一种基于酰胺键的吩噁嗪衍生物及其制备方法和应用

1.本发明涉及吩噁嗪衍生物和荧光检测，具体属于一种基于酰胺键的吩噁嗪衍生物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.动物、植物和微生物体内广泛存在着可以将酯类物质水解为羧酸和醇的羧酸酯酶。羧酸酯酶是一类丝氨酸蛋白酶，在生物体内被用于催化许多含有酯、酰胺、硫酯或乙酰基的化合物的水解。在生物体内，羧酸酯酶能够参与许多药物的水解或激活，基于羧酸酯酶的水解特性，许多酯前药策略被开发出来，比如将细胞通透性差的羧酸盐类药物以酯的形式进行预包装以使其可以顺利地透过细胞膜，最终经羧酸酯酶的水解释放出有效的药物。近年来，研究表明，人体内羧酸酯酶水平的异常可能与许多疾病(如动脉粥样硬化、肝癌和高血脂症)密切相关。
3.对于生命系统中这一重要的水解酶，进一步研究其生物分布和生理作用有利于对其进行有效的干预，以预防相关主要疾病的发生和发展。随着有机合成技术的改进，制备了基于酰胺键的吩噁嗪衍生物的高性能荧光探针，可作为生命系统中有效的羧酸酯酶视觉荧光追踪工具。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种基于酰胺键的吩噁嗪衍生物及其制备方法，以及将该吩噁嗪衍生物用于特异性检测羧酸酯酶。
5.本发明提供的一种基于酰胺键的吩噁嗪衍生物，中文名称为(3,7-二(二乙胺基)-10h-苯恶嗪)-10-(环丙基)甲酮、(3,7-二(二乙胺基)-10h-苯恶嗪)-10-(环丁基)甲酮、(3,7-二(二乙胺基)-10h-苯恶嗪)-10-(环戊基)甲酮或(3,7-二(二乙胺基)-10h-苯恶嗪)-10-(环己基)甲酮；其英文名称为(3,7-bis(diethylamino)-10h-phenoxazin-10-yl)(cyclopropyl)methanone、(3,7-bis(diethylamino)-10h-phenoxazin-10-yl)(cyclobutyl)methanone、(3,7-bis(diethylamino)-10h-phenoxazin-10-yl)(cyclopentyl)methanone或(3,7-bis(diethylamino)-10h-phenoxazin-10-yl)(cyclohexyl)methanone。分别命名为吩噁嗪衍生物1～4，结构式如下：
[0006][0007]
本发明提供的一种基于酰胺键的吩噁嗪衍生物的制备方法，包括如下步骤：
[0008]
(1)将碱性蓝3、碳酸钠和二氯甲烷混合物在氮气保护下搅拌并加热至45℃，并在此温度下缓慢加入用水溶解的连二亚硫酸钠，将混合物在45℃下反应至溶液由蓝色变为红色(约30min～1h)，反应完毕后停止加热并在保持搅拌10min，静置至体系分层；其中投料摩尔比为碱性蓝3染料:碳酸钠:连二亚硫酸钠＝1:4～5:4～5。
[0009]
(2)在另一氮气保护体系中加入4-二甲氨基吡啶和碳酸钠，冰浴条件下边搅拌边加入步骤(1)中静置分层后的二氯甲烷相，之后缓慢滴入环丙基甲酰氯，反应2小时后停止反应，将反应体系过滤，得到深蓝色粗产物溶液；旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡黄色固体目标产物，即为吩噁嗪衍生物1；其中投料摩尔比为碳酸钠：4-二甲氨基吡啶：环丙基甲酰氯＝12.5～14:5:6；
[0010]
(3)将步骤(2)中的环丙基甲酰氯替换为环丁基甲酰氯、环戊基甲酰氯、环己基甲酰氯以制备吩噁嗪衍生物2～4。
[0011]
作为优选：步骤(1)中所述投料摩尔比为碱性蓝3染料:碳酸钠:连二亚硫酸钠＝1:4:4。步骤(2)中所述投料摩尔比为碳酸钠:4-二甲氨基吡啶:环丙基甲酰氯＝12.5:5:6。
[0012]
上述制备的吩噁嗪衍生物1～4作为近红外荧光探针，碱性蓝3作为荧光团，酰胺键作为羧酸酯酶的识别位点，与羧酸酯酶作用时酰胺键被切断，释放出碱性蓝3荧光团，发出红色荧光，可用于羧酸酯酶的检测。
[0013]
本发明提供的一种检测羧酸酯酶的方法，步骤为：
[0014]
(1)配制ph 7.4的10mm的磷酸缓冲盐溶液；将吩噁嗪衍生物1溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)配制成2mm的储备液，对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作，制备相应的2mm的储备液；将羧酸酯酶冻干粉溶于水配制60u/ml的羧酸酯酶储备液；
[0015]
(2)荧光光谱：取830μl的磷酸缓冲盐溶液、2.5μl吩噁嗪衍生物1储备液、167μl的羧酸酯酶储备液加入到比色皿中，立即以630nm激发光进行荧光光谱扫描，时间间隔为10min。对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作；
[0016]
(3)动力学曲线：取830μl的磷酸缓冲盐溶液、2.5μl吩噁嗪衍生物1储备液、167μl
的羧酸酯酶储备液加入到比色皿中，立即以630nm激发波长进行动力学扫描，时长为4800s。对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作；
[0017]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0018]
1、本发明吩噁嗪衍生物可灵敏、快速地检测羧酸酯酶；
[0019]
2、本发明技术操作较为简单，检测简便，仅需荧光检测器；
[0020]
3、本发明检测信号明显，反应溶液颜色变化肉眼可见，反应时间迅速。
附图说明
[0021]
图1实施例1制备的吩噁嗪衍生物1的核磁共振氢谱图
[0022]
图2实施例1制备的吩噁嗪衍生物2的核磁共振氢谱图
[0023]
图3实施例1制备的吩噁嗪衍生物3的核磁共振氢谱图
[0024]
图4实施例1制备的吩噁嗪衍生物4的核磁共振氢谱图
[0025]
图5实施例1制备的吩噁嗪衍生物1的高分辨率质谱图
[0026]
图6实施例1制备的吩噁嗪衍生物2的高分辨率质谱图
[0027]
图7实施例1制备的吩噁嗪衍生物3的高分辨率质谱图
[0028]
图8实施例1制备的吩噁嗪衍生物4的高分辨率质谱图
[0029]
图9实施例2吩噁嗪衍生物1与羧酸酯酶响应的荧光光谱图
[0030]
图10实施例2吩噁嗪衍生物2与羧酸酯酶响应的荧光光谱图
[0031]
图11实施例2吩噁嗪衍生物3与羧酸酯酶响应的荧光光谱图
[0032]
图12实施例2吩噁嗪衍生物4与羧酸酯酶响应的荧光光谱图
[0033]
图13实施例3吩噁嗪衍生物1～4与羧酸酯酶响应后，676nm处的荧光强度值随时间变化图
[0034]
图14实施例4吩噁嗪衍生物1～4孵育细胞的细胞成像图
[0035]
图15实施例4吩噁嗪衍生物1～4孵育细胞的细胞荧光强度定量处理图
具体实施方式
[0036]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
[0037]
说明书和说明书附图中的ces-1、ces-2、ces-3、ces-4即为吩噁嗪衍生物1、吩噁嗪衍生物2、吩噁嗪衍生物3、吩噁嗪衍生物4。
[0038]
实施例1
[0039]
吩噁嗪衍生物1～4的合成和表征：
[0040]
(1)将1795mg碱性蓝3(5mmol)、2120mg碳酸钠(20mmol)和20ml二氯甲烷的混合物在氮气保护下搅拌并加热至45℃，缓慢加入用20ml水溶解的3482mg连二亚硫酸钠(20mmol)，将混合物在45℃下反应至溶液由蓝色变为红色(约30min)，反应完毕后停止加热并在保持搅拌10min，静置至体系分层。
[0041]
(2)在另一氮气保护体系中加入611mg 4-二甲氨基吡啶(5mmol)和1325mg碳酸钠(12.5mmol)，冰浴条件下边搅拌边加入步骤(1)中静置分层后的二氯甲烷相，之后缓慢滴入627.18mg环丙基甲酰氯(6mmol)，反应2小时后停止反应，将反应体系过滤，得到深蓝色粗产
物溶液。旋蒸除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到淡黄色至黄色固体目标产物，命名为吩噁嗪衍生物1。
[0042]
(3)依次将步骤(2)中的627.18mg环丙基甲酰氯(6mmol)替换为711.36mg环丁基甲酰氯(6mmol)、795.54mg环戊基甲酰氯(6mmol)和879.66mg环己基甲酰氯(6mmol)以制备吩噁嗪衍生物2～4。
[0043]
图1～图4显示了吩噁嗪衍生物1～4的核磁共振氢谱(1h nmr)图。
[0044]
吩噁嗪衍生物1：1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.42(d,j＝7.9hz,2h),6.42
–
6.35(m,4h),3.33(q,j＝7.1hz,8h),2.16
–
2.10(m,1h),1.57(d,j＝10.0hz,2h),1.15(t,j＝7.1hz,12h),0.80(td,j＝6.6,3.5hz,2h).
[0045]
吩噁嗪衍生物2：1h nmr(600mhz,dmso)δ7.24(s,2h),6.41(d,j＝8.7hz,2h),6.38(s,2h),3.67
–
3.60(m,1h),3.33(d,j＝6.3hz,8h),2.17
–
2.09(m,2h),1.90(d,j＝9.0hz,2h),1.81(dd,j＝18.6,9.6hz,1h),1.70(d,j＝9.9hz,1h),1.08(t,j＝7.0hz,12h).
[0046]
吩噁嗪衍生物3：1h nmr(600mhz,dmso)δ7.27(d,j＝8.7hz,2h),6.41(d,j＝8.9hz,2h),6.39(s,2h),3.36
–
3.31(m,8h),3.28(d,j＝8.0hz,1h),1.66(d,j＝18.6hz,4h),1.64
–
1.58(m,2h),1.50
–
1.43(m,2h),1.08(t,j＝7.0hz,12h).
[0047]
吩噁嗪衍生物4：1h nmr(600mhz,dmso)δ7.25(d,j＝8.4hz,2h),6.44
–
6.37(m,4h),2.91(t,j＝11.3hz,1h),1.67(d,j＝9.9hz,4h),1.58(s,1h),1.35(dd,j＝22.7,11.3hz,2h),1.14(td,j＝13.8,7.2hz,3h),1.08(t,j＝6.8hz,12h).
[0048]
图5～8显示了吩噁嗪衍生物1～4的高分辨率质谱图。
[0049]
吩噁嗪衍生物1：calc.for c
24h32
n3o
2
[m h]

394.2495,found 394.2495.
[0050]
吩噁嗪衍生物2：calc.for c
25h34
n3o
2
[m h]

408.2651,found 408.2650.
[0051]
吩噁嗪衍生物3：calc.for c
26h36
n3o
2
[m h]

422.2808,found 422.2808.
[0052]
吩噁嗪衍生物4：calc.for c
27h38
n3o
2
[m h]

436.2964,found 436.2960.
[0053]
实施例2
[0054]
(1)配制ph 7.4的10mm的磷酸缓冲盐溶液，将吩噁嗪衍生物1溶于dmf配制成2mm的储备液，对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作，制备相应的2mm的储备液；将羧酸酯酶冻干粉溶于水配制60u/ml的羧酸酯酶储备液；
[0055]
(2)取830μl的10mm磷酸缓冲盐溶液、2.5μl吩噁嗪衍生物1储备液、167μl的羧酸酯酶储备液加入到比色皿中，立即以630nm激发光进行荧光光谱扫描，时间间隔为10min。结果如图9所示；
[0056]
(3)重复步骤(2)3次，依次将步骤(2)中的对吩噁嗪衍生物1，替换为对吩噁嗪衍生物2～4，依次得到荧光光谱谱图，如图10、11、12所示。光谱显示：以630nm为激发，羧酸酯酶的额外加入使吩噁嗪衍生物1～3在676nm处的荧光强度随着时间的增加而增强，而同等条件下，吩噁嗪衍生物4在676nm处的荧光强度不随时间的增加而变化。
[0057]
实施例3
[0058]
(1)配制ph 7.4的10mm的磷酸缓冲盐溶液；将吩噁嗪衍生物1溶于dmf配制成2mm的储备液，对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作，制备相应的2mm的储备液；将羧酸酯酶冻干粉溶于水配制60u/ml的羧酸酯酶储备液；
[0059]
(2)取830μl的磷酸缓冲盐溶液、2.5μl吩噁嗪衍生物1储备液、167μl的羧酸酯酶储
备液加入到比色皿中，立即以630nm激发波长进行动力学扫描，扫描时长为4800s。对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作。结果如图13所示，光谱显示：以630nm为激发，羧酸酯酶的额外加入使吩噁嗪衍生物1～3在676nm处的荧光强度随着时间的增加而增强，且吩噁嗪衍生物1～3与羧酸酯酶的反应速率依次降低，而同等条件下，吩噁嗪衍生物4在676nm处的荧光强度不随时间的增加而变化。
[0060]
实施例4
[0061]
(1)配制ph 7.4的10mm的磷酸缓冲盐溶液；将吩噁嗪衍生物1溶于dmf配制成2mm的储备液，对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作，制备相应的2mm的储备液；
[0062]
(2)细胞测试：取10μl吩噁嗪衍生物1储备液加入到2ml的磷酸缓冲盐溶液中，使其浓度为10μm；在37℃下用上述溶液孵育人肝癌细胞hepg2 30min，孵育完毕后用2ml磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，在激光扫描共聚焦显微镜下成像；第二组使用人肝正常细胞hl7702重复上述操作。对吩噁嗪衍生物2～4进行同样操作。所有实验组结果如图14所示，定量比较结果如图15所示。