一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库、其构建方法及应用与流程

1.本发明涉及蛋白质类药物筛选系统，具体涉及一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库、其构建方法及应用。


背景技术：

2.拟抗体是一类全新的经蛋白质工程设计合成的结合蛋白，其功能与抗体类似，但结构与之没有任何关系。具有类似纤维粘连蛋白iii型结构域的拟抗体大小约为10千道尔顿，可执行和抗体相同的与靶蛋白结合的功能。和当前广泛应用于医药领域的抗体相比，此类拟抗体分子远远小于抗体，更容易穿过人体组织和细胞。拟抗体已成为一类可以替代抗体的用于科研、诊断、治疗等生物医药领域的蛋白质分子。


技术实现要素：

3.为促进蛋白质类药物研发，我们构建了一种具有类似纤维粘连蛋白结构域的拟抗体筛选库，基于核糖体展示技术和rna展示技术进行拟抗体筛选，经过4至7个循环可获得高效及特异结合靶蛋白质的拟抗体。
4.本发明提供一种用于拟抗体筛选的dna库，由多个dna分子组成，其特征在于：所述多个dna分子具有如seq id no:1所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的n为a，t，g或c，k为g或t。
5.在本发明的一些实施例中，所述多个dna分子的5’端还包含t7噬菌体rna聚合酶启动子序列和核糖体结合位点序列，3’端还包含用于连接嘌呤霉素连接体的链接dna序列和终止密码子。
6.在本发明的一些实施例中，所述多个dna分子具有如seq id no:2所示的核苷酸序列；所述核苷酸序列中的n为a，t，g或c，k为g或t。
7.在本发明的一些实施例中，所述dna库的dna多样性为20
34
(1.7
×
10
44
)。
8.本发明还提供一种用于拟抗体筛选的rna库，其特征在于：是由任一所述的dna库经转录反应获得。
9.本发明还提供一种拟抗体筛选库，其特征在于：是由所述rna库经体外无细胞表达获得的rna-拟抗体库，或者由所述rna-拟抗体库经反转录获得的cdna-拟抗体库。
10.本发明还提供包含任一所述的dna库或所述的rna库或所述的拟抗体筛选库的试剂盒。
11.在本发明的一些实施例中，所述试剂盒还包含用于拟抗体筛选的通用试剂；所述通用试剂包括pcr试剂、dna提取与纯化试剂、体外转录试剂、rna提取与纯化试剂、体外无细胞表达试剂，和/或反转录试剂。所述pcr试剂包括普通pcr试剂和定量pcr试剂。pcr使用的聚合酶优选高保真dna聚合酶，可保证长链dna的高准确扩增，不推荐使用taq。为了最大程度提取出含不同序列的dna库，不推荐使用商用dna提取试剂盒。
12.任一所述的dna库或所述的rna库或所述的拟抗体筛选库或所述的试剂盒在拟抗体筛选中的应用也属于本发明的保护范围。
13.本发明还提供一种拟抗体筛选库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
14.1)合成任一所述的dna库；
15.2)以所述dna库为模板，合成rna库；
16.3)将所述rna库与嘌呤霉素连接体连接，获得嘌呤霉素连接体-rna库；
17.4)以所述嘌呤霉素连接体-rna库为模板进行体外无细胞表达，获得rna-拟抗体库；
18.5)以所述rna-拟抗体库为模板进行反转录，获得拟抗体筛选库。
19.在本发明的一些实施例中，步骤1)中，通过两步重叠pcr反应合成dna库；第一步pcr反应使用核苷酸序列如seq id no:4和seq id no:5所示的引物；第二步pcr反应使用核苷酸序列如seq id no:6和seq id no:7所示的引物；引物中的n为a，t，g，c的等摩尔混合物，k为g，t的等摩尔混合物；步骤3)中，所述嘌呤霉素连接体由seq id no:8所示的寡核苷酸经5’端修饰po4，3’端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六乙二醇而获得。
20.本发明还提供一种筛选针对靶蛋白质的拟抗体的方法，使用所述的拟抗体筛选库针对靶蛋白质进行拟抗体筛选。
21.在本发明的一些实施例中，所述方法包括如下步骤：
22.1)制备和纯化靶蛋白质，将靶蛋白质固定在固相载体上；
23.2)制备所述的rna库；
24.3)将rna库与嘌呤霉素连接体相连，获得嘌呤霉素连接体-rna库；
25.4)以嘌呤霉素连接体-rna库为模板进行体外无细胞表达，然后解离核糖体复合物，获得rna-拟抗体库；
26.5)以rna-拟抗体库为模板进行反转录，获得cdna-拟抗体库；
27.6)将固定有靶蛋白质的固相载体与cdna-拟抗体库一起孵育，然后洗去未结合的cdna-拟抗体，作为筛选样本；将不含靶蛋白质的固相载体与cdna-拟抗体库一起孵育，然后洗去未结合的cdna-拟抗体，作为对照样本；
28.7)向步骤6)得到的样本中加入洗脱液，获得筛选的cdna；
29.8)以筛选的cdna为模板，转录获得rna库，然后重复步骤3)－7)，进行下一个筛选循环；
30.9)以步骤5)获得的cdna-拟抗体库为模板进行定量pcr，得到原始dna量；以步骤7)获得的cdna为模板进行定量pcr，得到筛选样本和对照样本的dna量；按照样本dna量/原始dna量计算每个筛选循环中筛选样本和对照样本的dna回收率；若筛选样本c
t
值逐渐小于对照样本c
t
值且筛选样本的dna回收率逐渐增加且越来越大于对照样本的dna回收率，则表明筛选样本中存在能与靶蛋白质结合的拟抗体，然后通过dna测序确定筛选得到的拟抗体。
31.在本发明的一些实施例中，所述固相载体为带有标签的磁珠，并且所述靶蛋白质含有能与所述磁珠相结合的标签。
32.在本发明的一些实施例中，所述嘌呤霉素连接体由seq id no:8所示的寡核苷酸经5’端修饰po4，3’端修饰嘌呤霉素，并在第16个碱基和第17个碱基之间并入连续的6个六
乙二醇而获得。
33.在本发明的一些实施例中，步骤9)中，使用核苷酸序列如seq id no:10和seq id no:11所示的引物进行定量pcr。
34.如图1所示，本发明提供的筛选针对靶蛋白质的拟抗体的方法，将核糖体展示技术和rna展示技术结合起来，使用体外无细胞的蛋白质表达系统，表达预先设计和合成的蛋白质类药物(拟抗体)的rna库，表达出的每个拟抗体通过与其对应的rna上的嘌呤霉素链接体连接，使得每个拟抗体可与表达它的rna链相连，获得rna-拟抗体库。然后通过反转录技术，合成每个rna的cdna，获得cdna-拟抗体库。然后，将得到的cdna-拟抗体库与预先准备好的包裹在磁珠上的靶蛋白质孵育。拟抗体库中如果存在可与靶蛋白质结合的拟抗体，可通过磁珠上的靶蛋白质筛选出来。筛选得到的拟抗体的cdna可通过pcr技术扩增、再次转录成rna、使用体外无细胞蛋白质系统表达获得rna-拟抗体库并反转录为cdna-拟抗体库，然后与包裹在磁珠上的靶蛋白质孵育，重复以上筛选过程。经过4至7个循环，逐步得到可高效及特异结合靶蛋白质的拟抗体。最后通过深度测序技术，可检测最终筛选的拟抗体的dna序列，从而可使用原核细胞大规模生产筛选出的拟抗体，进行功能验证。该筛选系统不依赖于细胞及动物体，可高效筛选与靶蛋白质结合的蛋白质类分子，为蛋白质类药物研发提供了新的方法。
35.本发明的拟抗体筛选库的多样性可达20
34
种。使用本发明的筛选系统，可得到与靶蛋白质高效结合的拟抗体。拟抗体与靶蛋白质的结合可抑制靶蛋白质与其他蛋白质的结合，或改变靶蛋白质的功能。本发明的筛选系统可用于针对病毒类蛋白、癌症相关蛋白和免疫类疾病相关蛋白的筛选，获得的蛋白质类药物可用于科研及开发新的诊断工具和治疗药物。
附图说明
36.图1.筛选针对靶蛋白质的拟抗体的流程示意图。其中：(1)制备好的拟抗体的rna库；(2)rna库与嘌呤霉素连接体相连；(3)体外无细胞表达拟抗体；(4)反转录生成cdna；(5)使用覆盖在磁珠上的靶蛋白筛选拟抗体库中能与之结合的拟抗体；(6)获取能与靶蛋白结合的拟抗体的cdna库，再次转录生成rna库，然后进行进一步筛选。一般筛选需要4-7个循环。
37.图2.合成的dna库的电泳检测结果。
38.图3.合成的rna库的电泳检测结果。
39.图4.包裹磁珠的蛋白质量的检测结果。其中：s＝上清液，b＝磁珠。25pmol，50pmol，75pmol表示用于包裹每微升(40μg)his-标签磁珠的蛋白量。
40.图5.第一个筛选循环中各样本的定量pcr扩增曲线。
41.图6.第二个筛选循环中各样本的定量pcr扩增曲线。
42.图7.第三个筛选循环中各样本的定量pcr扩增曲线。
43.图8.第四个筛选循环中各样本的定量pcr扩增曲线。
44.图5-8中，c：步骤c得到的反转录后dna；d：脱盐后样本的dna；e：步骤e预清除后的dna；p：阳性筛选得到的拟抗体的dna；n：阴性对照的dna；blank：空白对照，即洗脱液所含的dna。
45.图9.每个筛选循环中的阳性筛选样本的dna回收率与阴性对照样本的dna回收率。
46.图10.拟抗体筛选库的dna结构。
具体实施方式
47.下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
48.若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；使用的实验方法和条件均为本领域常规的实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
49.实施例1.拟抗体的dna库的构建
50.1.序列设计
51.我们以类似纤维粘连蛋白iii型结构域的核苷酸序列作为骨架序列，根据骨架序列的结构设计了34个nnk(n＝a/t/g/c；k＝g/t)随机突变位点，获得的拟抗体dna序列如序列表中seq id no:1所示。该序列具有20
34
(1.7*10
44
)的dna多样性。
52.拟抗体dna序列如下：
53.atgagcgtttctgatgttccgagggacctggaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctggnnknnknnknnknnknnknnknnknnktacnnkatcacttacggagaannknnknnknnknnknnknnkcagnnkttcnnkgtgcctnnknnknnknnknnkgctaccatcagcggccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactnnknnknnknnknnknnknnknnknnknnkccaatttccattaattaccgaaca。(seq id no:1)
54.为进行蛋白质类药物筛选，我们在拟抗体dna序列的5’端添加t7噬菌体rna聚合酶启动子(5’taatacgactcactatag 3’)和核糖体结合位点(5’taggag 3’)，3’端添加链接dna(gggtctgggtctgggtct)和终止密码子，形成如图10所示的拟抗体筛选库的dna结构。所述dna结构中，t7 promoter：t7噬菌体rna聚合酶启动子；rbs：ribosome-binding site，核糖体结合位点；链接dna：3个重复的甘氨酸和丝氨酸序列，设计用于通过共价键连接嘌呤霉素连接体，用于基于核糖体展示技术和rna展示技术的蛋白质类药物筛选系统。
55.修饰后的核苷酸序列为：
56.taatacgactcactatagggttgaactttaagtaggagatatatccatgagcgtttctgatgttccgagggacctggaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctggnnknnknnknnknnknnknnknnknnktacnnkatcacttacggagaannknnknnknnknnknnknnkcagnnkttcnnkgtgcctnnknnknnknnknnkgctaccatcagcggccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactnnknnknnknnknnknnknnknnknnknnkccaatttccattaattaccgaacagggtctgggtctgggtcttaggacggggggcggaaa。(seq id no:2)
57.翻译后所得拟抗体的氨基酸序列为：
58.msvsdvprdlevvaatptslliswxxxxxxxxxyxitygexxxxxxxqxfxvpxxxxxatisglkpgvdytitvyavtxxxxxxxxxxpisinyrtgsgsgs。(seq id no:3)
59.其中x为突变位点。
60.2.dna合成
61.使用重叠延伸聚合酶链式反应，通过两步pcr合成完整拟抗体的dna链。下列pcr扩增使用new england biolabs公司生产的phusion high-fidelity dna polymerase(货号m0530s)。
62.2.1第一步延伸pcr
[0063][0064]
引物的dna序列：
[0065]
f140(5
’‑3’
)(引物合成时，n为a，t，g和c的等摩尔混合物，k为g和t的等摩尔混合物)：
[0066]
cagcctactgatcagctggnnknnknnknnknnknnknnknnknnktacnnkatcacttacggagaannknnknnknnknnknnknnkcagnnkttcnnkgtgcctnnknnknnknnknnkgctaccatcagcggcctta；(seq id no:4)
[0067]
r113(5
’‑3’
)(引物合成时，n为a，t，g和c的等摩尔混合物，m为c和a的等摩尔混合物)：
[0068]
gttcggtaattaatggaaattggmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnnagtgacagcatacacagtgatggtataatcaactccaggtttaaggccgctgatggtagc。(seq id no:5)
[0069]
pcr结束后，取2μl产物于3％琼脂凝胶电泳检测产物dna的大小。产物是大小为234碱基长度的dna片段，无杂带。产物dna多样性：1.5*10
14
，产物里每种dna有1条链。
[0070]
2.2第二步延伸pcr
[0071][0072]
引物dna序列(5
’‑3’
)：
[0073]
t7-f118：
[0074]
taatacgactcactatagggttgaactttaagtaggagatatatccatgagcgtttctgatgttccgagggacctggaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctgg；(seq id no:6)
[0075]
r60：
[0076]
tttccgccccccgtcctaagacccagacccagaccctgttcggtaattaatggaaattgg。(seq id no:7)
[0077]
pcr结束后，取2μl产物于3％琼脂凝胶电泳检测产物dna的大小。结果如图2所示，终产物是大小为370碱基长度的dna片段，无杂带。产物dna多样性：1.5*10
14
(2.5
×
)，产物里每种dna有5条链。
[0078]
3.终产物dna库的提取及纯化
[0079]
为了最大程度提取出含不同序列的dna库，按照如下方法进行终产物dna的提取与纯化：
[0080]
1)加同等体积的苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，10mm tris饱和溶液，ph8.0，1mm edta(sigma-aldrich公司，货号p3803)。*使用1.7ml的eppendorf管，*确保使用溶剂的下层液。
[0081]
2)剧烈震荡混匀至少10秒。
[0082]
3)离心3分钟，转速13000rpm。
[0083]
4)分离取出上层液(含所提取dna)，丢弃下层液(有机层)。
[0084]
5)取出的上层液中加同等体积的氯仿
–
异戊醇混合物(24:1，sigma-aldrich公司，货号25666)。
[0085]
6)再次剧烈震荡混匀至少10秒。
[0086]
7)离心3分钟，转速13000rpm。
[0087]
8)再次分离取出上层液(含所提取dna)，丢弃下层液(有机层)。
[0088]
9)取出的上层液中加入1/10体积的3m nacl，加入2.2倍体积的100％乙醇，混匀，放置于冰上至少10分钟。
[0089]
10)离心15分钟，转速13000rpm。
[0090]
11)丢弃上清液(可见dna沉淀于管底部)。
[0091]
12)用0.5倍原pcr体积的70％乙醇洗两次沉淀物。
[0092]
13)离心3分钟，转速13000rpm。
[0093]
14)丢弃上清液，室温下干燥沉淀的dna。然后将dna溶解于16μl的milli q水中，用于下一步转录(如果沉淀物少，可溶解于8μl的milli q水中)。
[0094]
实施例2.拟抗体的rna库的合成
[0095]
1.体外转录
[0096]
以实施例1步骤3(终产物dna库的提取及纯化)纯化的dna库为模板，使用hiscribe t7 quick high yield rna synthesis kit(new england biolabs公司生产，货号e2050s)进行体外转录，产生rna库。
[0097]
1)设置以下转录反应(反应体积可根据需要而改变)：
[0098][0099]
2)放置于37℃恒温器中至少8-10小时(推荐过夜)。
[0100]
3)加入milli q水(60μl)使总体积达到100μl(2
×
)，加入4μl的dnase1(2
×
)。室温下放置15分钟。加入等体积(104μl)的含有0.6m nacl和10mm edta的混合溶液。加入0.8倍体积(166.4μl)的异丙醇，放置于-20℃冰箱30分钟。
[0101]
4)离心15分钟，转速13000rpm。
[0102]
5)使用100μl的70％乙醇清洗，然后再次离心3分钟，丢弃上清液。清洗两次。
[0103]
6)室温下干燥沉淀的rna，注意避免放置于室温下过久。将沉淀的rna充分溶解于至少10μl的milli q水中，得到rna溶液。
[0104]
2.rna库的纯化和提取
[0105]
向步骤1获得的rna溶液中加入等体积(10μl)的2
×
rna loading dye，98℃加热2分钟。使用8％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳提取和纯化rna库。
[0106]
1)准备8％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲液使用1
×
tbe(tris硼酸盐
–
edta缓冲液)。注意使用宽的teflon梳子。
[0107]
8％的变性聚丙烯酰胺凝胶(13cm
×
13cm
×
1mm)制作方法如下:
[0108]
18ml的含有8.8％丙烯酰胺和6.7m尿素的溶液
[0109]
2ml 5
×
tbe(1ml 10
×
tbe 1ml milliq水)
[0110]
15μl temed
[0111]
200μl 10％aps*
[0112]
*加入10％aps(过硫酸铵)后快速将溶液加入到准备好的胶板中，插入宽的teflon梳子。
[0113]
2)使用25ma电流进行凝胶电泳，直到溴酚蓝条带到达胶板底部(建议加样前预先
nacl的pbs溶液)洗磁珠三遍，丢弃缓冲液，于磁珠也加入sds上样缓冲液。95℃加热2分钟变性。sds凝胶电泳，然后使用考马斯亮蓝染色。结果如图4所示，随着所用蛋白质摩尔数量增加，磁珠(b)和上清液(s)的蛋白质条带逐渐加深。25pmol时，未见上清液有剩余蛋白质，蛋白质全部用于包裹磁珠，磁珠可能未被充分包裹。50pmol和75pmol时，上清液中剩余蛋白质逐渐增多，且覆盖于磁珠的蛋白质量未变化，说明加入50pmol时，蛋白质已可充分包裹磁珠。即，50pmol的靶蛋白质是充分包裹40μg磁珠所需要的量。
[0129]
2.筛选针对靶蛋白质的拟抗体
[0130]
a.嘌呤霉素连接体与拟抗体的rna库的连接
[0131]
本实验所使用的嘌呤霉素连接体如下：
[0132]5’‑
[pho]ctcccgccccccgtcc-(c18)(c18)(c18)(c18)(c18)(c18)-cc-嘌呤霉素-3’，
[0133]
其中，[pho]代表po4。寡核苷酸(ctcccgccccccgtcccc)(seq id no:8)的5’端修饰po4，3’端修饰嘌呤霉素，在所述寡核苷酸第16个碱基和第17个碱基之间并入6个spacer 18(六乙二醇)，寡核苷酸由hplc纯化。
[0134]
嘌呤霉素连接体的功能和机制：嘌呤霉素连接体5’端的磷酸基团在t4 rna连接酶的作用下可与位于rna链3’端的-oh基团连接。嘌呤霉素连接体3’端可在无细胞蛋白质翻译结束后，进入核糖体a受位，通过共价键与翻译出的蛋白质c端结合。使用嘌呤霉素连接体可使每个rna与它所表达的拟抗体相连。
[0135]
1.合成嘌呤霉素连接体，建立嘌呤霉素连接体与实施例2制备的拟抗体的rna库的连接反应(可按需求调整反应体积)：
[0136][0137]
室温条件下放置2-4小时反应。注：连接体系中使用的pnk为t4多聚核苷酸激酶(t4 polynucleotide kinase，new england biolabs，货号m0201s)，目的是充分使嘌呤霉素连接体的5’端磷酸化。所使用的10
×
t4 rna连接酶缓冲液和200u/μl t4 rna连接酶从thermo fisher公司定制。
[0138]
2.加同等体积(20μl)的苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，10mm tris饱和溶液，ph 8.0，1mm edta(sigma-aldrich公司，货号p3803)。剧烈震荡混匀至少10秒后，离心15200
×
g，3分钟，将上层(水层)液体转移至新的离心管中。
[0139]
3.加入和离心管内同等体积(小于等于20μl)的氯仿
–
异戊醇混合物(24:1，sigma-aldrich公司，货号25666)。剧烈震荡混匀至少10秒后，离心15200
×
g，3分钟，再次将上层
(水层)液体转移至新的离心管中。
[0140]
4.加入1/10体积的3m nacl，2.2倍体积的100％乙醇，0.2μl的glycogen(ultrapure glycogen，thermo fisher，货号10814010)。放置于-20℃冰箱30分钟。离心15200
×
g，15分钟，可见rna沉淀于管底部。丢弃上清液，用50μl 70％乙醇洗两次，离心丢弃上清液，室温下干燥rna沉淀。
[0141]
5.溶解rna于3μl水中。注意：100％提取会得到10μm mrna-嘌呤霉素连接体，但是实际提取率会因操作精准度而异，会低于100％。由于最终提取到的rna液体中含有atp，故使用分光光度仪无法准确测出浓度。
[0142]
为了检测嘌呤霉素连接体的连接效率和最终rna的回收情况，须使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳。分别于未连接嘌呤霉素连接体的浓度为10μm的rna库和溶解于3μl水中的rna-嘌呤霉素连接体样本中取1μl样本，加入1μl的2
×
rna loading dye，98℃加热2分钟变性。使用浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，缓冲液使用1
×
tbe(tris硼酸盐
–
edta缓冲液)。8％的聚丙烯酰胺凝胶(13cm
×
13cm
×
1mm)制备如下：18ml的含有8.8％丙烯酰胺及6.7m尿素的溶液，2ml 5
×
tbe(1ml 10
×
tbe 1ml milliq水)，15μl temed，200μl 10％aps(过硫酸铵)。混合后迅速倒入胶板中。加入样本后，使用25ma电流进行凝胶电泳，直到溴酚蓝条带到达胶板底部(建议加样前预先使用25ma电流电泳15分钟)。电泳结束后切除多余的凝胶，使用1
×
tbe摇动清洗样本10分钟。丢弃清洗液，使用溴化乙锭染rna 10分钟。回收溴化乙锭以备下次使用。用milliq水摇晃清洗10分钟。使用紫外光分析暗箱检测样本。
[0143]
嘌呤霉素连接体与rna库的连接产物出现两个条带，上层条带为连接嘌呤霉素连接体后的rna库的条带，下层条带为未连接嘌呤霉素连接体的rna库的条带，连接率大约为50％。
[0144]
b.体外无细胞表达拟抗体
[0145]
所需的体外无细胞表达系统来源于大肠杆菌的蛋白质表达系统，包含除释放因子外的蛋白质翻译所需的所有成分(参考shimizu y,kanamori t,ueda t.protein synthesis by pure translation systems.methods.2005jul；36(3):299-304.doi:10.1016/j.ymeth.2005.04.006)。具体构建如下：50mm hepes-koh(ph 7.6)；12mm醋酸镁；100mm醋酸钾；2mm亚精胺；20mm磷酸肌酸；2mm dtt；2mm atp；2mm gtp；1mm ctp；1mm utp；0.1mm 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid；0.5mm 20种氨基酸；1.5mg/ml大肠杆菌总trna；0.73μm alars；0.03μm argrs；0.38μm asnrs；0.13μm asprs；0.02μm cysrs；0.06μm glnrs；0.23μm glurs；0.02μm glyrs；0.02μm hisrs；0.04μm ilers；0.04μm leurs；0.11μm lysrs；0.03μm metrs；0.68μm phers；0.16μm prors；0.04μm serrs；0.09μm thrrs；0.03μm trprs；0.02μm tyrrs；0.02μm valrs；0.6μm mtf；0.26μm ef-g；10μm ef-tu；10μm ef-ts；2.7μm if1；0.4μm if2；1.5μm if3；0.5μm rrf；0.1μm t7 rna聚合酶；4μg/ml肌酸激酶；3μg/ml肌激酶；0.1μm焦磷酸酶；0.1μm核苷二磷酸激酶；1.2μm核糖体。
[0146]
目前，商用的能满足该条件并且证实有效的无细胞表达系统有两种。一种是美国new england biolabs公司生产的purexpress体外蛋白质表达试剂盒(货号e6850s)，另一种是日本gene frontier公司生产的purefrex2.0体外蛋白质表达试剂盒(货号pf201-0.25-ex)。
[0147]
使用purexpress delta rf123 kit(new england biolabs，货号e6850s)体外表
达拟抗体rna筛选库的反应如下。反应体系的设置可按需要进行改变，一般建议第一个筛选循环使用10
×
反应体系，第二个筛选循环后使用2
×
反应体系。
[0148][0149]
37℃恒温反应30分钟。然后加入表达体系的1/5体积的100mm edta(ph＝8.0)，37℃恒温30分钟，目的是解离核糖体复合物，获得rna-拟抗体库。如下：
[0150][0151]
c.反转录合成cdna-拟抗体库
[0152]
使用反转录试剂盒m-mlv rt rnase(h-)pointmutant(promega m3682)，按照试剂盒说明书的方法合成与拟抗体相连接的rna的cdna。反应体系的设置可按需要进行改变，一般建议第一个筛选循环使用10
×
反应体系，第二个筛选循环后使用2
×
反应体系。
[0153][0154]
将上面的反转录混合物加入上述步骤b(体外无细胞表达拟抗体)获得的rna-拟抗体库中，如下：
[0155][0156][0157]
42℃恒温反应1小时。
[0158]
反转录引物：
[0159]
library-r36：tttccgccccccgtcctaagacccagacccagaccc。(seq id no:9)
[0160]
1小时后，留取0.5μl样本加入499.5μl水，置于冰上，用于实时定量pcr反应。在剩余49.5μl样本中加入靶蛋白质缓冲液(储存靶蛋白质的缓冲液，即含有20mm tris-hcl(ph 7.0)，150mm nacl的pbs溶液)50.5μl。
[0161]
d.脱盐
[0162]
1.准备一个～0.7ml的脱盐柱。脱盐柱用于去除样本内会增加拟抗体非特异结合的物质，比如镁离子和edta。
[0163]
2.脱盐柱制作方法如下：准备一个1ml的一次性注射器和一个15ml的离心管。取出注射器的活塞，在针筒内放入一小片kimwipe或lenswipe低尘土擦拭纸，用活塞将擦拭纸推入针筒底部，目的为了下一步在针筒内加入葡萄糖凝胶。提前把g-25葡萄糖凝胶浸泡于靶蛋白质缓冲液内，充分浸泡至少4小时(推荐前一天准备，常温浸泡过夜后4℃保存)。向针筒内加入准备好的g-25葡萄糖凝胶，按步骤3离心后使得针筒内的凝胶的量达到针筒0.7ml刻度线。
[0164]
3.把准备好的针筒放入15ml的离心管，转速800
×
g(不是rpm)离心1分钟。然后向针筒内加入300μl的靶蛋白质缓冲液并再次离心，时间至少3分钟。把离心后的针筒放入一个新的离心管内。(注意，此时如果再次离心，针筒内不应有液体流入到离心管内。)
[0165]
4.把经过步骤c反转录后的样本加入脱盐柱，转速800
×
g离心3分钟，样本经过脱盐柱流入离心管内。此时离心管内得到样本体积应与加入脱盐柱前的样本体积相同。
[0166]
留取0.5μl样本加入499.5μl水，置于冰上，用于实时定量pcr反应。向剩余样本内加入等体积的2
×
封闭液(含有0.2％牛血清白蛋白bsa的靶蛋白质缓冲液)。
[0167]
e.预清除
[0168]
预清除需6-12次，预清除的目的是移除拟抗体库内可与磁珠非特异性结合的拟抗体。预清除前，需准备能与靶蛋白特异结合的磁珠，每次预清除可使用2至5微升磁珠。若需预清除6次，则准备6个1.7毫升的离心管，加入靶蛋白质缓冲液(每微升磁珠需使用至少50微升缓冲液清洗)和磁珠。用移液枪吹打磁珠，然后用磁铁固定磁珠后，移除缓冲液。如此方法清洗2至3次。注意：操作时应迅速，不能将磁珠干燥。
[0169]
把步骤d得到的样本加入2至5μl的清洗好的磁珠中，于4℃旋转10分钟，然后用吸铁石把磁珠固定在离心管内壁，将样本移至新的磁珠，按此步骤预清除6-12次。预清除完成后，将样本放入新的1.7毫升的离心管内。留取0.5μl样本加入499.5μl水，置于冰上，用于实时定量pcr反应。
[0170]
f.蛋白质固定
[0171]
充分固定并包裹磁珠所需要的靶蛋白质的量因靶蛋白质的不同而改变。使用至少2倍的所需量充分包裹磁珠。如何确定所需蛋白质的量可参见前文。
[0172]
磁珠的使用量因磁珠的不同和拟抗体的分子数量不同而改变。以thermo fisher公司生产的his标签的磁珠(dynabeads his-tag isolation and pulldown，货号10103d)为例，每微升磁珠含有磁珠40μg。推荐第一循环筛选使用4-5μl磁珠，之后每个循环使用1-2μl磁珠。注意：大量的磁珠会增加拟抗体与磁珠的非特异性结合，不推荐使用过量磁珠。
[0173]
操作：使用靶蛋白质缓冲液清洗所需磁珠2-3次，移除缓冲液，加入靶蛋白质，4℃下旋转30分钟。用100μl蛋白质缓冲液清洗3次包裹有靶蛋白质的磁珠，最后一次清洗前，将磁珠移至新的离心管内。
[0174]
g.筛选
[0175]
将完成步骤e的样本分为等体积的两份，一半与步骤f准备的包裹了靶蛋白质的磁珠相混合(阳性筛选样本)，另一半与未包裹靶蛋白质的磁珠混合(阴性对照样本)，4℃条件下混合30分钟。使用100μl靶蛋白质缓冲液充分清洗磁珠3-5次(使用移液枪吹打清洗，若磁珠易与移液枪枪头沾粘，则用手指轻弹离心管清洗磁珠)。最后一次清洗前，将磁珠移至新的离心管内。清洗完成后，移除缓冲液，加入50μl的洗脱液(洗脱液的配制见步骤h)。
[0176]
h.获取拟抗体的cdna
[0177]
配制洗脱液如下，建议使用new england biolabs公司生产的phusion high-fidelity dna polymerase试剂盒(货号m0530s)。使用量：阳性筛选样本和阴性对照样本各50μl，额外准备50μl用于稀释在步骤i的定量pcr中使用的标准dna以及空白对照。
[0178]
洗脱液：
[0179][0180]
阳性筛选样本和阴性对照样本分别加入50μl的洗脱液后，置于98℃加热5分钟。然后迅速将含有cdna的洗脱液移入新的离心管，放置于冰上。
[0181]
cdna-f46(5
’‑3’
)：
[0182]
taatacgactcactatagggttgaactttaagtaggagatatatcc；(seq id no:10)cdna-r24(5
’‑3’
)：
[0183]
tttccgccccccgtcctaagaccc。(seq id no:11)
[0184]
i.定量pcr
[0185]
使用定量pcr检测的样本为：步骤c，d，e稀释于500μl水中的dna，步骤h得到的阳性筛选样本和阴性对照样本的dna(不需要稀释)，5个等比例稀释的标准dna，以及1个空白对照的dna(洗脱液)。
[0186]
使用定量pcr的目的：a)获取一个循环内每一步骤拟抗体dna扩增所需的c
t
值及dna数量，比较区别和变化，用于优化筛选；b)比较阳性筛选样本与阴性对照样本c
t
值的区别；c)通过确定阳性筛选样本与阴性对照样本的cdna量，计算每个循环阳性筛选样本和阴性对照样本中dna的量和筛选前(预清除后的样本)的dna的量的比值(回收率)；d)使用洗脱液作为空白对照，检测样本中是否存在污染dna，若空白对照的c
t
值小于28，说明所有样本中可能存在污染dna，需找出dna污染来源，并重新进行相应循环的筛选。
[0187]
操作方法：提前准备标准dna用于定量pcr。标准dna的准备方法：使用浓度为10μm的拟抗体的rna库，反转录可得浓度为10μm的dna，使用步骤h制备的洗脱液，分别稀释为如下浓度：1nm，100pm，10pm，1pm，100fm。
[0188]
使用sybr green定量试剂盒(thermo fisher，货号a25780)准备定量pcr如下：
[0189][0190]
定量pcr时间及温度设置如下：95℃/10分钟；95℃/20秒，55℃/20秒，72℃/1分钟，40个循环。
[0191]
j.pcr扩增筛选样本的cdna，准备下一循环
[0192]
使用new england biolabs公司生产的phusion high-fidelity dna polymerase(货号m0530s)进行pcr扩增：
[0193][0194]
温度及时间设定如下：98℃/5分钟；n个循环：98℃/20秒，55℃/20秒，72℃/1分钟；72℃/5分钟。其中，循环数量(n)是定量pcr得到的阳性筛选样本的ct值。
[0195]
pcr结束后取2μl样本，使用3％琼脂凝胶电泳检测扩增出的拟抗体的dna，所见dna条带大小与设计的拟抗体dna大小一致为正常。若所见dna条带大小与设计的拟抗体dna条带大小不一致，或者出现杂带，说明筛选过程中有dna污染或异常扩增。
[0196]
然后，按照如下方法进行终产物dna的提取与纯化：
[0197]
1)加同等体积的苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，10mm tris饱和溶液，ph8.0，1mm edta(sigma-aldrich公司，货号p3803)。*使用1.7ml的eppendorf管，*确保使用溶剂的下层液。
[0198]
2)剧烈震荡混匀至少10秒。
[0199]
3)离心3分钟，转速13000rpm。
[0200]
4)分离取出上层液(含所提取dna)，丢弃下层液(有机层)。
[0201]
5)取出的上层液中加同等体积的氯仿
–
异戊醇混合物(24:1，sigma-aldrich公司，货号25666)。
[0202]
6)再次剧烈震荡混匀至少10秒。
[0203]
7)离心3分钟，转速13000rpm。
[0204]
8)再次分离取出上层液(含所提取dna)，丢弃下层液(有机层)。
[0205]
9)取出的上层液中加入1/10体积的3m nacl，加入2.2倍体积的100％乙醇，混匀，放置于冰上至少10分钟。
[0206]
10)离心15分钟，转速13000rpm。
[0207]
11)丢弃上清液(可见dna沉淀于管底部)。
[0208]
12)用100μl的70％乙醇洗两次沉淀物。
[0209]
13)离心3分钟，转速13000rpm。
[0210]
14)丢弃上清液，室温下干燥沉淀的dna。然后将dna溶解于10μl的milli q水中。
[0211]
k.转录
[0212]
1)以步骤j获得的dna为模板，使用hiscribe t7 quick high yield rna synthesis kit(new england biolabs公司生产，货号e2050s)进行转录。设置转录体系为7.5μl的反应(反应体积可按需要调整)。
[0213][0214]
2)放置于37℃恒温器或pcr过夜。
[0215]
3)加入milli q水使总体积达到50μl，加入2μl的dnase 1。室温下放置15分钟。加入等体积(52μl)的含有0.6m nacl和10mm edta的混合溶液。加入0.8倍体积(83.2μl)的异丙醇，放置于-20℃冰箱30分钟。
[0216]
4)离心15分钟，转速13000rpm。
[0217]
5)使用100μl的70％乙醇清洗，然后再次离心3分钟，丢弃上清液。清洗两次。
[0218]
6)室温下干燥沉淀的rna，注意避免放置于室温下过久。将沉淀的rna充分溶解于至少10μl的milli q水中。
[0219]
接下来，重复上述a-i的筛选过程。
[0220]
结果分析：
[0221]
经过4-7个循环后，若阳性筛选样本的c
t
值逐渐小于阴性对照样本的c
t
值，且每个循环阳性筛选样本的dna回收率逐渐增加且越来越大于阴性对照样本的dna回收率，则表明与靶蛋白质结合的拟抗体数量增加，阳性筛选样本中存在能与靶蛋白质结合的拟抗体的dna。此时，可通过第二代dna测序，确定筛选得到的拟抗体的dna序列。
[0222]
本次筛选共4个循环。图5-8为采用本发明制备的拟抗体库针对靶蛋白质进行拟抗体筛选的第1-4个循环的定量pcr结果。图5-8中，c：步骤c得到的反转录后的dna；d：脱盐后样本的dna；e：步骤e预清除后的dna；p：阳性筛选得到的拟抗体的dna；n：阴性对照的dna；blank：空白对照，即洗脱液所含的dna。表1-4为每个循环各个样本的c
t
值和dna量。
[0223]
表1.第一循环中各个样本的c
t
值和dna量
[0224]
样本名cт值dna量反转录(c)11.614717481.98641e 15脱盐(d)14.701734544.50844e 13预清除(e)15.256355292.28378e 13阳性筛选(p)16.462530145.20338e 12阴性对照(n)18.923074722.54614e 11空白(blank)31.0009059994109.78125
[0225]
表2.第二循环中各个样本的c
t
值和dna量
[0226]
样本名cт值dna量
反转录(c)14.031106953552012.25脱盐(d)17.30154419478917.5预清除(e)18.51946259227086.3906阳性筛选(p)15.457153321482603.875阴性对照(n)23.0530319214121.37793空白(blank)30.9497604480428.5572
[0227]
表3.第三循环中各个样本的c
t
值和dna量
[0228]
样本名cт值dna量反转录(c)13.976576813115014.75脱盐(d)16.94735336476487.9688预清除(e)18.20386696215361.75阳性筛选(p)17.98355675247536.0938阴性对照(n)25.916492461645.260254空白(blank)28.9102478248.03862
[0229]
表4.第四循环中各个样本的c
t
值和dna量
[0230][0231][0232]
确定筛选样本与阴性对照样本的cdna量后，计算每个循环中阳性筛选样本和阴性对照样本中dna的量占筛选前(预清除后的样本)的dna的量的比值，即为回收率，若每个循环的拟抗体阳性回收率逐渐增加，且阴性对照的回收率未显著增加，则说明能与靶蛋白结合的拟抗体被筛选出。注意：计算回收率时，先使用定量pcr检测到的dna量计算原样本含有的dna量，再计算回收率。
[0233]
图9和表5示出了本次筛选每个循环的阳性筛选样本的dna回收率(阳性回收率)与阴性对照样本的dna回收率(阴性回收率)。可以看出，阳性回收率从第三个循环开始迅速增加，预示有拟抗体被成功筛选。通过dna测序，获得被筛选的拟抗体的核酸序列。拟抗体序列可通过使用pure系统或原核细胞系统表达并进行进一步验证。
[0234]
表5
[0235] 第一循环第二循环第三循环第四循环阳性回收率0.1403318380.1915661241.0881349831.550549189阴性回收率0.0222170.0012732530.0103641750.026623753