一种B族链球菌抗原试纸条、检测卡、试剂盒及其制备方法和检测方法与流程

一种b族链球菌抗原试纸条、检测卡、试剂盒及其制备方法和检测方法
技术领域
1.本发明属于b族链球菌检测技术领域，具体涉及一种b族链球菌抗原试纸条、检测卡、试剂盒及其制备方法和检测方法。


背景技术：

2.b族链球菌学名无乳链球菌(s.agalactiae)，因其细胞壁中的多糖物质属于抗原构造分类中的b族，故目前一般采用b族链球菌(group b streptococcus，gbs)来替代无乳链球菌原名。b族链球菌是一种革兰阳性链状球菌，成对或呈短链状排列，正常寄生于阴道和直肠，它是一种条件致病菌，可引起新生儿败血症、肺炎、脑膜炎，甚至死亡。在感染后存活的新生儿，还有可能有严重的神经系统后遗症，包括脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等。同时，b族链球菌还可引起孕妇感染、引起早产、胎儿发育不良(低体重儿)、胎膜早破及晚期流产，严重危害妊娠妇女及新生儿的健康，引起世界范围临床医生的关注。目前该菌已被认为是围产期严重感染性疾病的主要病原菌。
3.现有的b族链球菌主要检测方法有培养法、免疫学检测法、pcr法，其中培养法是确诊b族链球菌感染的金标准，缺点是检测时间较长、对培养液的要求较高，且由于阴道及肛门周围粪肠球菌等杂菌混杂，检测结果的假阳性率和假阴性率均较高；免疫学检测检测方法采用特异性抗体检查b族链球菌抗原，优点是检测迅速，但敏感性和特异性稍低，易出现假阴性结果，b族链球菌菌量较少时难以检测出来；pcr法是采用实时荧光定量pcr方法，通过设计特异性引物和探针，使b族链球菌靶基因快速准确的扩增百万倍，达到迅速、敏感检测b族链球菌的目的，虽然pcr快速诊断b族链球菌的方法比免疫学检测和细菌直接培养方法的敏感性和特异性显著提高，但价格相对昂贵。
4.综上所述，b族链球菌检测主要是关于各检测方法的灵敏度、特异性的比较，然而合适的筛查策略需要考虑多种因素，免疫层析法检测b族链球菌具有耗时短，经济、便捷等优点，且与细菌培养法诊断gbs的一致性较高，值得推广使用。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供一种b族链球菌抗原试纸条，利用免疫层析技术，可以实现对b族链球菌，同时具有耗时短，经济、便捷等优点。
6.本发明的目的之二在于提供一种b族链球菌抗原检测卡。
7.本发明的目的之三在于提供一种b族链球菌抗原检测试剂盒。
8.本发明的目的之四在于提供一种b族链球菌抗原试剂盒的制备方法。
9.本发明的目的之五在于提供一种b族链球菌抗原检测卡的检测方法，操作简单，反应快速，结果容易判读。
10.为了实现上述目的之一，本发明采用以下技术方案：
11.本发明提供一种b族链球菌抗原试纸条，包括样品垫、乳胶结合垫、硝酸纤维素膜、
吸水层、底板，所述底板的上部贴合有所述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上部两端分别贴合有所述乳胶结合垫和所述吸水层，所述乳胶结合垫上部一端贴合有所述样品垫，其特征在于，所述乳胶结合垫上固定红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素，所述硝酸纤维素膜的检测线(t)位置包被b族链球菌抗体，在质控线(c)位置包被生物素-bsa。
12.为了实现上述目的之二，本发明采用以下技术方案：
13.本发明还提供一种b族链球菌抗原检测卡，包括装有权利要求1所述试纸条的塑料外壳，其中所述塑料外壳设有加样孔和观察窗，所述加样孔在所述样品垫上方，所述观察窗在所述检测线和所述质控线上方。
14.为了实现上述目的之三，本发明采用以下技术方案：
15.本发明还提供一种b族链球菌抗原检测试剂盒，包括一种b族链球菌抗原检测卡。
16.进一步地，所述b族链球菌抗原检测试剂盒还包括样本处理液a、样本处理液b、说明书，所述样本处理液a包括亚硝酸盐，所述样本处理液b包括乙酸。
17.为了实现上述目的之四，本发明采用以下技术方案：
18.本发明还提供一种b族链球菌抗原试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
19.s1、乳胶微球的清洗和活化
20.分别量取所述红色乳胶微球和所述蓝色乳胶微球，加入mes缓冲液超声混匀，离心留沉淀，向所述沉淀中加入所述mes缓冲液复溶，超声混匀，然后分别加入nhs溶液和edc溶液，室温孵育，离心留沉淀，所述沉淀用硼砂缓冲液重悬，振荡，超声处理后即分别成活化后的所述红色乳胶微球和所述蓝色乳胶微球；
21.s2、红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物制备
22.取所述b族链球菌特异性抗体加入所述s1制备的活化后的所述红色乳胶微球中，取所述链霉亲和素加入所述s1制备的活化后的所述蓝色乳胶微球中，分别进行缓慢混匀，室温孵育，离心取沉淀，所述沉淀用含有酪蛋白的所述硼砂缓冲液重悬，即得到所述红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及所述蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素，4℃放置备用；
23.s3、乳胶结合垫的制备
24.将玻璃纤维用处理液浸泡，晾干后裁切成条式备用，在处理后的所述玻璃纤维结合垫上喷涂所述红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及所述蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物，喷涂完后烘干，即制得含所述红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及所述蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物的所述乳胶结合垫，密封干燥保存备用；
25.s4、硝酸纤维素膜的制备
26.所述硝酸纤维素膜上包被所述b族链球菌抗体和所述生物素-bsa，形成包被有所述b族链球菌抗体的检测线和包被有所述生物素-bsa质控线的所述硝酸纤维素膜；
27.s5、b族链球菌抗原试纸条的制备
28.在所述底板的中间位置粘贴所述s4中制备的所述硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜上部两端分别贴合含所述红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及所述蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物的所述乳胶结合垫和所述吸水层，所述乳胶结合垫上部另一
端贴合所述样品垫，所述硝酸纤维素膜的检测线(t)位置包被所述b族链球菌抗体，在质控线(c)位置包被所述生物素-bsa；
29.s6、试剂盒的组装
30.将所述s5中制备的所述b族链球菌抗原试纸条装进所述塑料外壳中，调整b族链球菌抗原试纸条的位置，使所述加样孔在所述样品垫上方，所述观察窗在所述检测线和所述质控线上方，与所述样本处理液a、所述样本处理液b、所述说明书分别置于盒中，得到所述b族链球菌抗原检测试剂盒。进一步地，所述s3中，喷涂完后在相对湿度不超过30％的环境中37℃烘干。
31.为了实现上述目的之五，本发明采用以下技术方案：
32.本发明还提供一种b族链球菌抗原检测卡的检测方法，用权利要求1所述的b族链球菌抗原试纸条，对待检样品进行检测，具体步骤包括：
33.s1、取生殖道分泌物拭子样本放入样本处理管中，向所述样本处理管中加入适量的的样本处理液a和b，充分混匀，得到处理后的样本液；
34.s2、将所述处理后的样本液滴加到所述试纸条的加样孔中，静置后，观察所述检测线和所述质控线；
35.s3、结果判读：所述检测线和所述质控线均显现，结果为阳性；所述检测线不显现，所述质控线显现，结果为阴性；所述检测线和所述质控线均不显现或其他现象，提示试纸失效,操作失误或试剂失效。
36.进一步地，所述s1中，取所述生殖道分泌物拭子样本放入样本处理管后，挤压所述样本处理管，并转动拭子15～20次，然后将所述拭子在所述样本处理管中静置5分钟，沿管壁挤压所述拭子使液体尽可能被挤压出来，得到所述处理后的样本液。
37.进一步地，所述s2中，静置15分钟，观察所述检测线和所述质控线。
38.本发明的检测原理：
39.检测阳性样本时，样品中的b族链球菌抗原可分别与乳胶结合垫上红色乳胶标记的b族链球菌特异性抗体结合形成复合物，并在层析作用下沿膜移动。经过检测线时与预包被的b族链球菌抗体形成夹心复合物而凝聚出现一条红色条带，乳胶结合垫上蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素则在质控线处与生物素-bsa结合而出现一条蓝色条带；检测阴性样本时，阴性样本则仅在质控线处显蓝色。因此，无论b族链球菌抗原是否存在于临床样本中，一条蓝色条带都会出现在质控线处。
40.与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
41.(1)本发明提供的一种b族链球菌抗原检测试剂盒，利用免疫层析技术，可以实现对b族链球菌的检测，同时具有耗时短，经济、便捷等优点，为临床诊断b族链球菌感染提供依据。
42.(2)本发明提供的一种b族链球菌抗原检测卡的检测方法，操作简单，反应快速，结果容易判读。
43.(3)本发明提供的一种b族链球菌抗原试剂盒的制备方法，制备方法简单，成本低廉，易于进行商业化生产。
附图说明
44.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
45.图1是用本技术实施例1提供的b族链球菌抗原试纸条的侧视结构示意图。
46.图2是用本技术实施例2提供的b族链球菌抗原检测卡的俯视结构示意图。
47.图3是用本技术实施例5提供的检测卡的检测结果判读示意图。
48.图中：1、样品垫；2、乳胶结合垫；3、硝酸纤维素膜；31、检测线；32、质控线；4、吸水层；5、底板；6、加样孔；7、观察窗；8、采样吸管；100、检测卡。
具体实施方式
49.为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下将结合实施例对本技术的技术方案进行清楚、完整的描述。应当理解此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
50.所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
51.实施例1
52.本实施例提供一种b族链球菌抗原试纸条，请参阅附图1，该b族链球菌抗原试纸条包括样品垫1、乳胶结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水层4、底板5，底板5的上部贴合有硝酸纤维素膜3，硝酸纤维素膜3上部两端分别贴合有乳胶结合垫2和吸水层4，乳胶结合垫2上部一端贴合有样品垫1，乳胶结合垫2上固定红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素，硝酸纤维素膜3依次设有包被b族链球菌抗体的检测线31和包被生物素-bsa的质控线32。
53.实施例2
54.本实施例提供一种b族链球菌抗原检测卡100，请参阅附图2，检测卡100中包括实施例1制备的b族链球菌抗原试纸条，该检测卡100还包括装有试纸条的塑料外壳，其中塑料外壳设有加样孔6和观察窗7，加样孔6在样品垫1上方，观察窗7在检测线31和质控线32上方。
55.实施例3
56.本实施例提供一种b族链球菌抗原试剂盒，请参阅附图2，将实施例2提供的b族链球菌抗原检测卡100、样本处理液a、样本处理液b和说明书装盒得到试剂盒，样本处理液a主要为2m亚硝酸盐溶液，样本处理液b主要为1m乙酸溶液。
57.实施例4
58.本实施例提供一种b族链球菌抗原试剂盒的制备方法，具体步骤如下：
59.s1、乳胶微球的清洗、活化
60.量取粒径为400nm的红色和蓝色乳胶微球，按照每100μl加入900μl的比例加入mes缓冲液(45mm，ph6.0)超声混匀，10000rpm离心20min，弃上清，留沉淀，如此操作两次，沉淀中加入900μlmes缓冲液(45mm，ph6.0)复溶，超声混匀，分别加入nhs和edc，使其终浓度为0.8mg/ml，室温孵育20min，10000rpm离心20min，弃上清，留沉淀，沉淀用20ml硼砂缓冲液
(0.1mol/l na2b4o7，所述硼砂缓冲液的ph8.5)重悬，振荡，超声处理后即成活化后的乳胶微球。
61.s2、抗体-红色乳胶微球标记物制备
62.取b族链球菌特异性抗体加入s1制备的活化后的红色乳胶微球中(终浓度为0.5μg/ml)，取链霉亲和素加入s1制备的活化后的蓝色乳胶微球中(终浓度为0.5μg/ml)，分别进行缓慢混匀，室温孵育6h，17000rpm/min离心10min，弃上清；沉淀用10ml含有0.5％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，超声后重复离心1次，去上清；沉淀用上述方法重悬，即得到红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素，4℃放置备用。
63.s3、含红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素的乳胶结合垫2的制备
64.玻璃纤维的预处理：将玻璃纤维用处理液浸泡，晾干后裁切成1.4cm*30cm的条式备用，处理液为ph8.0的tris缓冲液、0.5mg/ml的bsa、0.15％吐温20、2％蔗糖。在处理后的玻璃纤维结合垫上分别喷涂红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物，在1.4cm*30cm的条式玻璃纤维边缘只喷一条宽0.5cm和长30cm的红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物，喷涂量为都为50μl，喷涂浓度为20％，喷涂完后在相对湿度不超过30％的环境中37℃烘干，即制得含红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物的乳胶结合垫2，密封干燥保存备用。
65.s4、硝酸纤维素膜3的制备
66.所述硝酸纤维素膜3的制备方法如下：
67.硝酸纤维素膜3上包被b族链球菌抗体和生物素-bsa，形成检测线31和质控线32；b族链球菌抗体浓度为1.5mg/ml，生物素-bsa浓度为1.0mg/ml。
68.s5、b族链球菌抗原试纸条的制备
69.在底板5的中间位置粘贴s4中制备的硝酸纤维素膜3，在硝酸纤维素膜3上部两端分别贴合含红色乳胶微球标记的b族链球菌特异性抗体及蓝色乳胶微球标记的链霉亲和素标记物的乳胶结合垫2和吸水层4，乳胶结合垫2上部另一端贴合样品垫1，硝酸纤维素膜3依次设有包被b族链球菌抗体的检测线31和包被生物素-bsa的质控线32；
70.s6、试剂盒的组装
71.将s5中制备的b族链球菌抗原试纸条装进塑料外壳中，调整b族链球菌抗原试纸条的位置，使加样孔6在样品垫1上方，观察窗7在检测线31和质控线32上方，与样本处理液a，样本处理液b和说明书分别置于盒中，得到b族链球菌抗原检测试剂盒。
72.实施例5
73.本实施例提供一种b族链球菌抗原检测卡100的检测方法，具体步骤如下：
74.(1)样本采集
75.先拭去阴道过多的分泌物，采用无菌拭子插入阴道至1/3处，沿阴道壁轻轻旋转取得阴道分泌物，将采集的拭子至于无菌管中，密闭送检。
76.(2)样本处理
77.向样本处理管中加入适量的的样本处理液a和b，充分混匀；
78.放入已取样拭子，挤压样本处理管，并转动拭子15～20次，然后将拭子在样本处理
管中静置5分钟；
79.沿管壁挤压拭子使液体尽可能被挤压出来，得到样本液，然后取出、丢弃拭子。
80.(3)样本检测
81.1.从铝箔袋中取出检测卡100，编写样本号，置水平桌面；
82.2.通过采样吸管8向检测卡100加样孔6中滴入适量处理过的样本液；
83.3.在15min后，20min内判读结果,20min后检测无效。
84.(4)阳性判断值
85.b族链球菌阳性判断值为≥105cfu/ml。根据地域的不同、人群的不同，建议各检验室建立自己的参考范围，根据地域的不同、人群的不同，建议各检验室建立自己的参考范围。
86.(5)结果判断
87.请参阅图3
88.a、阴性：仅质控线32(c)处出现一条蓝色条带，在检测线31(t)处无红色条带出现。阴性结果表明：样本中不含肺炎支原体抗原或是含量低于可检范围。
89.b、阳性：质控线32(c)处出现一条蓝色条带，在检测线31(t)处出现另一条红色条带。阳性结果表明：t检测线31表示样本中含有b族链球菌抗原。
90.c、无效：质控线32(c)处未出现一条蓝色条带，表明操作过程不正确或检测卡100已损坏。
91.实验例1
92.本发明试剂盒的特异性试验
93.交叉反应：人乳头瘤病毒、白色念珠菌、阴道毛滴虫、阴道加德纳菌、沙眼衣原体、奈瑟氏淋球菌、解脲脲原体阳性样本检测，菌液浓度均为106cfu/ml，均无交叉反应。
94.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。