治疗的一项重要策略，通过检测血清中mmp-13、ctx-ii以及炎症因子tnf-α的水平，可以监测oa的病理发展程度。
28.本研究采用酶联免疫吸附实验(elisa法)检测大鼠血清中mmp-13、ctx-ii以及tnf-α水平。图2是本发明的实施例2中各处理组大鼠血清胶原酶mmp-13、软骨基质降解物ctx-ii以及炎症因子tnf-α检测结果。结果发现，与对照组相比，模型组大鼠血液中mmp-13、ctx-ii及tnf-α水平均显著升高，表明大鼠骨关节炎模型成功。在给与植物乳杆菌ar495灌胃治疗后，oa大鼠血清mmp-13、ctx-ii、tnf-α水平显著下降(p≤0.05)，其中特别是ctx-ii的下降极为显著(p≤0.01)，这表明ar495能够显著改善大鼠骨关节炎病程发展，缓解疾病损伤。
29.实施例3：oa大鼠膝关节病理组织切片分析
30.病理切片制备：解剖取各组大鼠完整右膝关节，去除多余组织，固定于4％多聚甲醛溶液中，48h后将其用石蜡包埋，根据不同需要进行切片及染色分析。
31.免疫荧光染色步骤：
①
室温脱蜡、水化：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯10min
→
无水乙醇10min
→
95％乙醇10min
→
75％乙醇10min，pbs洗1min*3次。
②
抗原修复：组织切片滴加骨组织修复液置于湿盒中进行抗原修复37℃/2h，切勿干片，恢复室温后将玻片置于pbs中洗涤1min*3次。
③
封闭：各玻片加封闭液50μl，放入湿盒内，室温封闭1h。
④
一抗孵育：甩掉封闭液，滴加稀释后的一抗各20μl盖住组织，然后放入湿盒内4℃过夜。
⑤
洗涤：第二天室温复温30min，pbs洗1min*3次。
⑥
二抗孵育：滴加稀释后二抗20μl，室温孵育30min，避光反应。
⑦
dapi核复染：甩干二抗，pbs洗5min*3次，滴加dapi染液，避光室温孵育5min。
⑧
封片：玻片置于pbs中在脱色摇床上晃动洗5min*3次，滴加适量抗荧光淬灭封片液进行封片。
⑨
镜检拍照：切片于荧光显微镜工作站特定波长范围下中观察并采集图像。
32.免疫荧光染色结果：图3是本发明的实施例3中大鼠膝关节组织病理切片中胶原酶mmp-13免疫荧光染色图，图中，箭头所指的荧光为mmp-13。如图3可知，对照组个体的关节软骨结构层次分明，表层光滑均匀，未见到被特异性荧光标记的阳性细胞；模型组大鼠则表现出明显的软骨损伤和滑膜破坏，包括出现软骨层变薄，关节腔收窄，滑膜组织糜烂以及被标记到mmp-13呈现高强度荧光表达。植物乳杆菌ar495治疗组中mmp-13表达量显著降低。既，与模型组大鼠相比，ar495治疗刺激了机体的修复能力，显著缓解了oa炎症。
33.实施例4：oa大鼠膝关节组织番红固绿染色及形态学观察
34.番红固绿染色可以将软骨层染成红色，骨髓染呈绿色。图4是本发明的实施例4中大鼠膝关节组织番红固绿染色图，图中，黑色箭头所指空白区域为软骨层丢失。结果显示，
对照组大鼠关节切面平整，染色均匀，软骨层较厚且被染成红色，潮线连续且清晰可见。模型组大鼠的软骨结构被严重破坏，软骨层染厚度降低且潮线出现不规则缺失，纤维状的滑膜细胞减少。植物乳杆菌ar495治疗组中大鼠关节软骨层的缺失面积显著低于模型组，说明ar495能较好的恢复大鼠关节软骨结构。
35.实施例5：oa大鼠膝关节滑膜组织he染色及形态学观察
36.he染色中可见白细胞及软骨细胞核呈蓝色，软骨细胞质及胞外胶原纤维呈粉红色，深层骨髓呈紫色。图5是本发明的实施例5中大鼠膝关节组织he染色图，图中，黑色箭头所指深色密级区域为炎症聚集。结果显示，对照组大鼠关节组织切片染色均匀，软骨结构层次清楚，细胞圆润且排列均匀，胞外胶原纤维充盈丰富，潮线清晰且连续。模型组大鼠的关节滑膜组织出现大量的炎性细胞聚集和浸润，软骨基质着色减少，软骨及滑膜均缺损严重，并且呈粉红色的胶原基质大量缺失，滑膜和软骨严重受损。植物乳杆菌ar495治疗组炎症浸润显现显著少于模型组，且软骨基质着色均匀，关节滑膜和软骨炎症损伤得到显著恢复。
37.实施例6：oa大鼠关节面micro-ct显微成像
38.长期以来，oa一直被认为是一种主要与基质降解相关的软骨疾病，其主要特征是关节软骨的退化及滑膜炎症。然而最近研究发现，软骨下骨的变化也是疾病发展的关键组成部分，如软骨下骨板骨密度降低是oa患者的重要临床表现。实验采用micro-ct测定oa动物模型中软骨下骨的形态学变化，使用同性体素尺寸为18μm的scancoμct 40扫描大鼠关节面。
39.图6是本发明的实施例6中大鼠关节面micro-ct显微成像图，图中，黑色箭头所指为关节面骨质流失区域。结果显示，对照组关节面平整光滑，无明显骨质流失区域。模型组大鼠关节面有明显的骨赘及骨缺损形成；植物乳杆菌ar495治疗组大鼠关节面平整度有所恢复，且骨质流失区域显著小于模型组。
40.实施例的作用与效果
41.本发明的上述实施例中，通过手术切除膝关节十字交叉方法建立大鼠骨关节炎模型，并评价了植物乳杆菌ar495干预对大鼠关节组织病理状况、炎症状况等指标的改善作用。结果显示，与模型组相比，ar495能够显著降低大鼠关节组织炎症标志物胶原酶mmp-13及胶原降解物ctx-ii在血清中的水平，减少了炎症因子tnf-α的表达，这对缓解oa炎症及软骨损伤具有直接效果。此外，ar495能够有效缓解oa大鼠的软骨损伤，并提高关节面骨活性，减少关节面磨损与骨质流失。综上所述，本发明提供的植物乳杆菌能够有效改善骨关节炎导致的关节损伤症状，利用该植物乳杆菌ar495可以从来制备用于改善骨关节炎的乳酸菌发酵食品，从而提高身体的健康水平。
42.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。