癌症组合疗法的制作方法

癌症组合疗法
1.本技术是申请日为2016年4月12日、申请号为201680034138.0(国际申请号为pct/us2016/027038)、名称为“癌症组合疗法”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求保护2015年4月13日申请的美国临时申请第62/146,766号；及2015年7月10日申请的美国临时申请第62/190,945号的优先权，这些申请出于任何目的各以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
4.使用结合集落刺激因子1受体(csf1r)的抗体与一种或多种免疫刺激剂的组合来治疗癌症的方法。
5.背景
6.集落刺激因子1受体(在本文中称为csf1r；在本领域中还称为fms、fim2、c-fms、m-csf受体及cd115)为具有n末端胞外域(ecd)及c末端胞内域的具有酪氨酸激酶活性的单次跨膜受体。csf1配体或介白素34配体(在本文中称为il-34；lin等人，science 320：807-11(2008))结合至csf1r引起受体二聚、csf1r蛋白质酪氨酸激酶活性上调、csf1r酪氨酸残基磷酸化及下游信号事件。csf1或il-34活化csf1r引起单核细胞及巨噬细胞以及其他单核细胞系(如破骨细胞、树突状细胞及微神经胶质细胞)输送、存活、增殖及分化。
7.已发现许多肿瘤细胞或肿瘤基质细胞会产生csf1，其通过csf1r活化单核细胞/巨噬细胞。已显示肿瘤中的csf1水平与肿瘤中的肿瘤相关巨噬细胞(tam)的水平相关。已发现较高水平的tam与大部分癌症中的较差患者预后相关。另外，已发现csf1促进肿瘤生长及进展至转移，例如小鼠中的人乳腺癌异种移植物。参见例如paulus等人，cancer res.66：4349-56(2006)。另外，csf1r在骨转移中起溶骨性骨毁坏的作用。参见例如ohno等人，mol.cancer ther.5：2634-43(2006)。tam部分地促进肿瘤生长，其通过释放免疫抑制细胞因子及表达t细胞抑制表面蛋白质来抑制抗肿瘤t细胞效应功能。因此，结合至csf1r的抗体可适用于治疗癌症的方法中。
8.一些肿瘤细胞可通过抑制免疫响应(例如通过改变免疫调节基因的表达)来至少部分地逃避免疫系统检测。举例而言，免疫刺激分子与免疫抑制分子在体内的相对浓度可调节适应性免疫响应。抑制分子相对高的表达量和/或某些刺激分子的表达减少可产生下调适应性免疫响应的检查点或开关。通过上调适应性免疫响应或刺激先天性免疫响应来抵消此作用的作用剂为潜在癌症疗法。
9.在癌症中调节免疫响应的作用剂(如免疫刺激剂)的组合疗法可增加响应的深度及持久性且还可拓宽针对对单独单一作用剂无响应的患者的功效。
10.概述
11.在一些实施方案中，提供治疗受试者的癌症的方法，包含向受试者施用抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激动剂，而在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫抑制分子
(包括共抑制分子)的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫细胞(如t细胞)上所发现的免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫细胞(如t细胞)上所发现的免疫抑制分子(包括共抑制分子)的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含涉及先天性免疫的细胞(如nk细胞)上所发现的免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含涉及先天性免疫的细胞(如nk细胞)上所发现的免疫抑制分子(包括共抑制分子)的拮抗剂。在一些实施方案中，该组合使所治疗受试者中的抗原特异性t细胞响应增强且/或增强受试者的先天性免疫响应。在一些实施方案中，相较于单独施用抗csf1r抗体或免疫刺激剂，该组合使得动物癌症模型(如异种移植模型)中的抗肿瘤响应改善。在一些实施方案中，相较于单独施用抗csf1r抗体或免疫刺激剂，该组合使得动物癌症模型(如异种移植模型)中产生协同响应。
12.在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含t细胞活化抑制剂的拮抗剂，而在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含t细胞活化刺激剂的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含ctla4、lag-3、半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd25、cd69、tigit、cd113、gpr56、vista、b7-h3、b7-h4、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim1、tim3、tim4、ilt4、il-6、il-10、tgfβ、vegf、kir、lag-3、腺苷a2a受体、pi3kδ或ido的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd27、cd40、cd40l、dr3、cd28h、il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、ifnα、sting的激动剂，或toll样受体激动剂，如tlr2/4激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至膜结合蛋白质b7家族成员(如b7-1、b7-2、b7-h2(icos-l)、b7-h3、b7-h4、b7-h5(vista)及b7-h6)的作用剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至tnf受体家族成员的作用剂或结合至tnf受体家族成员(如cd40、cd40l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27l、cd30、cd30l、4-1bbl、cd137(4-1bb)、trail/apo2-l、trailr1/dr4、trailr2/dr5、trailr3、trailr4、opg、rank、rankl、tweakr/fn14、tweak、baffr、edar、xedar、eda1、eda2、taci、april、bcma、ltβr、light、der3、hvem、vegl/tl1a、tramp/dr3、tnfr1、tnfβ、tnfr2、tnfα、1β2、fas、fasl、relt、dr6、troy或ngfβ)的共刺激或共抑制分子。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含拮抗或抑制细胞因子的作用剂，该细胞因子抑制t细胞活化，如il-6、il-10、tgfβ、vegf。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含趋化因子拮抗剂，如cxcr2、cxcr4、ccr2或ccr4。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含刺激t细胞活化的细胞因子(如il-2、il-7、il-12、il-15、il-21及ifnα)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含抗体。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂可包含疫苗，如间皮素靶向疫苗或减毒的李斯特菌(listeria)癌症疫苗，如crs-207。上述拮抗剂、激动剂及结合剂中的任何一种或多种可与本文所述的抗csf1r抗体中的任何一种或多种组合。
13.在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含cd40激动剂，任选与上列至少一种其他免疫刺激剂组合。在一些实施方案中，cd40激动剂为抗体。在一些实施方案中，cd40激动剂为抗cd40抗体。在一些实施方案中，抗cd40抗体包含选自cp-870,893；达西珠单抗(dacetuzumab)；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4的抗体中的cdr。在一些实施方案中，抗cd40抗体包含选自cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；
及chi lob 7/4的抗体的重链及轻链可变区。在一些实施方案中，抗cd40抗体为选自cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4的抗体。在一些实施方案中，cd40激动剂为重组cd40l。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含cd40激动剂及至少一种选自上述那些任一种的其他免疫刺激剂。举例而言，上述免疫刺激剂中的任何一种或多种可与本文所述的抗csf1r抗体中的任何一种或多种组合以及与cd40激动剂(如cd40激动剂抗体)或重组cd40l(如上述抗cd40抗体中的任一种)组合。
14.在一些实施方案中，同时或顺序施用抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，同时施用抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，施用抗csf1r抗体之前，施用一次或多次剂量的至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，施用抗csf1r抗体之前，受试者接受至少一种免疫刺激剂的全过程疗法。在一些实施方案中，抗csf1r抗体在第二次治疗过程中联合至少一种免疫刺激剂施用。在一些实施方案中，施用抗csf1r抗体之前，受试者接受至少一次、至少两次、至少三次或至少四次剂量的至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，至少一次剂量的至少一种免疫刺激剂与抗csf1r抑制剂同时施用。在一些实施方案中，施用至少一种免疫刺激剂之前，施用一次或多次剂量的抗csf1r抗体。在一些实施方案中，施用至少一种免疫刺激剂之前，受试者接受至少两次、至少三次或至少四次剂量的抗csf1r抗体。在一些实施方案中，至少一次剂量的抗csf1r抗体与至少一种免疫刺激剂同时施用。
15.在一些实施方案中，癌症选自非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、膀胱癌、子宫内膜癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、骨癌、皮肤癌、子宫癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(stomach cancer)、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、前列腺癌、间皮瘤及肾癌。在一些实施方案中，在选自手术、化疗、放疗或其组合的疗法之后，癌症复发或进展。
16.在一些实施方案中，提供包含抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂的组合物。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含t细胞活化抑制剂的拮抗剂，而在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含t细胞活化刺激剂的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含ctla4、lag-3、半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd25、cd69、tigit、cd113、gpr56、vista、b7-h3、b7-h4、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim1、tim3、tim4、ilt4、il-6、il-10、tgfβ、vegf、kir、lag-3、腺苷a2a受体、pi3kδ或ido的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd27、cd40、cd40l、dr3、cd28h、il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、ifnα、sting的激动剂，或toll样受体激动剂，如tlr2/4激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至膜结合蛋白质b7家族成员(如b7-1、b7-2、b7-h2(icos-l)、b7-h3、b7-h4、b7-h5(vista)及b7-h6)的作用剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至tnf受体家族成员的作用剂或结合至tnf受体家族成员(如cd40、cd40l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27l、cd30、cd30l、4-1bbl、cd137(4-1bb)、trail/apo2-l、trailr1/dr4、trailr2/dr5、trailr3、trailr4、opg、rank、rankl、tweakr/fn14、tweak、baffr、edar、xedar、eda1、eda2、taci、april、bcma、ltβr、light、der3、hvem、vegl/tl1a、tramp/dr3、tnfr1、tnfβ、tnfr2、tnfα、1β2、fas、fasl、relt、dr6、troy或ngfβ)的共刺激或共抑制分子。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含拮抗或抑制细胞因子的作用剂，该细胞因子
抑制t细胞活化，如il-6、il-10、tgfβ、vegf。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含刺激t细胞活化的细胞因子(如il-2、il-7、il-12、il-15、il-21及ifnα)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含趋化因子拮抗剂，如cxcr2、cxcr4、ccr2或ccr4。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含抗体。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂可包含疫苗，如间皮素靶向疫苗或减毒的李斯特菌癌症疫苗，如crs-207。
17.在一些实施方案中，组合物包含上述拮抗剂、激动剂及结合剂中的任何一种或多种与本文所述的抗csf1r抗体中的任何一种或多种的组合。组合物可包括存在于单独的容器或隔室中的多种治疗剂，或者可包括混合在一起的两种或多种治疗剂。
18.在一些实施方案中，组合物包含抗csf1r抗体及cd40激动剂，任选与上列至少一种其他免疫刺激剂。在一些实施方案中，cd40激动剂为抗cd40抗体。在一些实施方案中，抗cd40抗体包含选自cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4的抗体中的cdr。在一些实施方案中，抗cd40抗体包含选自cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4的抗体的重链及轻链可变区。在一些实施方案中，抗cd40抗体为选自cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4的抗体。在一些实施方案中，cd40激动剂为重组cd40l。在一些实施方案中，组合物包含上述免疫刺激剂中的任何一种或多种与本文所述的抗csf1r抗体中的任何一种或多种的组合以及与cd40激动剂(如cd40激动剂抗体)或重组cd40l(如上述抗cd40抗体中的任一种)的组合。组合物可包括存在于单独的容器或隔室中的多种治疗剂，或者可包括混合在一起的两种或多种治疗剂。
19.在本文所述的组合物或方法中的任一者中，抗csf1r抗体的抗体重链和/或抗体轻链可具有下文所述的结构。
20.在本文所述的组合物或方法中的任一者中，抗csf1r抗体重链可包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列。在本文所述的任一种方法中，抗csf1r抗体轻链可包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列。在本文所述的组合物或方法中的任一者中，抗csf1r抗体重链可包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列，且抗csf1r抗体轻链可包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列。
21.在本文所述的组合物或方法中的任一者中，抗csf1r抗体hc cdr1、hc cdr2及hc cdr3可包含选自以下的序列组：(a)seq id no：15、16及17；(b)seq id no：21、22及23；以及(c)seq id no：27、28及29。在本文所述的组合物或方法中的任一者中，抗csf1r抗体lc cdr1、lc cdr2及lc cdr3可包含选自以下的序列组：(a)seq id no：18、19及20；(b)seq id no：24、25及26；以及(c)seq id no：30、31及32。
22.在本文所述的组合物或方法中的任一者中，抗-csf1r抗体重链可包含hc cdr1、hc cdr2及hc cdr3，其中hc cdr1、hc cdr2及hc cdr3包含选自以下的序列组：(a)seq id no：15、16及17；(b)seq id no：21、22及23；以及(c)seq id no：27、28及29；且轻链可包含lc cdr1、lc cdr2及lc cdr3，其中lc cdr1、lc cdr2及lc cdr3包含选自以下的序列组：(a)seq id no：18、19及20：(b)seq id no：24、25及26；以及(c)seq id no：30、31及32。
23.在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可包含：(a)包含与seq id no：9至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：10至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(b)包含与seq id no：11至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：12至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(c)包含与seq id no：13至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：14至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(d)包含与seq id no：39至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：46至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(e)包含与seq id no：40至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：46至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(f)包含与seq id no：41至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：46至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(g)包含与seq id no：39至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：47至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(h)包含与seq id no：40至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：47至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(i)包含与seq id no：41至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：47至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；及(j)包含与seq id no：42至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：48至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(k)包含与seq id no：42至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：49至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(1)包含与seq id no：42至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：50至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(m)包含与seq id no：43至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：48至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(n)包含与seq id no：43至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：49至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(o)包含与seq id no：43至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：50至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(p)包含与seq id no：44至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：51至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(q)包含与seq id no：44至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：52至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；(r)包含与seq id no：45至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：51至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链；或(s)包含与seq id no：45至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的重链及包含与seq id no：52至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列的轻链。
24.在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可包含：(a)包含以下的重链：具有序列seq id no：15的重链(hc)cdr1、具有序列seq id no：16的hc cdr2及具有序列
seq id no：17的hc cdr3，以及包含以下的轻链：具有序列seq id no：18的轻链(lc)cdr1、具有序列seq id no：19的lc cdr2及具有序列seq id no：20的lc cdr3；(b)包含以下的重链：具有序列seq id no：21的重链(hc)cdr1、具有序列seq id no：22的hc cdr2及具有序列seq id no：23的hc cdr3，以及包含以下的轻链：具有序列seq id no：24的轻链(lc)cdr1、具有序列seq id no：25的lc cdr2及具有序列seq id no：26的lc cdr3；或(c)包含以下的重链：具有序列seq id no：27的重链(hc)cdr1、具有序列seq id no：28的hc cdr2及具有序列seq id no：29的hc cdr3，以及包含以下的轻链：具有序列seq id no：30的轻链(lc)cdr1、具有序列seq id no：31的lc cdr2及具有序列seq id no：32的lc cdr3。
25.在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可包含：(a)包含序列seq id no：53的重链及包含序列seq id no：60的轻链；(b)包含序列seq id no：53的重链及包含序列seq id no：61的轻链；或(c)包含序列seq id no：58的重链及包含序列seq id no：65的轻链。在一些实施方案中，抗体包含重链及轻链，其中抗体包含：(a)由序列seq id no：53组成的重链及由序列seq id no：60组成的轻链；(b)由序列seq id no：53组成的重链及由序列seq id no：61组成的轻链；或(c)由序列seq id no：58组成的重链及由序列seq id no：65组成的轻链。
26.在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可为人源化抗体。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可选自fab、fv、scfv、fab'及(fab')2。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可为嵌合抗体。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可选自iga、igg及igd。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可为igg。在本文所述的任何方法中，抗体可为igg1或igg2。
27.在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可结合至人csf1r和/或结合至食蟹猴csf1r。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可阻断配体与csf1r的结合。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可阻断csf1和/或il-34与csf1r的结合。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可阻断csf1与il-34与csf1r的结合。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可抑制配体诱导的csf1r磷酸化。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可抑制csf1-和/或il-34诱导csf1r磷酸化。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体可以小于1nm的亲和力(kd)结合至人csf1r。在本文所述的组合物或方法的任一者中，抗csf1r抗体在csf1或il-34存在下可抑制单核细胞增殖和/或存活响应。
28.附图简述
29.图1a-图1c显示人源化抗体huab1至huab16中每一者的人源化重链可变区的比对，如实施例1中所述。加框残基为人受体序列中变回相应小鼠残基的氨基酸。
30.图2a-图2c显示人源化抗体huab1至huab16中每一者的人源化轻链可变区的比对，如实施例1中所述。加框氨基酸为人受体序列中变回相应小鼠残基的残基。
31.图3显示抗csf1r抗体与抗cd40抗体的组合，其在mc38肿瘤小鼠模型中展现的肿瘤生长抑制作用大于任一种单独疗法。
32.图4a-图4b显示个别小鼠在第11天(图4a)及第13天(图4b)的肿瘤体积。抗csf1r抗体与抗cd40抗体的组合在两个时间点的表现显著好于任一种单独疗法。
33.图5显示研究中所用的小鼠的体重。
34.发明详述
35.肿瘤相关巨噬细胞(tam)牵涉于许多癌症的发病机制，且与不良预后相关。tam可经由多种机制抑制抗肿瘤响应。tam表达抗炎性细胞因子，如tgfβ及il-10，这些抗炎性细胞因子的作用以抑制瘤内树突状细胞刺激细胞毒性t细胞响应的能力(ruffell等人，2014,cancer cell)。tam还表达使免疫抑制性调节t细胞募集至肿瘤中的趋化因子(curiel等人，2004,nature med.；mizukami等人，2008,int.j.cancer)，此外，tam表达t细胞抑制剂受体pd-1及ctla-4的配体，其用于直接抑制t细胞活化及功能。抑制csf1r可减少小鼠模型及人肿瘤中的免疫抑制tam。参见例如ries等人，2014,cancer cell,25：846-859；pyontech等人，2013,nature med.,19：1264-1272；及zhu等人，2014,cancer res.,74：5057-5069。与通过减少免疫抑制而起作用的csf1r阻断相比，免疫刺激剂通过刺激免疫响应来起作用。
36.本文中所用的章节标题仅出于组织目的而不应视为限制所述主题。
37.定义
38.除非另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语将具有本领域的技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
39.结合重组dna、寡核苷酸合成、组织培养及转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应及纯化技术使用的例示性技术为本领域中已知。许多这样的技术及方法尤其描述于例如sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual(第2版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.(1989))中。另外，本领域中还已知用于化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送以及患者治疗的例示性技术。
40.在本技术中，除非另有陈述，否则“或”的使用意为“和/或”。在多个从属权利要求的上下文中，“或”的使用仅以替代方式重新提及超过一个前述独立权利要求或附属权利要求。此外，除非另外具体规定，否则如“元件”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的元件与组分以及包含超过一个子单元的元件与组分。
41.除非另外规定，否则如根据本发明使用的以下术语应理解为具有以下含义：
42.术语“核酸分子”及“多核苷酸”可互换使用，且指核苷酸的聚合物。这样的核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括但不限于dna、rna及pna。“核酸序列”指构成核酸分子或多核苷酸的线性核苷酸序列。
43.术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用且指氨基酸残基聚合物，且不限于最小长度。这样的氨基酸残基聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚物、三聚物及多聚物。全长蛋白质与其片段都涵盖于定义中。术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化及其类似修饰。此外，出于本发明的目的，“多肽”指天然序列包括修饰(如缺失、添加及取代(通常天然是保守的))的蛋白质，只要该蛋白质保持所要活性。这些修饰可为有意的，如经由定点突变诱发；或可为偶然的，如经由产生蛋白质的宿主的突变或因pcr扩增所致的错误。
44.术语“csf1r”在本文中指全长csf1r，其包括n末端ecd、跨膜域及胞内酪氨酸激酶域，具有或不具有n末端前导序列。在一些实施方案中，csf1r为具有氨基酸序列seq id no：1或seq id no：2的人csf1r。
45.如本文所用，术语“免疫刺激剂”指通过充当免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激
动剂或充当免疫抑制分子(包括共抑制分子)的拮抗剂来刺激免疫系统的分子。免疫刺激剂可为生物制剂，如抗体或抗体片段、其他蛋白质或疫苗，或可为小分子药物。“免疫刺激分子”包括作用以增强、刺激、诱导或以其他方式“开启”免疫响应的受体或配体。如本文所定义的免疫刺激分子包括共刺激分子。“免疫抑制分子”包括作用以减少、抑制、抑止或以其他方式“关闭”免疫响应的受体或配体。如本文所定义的免疫抑制分子包括共抑制分子。这样的免疫刺激及免疫抑制分子可为例如免疫细胞(如t细胞)上所发现或涉及先天免疫的细胞(如nk细胞)上所发现的受体或配体。
46.术语“b细胞表面抗原cd40”及“cd40”本文中指全长cd40，其包括n末端ecd、跨膜域及胞内域，具有或不具有n末端前导序列。在一些实施方案中，cd40为具有氨基酸序列seq id no：96(前体，具有信号序列)或seq id no：97(成熟，无信号序列)的人cd40。
47.术语“cd40激动剂”指与cd40相互作用且增强cd40活性的部分。非限制性例示性cd40活性包括经由cd40进行信号传导、增强抗原呈递活性、诱导促炎性细胞因子及诱导杀肿瘤活性。在一些实施方案中，cd40激动剂为抗cd40抗体。
48.术语“抗cd40抗体”指特异性结合至cd40的抗体。除非另有特定说明，否则如本文所用，术语“抗cd40抗体”指抗cd40激动剂抗体。
49.提及抗csf1r抗体时，术语“阻断配体(如csf1和/或il-34)的结合及其语法变化形式”用于指抑制csf1r与csf1r配体(如csf1和/或il-34)之间相互作用的能力。这样的抑制可经由任何机制发生，包括直接干扰配体结合(例如由于csf1r上的重叠结合位点)，和/或改变配体亲和力的抗体所诱导的csf1r构形变化等。称为“功能性”的抗体及抗体片段特征为具有这样的特性。
50.如本文所用，术语“抗体”指包含重链的至少互补决定区(cdr)1、cdr2及cdr3及轻链的至少cdr1、cdr2及cdr3的分子，其中该分子能够结合至抗原。术语抗体包括但不限于能够结合抗原的片段，如fv、单链fv(scfv)、fab、fab'及(fab')2。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体及多种物种的抗体，如小鼠、人、食蟹猴等。
51.在一些实施方案中，抗体包含重链可变区及轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含至少一个包含重链可变区及重链恒定区至少一部分的重链，及至少一个包含轻链可变区及轻链恒定区至少一部分的轻链。在一些实施方案中，抗体包含两个重链，其中各重链包含重链可变区及重链恒定区的至少一部分，及两个轻链，其中各轻链包含轻链可变区及轻链恒定区的至少一部分。如本文所使用，单链fv(scfv)或包含例如单一多肽链(包含全部六个cdr(三个重链cdr及三个轻链cdr))的任何其他抗体视为具有重链及轻链。在一些这样的实施方案中，重链为包含三个重链cdr的抗体区域且轻链为包含三个轻链cdr的抗体区域。
52.如本文所用，术语“重链可变区”指包含重链cdr1、框架(fr)2、cdr2、fr3及cdr3的区域。在一些实施方案中，重链可变区还包含fr1的至少一部分和/或fr4的至少一部分。在一些实施方案中，重链cdr1对应于kabat残基26至35；重链cdr2对应于kabat残基50至65；且重链cdr3对应于kabat残基95至102。参见例如kabat sequences of proteins of immunological interest(1987及1991,nih,bethesda,md.)；及图1。在一些实施方案中，重链cdr1对应于kabat残基31至35；重链cdr2对应于kabat残基50至65；且重链cdr3对应于kabat残基95至102。参见上文。
53.如本文所用，术语“重链恒定区”指包含至少三个重链恒定域c
h1
、c
h2
及c
h3
的区。非
限制性例示性重链恒定区包括γ、δ及α。非限制性例示性重链恒定区还包括ε及μ。各重链恒定区对应于抗体同型。举例而言，包含γ恒定区的抗体为igg抗体，包含δ恒定区的抗体为igd抗体且包含α恒定区的抗体为iga抗体。另外，包含μ恒定区的抗体为igm抗体且包含ε恒定区的抗体为ige抗体。特定同型可进一步细分为子类。举例而言，igg抗体包括但不限于igg1(包含γ1恒定区)、igg2(包含γ2恒定区)、igg3(包含γ3恒定区)及igg4(包含γ4恒定区)抗体；iga抗体包括但不限于iga1(包含α1恒定区)及iga2(包含α2恒定区)抗体；且igm抗体包括但不限于igm1及igm2。
54.在一些实施方案中，重链恒定区包含一个或多个赋予抗体所要特征的突变(或取代)、添加或缺失。非限制性例示性突变为igg4铰链区中的s241p突变(恒定域ch1与ch2之间)，其使igg4基序cpscp变成cppcp，其类似于igg1中的相应基序。在一些实施方案中，该突变产生更稳定的igg4抗体。参见例如angal等人，mol.immunol.30：105-108(1993)；bloom等人，prot.sci.6：407-415(1997)；schuurman等人，mol.immunol.38：1-8(2001)。
55.如本文所用，术语“重链”指至少包含重链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长重链”指包含重链可变区及重链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。
56.如本文所用，术语“轻链可变区”指包含轻链cdr1、框架(fr)2、cdr2、fr3及cdr3的区域。在一些实施方案中，轻链可变区还包含fri和/或fr4。在一些实施方案中，轻链cdr1对应于kabat残基24至34；轻链cdr2对应于kabat残基50至56；且轻链cdr3对应于kabat残基89至97。参见例如kabat sequences of proteins of immunological interest(1987及1991,nih,bethesda,md.)；及图1。
57.如本文所用，术语“轻链恒定区”指包含轻链恒定域c
l
的区域。非限制性例示性轻链恒定区包括λ及κ。
58.如本文所用，术语“轻链”指至少包含轻链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长轻链”指包含轻链可变区及轻链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。
59.如本文所用，“嵌合抗体”指包含至少一个来自第一物种(如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的可变区及至少一个来自第二物种(如人、食蟹猴等)的恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区及至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区及至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个大鼠可变区及至少一个小鼠恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的全部可变区来自第一物种且嵌合抗体的全部恒定区来自第二物种。
60.如本文所用，“人源化抗体”指非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸替换为来自人可变区的相应氨基酸的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体为fab、scfv、(fab')2等。
61.如本文所用，“cdr移植抗体”指第一(非人)物种的互补决定区(cdr)已移植至第二(人)物种的框架区(fr)上的人源化抗体。
62.如本文所用，“人抗体”指在人体中产生的抗体；非人动物中产生的包含人免疫球蛋白基因的抗体，如及使用体外方法(如噬菌体展示)选择的抗体，其中抗体文库基于人免疫球蛋白序列。
63.术语“前导序列”指位于多肽n末端的氨基酸残基序列，其促进哺乳动物细胞分泌多肽。当自哺乳动物细胞输出多肽时，前导序列可裂解形成成熟蛋白质。前导序列可为天然或合成的，且其可与其所连接的蛋白质异源或同源。例示性前导序列包括但不限于抗体前导序列，如氨基酸序列seq id no：3及4，其分别对应于人轻链及重链前导序列。非限制性例示性前导序列还包括来自异源蛋白质之前导序列。在一些实施方案中，抗体不具有前导序列。在一些实施方案中，抗体包含至少一个前导序列，其可选自天然抗体前导序列及异源前导序列。
64.术语“载体”用于描述这样一种多核苷酸，其可经工程化以含有可在宿主细胞中繁殖的一个或多个克隆的多核苷酸。载体可包括以下元件中的一种或多种：复制起点、一个或多个调节感兴趣多肽的表达的调节序列(如启动子和/或增强子)，和/或一个或多个可选标记基因(如抗生素抗性基因及可用于比色分析法中的基因，例如β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达感兴趣多肽的载体。
[0065]“宿主细胞”指可为或已成为载体或经分离多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。例示性真核细胞包括哺乳动物细胞，如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性例示性哺乳动物细胞包括但不限于nso细胞、per.细胞(crucell)以及293及cho细胞，及其衍生物，分别如293-6e及dg44细胞。
[0066]
如本文所用，术语“分离的”指已与自然界中通常存在的至少一些组分分离的分子。举例而言，当多肽与产生多肽的细胞的至少一些组分分离时，该多肽称为“分离的”。若多肽在表达后由细胞分泌，则使含有多肽的上清与产生其的细胞在实体上分离视为“分离”多肽。类似地，当多核苷酸不为较大多核苷酸(如基因组dna或粒线体dna，在dna多核苷酸的情况下)(其通常发现于自然界中)的一部分或与产生其的细胞中的至少一些组分分离(例如在rna多核苷酸的情况下)时，称多核苷酸为“分离的”。因此，宿主细胞内的载体中所含的dna多核苷酸可称为“分离的”，只要自然界中该多核苷酸不存在于该载体中。
[0067]
术语“升高的水平”意为受试者的特定组织中的蛋白质水平高于对照组(如未罹患癌症或本文所述的其他病况的受试者)中的相同组织。升高的水平可为任何机制的结果，如蛋白质的表达增加、稳定性提高、降解减少、分泌增加、清除率降低等。
[0068]
术语“降低”或“减少”意为使受试者的特定组织中的蛋白质水平降低至少10％。在一些实施方案中，作用剂(如结合csf1r的抗体)使受试者的特定组织中的蛋白质水平降低至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。在一些实施方案中，蛋白质水平相对于与作用剂(如结合csf1r的抗体)接触之前的蛋白质水平减少。
[0069]
当在针对治疗剂的抗性的情形下使用时，术语“抗性”意为相对于受试者过去对标准剂量的治疗剂的响应或相对于患有类似病症的类似受试者对标准剂量的治疗剂的预期响应，对标准剂量的治疗剂的响应降低或缺乏响应。因此，在一些实施方案中，尽管受试者先前并未经治疗剂给药，但受试者可对治疗剂具有抗性，或受试者在一种或多种前述场合对作用剂产生响应后可对治疗剂产生抗性。
[0070]
术语“受试者”及“患者”在本文中可互换地用于指人。在一些实施方案中，还提供治疗其他哺乳动物(包括但不限于啮齿动物、猿类、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动
物、猪科动物、绵羊、山羊、实验室哺乳动物、农用哺乳动物、运动型哺乳动物及哺乳宠物)的方法。
[0071]
如本文所用，术语“样品”指获自或来源于含有细胞和/或其他分子实体的受试者的组合物，该细胞和/或其他分子实体例如基于物理、生物化学、化学和/或生理特征表征、定量和/或鉴别。例示性样品为组织样品。
[0072]
术语“组织样品”指获自受试者组织的类似细胞的统称。组织样品来源可为来自新鲜、冷冻和/或防腐器官或组织样品或活检或抽出物的实体组织；血液或任何血液组分；体液，如大脑脊髓液、羊膜液、腹膜液、滑液或间质液；受试者妊娠或发育的任何时间的细胞。在一些实施方案中，组织样品为滑膜活检组织样品和/或滑液样品。在一些实施方案中，组织样品为滑液样品。组织样品还可为原代或经培养细胞或细胞系。任选地，组织样品获自疾病组织/器官。组织样品可含有自然界中不与组织天然互混的化合物，如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素或其类似物。如本文所用，“对照样品”或“对照组织”指获自已知来源的样品、细胞或组织，或确信未罹患受试者所治疗的疾病的样品、细胞或组织。
[0073]
出于本文的目的，组织样品“切片”意为组织样品的一部分或块，如自实体组织样品切下的组织或细胞的薄片。
[0074]
本文所用的术语“癌症”指展现增殖及生长程度异常高的细胞群。癌症可为良性(还称为良性肿瘤)、恶化前或恶性。癌细胞可为实体癌细胞或白血病癌细胞。本文所用的术语“癌症生长”指包含癌症的细胞增殖或生长，其导致癌症尺寸或程度相应提高。
[0075]
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病。更具体地，这样的癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睪丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤及多种类型的头颈癌(包括头颈部的鳞状细胞癌)。
[0076]
术语“复发性癌症”指癌症在先前治疗方案之后(随后存在癌症检测不到的一段时间)恢复。
[0077]
术语“渐进性癌症”为自治疗方案开始，尺寸增加或肿瘤扩散的癌症。在某些实施方案中，渐进性癌症为自治疗方案开始，尺寸增加或肿瘤扩散至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％的癌症。
[0078]“化疗剂”为适用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括但不限于烷基化剂，如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰氨，包括六甲蜜胺(altretamine)、他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)及三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(具体而言，布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康(topotecan))；苔藓虫素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；cc-1065(包括其合成类
似物阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin))；念珠藻环肽(cryptophycins)(具体言的，念珠藻环肽1及念珠藻环肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189及cb1-tm1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺、氧化二氯甲二乙氨盐酸盐、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1i及卡奇霉素ωi1(参见例如agnew,chem intl.ed.engl.,33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素a；双膦酸盐，如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(阿克拉霉素)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素c、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素d、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-侧氧基-l-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉基-多柔比星、氰基吗啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)(如丝裂霉素c)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨喋呤及5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如迪诺特宁(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉宾(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫米嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如卡鲁睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯(testolactone)；抗肾上腺药物，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐氨(defofamine)；秋水仙氨(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁
(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；蘑菇多糖(lentinan)；罗尼达宁(lonidainine)；类美登素(maytansinoids)，如美登素(maytansine)及氨沙托辛(ansamitocins)；丙脒腺(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比达摩(mopidanmol)；硝拉维林(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(jhs natural products,eugene,or)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚氨醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙氨；单端孢霉烯(trichothecenes)(具体而言，t-2毒素、弗纳库林a(verracurin a)、杆孢菌素a(roridin a)及氨癸叮(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)、环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇，例如紫杉醇(bristol-myers squibb oncology,princeton,n.j.)、紫杉醇的不含十六醇聚氧乙烯醚且经白蛋白工程化的奈米粒子配制物(american pharmaceutical partners,schaumberg,illinois)，及多西他赛(doxetaxel)(-poulenc rorer,antony,france)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)及卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；诺凡特龙(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；伊立替康(irinotecan)(camptosar,cpt-11)(包括伊立替康与5-fu及甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄素，如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；康柏斯达汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(lv)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(folfox)；pkc-α、raf、h-ras的抑制剂、egfr抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib))及减少细胞增殖的vegf-a抑制剂，以及上述任一种的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
[0079]
其他非限制性例示性化疗剂包括调节或抑制对癌症的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素及选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷诺昔酚(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺腺体中的雌激素产生，如4(5)-咪唑、氨格鲁米特(aminoglutethimide)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)及阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素，如氟他胺(flutamide)、尼鲁胺
(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，具体而言，抑制异常细胞增殖中所牵涉的信号传导路径中的基因表达的，如pkc-α、raf及h-ras；核糖核酸酶，如vegf表达抑制剂(例如核糖核酸酶)及her2表达抑制剂；疫苗，如基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗及疫苗；ril-2；1型拓扑异构酶抑制剂；rmrh；及上述任一种的药物上可接受的盐、酸或衍生物。
[0080]“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”指直接或间接抑制血管生成、血小管生成或非所要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸(包括例如抑制rna(rnai或sirna))、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白质、抗体或其偶联物或融合蛋白。应理解，抗血管生成剂包括结合及阻断血管生成因子或其受体的血管生成活性的那些作用剂。举例而言，抗血管生成剂为血管生成剂的抗体或其他拮抗剂，例如vegf-a的抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab))或vegf-a受体的抗体(例如kdr受体或flt-1受体)、抗pdgfr抑制剂，如(甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate))、阻断vegf受体信号传导的小分子(例如ptk787/zk2284、su6668、/su11248(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、amg706或例如国际专利申请wo 2004/113304中所述的那些物。抗血管生成剂还包括天然血管生成抑制剂，例如血管生长抑素、内皮生长抑素等。参见例如klagsbrun及d'amore(1991)annu.rev.physiol.53：217-39；streit及detmar(2003)oncogene 22：3172-3179(例如表3列举恶性黑色素瘤的抗血管生成疗法)；ferrara及alitalo(1999)nature medicine 5(12)：1359-1364；tonini等人(2003)oncogene 22：6549-6556(例如表2列举已知抗血管生成因子)；及sato(2003)int.j.clin.oncol.8：200-206(例如表1列举临床试验中所用的抗血管生成剂)。
[0081]
如本文所用，“生长抑制剂”指体外或体内抑制细胞(如表达vegf的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可为显著降低s期细胞(如表达vegf的细胞)百分比的作用剂。生长抑制剂的实例包括但不限于阻断细胞周期进程(除s期以外之处)的作用剂，如诱发g1停滞及m期停滞的作用剂。经典m期阻断剂包括长春花(长春新碱及长春碱)、紫杉烷及ii型拓扑异构酶抑制剂，如多柔比星、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷及博莱霉素。阻滞g1的那些作用剂还深入到s期阻滞，例如dna烷基化剂，如他莫西芬、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪、甲基二(氯乙基)氨、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶及阿糖胞苷。其他信息可见于mendelsohn及israel编，the molecular basis of cancer，第1章，标题为"cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"murakami等人(w.b.saunders,philadelphia,1995)，例如第13页。紫杉烷(紫杉醇及多西他赛)为来源于紫杉树的抗癌药物。来源于欧洲紫杉的多西他赛(rhone-poulenc rorer)为紫杉醇(bristol-myers squibb)的半合成类似物。紫杉醇及多西他赛促进微管蛋白二聚物组装成微管且通过防止解聚合而稳定微管，从而抑制细胞中的有丝分裂。
[0082]
术语“抗肿瘤组合物”指适用于治疗癌症的包含至少一种活性治疗剂的组合物。治疗剂的实例包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、用于辐射疗法的作用剂、
抗血管生成剂、癌症免疫治疗剂、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂及治疗癌症的其他作用剂，如抗her-2抗体、抗cd20抗体、表皮生长因子受体(egfr)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、her1/egfr抑制剂(例如埃罗替尼血小板源生长因子抑制剂(例如(甲磺酸伊马替尼))、cox-2抑制剂(例如塞内昔布(celecoxib))、干扰素、ctla4抑制剂(例如抗ctla抗体伊匹单抗(ipilimumab))tim3抑制剂(例如抗tim3抗体)、细胞因子、结合至以下标靶中的一种或多种的拮抗剂(例如中和抗体)：erbb2、erbb3、erbb4、pdgfr-β、blys、april、bcma、ctla4、tim3或vegf受体、trail/apo2，及其他生物活性及有机化学剂等。本发明还包括其组合。
[0083]
当作用剂中和、阻断、抑制、消除、降低和/或干扰因子活性时，表示该作用剂可“拮抗”因子活性，包括当因子为配体时，该作用剂可结合至一种或多种受体。
[0084]
如本文所用，“治疗”指治疗性处理与预防性或防治性措施，其中目标为预防或减缓(减轻)靶向病理性病况或病症。在某些实施方案中，术语“治疗”涵盖针对哺乳动物(包括人)疾病的治疗剂的任何施用或应用，且包括抑制或减缓疾病或疾病进展；部分或完全缓解疾病，例如通过引起消退，或恢复或修补损失、遗失或有缺陷的功能；刺激低效过程；或促使疾病稳定期时的严重程度降低。术语“治疗”还包括降低任何表型特征的严重程度和/或降低彼特征的发生率、程度或可能性。需要治疗者包括已患该病症者以及倾向于患该病症者；或预防该病症者。
[0085]
术语“有效量”或“治疗有效量”指有效治疗受试者的疾病或病症的药物的量。在某些实施方案中，有效量指以必需的剂量及时间段有效实现所要治疗或预防结果的量。本发明的抗csf1r抗体和/或免疫刺激剂的治疗有效量可根据如以下因素改变：受试者的疾病况态、年龄、性别及体重，及该或这些抗体诱发受试者出现所要响应的能力。治疗有效量涵盖抗体的治疗有益作用超过任何毒性或有害作用的量。在一些实施方案中，表述“有效量”指抗体有效治疗癌症的量。
[0086]“预防有效量”指以必要的剂量及时间段有效实现所要预防结果的量。通常但并非必需，因为在疾病之前或在疾病早期，在受试者中使用预防剂量，所以预防有效量将低于治疗有效量。
[0087]
与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括同时(并行)及以任何顺序连续(顺序)施用。
[0088]“药物上可接受的载剂”指本领域中已知的无毒固体、半固体或液体填补剂、稀释剂、囊封材料、配制助剂或载剂，其联合治疗剂使用，一起构成“药物组合物”施用受试者。药物上可接受的载剂在所用剂量及浓度下对接受者无毒且与配制物的其他成分相容。药物上可接受的载剂适于所用的配制物。举例而言，若治疗剂口服施用，则载剂可为凝胶胶囊。若治疗剂皮下施用，则理想的是，载剂对皮肤无刺激性且不引起注射部位反应。
[0089]
抗csf1r抗体
[0090]
抗csf1r抗体包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体及本文所述的包含重链和/或轻链cdr的抗体。
[0091]
例示性人源化抗体
[0092]
在一些实施方案中，提供结合csf1r的人源化抗体。人源化抗体用作治疗分子，因
为人源化抗体减轻或消除对非人抗体的人免疫响应(如人抗小鼠抗体(hama)响应)，其可导致对抗体治疗产生免疫响应，且降低治疗的有效性。
[0093]
非限制性例示性人源化抗体包括本文所述的huab1至huab16。非限制性例示性人源化抗体还包括包含选自huab1至huab16的抗体的重链可变区和/或选自huab1至huab16的抗体的轻链可变区的抗体。非限制性例示性人源化抗体包括包含选自seq id no：39至45的重链可变区和/或选自seq id no：46至52的轻链可变区的抗体。例示性人源化抗体还包括但不限于包含选自0301、0302及0311的抗体的重链cdr1、cdr2及cdr3和/或轻链cdr1、cdr2及cdr3的人源化抗体。
[0094]
在一些实施方案中，人源化抗csf1r抗体包含选自0301、0302及0311的抗体的重链cdr1、cdr2及cdr3和/或轻链cdr1、cdr2及cdr3。非限制性例示性人源化抗csf1r抗体包括包含选自seq id no：15、16及17；seq id no：21、22及23；及seq id no：27、28及29的重链cdr1、cdr2及cdr3组的抗体。非限制性例示性人源化抗csf1r抗体还包括包含选自seq id no：18、19及20；seq id no：24、25及26；及seq id no：30、31及32的轻链cdr1、cdr2及cdr3组的抗体。
[0095]
非限制性例示性人源化抗csf1r抗体包括包含表1中的重链cdr1、cdr2及cdr3以及轻链cdr1、cdr2及cdr3组的抗体(所示seq id no；参见表8中的序列)。表1的每一列显示例示性抗体的重链cdr1、cdr2及cdr3以及轻链cdr1、cdr2及cdr3。
[0096]
表1：重链及轻链cdr
[0097][0098][0099]
其他例示性人源化抗体
[0100]
在一些实施方案中，人源化抗csf1r抗体包含可变区序列与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的重链，且其中该抗体结合csf1r。在一些实施方案中，人源化抗-csf1r抗体包含可变区序列与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的轻链，且其中该抗体结合csf1r。在一些实施方案中，人源化抗csf1r抗体包含重链，该重链包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列；以及轻链，该轻链包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列；其中该抗体结合csf1r。
[0101]
如本文所用，可使用例如电脑程序确定多肽是否例如与氨基酸序列至少95％相同。确定特测序列是否与参考序列例如95％相同时，在参考氨基酸序列的全长上计算同一性百分比。
[0102]
在一些实施方案中，人源化抗csf1r抗体包含本文所述的至少一个cdr。也就是说，在一些实施方案中，人源化抗csf1r抗体包含选自以下的至少一个cdr：本文所述的重链cdr1、本文所述的重链cdr2、本文所述的重链cdr3、本文所述的轻链cdr1、本文所述的轻链cdr2及本文所述的轻链cdr3。另外，在一些实施方案中，人源化抗csf1r抗体包含基于本文所述的cdr的至少一个突变cdr，其中突变cdr相对于本文所述的cdr包含1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代中的一个或多个为保守氨基酸取代。本领域的技术人员可选择一种或多种适于特定cdr序列的保守氨基酸取代，其中适合的保守氨基酸取代预测不会显著改变包含突变cdr的抗体的结合特性。
[0103]
例示性人源化抗csf1r抗体还包括与本文所述的抗体竞争结合至csf1r的抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自fab 0301、0302及0311的抗体；以及那些fab的二价(也就是说具有两个重链及两个轻链)抗体型式竞争结合至csf1r的人源化抗csf1r抗体。
[0104]
例示性人源化抗体恒定区
[0105]
在一些实施方案中，本文所述的人源化抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自iga、igg及igd的同型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ及λ的同型。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗体包含人igg恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗体包含人igg4重链恒定区。在一些这样的实施方案中，本文所述的人源化抗体包含人igg4恒定区中的s241p突变。在一些实施方案中，本文所述的人源化抗体包含人igg4恒定区及人κ轻链。
[0106]
重链恒定区的选择可决定抗体是否将具有体内效应功能。在一些实施方案中，这样的效应功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，且从而可杀死抗体所结合的细胞。在一些治疗方法(包括治疗一些癌症的方法)中，例如当抗体结合至支持肿瘤维持或生长的细胞时，可能需要杀死细胞。可支持肿瘤维持或生长的例示性细胞包括但不限于肿瘤细胞本身、帮助血管向肿瘤募集的细胞及提供支持或促进肿瘤生长或肿瘤存活的配体、生长因子或反受体的细胞。在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人igg1重链或人igg3重链的抗csf1r抗体。
[0107]
抗体可通过任何方法人源化。非限制性例示性人源化方法包括例如以下文献中所述的方法：美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、第6,180,370号；jones等人，nature 321：522-525(1986)；riechmann等人，nature 332：323-27(1988)；verhoeyen等人，science 239：1534-36(1988)；及美国公开案us 2009/0136500。
[0108]
如上文所述，人源化抗体为非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸已替换为来自人框架区相应位置的氨基酸的抗体。在一些实施方案中，非人可变区的框架区中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少15个或至少20个氨基酸替换为来自一个或多个人框架区中的一个或多个相应位置的氨基酸。
[0109]
在一些实施方案中，用于取代的一些相应人氨基酸来自不同人免疫球蛋白基因的框架区。也就是说，在一些这样的实施方案中，一个或多个非人氨基酸可替换为来自第一人
抗体的人框架区或由第一人免疫球蛋白基因编码的相应氨基酸，一个或多个非人氨基酸可替换为来自第二人抗体的人框架区或由第二人免疫球蛋白基因编码的相应氨基酸，一个或多个非人氨基酸可替换为来自第三人抗体的人框架区或由第三人免疫球蛋白基因编码的相应氨基酸等。另外，在一些实施方案中，单个框架区(例如fr2)中用于取代的全部相应人氨基酸无需来自相同人框架。然而，在一些实施方案中，用于取代的全部相应人氨基酸均来自相同人抗体或由相同人免疫球蛋白基因编码。
[0110]
在一些实施方案中，通过用相应人框架区替换一个或多个全部框架区将抗体人源化。在一些实施方案中，选择与所替换的非人框架区具有最高同源度的人框架区。在一些实施方案中，这样的人源化抗体为cdr移植抗体。
[0111]
在一些实施方案中，在cdr移植之后，一个或多个框架氨基酸变回小鼠框架区中的相应氨基酸。在一些实施方案中，进行这样的“回复突变”以保留似乎促成一个或多个cdr的结构和/或可能涉及抗原接触和/或似乎涉及抗体的整体结构完整性的一个或多个小鼠框架氨基酸。在一些实施方案中，在cdr移植之后，对抗体的框架区作出十个或低于十个、九个或低于九个、八个或低于八个、七个或低于七个、六个或低于六个、五个或低于五个、四个或低于四个、三个或低于三个、两个或低.于两个、一个或零个回复突变。
[0112]
在一些实施方案中，人源化抗体还包含人重链恒定区和/或人轻链恒定区。
[0113]
例示性嵌合抗体
[0114]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体为嵌合抗体。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含至少一个非人可变区及至少一个人恒定区。在一些这样的实施方案中，抗csf1r抗体的全部可变区为非人可变区，且抗csf1r抗体的全部恒定区为人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的一个或多个可变区为小鼠可变区。嵌合抗体的人恒定区无需与其替换的非人恒定区(若存在)为相同同型。嵌合抗体论述于例如美国专利第4,816,567号；及morrison等人.proc.natl.acad.sci.usa 81：6851-55(1984)中。
[0115]
非限制性例示性嵌合抗体包括包含选自0301、0302及0311的抗体的重链和/或轻链可变区的嵌合抗体。其他非限制性例示性嵌合抗体包括包含选自0301、0302及0311的抗体的重链cdr1、cdr2及cdr3和/或轻链cdr1、cdr2及cdr3的嵌合抗体。
[0116]
非限制性例示性嵌合抗csf1r抗体包括包含以下重链及轻链可变区对的抗体：seq id no：9及10；seq id no：11及12；以及seq id no：13及14。
[0117]
非限制性例示性抗csf1r抗体包括包含上文在表1中所示的一组重链cdr1、cdr2及cdr3以及轻链cdr1、cdr2及cdr3的抗体。
[0118]
其他例示性嵌合抗体
[0119]
在一些实施方案中，嵌合抗csf1r抗体包含重链，该重链包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列，其中该抗体结合csf1r。在一些实施方案中，嵌合抗csf1r抗体包含轻链，该轻链包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列，其中该抗体结合csf1r。在一些实施方案中，人源化抗csf1r抗体包含重链，该重链包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％
或至少99％相同的可变区序列；以及轻链，该轻链包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列；其中该抗体结合csf1r。
[0120]
在一些实施方案中，嵌合抗csf1r抗体包含本文所述的至少一个cdr。也就是说，在一些实施方案中，嵌合抗csf1r抗体包含选自以下的至少一个cdr：本文所述的重链cdr1、本文所述的重链cdr2、本文所述的重链cdr3、本文所述的轻链cdr1、本文所述的轻链cdr2及本文所述的轻链cdr3。另外，在一些实施方案中，嵌合抗csf1r抗体包含基于本文所述的cdr的至少一个突变cdr，其中突变cdr相对于本文所述的cdr包含1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代中的一个或多个为保守氨基酸取代。本领域的技术人员可选择一种或多种适于特定cdr序列的保守氨基酸取代，其中适合的保守氨基酸取代预测不会显著改变包含突变cdr的抗体的结合特性。
[0121]
例示性嵌合抗csf1r抗体还包括与本文所述的抗体竞争结合至csf1r的嵌合抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自fab 0301、0302及0311；以及那些fab的二价(也就是说具有两个重链及两个轻链)抗体型式结合至csf1r的嵌合抗csf1r抗体。
[0122]
例示性嵌合抗体恒定区
[0123]
在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自iga、igg及igd的同型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ及λ的同型。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人igg恒定区。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人igg4重链恒定区。在一些这样的实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人igg4恒定区中的s241p突变。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗体包含人igg4恒定区及人κ轻链。
[0124]
如上文所指出，是否需要效应功能可视抗体预定的特定治疗方法而定。因此，在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人igg1重链恒定区或人igg3重链恒定区的嵌合抗csf1r抗体。在一些实施方案中，当不需要效应功能时，选择包含人igg4或igg2重链恒定区的嵌合抗csf1r抗体。
[0125]
例示性人抗体
[0126]
人抗体可通过任何适合方法制备。非限制性例示性方法包括在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中产生人抗体。参见例如jakobovits等人，proc.natl.acad.sci.usa 90：2551-55(1993)；jakobovits等人，nature 362：255-8(1993)；lonberg等人，nature 368：856-9(1994)；及美国专利第5,545,807号、第6,713,610号、第6,673,986号、第6,162,963号、第5,545,807号、第6,300,129号、第6,255,458号、第5,877,397号、第5,874,299号；及第5,545,806号。
[0127]
非限制性例示性方法还包括使用噬菌体展示文库制备人抗体。参见例如hoogenboom等人，j.mol.biol.227：381-8(1992)；marks等人，j.mol.biol.222：581-97(1991)；及pct公开案第wo 99/10494号。
[0128]
在一些实施方案中，人抗csf1r抗体结合至具有序列seq id no：1的多肽。例示性人抗csf1r抗体还包括与本文所述的抗体竞争结合至csf1r的抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自fab 0301、0302及0311及那些fab的二价(也就是说具有两个重链及两个轻链)抗体型式的抗体竞争结合至csf1r的人抗csf1r抗体。
[0129]
在一些实施方案中，人抗csf1r抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自iga、igg及igd的同型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ及λ的同型。在一些实施方案中，本文所述的人抗体包含人igg恒定区。在一些实施方案中，本文所述的人抗体包含人igg4重链恒定区。在一些这样的实施方案中，本文所述的人抗体包含人igg4恒定区中的s241p突变。在一些实施方案中，本文所述的人抗体包含人igg4恒定区及人κ轻链。
[0130]
在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人igg1重链恒定区或人igg3重链恒定区的人抗csf1r抗体。在一些实施方案中，当不需要效应功能时，选择包含人igg4或igg2重链恒定区的人抗csf1r抗体。
[0131]
其他例示性抗csf1r抗体
[0132]
例示性抗csf1r抗体还包括但不限于包含例如本文所述的一种或多种cdr序列的小鼠、人源化、人、嵌合及工程化抗体。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的重链可变区。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的轻链可变区。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的重链可变区及本文所述的轻链可变区。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的重链cdr1、cdr2及cdr3。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的轻链cdr1、cdr2及cdr3。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的重链cdr1、cdr2及cdr3及本文所述的轻链cdr1、cdr2及cdr3。
[0133]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含选自fab 0301、0302及0311的抗体的重链可变区。非限制性例示性抗csf1r抗体还包括包含选自人源化抗体huab1至huab16的抗体的重链可变区的抗体。非限制性例示性抗csf1r抗体包括包含重链可变区的抗体，该重链可变区包含选自seq id no：9、11、13及39至45的序列。
[0134]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含选自fab 0301、0302及0311的抗体的轻链可变区。非限制性例示性抗csf1r抗体还包括包含选自人源化抗体huab1至huab16的抗体的轻链可变区的抗体。非限制性例示性抗csf1r抗体包括包含轻链可变区的抗体，该轻链可变区包含选自seq id no：10、12、14及46至52的序列。
[0135]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含选自fab 0301、0302及0311的抗体的重链可变区及轻链可变区。非限制性例示性抗csf1r抗体还包括包含选自人源化抗体huab1至huab16的抗体的重链可变区及轻链可变区的抗体，非限制性例示性抗csf1r抗体包括包含以下重链及轻链可变区对的抗体：seq id no：9及10；seq id no：11及12；以及seq id no：13及14；seq id no：39及40；seq id no：41及42；seq id no：43及44；seq id no：45及46；seq id no：47及48；seq id no：49及50；以及seq id no：51及52。非限制性例示性抗csf1r抗体还包括包含以下重链及轻链对的抗体：seq id no：33及34；seq id no：35及36；以及seq id no：37及38。
[0136]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含选自fab 0301、0302及0311的重链cdr1、cdr2及cdr3。非限制性例示性抗csf1r抗体包括包含选自seq id no：15、16及17；seq id no：21、22及23；及seq id no：27、28及29的重链cdr1、cdr2及cdr3组的抗体。
[0137]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含选自fab 0301、0302及0311的抗体的轻链cdr1、cdr2及cdr3。非限制性例示性抗csf1r抗体还包括包含选自seq id no：18、19及20；seq id no：24、25及26；及seq id no：30、31及32的轻链cdr1、cdr2及cdr3组的抗体。
[0138]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含选自fab 0301、0302及0311的抗体的重链cdr1、cdr2及cdr3及轻链cdr1、cdr2及cdr3。
[0139]
非限制性例示性抗csf1r抗体包括包含上文在表1中所示的重链cdr1、cdr2及cdr3及轻链cdr1、cdr2及cdr3组的抗体。
[0140]
其他例示性抗体
[0141]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含重链，该重链包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列，其中该抗体结合csf1r。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含轻链，该轻链包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列，其中该抗体结合csf1r。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含重链，该重链包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列；以及轻链，该轻链包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列；其中该抗体结合csf1r。
[0142]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的至少一个cdr。也就是说，在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含选自以下的至少一个cdr：本文所述的重链cdr1、本文所述的重链cdr2、本文所述的重链cdr3、本文所述的轻链cdr1、本文所述的轻链cdr2及本文所述的轻链cdr3。另外，在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含基于本文所述的cdr的至少一个突变cdr，其中突变cdr相对于本文所述的cdr包含1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代中的一个或多个为保守氨基酸取代。本领域的技术人员可选择一种或多种适于特定cdr序列的保守氨基酸取代，其中适合的保守氨基酸取代预测不会显著改变包含突变cdr的抗体的结合特性。
[0143]
例示性抗csf1r抗体还包括与本文所述的抗体竞争结合至csf1r的抗体。因此，在一些实施方案中，提供与选自fab 0301、0302及0311及那些fab的二价(也就是说具有两个重链及两个轻链)抗体型式的抗体竞争结合至csf1r的抗csf1r抗体。
[0144]
例示性抗体恒定区
[0145]
在一些实施方案中，本文所述的抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自iga、igg及igd的同型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ及λ的同型。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人igg恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人igg4重链恒定区。在一些这样的实施方案中，本文所述的抗体包含人igg4恒定区中的s241p突变。在一些实施方案中，本文所述的抗体包含人igg4恒定区及人κ轻链。
[0146]
如上文所指出，是否需要效应功能可视抗体预定的特定治疗方法而定。因此，在一些实施方案中，当需要效应功能时，选择包含人igg1重链恒定区或人igg3重链恒定区的抗csf1r抗体。在一些实施方案中，当不需要效应功能时，选择包含人igg4或igg2重链恒定区的抗csf1r抗体。
[0147]
例示性抗csf1r重链可变区
[0148]
在一些实施方案中，提供抗csf1r抗体重链可变区。在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链可变区为小鼠可变区、人可变区或人源化可变区。
[0149]
抗csf1r抗体重链可变区包含重链cdr1、fr2、cdr2、fr3及cdr3。在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链可变区进一步包含重链fr1和/或fr4。非限制性例示性重链可变区包括但不限于具有选自seq id no：9、11、13及39至45的氨基酸序列的重链可变区。
[0150]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链可变区包括含有选自seq id no：15、21及27的序列的cdr1。
[0151]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链可变区包括含有选自seq id no：16、22及28的序列的cdr2。
[0152]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链可变区包括含有选自seq id no：17、23及29的序列的cdr3。
[0153]
非限制性例示性重链可变区包括但不限于包含选自seq id no：15、16及17；seq id no：21、22及23；以及seq id no：27、28及29的cdr1、cdr2及cdr3组的重链可变区。
[0154]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链包含与选自seq id no：9、11、13及39至45的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列，其中重链与轻链一起能够形成结合csf1r的抗体。
[0155]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链包含本文所述的至少一个cdr。也就是说，在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链包含选自以下的至少一个cdr：本文所述的重链cdr1、本文所述的重链cdr2及本文所述的重链cdr3。另外，在一些实施方案中，抗csf1r抗体重链包含基于本文所述的cdr的至少一个突变cdr，其中突变cdr相对于本文所述的cdr包含1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代中的一个或多个为保守氨基酸取代。本领域的技术人员可选择一种或多种适于特定cdr序列的保守氨基酸取代，其中适合的保守氨基酸取代预测不会显著改变包含突变cdr的重链的结合特性。
[0156]
在一些实施方案中，重链包含重链恒定区。在一些实施方案中，重链包含人重链恒定区。在一些实施方案中，人重链恒定区具有选自iga、igg及igd的同型。在一些实施方案中，人重链恒定区为igg恒定区。在一些实施方案中，重链包含人igg4重链恒定区。在一些这样的实施方案中，人igg4重链恒定区包含s241p突变。
[0157]
在一些实施方案中，当需要效应功能时，重链包含人igg1或igg3重链恒定区。在一些实施方案中，当效应功能不太需要时，重链包含人igg4或igg2重链恒定区。
[0158]
例示性抗csf1r轻链可变区
[0159]
在一些实施方案中，提供抗csf1r抗体轻链可变区。在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链可变区为小鼠可变区、人可变区或人源化可变区。
[0160]
抗csf1r抗体轻链可变区包含轻链cdr1、fr2、cdr2、fr3及cdr3。在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链可变区进一步包含轻链fr1和/或fr4。非限制性例示性轻链可变区包括具有选自seq id no：10、12、14及46至52的氨基酸序列的轻链可变区。
[0161]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链可变区包括含有选自seq id no：18、24及30的序列的cdr1。
[0162]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链可变区包括含有选自seq id no：19、25及31的序列的cdr2。
[0163]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链可变区包含选自seq id no：20、26及32的序列的cdr3。
[0164]
非限制性例示性轻链可变区包括但不限于包含选自seq id no：18、19及20；seq id no：24、25及26；以及seq id no：30、31及32的cdr1、cdr2及cdr3组的轻链可变区。
[0165]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链包含与选自seq id no：10、12、14及46至52的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的可变区序列，其中轻链与重链一起能够形成结合csf1r的抗体。
[0166]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链包含本文所述的至少一个cdr。也就是说，在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链包含选自以下的至少一个cdr：本文所述的轻链cdr1、本文所述的轻链cdr2及本文所述的轻链cdr3。另外，在一些实施方案中，抗csf1r抗体轻链包含基于本文所述的cdr的至少一个突变cdr，其中突变cdr相对于本文所述的cdr包含1、2、3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代中的一个或多个为保守氨基酸取代。本领域的技术人员可选择一种或多种适于特定cdr序列的保守氨基酸取代，其中适合的保守氨基酸取代预测不会显著改变包含突变cdr的轻链的结合特性。
[0167]
在一些实施方案中，轻链包含人轻链恒定区。在一些实施方案中，人轻链恒定区选自人κ及人λ轻链恒定区。
[0168]
其他的例示性csf1r结合分子
[0169]
在一些实施方案中，提供结合csf1r的其他分子。这样的分子包括但不限于非典型骨架，如抗运载蛋白(anti-calins)、纤连蛋白、锚蛋白重复等。参见例如hosse等人，prot.sci.15：14(2006)；fiedler,m.及skerra,a.,“non-antibody scaffolds,”第467-499页，于handbook of therapeutic antibodies,dubel,s.编，wiley-vch,weinheim,germany,2007。
[0170]
抗csf1r抗体的例示性特性
[0171]
在一些实施方案中，具有上述结构的抗体以小于1nm的结合亲和力(kd)结合至csf1r，阻断csf1和/或il-34与csf1r的结合且抑制csf1和/或il-34诱导csf1r磷酸化。
[0172]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体结合至csf1r的胞外域(csf1r-ecd)。在一些实施方案中，抗csf1r抗体具有小于1nm、小于0.5nm、小于0.1nm或小于0.05nm的针对csf1r的结合亲和力(kd)。在一些实施方案中，抗csf1r抗体具有0.01nm与1nm之间、0.01与0.5nm之间、0.01与0.1nm之间、0.01与0.05nm之间或0.02与0.05nm之间的kd。
[0173]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体阻断配体与csf1r的结合。在一些实施方案中，抗csf1r抗体阻断csf1与csf1r结合。在一些实施方案中，抗csf1r抗体阻断il-34与csf1r的结合。在一些实施方案中，抗csf1r抗体阻断csf1及il-34与csf1r的结合。在一些实施方案中，阻断配体结合的抗体结合至csf1r的胞外域。在一些实施方案中，当抗体使配体相对于csf1r的可检测结合的量降低至少50％(使用例如美国专利第8,206,715b2号实施例7中所述的分析，该文献以引用的方式并入本文中用于任何目的)时，该抗体阻断配体与csf1r的结合。在一些实施方案中，抗体使配体相对于csf1r的可检测结合的量降低至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些这样的实施方案中，据称抗体将配体结合阻断至少50％、至少60％、至少70％等。
[0174]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体抑制配体诱导的csf1r磷酸化。在一些实施方案中，抗csf1r抗体抑制csf1诱导csf1r磷酸化。在一些实施方案中，抗csf1r抗体抑制il-34诱导csf1r磷酸化。在一些实施方案中，抗csf1r抗体抑制csf1诱导及il-34诱导的csf1r磷酸化。在一些实施方案中，当抗体使可检测的配体诱导的csf1r磷酸化的量降低至少50％(使用例如美国专利第8,206,715b2号实施例6所述的分析，该专利以引用的方式并人本文中用于任何目的)时，抗体视为“抑制配体诱导的csf1r磷酸化”。在一些实施方案中，抗体使可检测的配体诱导的csf1r磷酸化的量降低至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些这样的实施方案中，据称抗体将配体诱导的csf1r磷酸化抑制至少至少50％、至少60％、至少70％等。
[0175]
在一些实施方案中，抗体抑制csf1和/或il-34存在下的单核细胞增殖和/或存活响应。在一些实施方案中，当抗体使csf1和/或il-34存在下的单核细胞增殖和/或存活响应的量降低至少50％(使用例如美国专利第8,206,715b2号实施例10所述的分析，该专利以引用的方式并入本文中用于任何目的)时，抗体视为“抑制单核细胞增殖和/或存活响应”。在一些实施方案中，抗体使csf1和/或il-34存在下的单核细胞增殖和/或存活响应的量降低至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些这样的实施方案中，据称抗体至少将单核细胞增殖和/或存活响应抑制至少50％、至少60％、至少70％等。
[0176]
例示性免疫刺激剂
[0177]
免疫刺激剂可包括例如小分子药物、抗体或其片段，或其他生物制剂或小分子。生物免疫刺激剂的实施例包括但不限于抗体、抗体片段、受体或配体多肽片段(例如阻断受体-配体结合)、疫苗及细胞因子。在一方面中，抗体为单克隆抗体。在某些方面中，单克隆抗体为人源化或人抗体。
[0178]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激动剂，而在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫抑制分子(包括共抑制分子)的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫细胞(如t细胞)上所发现的免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含免疫细胞(如t细胞)上所发现的免疫抑制分子(包括共抑制分子)的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含涉及先天性免疫的细胞(如nk细胞)上所发现的免疫刺激分子(包括共刺激分子)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含涉及先天性免疫的细胞(如nk细胞)上所发现的免疫抑制分子(包括共抑制分子)的拮抗剂。在一些实施方案中，该组合使所治疗受试者中的抗原特异性t细胞响应增强且/或增强受试者的先天性免疫响应。在一些实施方案中，相较于单独施用抗csf1r抗体或免疫刺激剂，该组合使得动物癌症模型(如异种移植模型)中的抗肿瘤响应改善。在一些实施方案中，相较于单独施用抗csf1r抗体或免疫刺激剂，该组合使得动物癌症模型(如异种移植模型)中产生协同响应。
[0179]
在某些实施方案中，免疫刺激剂靶向作为免疫球蛋白超家族(igsf)成员的刺激或抑制分子。举例而言，免疫刺激剂可为靶向(或特异性地结合至)膜结合配体b7家族(包括b7-1、b7-2、b7-h2(icos-l)、b7-h3、b7-h4、b7-h5(vista)及b7-h6)成员的作用剂，或特异性地结合至b7家族成员的共刺激或共抑制受体。免疫刺激剂可为靶向膜结合配体的tnf家族成员的作用剂，或特异性地结合至tnf家族成员的共刺激或共抑制受体。免疫刺激剂可靶向的例示性tnf及tnfr家族成员包括cd40及cd40l、ox-40、ox-40l、gitr、gitrl、cd70、cd27l、
cd30、cd30l、4-1bbl、cd137(4-1bb)、trail/apo2-l、trailr1/dr4、trailr2/dr5、trailr3、trailr4、opg、rank、rankl、tweakr/fn14、tweak、baffr、edar、xedar、taci、april、bcma、ltβr、light、dcr3、hvem、vegi/tl1a、tramp/dr3、edar、eda1、xedar、eda2、tnfr1、淋巴毒素α/tnfβ、tnfr2、tnfα、ltβr、淋巴毒素α1β2、fas、fasl、relt、dr6、troy及ngfr。免疫刺激剂可为靶向igsf成员(如b7家族成员、b7受体家族成员、tnf家族成员或tnfr家族成员，如上述那些物)的作用剂，例如抗体。
[0180]
在一些实施方案中，免疫刺激剂可包含(i)抑制t细胞活化的蛋白质(例如免疫检查点抑制剂)的拮抗剂，如ctla-4、lag-3、tim3、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd69、半乳糖凝集素-1、tigit、cd113、gpr56、vista、b7-h3、b7-h4、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim-1、tim-4及ilt4且/或可包含(ii)刺激t细胞活化的蛋白质的激动剂，如b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27、cd40、cd40l、dr3及cd28h。
[0181]
在一些实施方案中，免疫刺激剂可包含抑制细胞因子或为细胞因子拮抗剂的作用剂，这些细胞因子抑制t细胞活化(例如il-6、il-10、tgf-β、vegf及其他免疫抑制性细胞因子)，且在一些实施方案中，免疫刺激剂可包含作为细胞因子激动剂的作用剂，这些细胞因子刺激t细胞活化(如il-2、il-7、il-12、il-15、il-21及ifnα(例如细胞因子本身))。在一些实施方案中，免疫刺激剂可包含趋化因子拮抗剂，如cxcr2(例如mk-7123)、cxcr4(例如amd3100)、ccr2或ccr4(莫加木珠单抗(mogamulizumab))。
[0182]
在一些实施方案中，免疫刺激剂可包括nk细胞上的抑制性受体的拮抗剂或nk细胞上的活化受体的激动剂。举例而言，抗csf1r抗体可与kir拮抗剂组合，任选连同至少一种其他免疫刺激剂(如cd40激动剂)一起。
[0183]
免疫刺激剂还可包括抑制tgf-β信号传导的作用剂、增强肿瘤抗原递呈的作用剂(例如树突状细胞疫苗、分泌gm-csf的细胞疫苗、cpg寡核苷酸及咪喹莫特(imiquimod))，或增强肿瘤细胞免疫原性的疗法(例如蒽环霉素)。
[0184]
免疫刺激剂还可包括某些疫苗，如靶向间皮素的疫苗或减毒的李斯特菌癌症疫苗，如crs-207。
[0185]
免疫刺激剂还可包含耗乏或阻断treg细胞的作用剂，如特异性结合至cd25的作用剂。
[0186]
免疫刺激剂还可包含抑制新陈代谢酶(如吲哚胺双加氧酶(indoleamine dioxigenase；ido)、双加氧酶、精氨酸酶或氧化氮合成酶)的作用剂。
[0187]
免疫刺激剂还可包含抑制腺苷形成或抑制腺苷a2a受体的作用剂。
[0188]
免疫刺激剂还可包含逆转/防止t细胞失能或衰竭的作用剂及在肿瘤位点触发先天性免疫活化和/或发炎的作用剂。
[0189]
抗csf1r抗体可与超过一种免疫刺激剂组合，如cd40激动剂与至少一种其他免疫刺激剂。抗csf1r抗体，任选连同cd40激动剂一起，可与靶向免疫路径的多个元件的组合途径组合，如以下中的一种或多种：至少一种增强肿瘤抗原呈现的作用剂(例如树突状细胞疫苗、分泌gm-csf的细胞疫苗、cpg寡核苷酸、咪喹莫特)；至少一种抑制负向免疫调节的作用剂，例如通过抑制ctla-4路径和/或耗乏或阻断treg或其他免疫抑制细胞；刺激正向免疫调节的疗法，例如使用刺激cd-137、ox-40和/或gitr路径和/或刺激t细胞效应功能的激动剂；
至少一种全身性地提高抗肿瘤t细胞出现率的作用剂；耗乏或抑制tregs(如肿瘤中的tregs)的疗法，例如使用cd25拮抗剂(例如达利珠单抗(daclizumab))或通过离体抗cd25珠粒耗乏；至少一种影响肿瘤中的抑制性骨髓细胞的功能的作用剂；增强肿瘤细胞免疫原性的疗法(例如蒽环霉素)；过继性t细胞或nk细胞转移，包括经基因修饰的细胞，例如通过嵌合抗原受体修饰的细胞(car-t疗法)；至少一种抑制新陈代谢酶(如吲哚氨双加氧酶(ido)、双加氧酶、精氨酸酶或氧化氮合成酶)的作用剂；至少一种逆转/防止t细胞失能或衰竭的作用剂；在肿瘤位点触发先天性免疫活化和/或发炎的疗法；施用免疫刺激性细胞因子或阻断免疫抑制性细胞因子。
[0190]
举例而言，抗csf1r抗体，任选与cd40激动剂一起，可联合以下使用：一种或多种连接正向共刺激受体的激动剂；一种或多种经由抑制性受体减弱信号传导的拮抗剂(阻断剂)，如克服肿瘤微环境内的不同免疫抑止路径的拮抗剂；一种或多种全身性地增加抗肿瘤免疫细胞(如t细胞)出现率、耗乏或抑制trcgs(例如通过抑制cd25)的作用剂；一种或多种抑制代谢酶(如ido)的作用剂；一种或多种逆转/防止t细胞失能或衰竭的作用剂；及一种或多种在肿瘤位点触发先天性免疫活化和/或发炎的作用剂。
[0191]
在一个实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含ctla-4拮抗剂，如拮抗性ctla-4抗体。适合的ctla-4抗体包括例如yervoy(伊匹单抗(ipilimumab))或曲美单抗(tremelimumab)。
[0192]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含lag-3拮抗剂，如拮抗性lag-3抗体。适合的lag3抗体包括例如bms-986016(wo10/19570、wo14/08218)或imp-731或imp-321(wo08/132601、wo09/44273)。
[0193]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含cd137(4-1bb)激动剂，如激动性cd137抗体。适合的cd137抗体包括例如优瑞路单抗(urelumab)及pf-05082566(wo12/32433)。
[0194]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含gitr激动剂，如激动性gitr抗体。适合的gitr抗体包括例如trx-518(wo06/105021、wo09/009116)、mk-4166(wo11/028683)或wo2015/031667中所揭示的gitr抗体。
[0195]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含ox40激动剂，如激动性ox40抗体。适合的ox40抗体包括例如medi-6383、medi-6469或moxr0916(rg7888：wo06/029879)。
[0196]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含cd27激动剂，如激动性cd27抗体。适合的cd27抗体包括例如瓦里木单抗(varlilumab)(cdx-1127)。
[0197]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含靶向b7h3的mga271(wo11/109400)。
[0198]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含kir拮抗剂，如利瑞路单抗。
[0199]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含ido拮抗剂。ido拮抗剂包括例如incb-024360(wo2006/122150、wo07/75598、wo08/36653、wo08/36642)、因多莫得(indoximod)、nlg-919(wo09/73620、wo09/1156652、wo11/56652、wo12/142237)或f001287。
[0200]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含toll样受体激动剂，例如tlr2/4激动剂(例如卡介苗(bacillus calmette-guerin)；tlr7激动剂(例如希托洛(hiltonol)或咪喹莫特(imiquimod))；tlr7/8激动剂(例如雷西莫特(resiquimod))；或tlr9激动剂(例如cpg7909)。
[0201]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含tgf-β抑制剂，例如gc1008、ly2157299、tew7197或imc-tr1。
[0202]
cd40激动剂及例示性cd40激动剂分子
[0203]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含cd40激动剂，任选与如本文所述的至少一种其他免疫刺激剂一起。细胞表面分子cd40为肿瘤坏死因子受体超家族成员且由抗原呈递细胞(如树突状细胞、b细胞、巨噬细胞及单核细胞)且还在其他细胞类型(包括免疫、造血、血管及上皮细胞)上以及多种肿瘤细胞上表达。在抗原呈递细胞中，cd40信号传导引起t细胞共刺激分子及诱导免疫响应所必需的其他关键免疫介体发生活化及上调。cd40激动剂为潜在癌症疗法，其经由抗肿瘤免疫活化与针对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用引起肿瘤消退。cd40靶向疗法已经历针对晚期癌症患者的1期临床评估，且初步结果已显示功效而无较大毒性。
[0204]
就cd40而言，例如动物模型已显示树突状细胞上的cd40连接，引起介导肿瘤杀死的细胞毒性t淋巴细胞活化(marzo等人，2000,j.immunol.；todryk等人，2001,j.immunol.methods.)。巨噬细胞上的cd40的活化引起杀肿瘤活性(beatty等人，2011,science)，且由cd40刺激的抗原呈递细胞产生的细胞因子引起天然杀伤细胞活化，这对于肿瘤根除而言具有重要作用。鉴于抗肿瘤免疫响应的复杂性质，因此有效癌症疗法可能需要将多种免疫治疗剂组合。与此一致，在胰脏肿瘤模型中，csf1r的小分子抑制作用显示与抗pd1免疫检查点阻断作用协同发生。参见zhu等人，2014,cancer res.,74：5057-5069。因此，具有表达csf1r的tam的肿瘤可能对抗csf1r抗体与cd40激动剂的组合疗法敏感。
[0205]
本发明的组合物及方法的例示性cd40激动剂包括例如增强cd40活性的抗cd40抗体。这样的抗体可为人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体及包含本文所述抗cd40抗体的重链和/或轻链cdr的抗体。
[0206]
多种激动剂抗cd40抗体在本领域中已知。非限制性例示性激动剂抗cd40抗体包括但不限于cp-870,893(pfizer及vlst；ep 1 476 185 b1及us 专利第7,338,660号中的抗体21.4.1；还参见clinicaltrials.gov/ct2/show/nct02225002)；达西珠单抗(seattle genetics；本文中的seq id no：98及99；还参见美国专利第6,946,129号及美国专利第8,303,955号)；ro7009789(roche；参见例如clinicaltrials.gov/ct2/show/nct02304393)；adc-1013(alligator bioscience；美国公开案第2014/0348836号；还参见clinicaltrials.gov/ct2/show/nct02379741)；sea-cd40(seattle genetics；包含seq id no：98及99的抗体的去海藻糖基化形式；还参见clinicaltrials.gov/ct2/show/nct02376699)；及chi lob7/4(univ.southampton；美国公开案第2009/0074711号；还参见clinicaltrials.gov/ct2/show/nct01561911)。参见例如vonderheide等人，2013,clin cancer res 19：1035。
[0207]
例示性cd40激动剂还包括重组cd40l。
[0208]
例示性抗体偶联物
[0209]
在一些实施方案中，抗体结合至标记物和/或细胞毒性剂。如本文所用，标记物为促进检测抗体和/或促进检测抗体所结合的分子的部分。非限制性例示性标记物包括但不限于放射性同位素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素、抗原决定基标记物、金属结合标记物等。本领域的技术人员可根据预定应用来选择适合的标记物。
[0210]
如本文所用，细胞毒性剂为降低一种或多种细胞的增殖能力的部分。当细胞变得不太能够增殖(例如由于细胞经历细胞凋亡或以其他方式死亡)时，细胞增殖能力减弱，细胞不能完成细胞周期且/或不能分裂、细胞分化等。非限制性例示性细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素、毒素及化疗剂。本领域的技术人员可根据预定应用来选择适合细胞毒性。
[0211]
在一些实施方案中，标记物和/或细胞毒性剂使用化学方法体外与抗体结合。非限制性例示性化学结合方法在本领域中已知且可包括购自以下的服务、方法和/或试剂：例如thermo scientific life science research produces(先前为pierce；rockford,il)、普洛美(prozyme)(hayward,ca)、sacri抗体服务(sacri antibody services)(calgary,canada)、abd serotec(raleigh,nc)等。在一些实施方案中，当标记物和/或细胞毒性剂为多肽时，标记物和/或细胞毒性剂可与至少一个抗体链一起由同一表达载体表达，以产生包含标记物和/或细胞毒性剂与抗体链融合的多肽。本领域的技术人员可根据预期应用选择将标记物和/或细胞毒性剂结合至抗体的适合方法。
[0212]
例示性前导序列
[0213]
为了大量表达及分泌一些分泌型蛋白质，可能需要来自异源蛋白质的前导序列。在一些实施方案中，前导序列选自分别为轻链及重链前导序列的seq id no：3及4。在一些实施方案中，采用异源前导序列的有利之处在于，由于在分泌过程中，前导序列在er中移除，因此所得成熟多肽可保持不变。可能需要添加异源前导序列来表达及分泌一些蛋白质。
[0214]
某些例示性前导序列描述于例如新加坡国立大学生物化学系(department of biochemistry,national university of singapore)所维护的线上前导序列资料库(online leader sequence database)中。参见choo等人，bmc bioinformatics,6：249(2005)；及pct公开案第wo 2006/081430号。
[0215]
编码抗体的核酸分子
[0216]
提供包含多核苷酸的核酸分子，其编码抗体的一个或多个链。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体重链的多核苷酸及编码抗体轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
[0217]
在一些这样的实施方案中，重链及轻链由一个核酸分子表达，或以两个分别的多肽形式由两个分别的核酸分子表达。在一些实施方案中，如当抗体为scfv时，单一多核苷酸编码包含重链及轻链连接在一起的单一多肽。
[0218]
在一些实施方案中，编码抗体的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，该序列在翻译时位于重链或轻链的n末端。如上文所述，前导序列可为天然重链或轻链前导序列，或可为另一异源前导序列。
[0219]
核酸分子可使用本领域中已知的重组dna技术建构。在一些实施方案中，核酸分子为适于在所选宿主细胞中表达的表达载体。
[0220]
抗体表达及纯化
[0221]
载体
[0222]
提供包含编码抗体重链和/或轻链的多核苷酸的载体。还提供包含编码抗体重链和/或轻链的多核苷酸的载体。这样的载体包括但不限于dna载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列及编码轻
链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，重链及轻链以两种各别多肽形式由载体表达。在一些实施方案中，重链及轻链作为单一多肽的一部分表达，如抗体为scfv时。
[0223]
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体及第二载体以类似放入量(如类似摩尔量或类似质量)转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，第一载体与第二载体以5：1与1：5之间的摩尔比或质量比转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，编码重链的载体与编码轻链的载体使用1：1与1：5之间的质量比。在一些实施方案中，编码重链的载体与编码轻链的载体使用1：2质量比。
[0224]
在一些实施方案中，选择优化的载体以便cho或源自cho的细胞或nso细胞表达多肽。例示性的这样的载体描述于例如running deer等人，biotechnol.prog.20：880-889(2004)中。
[0225]
在一些实施方案中，选择载体用于在包括人的动物中体内表达抗体重链和/或抗体轻链。在一些这样的实施方案中，多肽在以组织特异性方式起作用的启动子控制下表达。举例而言，肝脏特异性启动子描述于例如pct公开案第wo 2006/076288号中。
[0226]
宿主细胞
[0227]
在多种实施方案中，抗体重链和/或轻链可表达于原核细胞中，如细菌细胞；或表达于真核细胞中，如真菌细胞(如酵母)、植物细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞。这样的表达可例如根据本领域中已知的方法进行。可用于表达多肽的例示性真核细胞包括但不限于cos细胞，包括cos 7细胞；293细胞，包括293-6e细胞；cho细胞，包括cho-s及dg44细胞；per.细胞(crucell)；及nso细胞。在一些实施方案中，抗体重链和/或轻链可表达于酵母中。参见例如美国公开案第us 2006/0270045 a1号。在一些实施方案中，特定真核宿主细胞根据其对抗体重链和/或轻链产生所要翻译后修饰的能力加以选择。举例而言，在一些实施方案中，cho细胞产生多肽，这些多肽的唾液酸化程度高于293细胞中所产生的相同多肽。
[0228]
向所要宿主细胞中引入一种或多种核酸可通过任何方法完成，包括但不限于磷酸钙转染、deae-聚葡萄糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性例示性方法描述于例如sambrook等人，molecular cloning,a laboratory manual，第3版cold spring harbor laboratory press(2001)。核酸可根据任何适合方法短暂或稳定转染于所要宿主细胞中。
[0229]
在一些实施方案中，可根据任何适合方法，在已使用一种或多种编码多肽的核酸分子工程化或转染的动物中体内产生一种或多种多肽。
[0230]
抗体纯化
[0231]
抗体可通过任何适合方法纯化。这样的方法包括但不限于使用亲和基质或疏水性相互作用层析。适合的亲和配体包括结合抗体恒定区的抗原及配体。举例而言，蛋白质a、蛋白质g、蛋白质a/g，或抗体亲和管柱可用于结合恒定区及纯化抗体。疏水性相互作用层析法(例如丁基或苯基管柱)还可适于纯化一些多肽。本领域中已知许多纯化多肽的方法。
[0232]
无细胞产生抗体
[0233]
在一些实施方案中，抗体在无细胞系统中产生。非限制性例示性无细胞系统描述于例如sitaraman等人，methods mol.biol.498：229-44(2009)；spirin,trends biotechnol.22：538-45(2004)；endo等人，biotechnol.adv.21：695-713(2003)。
[0234]
治疗性组合物及方法
[0235]
癌症治疗方法
[0236]
在一些实施方案中，提供癌症治疗方法，包含施用有效量的抗csf1r抗体及有效量的至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，同时施用抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂。举例而言，治疗剂可一起输注或在大致相同的时间注射。在一些实施方案中，顺序施用抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂。举例而言，在一些实施方案中，在至少一种免疫刺激剂之前或之后顺序施用抗csf1r抗体，使得两种治疗剂相隔30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或两周施用。
[0237]
在一些实施方案中，施用至少一种免疫刺激剂之前，施用至少一次、至少两次、至少三次剂量、至少五次剂量或至少十次剂量的抗csf1r抗体。在一些实施方案中，施用抗csf1r抗体之前，施用至少一次剂量、至少两次剂量、至少三次剂量、至少五次剂量或至少十次剂量的至少一种免疫刺激剂。在一些实施方案中，在csfr1抑制剂的第一剂量之前的至少一天、两天、三天、五天或十天，或一周、两周、三周、五周、十二周或二十四周施用免疫刺激剂的最后剂量。在一些其他实施方案中，在至少一种免疫刺激剂的第一剂量之前的至少一天、两天、三天、五天或十天，或一周、两周、三周、五周、十二周或二十四周施用csfr1抑制剂的最后剂量。在一些实施方案中，受试者已接受或正接受至少一种免疫刺激剂疗法，且将抗csf1r抗体添加至治疗方案中。
[0238]
在一些实施方案中，提供选择患者接受抗csf1r抗体与至少一种免疫刺激剂(如cd40激动剂)组合疗法的方法，包含确定患者中的tams和/或cd8 t细胞水平。在一些实施方案中，若患者的tam水平较高，则选择患者进行组合疗法。在一些实施方案中，若患者的tam及cd8 t细胞水平较高，则选择患者进行组合疗法。若tam或cd8 t细胞水平比未患癌症的受试者中的水平高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少100％，则tam或cd8 t细胞水平视为“较高”。在一些实施方案中，若tam或cd8 t细胞水平比患有癌症的受试者中发现的中值水平高，则tam或cd8 t细胞水平视为“较高”。在一些实施方案中，若患者的tam水平较高且cd8 t细胞水平较低，则选择患者用于抗csf1r抗体与至少一种免疫刺激剂(如cd40激动剂)的组合疗法。若cd8 t细胞水平为患有癌症的受试者中所发现的中值水平或比其低，则cd8 t细胞水平视为“较低”。在一些实施方案中，若cd8 t细胞水平比未患癌症的受试者中的水平低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％或至少100％，则cd8 t细胞水平视为“较低”。在一些实施方案中，测定患者的tam上的csf1r表达。在一些实施方案中，若患者的tam表达csf1r，则选择患者进行组合疗法。在一些实施方案中，若患者的tam表达csf1r的水平升高，则选择患者进行组合疗法。在一些实施方案中，若csf1r水平为发现于癌症受试者中的tams上所表达的csf1r的中值水平或比其高，则患者的tam视为表达csf1r的量“升高”。在一些实施方案中，若患者的csf1r表达显示与cd8 t细胞的水平高度相关，则选择患者进行组合疗法。若表达相关度为癌症受试者中所发现的中值水平或比其高，则表达相关度视为“高”。
[0239]
tam、csf1r表达、cd8 t细胞和/或调节t细胞的水平可通过本领域中的方法测量。非例示性方法包括免疫组织化学(ihc)、荧光活化细胞分选(facs)、蛋白质阵列及基因表达分析，如rna测序、基因阵列及定量pcr。在一些实施方案中，一种或多种选自csf1r、cd68、cd163、cd8及foxp3的标记物可通过ihc、facs或基因表达分析、针对肿瘤切片或来自肿瘤切
片的不连续细胞来检测。
[0240]
在一些实施方案中，癌症选自鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睪丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤及多种类型的头颈癌。在一些实施方案中，肺癌为非小细胞肺癌或肺鳞状细胞癌。在一些实施方案中，白血病为急性骨髓白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，乳腺癌为乳腺侵袭性癌。在一些实施方案中，卵巢癌为浆液性囊腺癌。在一些实施方案中，肾脏癌为肾脏肾透明细胞癌。在一些实施方案中，结肠癌为结肠腺癌。在一些实施方案中，膀胱癌为膀胱尿道上皮癌。在一些实施方案中，癌症选自膀胱癌、宫颈癌(如鳞状细胞宫颈癌)、头部及颈部鳞状细胞癌、直肠腺癌、非小细胞肺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌(如浆液性上皮细胞卵巢癌)及黑素瘤。
[0241]
在一些实施方案中，抗csf1r抗体阻断csf1和/或il-34与csf1r的结合和/或抑制csf1和/或il-34诱导csf1r磷酸化。在一些实施方案中，抗csf1r抗体阻断csf1及il-34与csf1r的结合和/或抑制csf1和/或il-34诱导csf1r磷酸化。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含本文所述的选自huab1至huab16的抗体的cdr或可变区。在一些实施方案中，抗csf1r抗体包含huab1的cdr或可变区。
[0242]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含t细胞活化抑制剂的拮抗剂，而在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含t细胞活化刺激剂的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含ctla4、lag-3、半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd25、cd69、tigit、cd113、gpr56、vista、b7-h3、b7-h4、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim1、tim3、tim4、ilt4、il-6、il-10、tgfβ、vegf、kir、lag-3、腺苷a2a受体、pi3kδ或ido的拮抗剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd27、cd40、cd40l、dr3、cd28h、il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、ifnα、sting的激动剂，或toll样受体激动剂，如tlr2/4激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至膜结合蛋白质b7家族成员(如b7-1、b7-2、b7-h2(icos-l)、b7-h3、b7-h4、b7-h5(vista)及b7-h6)的作用剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含结合至tnf受体家族成员的作用剂或结合至tnf受体家族成员(如cd40、cd40l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27l、cd30、cd30l、4-1bbl、cd137(4-1bb)、trail/apo2-l、trailr1/dr4、trailr2/dr5、trailr3、trailr4、opg、rank、rankl、tweakr/fn14、tweak、baffr、edar、xedar、eda1、eda2、taci、april、bcma、ltβr、light、der3、hvem、vegl/tl1a、tramp/dr3、tnfr1、tnfβ、tnfr2、tnfα、1β2、fas、fasl、relt、dr6、troy或ngfβ)的共刺激或共抑制分子。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含拮抗或抑制细胞因子的作用剂，该细胞因子抑制t细胞活化，如il-6、il-10、tgfβ、vegf。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含刺激t细胞活化的细胞因子(如il-2、il-7、il-12、il-15、il-21及ifnα)的激动剂。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含趋化因子拮抗剂，如cxcr2、cxcr4、ccr2或ccr4。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含抗体。在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂可包含疫苗，如间皮素靶向疫苗或减毒的李斯特菌癌症疫苗，如crs-207。
[0243]
在一些实施方案中，至少一种免疫刺激剂包含cd40激动剂，例如抗cd40抗体。非限
制性例示性激动剂抗cd40抗体包括cp-870,893(pfizer及vlst)；达西珠单抗(seattle genetics)；ro7009789(roche)；acd-1013(alligator bioscience)；sea-cd40(seattle genetics)；及chi lob 7/4(univ.southampton)。在一些实施方案中，cd40激动剂为重组cd40l。
[0244]
施用途径及载剂
[0245]
在多个实施方案中，抗体可通过多种途径体内施用，包括但不限于口服、动脉内、非肠胃、鼻内、静脉内、肌肉内、心内、室内、气管内、经颊、直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮及鞘内，或植入或吸入。本发明组合物可配制成呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂及气溶胶。编码抗体的核酸分子可涂布于金微粒上且通过颗粒轰击装置或“基因枪”皮内递送，如文献(参见例如tang等人，nature 356：152-154(1992))中所述。可根据目标应用选择适当的配制物及施用途径。
[0246]
在多种实施方案中，包含抗体的组合物使用广泛多种的药物上可接受的载剂、以配制物形式提供(参见例如gennaro,remington：the science and practice of pharmacy with facts and comparisons：drugfacts plus，第20版(2003)；ansel等人，pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems，第7版，lippencott williams and wilkins(2004)；kibbe等人，handbook of pharmaceutical excipients,第3版，pharmaceutical press(2000))。可使用药物上可接受的多种载剂，包括媒剂、佐剂及稀释剂。此外，还可使用药物上可接受的多种辅助物质，如ph调节剂及缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂及其类似物。非限制性例示性载剂包括生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、丙三醇、乙醇及其组合。
[0247]
在多种实施方案中，包含抗体的组合物可通过将其在水性或非水性溶剂(如植物油或其他油、合成的脂族酸甘油酯、较高碳数的脂族酸酯，或丙二醇)中溶解、悬浮或乳化来配制以用于注射(包括皮下施用)；且必要时，使用已知添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂及防腐剂。在多种实施方案中，组合物可针对吸入来配制，例如使用可接受的加压推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气及其类似物。在多种实施方案中，组合物还可配制成持续释放的微胶囊，如使用可生物降解或不可生物降解聚合物。非限制性例示性可生物降解配制物包括聚乳酸-乙醇酸聚合物。非限制性例示性不可生物降解配制物包括聚甘油脂肪酸酯。制备这样的配制物的某些方法描述于例如ep 1 125 584 a1中。
[0248]
本发明还提供包含一个或多个容器的药物包装及试剂盒，其各自含有一个或多个剂量的抗体或抗体组合。在一些实施方案中，提供单位剂型，其中单位剂型含有预定量的包含抗体或抗体组合且具有或不具有一种或多种其他作用剂的组合物。在一些实施方案中，这样的单位剂型于注射用的单次使用预装药注射器中供应。在多个实施方案中，单位剂型中所含的组合物可包含生理盐水、蔗糖或其类似物；缓冲液，如磷酸盐或其类似物；且/或在稳定及有效ph范围内配制。或者，在一些实施方案中，组合物可以冻干粉末形式提供，该冻干粉末可在添加适当液体(例如无菌水)时复原。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖及精氨酸。在一些实施方案中，本发明的组合物包含肝素和/或蛋白聚糖。
[0249]
药物组合物以有效治疗或预防特定适应症的量施用。治疗有效量通常取决于所治
疗受试者的体重、其生理或健康状况、所治疗病况的延伸情况或所治疗受试者的年龄。一般而言，可以每剂量约10μg/kg至约100mg/kg体重的量施用抗体。在一些实施方案中，可以每剂量约50μg/kg至约5mg/kg体重的的量施用抗体。在一些实施方案中，可以每剂量约100μg/kg至约10mg/kg体重的量施用抗体。在一些实施方案中，可以每剂量约100μg/kg至约20mg/kg体重的量施用抗体。在一些实施方案中，可以每剂量约0.5mg/kg至约20mg/kg体重的量施用抗体。
[0250]
需要时，可向受试者施用抗体组合物。本领域的技术人员(如主治医师)可基于以下考虑因素确定施用频率：所治疗病况、所治疗受试者的年龄、所治疗病况的严重程度、所治疗受试者的一般健康状态及其类似因素。在一些实施方案中，向受试者施用有效剂量的抗体一次或多次。在多种实施方案中，一月一次、小于一月一次(如每两个月一次或每三个月一次)向受试者施用有效剂量的抗体。在其他实施方案中，超过每月一次(如每三周一次、每两周一次或每周一次)施用有效剂量的抗体。在一些实施方案中，每1、2、3、4或5周一次施用有效剂量的抗体。在一些实施方案中，每周两次或三次施用有效剂量的抗体。施用受试者至少一次有效剂量的抗体。在一些实施方案中，有效剂量的抗体可施用多次，包括历时至少一个月、至少六个月或至少一年。
[0251]
其他组合疗法
[0252]
上述治疗组合可单独施用或联合其他治疗方式施用。其可在其他治疗方式(例如手术、化疗、放疗或施用生物制剂，如另一治疗性抗体)之前、实质上同时或之后提供。在一些实施方案中，癌症在选自手术、化疗及放疗或其组合的疗法之后复发或进展。
[0253]
治疗癌症时，组合可联合一种或多种其他抗癌剂(如化疗剂、生长抑制剂、抗癌疫苗(如基因疗法疫苗)、抗血管生成剂和/或抗肿瘤性组合物)施用。可与本发明的抗体组合使用的化疗剂、生长抑制剂、抗癌疫苗、抗血管生成剂及抗肿瘤性组合物的非限制性实例提供于本文的“定义”下。
[0254]
在一些实施方案中，抗炎症药(如类固醇或非类固醇抗炎症药(nsaid))可联合该组合施用。
实施例
[0255]
下文所述的实施例仅意欲说明本发明，且不应视为以任何方式限制本发明。这些实施例并非意欲表示下述实验为所进行的所有实验或唯一实验。已努力确保关于所用数量(例如量、温度等)的准确度，但应说明存在一些实验性误差及偏差。除非另外指示，否则份数为重量份，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度，且压力为大气压或近大气压。
[0256]
实施例1：人源化抗csf1r抗体
[0257]
先前开发了多种人源化抗csf1r抗体。参见例如pct公开案第wo 2011/140249号。
[0258]
图1(重链)及图2(轻链)中显示与亲本嵌合抗体可变区的序列及人受体可变框架区的序列比对的人源化重链可变区及人源化轻链可变区中的每一者的序列。人源化可变区序列相对于人受体可变框架区序列的变化加有方框。各可变区的各cdr显示于加方框区中，且在加方框序列上方标记为“cdr”。
[0259]
下表8显示抗体huab1至huab16的人源化重链及人源化轻链的完全序列。那些抗体中的每一者的人源化重链及人源化轻链的名称及seq id no显示于表3中。
[0260]
表3:huab1至huab16的人源化重链和轻链
[0261][0262][0263]
如上文所述，测试16种人源化抗体与人、食蟹猴及小鼠csf1r ecd的结合。参见例如pct公开案第wo 2011/140249号。发现抗体结合至人与食蟹猴csf1r ecd，但不结合至小鼠csf1r ecd。还发现人源化抗体阻断csf1与il-34与人及食蟹猴csf1r的结合且抑制csf1诱导及il-34诱导cho细胞中所表达的人csf1r磷酸化。参见例如pct公开案第wo 2011/140249号。
[0264]
预先测定结合至人csf1r ecd的ka、kd及kd且显示于表4中。参见例如pct公开案第wo 2011/140249号。
[0265]
表4:人源化抗体针对人csf1r的结合亲和力
[0266][0267][0268]
实施例2：使用组合疗法增强抗肿瘤活性
[0269]
按每个笼中5只动物来圈养6-8周龄的雌性c57bl/6小鼠，让其随意获得食物及水。小鼠在到达饲养室之后适应至少3天。对小鼠称重且在肿瘤细胞系接种之前对其侧腹刮毛。
[0270]
鼠类结肠腺癌细胞系mc38在37℃及5％co2下在rpmi 10％fbs 2mm l-麸酰胺酸 抗生素/抗霉菌素中培养。将细胞以5百万个细胞/ml的浓度悬浮于50％/v dpbs及50％/v基质胶(matrigel)中。使用27g1/2针，将100μl细胞溶液(50万个细胞)植入每只小鼠的右侧腹上。通过使用18g针及注射器且通过轻微涡旋防止细胞沉降至管底。使用异氟烷将小鼠麻醉以减少紧张且允许更精确的肿瘤细胞植入。使用电子卡尺测量每个肿瘤的长度(l)及宽度(w)且使用v＝(l
×
w2)/2计算肿瘤体积(v)。一旦平均肿瘤体积达到约105mm3，则如下文所论述将小鼠分组且给药，。
[0271]
分组及给药
[0272]
将小鼠分成以下各组且根据下述给药时程，向嵌合大鼠施用抗小鼠csf1r抗体(小鼠igg1；称为“cmfpa008”)和/或抗cd40抗体fgk45(bio x cell；参见rolink等人，1996,immunity 5：319-330)。
[0273]
·
对照：鼠类igg，30mg/kg，i.p.lx/wk，第0天开始。大鼠igg 100μg，i.p.，第0天。
[0274]
·
huab1：抗csf1r抗体，30mg/kg，i.p.lx/wk，第0天开始。大鼠igg100μg，i.p.，第0天。
[0275]
·
抗cd40(高)：抗cd40抗体，100μg i.p.，第0天。鼠类igg，30mg/kg，i.p.lx/wk，第0天开始。
[0276]
·
组合(高)：抗csf1r抗体，30mg/kg，i.p.lx/wk，第0天开始，抗cd40，100μg i.p.，第0天。
[0277]
·
抗cd40(低)：抗cd40抗体，30μg i.p.，第0天。鼠类igg，30mg/kg，i.p.lx/wk，第0天开始。
[0278]
·
组合(低)：抗csf1r抗体，30mg/kg，i.p.lx/wk，第0天开始，抗cd40，30μg i.p.，第0天。
[0279]
给药时程及分组情况显示于表5中：
[0280]
表5:研究剂量和分组
[0281][0282]
若观测到以下征兆中的任一种，则在研究结束之前将动物无痛处死。
[0283]
·
体重减轻等于或大于初始体重的15％。
[0284]
·
观测到肿瘤溃烂。
[0285]
·
小鼠呈现濒死状态。
[0286]
·
个别肿瘤体积等于或大于初始体重的10％
[0287]
收集血浆用于药物动力学(pk)分析。研究最后一天，经由心内放血来收集全血，且分离出血浆用于pk分析(生物分析组)。自每一组收集至少五(5)个肿瘤用于以下分析。通过胶原蛋白酶处理来产生肿瘤单细胞分离株，且利用facs检查免疫细胞在肿瘤中的浸润情况。还在液氮中快速冷冻肿瘤切片且在-80℃储存以用于蛋白质及mrna提取。将肿瘤切片包埋在最佳切片温度化合物(optimum cutting temperature compound；oct)中且在-80℃储存。肿瘤切片还在10％缓冲福马林中放置过夜，且随后于次日转移至70％乙醇中。
[0288]
此实验的结果显示于图3及图4中。如图3中所示，抗csf1r抗体与抗cd40抗体(高)的组合引起早期肿瘤消退，随后引起肿瘤停滞。抗csf1r抗体与抗cd40抗体(低)的组合还展现比任一种单独疗法更大的功效。图4显示(a)第11天及(b)第13天的个体肿瘤体积。表6显示在第11天及第13天使用单向anova所得的肿瘤体积统计资料。抗csf1r抗体与抗cd40抗体(高)的组合显示比任一种单独疗法显著更佳的功效。
[0289]
表6:肿瘤体积统计学分子
[0290][0291]
图5显示研究中所有动物的体重(每周测量至少两次)。任何群组中均未观测到相对于对照组的显著不同体重。
[0292]
序列表
[0293]
表10提供本文所述的某些序列。除非另外指示，否则显示不具有前导序列的全部多肽及抗体。
[0294]
表10:序列和说明
[0295]
[0296]
[0297]
[0298]
[0299]
[0300]
[0301]
[0302][0303]
本技术还涉及以下项：
[0304]
1.一种治疗受试者中癌症的方法，其包括向所述受试者施用抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂，所述至少一种免疫刺激剂选自属于以下类别中的一种或多种的作用剂：
[0305]
a.免疫刺激分子的激动剂，所述免疫刺激分子包括共刺激分子，如t细胞或nk细胞上所发现的免疫刺激分子；
[0306]
b.免疫抑制分子的拮抗剂，所述免疫抑制分子包括共抑制分子，如t细胞或nk细胞
上所发现的免疫刺激分子；
[0307]
c.以下的拮抗剂：lag-3、半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd25、cd69、tigit、cd113、gpr56、vista、b7-h3、b7-h4、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim1、tim3、tim4、ilt4、il-6、il-10、tgfβ、vegf、kir、lag-3、腺苷a2a受体、pi3kδ或ido；
[0308]
d.以下的激动剂：b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd27、cd40、cd40l、dr3、cd28h、il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、ifnα、sting，或toll样受体激动剂，如tlr2/4激动剂；
[0309]
e.结合至膜结合蛋白质b7家族成员的作用剂，所述b7家族成员如b7-1、b7-2、b7-h2(icos-l)、b7-h3、b7-h4、b7-h5(vista)及b7-h6；
[0310]
f.结合至tnf受体家族成员的作用剂或结合至tnf受体家族成员的共刺激或共抑制分子，所述tnf受体家族成员如cd40、cd40l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27l、cd30、cd30l、4-1bbl、cd137(4-1bb)、trail/apo2-l、trailr1/dr4、trailr2/dr5、trailr3、trailr4、opg、rank、rankl、tweakr/fn14、tweak、baffr、edar、xedar、eda1、eda2、taci、april、bcma、ltβr、light、der3、hvem、vegl/tl1a、tramp/dr3、tnfr1、tnfβ、tnfr2、tnfα、1β2、fas、fasl、relt、dr6、troy或ngfβ；
[0311]
g.拮抗或抑制细胞因子的作用剂，所述细胞因子抑制t细胞活化，所述细胞因子如il-6、il-10、tgfβ、vegf；
[0312]
h.刺激t细胞活化的细胞因子的激动剂，所述细胞因子如il-2、il-7、il-12、il-15、il-21及ifnα；及
[0313]
i.趋化因子的拮抗剂，所述趋化因子如cxcr2、cxcr4、ccr2或ccr4。
[0314]
2.如项1的方法，其中所述至少一种免疫刺激剂包含cd40激动剂，如抗cd40抗体，且任选包含至少一种其他的如项1(a)-(h)的免疫刺激剂。
[0315]
3.如项2的方法，其中所述cd40激动剂包含抗cd40抗体，所述抗cd40抗体包含选自下列抗体的cdr：cp-870,893；达西珠单抗(dacetuzumab)；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4。
[0316]
4.如项3的方法，其中所述抗cd40抗体包含选自下列抗体的重链及轻链可变区：cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4。
[0317]
5.如项4的方法，其中所述抗cd40抗体选为选自下列的抗体：cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4。
[0318]
6.如项2的方法，其中所述cd40激动剂包含重组cd40l。
[0319]
7.如前述项中任一项的方法，其中所述抗csf1r抗体与所述至少一种免疫刺激剂同时或顺序施用。
[0320]
8.如前述项中任一项的方法，其中所述抗csf1r抗体与所述至少一种免疫刺激剂同时施用。
[0321]
9.如项7的方法，其中至少一种免疫刺激剂的一次或多次剂量在施用抗csf1r抗体之前施用。
[0322]
10.如项7的方法，其中所述抗csf1r抗体的一次或多次剂量在施用免疫刺激剂之前施用。
[0323]
11.如前述项中任一项的方法，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈
部鳞状细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、膀胱癌、子宫内膜癌、霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)、肺癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、骨癌、皮肤癌、子宫癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(stomach cancer)、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、前列腺癌、间皮瘤及肾癌。
[0324]
12.如前述项中任一项的方法，其中所述癌症在选自手术、化疗、放疗或其组合的疗法之后复发或进展。
[0325]
13.如前述项中任一项的方法，其中所述抗csf1r抗体阻断csf1和/或il-34与csf1r的结合。
[0326]
14.如前述项中任一项的方法，其中所述抗csf1r抗体在体外抑制配体诱导的csf1r磷酸化。
[0327]
15.如前述项中任一项的方法，其中所述抗体选自：
[0328]
a)包括含有序列seq id no：39的重链及含有序列seq id no：46的轻链的抗体；
[0329]
b)包含重链及轻链的抗体，所述重链包含具有序列seq id no：15的重链(hc)cdr1、具有序列seq id no：16的hc cdr2及具有序列seq id no：17的hc cdr3，所述轻链包含具有序列seq id no：18的轻链(lc)cdr1、具有序列seq id no：19的lc cdr2及具有序列seq id no：20的lc cdr3；及
[0330]
c)包括含有序列seq id no：53的重链及含有序列seq id no：60的轻链的抗体。
[0331]
16.如项15的方法，其中所述抗体为人源化抗体。
[0332]
17.如项15或16的方法，其中所述抗体选自fab、fv、scfv、fab'及(fab')2。
[0333]
18.一种包含抗csf1r抗体及至少一种免疫刺激剂的组合物，所述至少一种免疫刺激剂选自属于以下类别中的一种或多种的作用剂：
[0334]
a.免疫刺激分子的激动剂，所述免疫刺激分子包括共刺激分子，如t细胞或nk细胞上所发现的免疫刺激分子；
[0335]
b.免疫抑制分子的拮抗剂，所述免疫抑制分子包括共抑制分子，如t细胞或nk细胞上所发现的免疫刺激分子；
[0336]
c.以下的拮抗剂：lag-3、半乳糖凝集素1、半乳糖凝集素9、ceacam-1、btla、cd25、cd69、tigit、cd113、gpr56、vista、b7-h3、b7-h4、2b4、cd48、garp、pd1h、lair1、tim1、tim3、tim4、ilt4、il-6、il-10、tgfβ、vegf、kir、lag-3、腺苷a2a受体、pi3kδ或ido；
[0337]
d.以下的激动剂：b7-1、b7-2、cd28、4-1bb(cd137)、4-1bbl、icos、icos-l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd27、cd40、cd40l、dr3、cd28h、il-2、il-7、il-12、il-15、il-21、ifnα、sting，或toll样受体激动剂，如tlr2/4激动剂；
[0338]
e.结合至膜结合蛋白质b7家族成员的作用剂，所述b7家族成员如b7-1、b7-2、b7-h2(icos-l)、b7-h3、b7-h4、b7-h5(vista)及b7-h6；
[0339]
f.结合至tnf受体家族成员的作用剂或结合至tnf受体家族成员的共刺激或共抑制分子，所述tnf受体家族成员如cd40、cd40l、ox40、ox40l、gitr、gitrl、cd70、cd27l、cd30、cd30l、4-1bbl、cd137(4-1bb)、trail/apo2-l、trailr1/dr4、trailr2/dr5、trailr3、trailr4、opg、rank、rankl、tweakr/fn14、tweak、baffr、edar、xedar、eda1、eda2、taci、april、bcma、ltβr、light、der3、hvem、vegl/tl1a、tramp/dr3、tnfr1、tnfβ、tnfr2、tnfα、1β2、fas、fasl、relt、dr6、troy或ngfβ；
[0340]
g.拮抗或抑制细胞因子的作用剂，所述细胞因子抑制t细胞活化，所述细胞因子如il-6、il-10、tgfβ、vegf；
[0341]
h.刺激t细胞活化的细胞因子的激动剂，所述细胞因子如il-2、il-7、il-12、il-15、il-21及ifnα；及
[0342]
i.趋化因子的拮抗剂，所述趋化因子如cxcr2、cxcr4、ccr2或ccr4。
[0343]
19.如项18的组合物，其中所述至少一种免疫刺激剂包含cd40激动剂，如抗cd40抗体，且任选进一步包含至少一种其他的如项18(a)-(h)的免疫刺激剂。
[0344]
20.如项19的组合物，其中所述cd40激动剂包含抗cd40抗体，所述抗cd40抗体包含选自下列抗体的cdr：cp-870,893；达西珠单抗(dacetuzumab)；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4。
[0345]
21.如项20的组合物，其中所述cd40激动剂包含抗cd40抗体，所述抗cd40抗体包含选自下列抗体的重链及轻链可变区：cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob 7/4。
[0346]
22.如项21的组合物，其中所述抗cd40抗体为选自下列的抗体：cp-870,893；达西珠单抗；sea-cd40；adc-1013；ro7009789；及chi lob7/4。
[0347]
23.如项19的组合物，其中所述cd40激动剂包含重组cd40l。
[0348]
24.如项18至23中任一项的组合物，其中所述抗csf1r抗体选自：
[0349]
a)包括含有序列seq id no：39的重链及含有序列seq id no：46的轻链的抗体；
[0350]
b)包含重链及轻链的抗体，所述重链包含具有序列seq id no：15的重链(hc)cdr1、具有序列seq id no：16的hc cdr2及具有序列seq id no：17的hc cdr3，所述轻链包含具有序列seq id no：18的轻链(lc)cdr1、具有序列seq id no：19的lc cdr2及具有序列seq id no：20的lc cdr3；及
[0351]
c)包括含有序列seq id no：53的重链及含有序列seq id no：60的轻链的抗体。
[0352]
25.如项24的组合物，其中所述抗csf1r抗体为人源化抗体。
[0353]
26.如项24或25的组合物，其中所述抗csf1r抗体选自fab、fv、scfv、fab'及(fab')2。
[0354]
27.如项18至26中任一项的组合物，其中所述抗csf1r抗体及所述至少一种免疫刺激剂各自分别存在于单独的的隔室或容器中。
[0355]
28.如项18至26中任一项的组合物，其中所述抗csf1r抗体与所述至少一种免疫刺激剂混合或配制在一起。
[0356]
29.如项18至28中任一项的组合物，其用于治疗癌症。
[0357]
30.如项18至28中任一项的组合物的用途，其用于制备治疗癌症的药物。
[0358]
31.如项29或30的组合物或用途，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、膀胱癌、子宫内膜癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、结肠癌、乳腺癌、骨癌、皮肤癌、子宫癌、胃癌(gastric cancer)、胃癌(stomach cancer)、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、前列腺癌、间皮瘤及肾癌。