防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗的制作方法

1.本发明涉及一种防治鸭病毒病的四联灭活疫苗，尤其涉及防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗，本发明进一步涉及该四联灭活疫苗的制备方法，属于防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联疫苗及其制备领域。


背景技术：

2.新型鸭呼肠孤病毒病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病，自2017年以来，在山东、河南、江苏等地区的养鸭场中发现。其易感日龄多在5d-25d范围内，发病率一般在10％-70％之间，死亡率一般在 50％-60％之间。日龄越小，发病和死亡率越高。在天气寒冷的环境下，发病率和死亡率都有明显升高。
3.鸭圆环病毒病是危害养鸭业的主要疫病之一，鸭圆环病毒除引起鸭发生原发感染致死亡之外，更严重的是使感染鸭的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，易遭受其他病原的并发或继发感染，使病情加重，造成更大损失。这种可导致机体免疫抑制的病毒，由于经常以亚临诊感染的形式出现，常易被忽视。近年来，随着中国养鸭产业快速发展、养殖规模不断壮大，鸭圆环病的防治逐渐引起重视，但由于鸭圆环病毒在各种细胞系及胚体中增殖均存在困难，因此，以全病毒作为抗原制备疫苗的困难较大。 cho表达系统具有准确的转录后修饰功能，使表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；重组基因的高效扩增和表达能力；具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高等优点，近年来被广泛用于蛋白的表达。本专利利用cho表达系统成功表达了鸭圆环病毒cap蛋白，并制备了一种安全有效的鸭圆环病毒病灭活疫苗。
4.鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病。主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状。鸭肝炎病毒有3个血清型，中国主要流行血清1型和3型鸭病毒性肝炎。本病主要发生于4～ 20日龄雏鸭，成年鸭有抵抗力，鸡和鸭不能自然发病。病鸭和带毒鸭是主要传染源，主要通过消化道和呼吸道感染。饲养管理不良，缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤，均可促使本病发生。本病发生于孵化雏鸭的季节，一旦发生，在雏鸭群中传播很快，发病率可达100％。
5.鸭腺病毒病3型最初于2014年在广东流行逐渐扩大到中国各地特别是南方数省。该病仅见于番鸭，多在15～20日龄发病，发病率40％～50％，死亡率35％～43％。剖检病变的特征为肝脏肿大、色泽变淡或黄化、肝脏出血、坏死，心包积液、心肌出血或坏死，肾脏肿大、出血、坏死。目前，该病已给现地养殖户带来了巨大的经济损失。
6.近年来，随着中国养鸭产业迅猛发展、养殖规模的不断壮大，各种鸭流行性疫病相继发生。从中国不同省份病死鸭子检测数据分析来看，鸭圆环病毒、鸭肝炎、新型呼肠孤病毒和鸭腺病毒3型是引发鸭只发生混合感染的常见病毒。目前尚未有同时防控这四种疫病
有效的疫苗，由此尽快研制出一种安全有、效的四联灭活疫苗尤为关键。


技术实现要素：

7.本发明的目的之一是提供一种安全且有效的同时防治新型鸭呼肠孤病毒病、鸭圆环病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗；
8.本发明的目的之二是提供一种制备所述的四联灭活疫苗方法。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
10.本发明首先提供了同时防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗，包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，其中，所述的灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠孤病毒抗原、鸭肝炎病毒抗原和鸭腺病毒3型抗原。
11.所述的鸭圆环病毒抗原优选是将鸭圆环病毒cap基因经过原核或真核系统重组表达后得到的重组蛋白；最为本发明一种优选的具体实施方式，优选为将seq id n.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至真核表达质粒并转染cho细胞，诱导表达是得到的重组鸭圆环病毒cap 蛋白。
12.作为参考，本发明提供了一种制备重组鸭圆环病毒cap蛋白的方法，包括：
13.(1)将seq idno.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至puc-57载体上，采用pcr方法从puc-ducv-cap重组载体中扩增 ducv-cap基因片段；
14.(2)将pci-gs质粒载体和纯化后的pcr产物使用xhoⅰ、ecorⅰ酶切，回收酶切的pci-gs质粒以及ducv-cap基因片段并进行连接得到 pci-ducv-cap-gs真核表达质粒；
15.(3)将pci-ducv-cap-gs真核表达质粒转染cho细胞，诱导重组 cap蛋白在cho细胞中表达，收集所表达的重组cap蛋白。
16.其中，所述的鸭呼肠孤病毒抗原优选是将鸭呼肠孤病毒s株(其微生物保藏编号为：cgmcc no.20000)在lmh细胞中进行增殖得到的病毒液。
17.所述鸭肝炎病毒抗原的制备可以是将1型和3型鸭肝炎病毒生产用毒种接种易感鸭胚，收获胚液，得到鸭肝炎病毒抗原。
18.所述鸭腺病毒3型抗原的制备可以是将鸭腺病毒3型1生产用毒种接种易感鸭胚，收获胚液，得到鸭腺病毒3型抗原。
19.本发明中所用到的鸭腺病毒3型1生产用毒种可以任何一种通过商业途径购买得到的鸭腺病毒3型毒种，本发明中所用的鸭腺病毒3型1生产用毒种是鸭腺病毒3型fz株，其微生物保藏编号为：cgmcc no.21928，其分类命名是：鸭腺病毒3型，保藏时间是：2021年11月4日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
20.本发明中所述的免疫佐剂可以任何一种常规的免疫佐剂，作为本发明的一种具体的实施方式，所述的免疫佐剂可以为白油、司班-80(span-80)、硬脂酸铝或吐温-80中的任何一种或多种。
21.本发明所述灭活疫苗部分还可包括冻干保护剂。
22.本发明进一步提供了一种制备所述防治新型鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗的方法，包括：
23.(1)油相制备：取白油与司班-80混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌后灭菌，备用；
24.(2)水相制备：将灭活的鸭呼肠孤病毒抗原、鸭病毒性肝炎抗原、鸭腺病毒3型抗原以及重组鸭圆环病毒cap蛋白混合得到抗原混合液；抗原混合液与无菌吐温-80混匀直至吐温-80完全溶解；
25.(3)乳化：取油相在组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相，加完水相后再搅拌，即得。
26.作为本发明的一种优选的实施方案，步骤(1)中将取白油与司班-80 按照94：6的比例混合均匀加入2％的硬脂酸铝；所述的搅拌是搅拌至淡黄色且澄清透明后121℃高压蒸汽灭菌。
27.作为本发明的一种优选的实施方案，步骤(2)中抗原混合液与无菌吐温-80(tween-80)按照97.5：2.5的比例震荡混匀直至吐温-80完全溶解。
28.作为本发明的一种优选的实施方案，取油相3份放入组织匀浆机内慢速搅拌，同时徐徐加入水相2份，加完后再以10000r/min的转速搅拌 4min-5min。
29.安全性试验检验结果表明，本发明制备的四联灭活疫苗接种雏鸭，观察期间雏鸭全部健活，无局部和全身不良反应，具有良好的安全性。
30.根据本发明四联灭活疫苗免疫保护效力试验结果可见，雏鸭免疫后 21日攻击鸭圆环病毒强毒，21日后采全血以rt-qpcr方法检测全血中 ducv核酸拷贝数，结果免疫组雏鸭10/10保护，攻毒对照组雏鸭10/10 发病；雏鸭免疫后3周采血，用中和试验方法测定鸭呼肠孤病毒中和抗体水平，结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭的抗体水平在21日中和抗体效价均不低于1:256；雏鸭免疫后3周采血，用中和试验方法测定鸭肝炎病毒中和抗体水平，结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭的抗体水平在21日中和抗体效价均不低于1:128。雏鸭免疫后3周进行鸭腺病毒3 型强毒攻毒试验。结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭100％保护；21 攻毒对照组100％发病。
31.本发明提供的四联灭活疫苗不会产生抗原成份的相互干扰或影响，能够同时预防鸭呼肠孤病、鸭圆环病、鸭肝炎和鸭腺病毒3型，可避免多次接种免疫出现的不良反应，具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等优点。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
33.实施例1鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭腺病毒3型四联灭活疫苗的制备以及检验
34.一.毒种
35.制苗用新型鸭呼肠孤病毒s株(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，cgmcc no.20000，其分类命名是：新型鸭呼肠孤病毒，保藏时间是：2020年7月6日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区
北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所)、1型鸭甲型肝炎病毒js株(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为： cgmcc no.6852，该毒株已在cn103013931a中公开)、3型鸭甲型肝炎病毒sd株(保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为：cgmcc no.8560，其分类命名是：鸭甲型肝炎病毒，保藏时间是：2013年12月9日，保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)均由哈药集团生物疫苗有限公司分离、鉴定、保管和供应。
36.二试验方法
37.1鸭圆环病毒cap蛋白的制备
38.1.1鸭圆环病毒cap基因的设计与合成
39.将鸭圆环病毒cap基因经密码子优化后(seq id no.1)克隆到puc-57 载体上。采用pcr方法从puc-ducv-cap重组载体中扩增ducv-cap 基因片段。
40.1.2 pci-ducv-cap-gs真核表达载体的构建
41.将pci-gs质粒载体和纯化后的pcr产物使用xhoⅰ、ecorⅰ37℃酶切3小时，分别使用dna回收试剂盒回收酶切的pci-gs质粒以及ducv-cap基因片段，并使用t
4 dna连接酶16℃水浴连接过夜。取10μl 连接产物入至200μl于冰上融化的大肠杆菌dh5α感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激45s，迅速置于冰上2min，加入900μl的s.o.c 培养基，37℃220rpm振荡培养4h，将1.0ml菌液离心浓缩成150μl涂布于含有amp的lb固体培养基上，37℃培养16小时。
42.1.3 pci-ducv-cap-gs重组质粒的鉴定
43.挑取平板上个单菌落分别接种lb液体培养基中，37℃培养2小时，以菌液作为模板，利用ducv-cap-r/ducv-cap-f引物进行pcr扩增。 vp2-f和vp2-r引物进行菌落pcr。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸10min，共设置30个循环；72℃延伸 10min。预计pcr扩增片段长度约为750bp，将阳性菌液进行序列测定。
44.表1 pcr扩增引物
[0045][0046]
2重组pci-ducv-cap-gs质粒转染cho细胞
[0047]
2.1准备细胞
[0048]
取对数生长期的cho细胞，800rpm离心5分钟后，弃上清，用20ml 左右的新鲜cho-wm培养基重悬，弃上清后用少量培养基重悬计数，调整细胞密度为1.5
×
107cells/ml。
[0049]
2.2质粒与细胞混合
[0050]
取pci-ducv-cap-gs重组质粒5μg，加入含有0.7ml细胞的ep管中，混合均匀后，静置15分钟。
[0051]
2.3电转
[0052]
以260v，15ms，电击2次，每次间隔1min完成电击后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6
×
106cells/ml时，添加50μm msx(l-methionine sulphoximine) 加压筛选。
[0053]
3.单克隆筛选
[0054]
用cho细胞无血清无蛋白培养基cho-wm细胞培养 50μm msx重新悬浮细胞，计数。将细胞稀释至5个/ml，取20ml细胞液加入到96 孔板中，每孔200μl，放置37℃，5％co2细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，pbs 洗一次，100μl 0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入cho-wm 培养基(含10％fbs 50μm msx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，elisa检测克隆是否为阳性，高效表达ducv-cap的阳性克隆继续扩大培养，冻存。
[0055]
4.目的蛋白的表达量测定
[0056]
利用bradford蛋白定量测定试剂盒，采用微孔酶标仪法测定 ducv-cap蛋白浓度，试验严格按照说明书进行。
[0057]
5细胞摇瓶发酵
[0058]
用cho-wm培养基添加50μm msx培养基将细胞稀释至 3.0-3.5
×
105cells/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置37℃，5％co2恒温摇床中100rpm/min培养过夜。每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/l的时候，添加葡萄糖到4g/l；每天取1ml样品，上清用于检测蛋白表达情况。
[0059]
2鸭呼肠孤病毒原液的制备及检验
[0060]
2.1病毒液制备
[0061]
将状态良好的lmh细胞悬液传至细胞瓶，按培养基总量的2％将毒种接种长满单层的lmh细胞，置37℃5％co2培养箱中培养，吸附1小时后，补加血清含量为2％的dmem细胞培养液，继续在37℃5％co2培养箱中培养。接毒后细胞培养40-48小时，当细胞病变达到80％以上时，收获细胞及细胞培养物。反复冻融2次后，使用tcid
50
方法检测病毒滴度。
[0062]
2.2病毒含量测定
[0063]
将lmh细胞制备为单细胞悬液铺于96孔细胞培养板，每孔100μl (细胞含量4.0
×
105个/ml)，置37℃含5％co2培养箱中培养24h。将病毒液用dmem培养基作10倍系列稀释，取10-6
、10-7
、10-8
、10-9 4个稀释度，各加入培养24h的96孔细胞培养板，每个稀释度接种96孔细胞培养板6孔，每孔100μl，同时设立正常细胞6孔为阴性对照。上述细胞孔加入含2％新生牛血清的dmem培养液，每孔100μl。置37℃含5％co2培养箱中培养5日，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，按reed-muench 法，计算病毒的致半数细胞感染滴度(tcid
50
)。
[0064]
2.3灭活及灭活检验
[0065]
2.3.1灭活
[0066]
收获的鸭呼肠孤病毒液中缓慢加入甲醛溶液，使其终浓度为0.1％，充分混匀，37℃灭活24小时，期间每两个小时搅拌一次。灭活后的病毒液置2～8℃保存。
[0067]
2.3.2灭活检验
[0068]
取灭活后的病毒液，接种于已形成良好单层的lmh细胞，置37℃培养观察7日，反复冻融2次后，再盲传2代，观察细胞病变情况。
[0069]
3 1型和3型鸭肝炎病毒原液的制备及检验
[0070]
3.1制苗用鸭肝炎病毒液制备
[0071]
用灭菌生理盐水将1型和3型鸭肝炎病毒生产用毒种分别做1000倍稀释，分别经尿
囊腔接种11日龄易感鸭胚，每胚0.2ml，用蜡封孔，于 37℃静置孵育。弃去24小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集24～120小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，并取样进行病毒含量(eld
50
)测定。病毒含量应不低于10
5.5
eld
50
/0.1ml。
[0072]
3.2灭活及检验
[0073]
3.2.1灭活
[0074]
将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻，分别边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％。37℃灭活16h，期间不断搅拌。灭活后病毒液置2～8℃保存，保存期不超过30天。
[0075]
3.2.2灭活检验
[0076]
取灭活后的病毒液，接种于10日龄易感鸭胚，置37℃培养观察168h，记录鸭胚存活情况，收获健活鸭胚尿囊液再盲传1代，记录鸭胚存活情况。
[0077]
4鸭腺病毒3型原液的制备及检验
[0078]
4.1制苗用鸭腺病毒3型病毒液的制备
[0079]
用灭菌生理盐水将鸭腺病毒3型生产用毒种做1000倍稀释，分别经尿囊腔接种11日龄易感番鸭胚，每胚0.2ml，用蜡封孔，于37℃静置孵育。弃去24小时前死亡的鸭胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集24～120 小时死亡鸭胚，于4℃冷却6～12小时。鸭胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存，并取样进行病毒含量(eld
50
)测定。病毒含量应不低于 10
5.5
eld
50
/0.2ml。
[0080]
4.2灭活及检验
[0081]
4.2.1灭活
[0082]
将检验合格的抗原于2～8℃条件下解冻，分别边搅拌边加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％。37℃灭活16h，期间不断搅拌。灭活后病毒液置2～8℃保存，保存期不超过30天。
[0083]
4.2.2灭活检验
[0084]
取灭活后的病毒液，接种于11日龄易感番鸭胚，置37℃培养观察 168h，记录番鸭胚存活情况，收获健活番鸭胚尿囊液再盲传1代，记录番鸭胚存活情况。
[0085]
5灭活疫苗的配制
[0086]
5.1油相制备
[0087]
取白油与司班-80(span-80)按照94：6的比例充分混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌至淡黄色且澄清透明后，121℃高压蒸汽灭菌备用。
[0088]
5.2水相制备
[0089]
将灭活检验合格的鸭圆环cap蛋白、鸭呼长孤病毒液、1型和3型鸭肝炎病毒液和3型鸭腺病毒液等比例均匀混合，混合液再与无菌吐温-80 (tween-80)按照97.5：2.5的比例震荡混匀，直至吐温-80完全溶解。
[0090]
5.3乳化
[0091]
取油相2份放入组织匀浆机内，慢速搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以10000r/min搅拌4min～5min。
[0092]
6成品检验
[0093]
6.1无菌检验
[0094]
按现行《中国兽药典》附录进行检验。
[0095]
6.2安全检验
[0096]
取1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，一组为试验组，在其颈部皮下注射1.0ml灭活疫苗；另一组为对照组，在其颈部皮下注射等量生理盐水。接种后每日观察试验动物精神、采食、有无不良反应。
[0097]
三.试验结果
[0098]
1鸭圆环病毒制备
[0099]
1.1 ducv-cap蛋白的测定
[0100]
根据测得的不同浓度标准品od值，以od值为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据线性回归方程，计算ducv-cap蛋白浓度为 1.2mg/ml。
[0101]
2鸭呼肠孤病毒原液的制备
[0102]
2.1鸭呼肠孤病毒病毒含量测定
[0103]
将鸭呼肠孤病毒种毒接种长满单侧的lmh细胞，培养44小时收获，反复冻融2次，测定病毒含量为10
7.5
tcid
50
/ml。
[0104]
2.2灭活检验
[0105]
灭活后的呼肠孤病毒接种lmh细胞，并盲传2代，细胞均无病变产生，结果表明病毒液灭活完全。
[0106]
3鸭肝炎病毒原液的制备
[0107]
3.1鸭肝炎病毒病毒含量测定
[0108]
将1型和3型鸭肝炎病液分别做10倍系列稀释，每个稀释度接种易感鸭胚5枚，每枚0.2ml，培养观察168h，记录鸭胚的死亡情况。按 reed-muench法计算病毒液的病毒含量分别为10
6.32
eld
50/
0.2ml和 10
6.22
eld
50/
0.2ml。
[0109]
3.2灭活检验
[0110]
灭活后的鸭肝炎病毒接种10日龄易感鸭胚，并盲传1代，鸭胚均全部健活，结果表明病毒液灭活完全。
[0111]
4鸭腺病毒3型原液的制备
[0112]
4.1鸭腺病毒3型病毒含量测定
[0113]
将鸭腺病毒3型病毒液分别做10倍系列稀释，每个稀释度接种易感番鸭胚5枚，每枚0.2ml，培养观察168h，记录鸭胚的死亡情况。按 reed-muench法计算病毒液的病毒含量分别为10
5.83
eld
50/
0.2m。
[0114]
4.2灭活检验
[0115]
灭活后的鸭腺病毒3型接种10日龄易感番鸭胚，并盲传1代，鸭胚均全部健活，结果表明病毒液灭活完全。
[0116]
5成品检验
[0117]
5.1无菌检验
[0118]
按现行《中国兽药典》附录对灭活疫苗进行无菌检验。结果表明成品无菌检验合格。
[0119]
5.2安全检验
[0120]
疫苗接种雏鸭，观察期间雏鸭全部健活，无局部和全身不良反应
[0121]
试验例1鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭腺病毒3型四联灭活疫苗的效力检验
[0122]
1效力检验方法
[0123]
1.1鸭圆环部分
[0124]
1日龄健康易感雏鸭30只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组10只为攻毒对照组，每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。免疫后21日，各组雏鸭腿部肌肉注射鸭圆环病毒1.0ml。攻毒后21日翅静脉采血。按新鲜血液与抗凝剂6:1的比例加入抗凝剂，用rt-qpcr方法检测全血中ducv核酸拷贝数。
[0125]
rt-qpcr方法具体如下：
[0126]
采用以下表2中的特异性引物进行检测
[0127]
表2 rt-qpcr检测引物
[0128][0129]
rt-qpcr反应：采用sybr gree i染料法，用2
×
sybr gree mix 试剂盒，rt-qpcr检测体系见表3。
[0130]
表3 rt-qpcr检测体系
[0131][0132]
rt-qpcr反应程序为：95℃预变性60秒；95℃变性15秒，60℃退火60秒，共40个循环。
[0133]
结果判定：ct≤26，判为阳性，ct＞26判为阴性。
[0134]
免疫组应至少8/10保护，攻毒对照组应至少8/10发病。
[0135]
1.2鸭呼肠孤部分
[0136]
1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组不免疫，作空白对照。接种后21天采血分离血清，用中和试验方法测定鸭呼肠孤病毒中和抗体效价。鸭呼肠孤病毒中和抗体效应不低于1:256。
[0137]
1.3鸭肝炎部分
[0138]
1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组不免疫，作空白对照。接种后21天采血分离血清，用中和试验方法测定1型和3型鸭肝炎病毒中和抗体效价。 1型和3型鸭肝炎病毒中和抗体效价应均不低于1:128。
[0139]
1.4鸭腺病毒3型部分
[0140]
1日龄健康易感雏鸭20只，随机分为2组，每组10只。第1组，每只颈部皮下接种疫苗0.5ml，第2组不免疫，作空白对照。接种后21日，各组雏鸭腿部肌肉注射3型鸭腺病毒0.5ml，隔离饲养10日，剖检各组鸭只观察肝脏病变(3型鸭腺病毒病发病标准剖检雏鸭可见肝脏肿大、色泽变淡或黄化)。免疫组应至少8/10保护，攻毒对照组应至少8/10发病。
[0141]
2效力检验试验结果
[0142]
2.1鸭圆环病毒部分
[0143]
雏鸭免疫后21日攻击鸭圆环病毒强毒，21日后采全血以rt-qpcr 方法检测全血中ducv核酸拷贝数，结果免疫组雏鸭10/10保护，攻毒对照组雏鸭10/10发病，结果见表4。
[0144]
表4鸭圆环病毒免疫攻毒保护结果
[0145][0146]
注：“ ”代表ct≤26，判为阳性，
“‑”
ct＞26判为阴性。
[0147]
2.2鸭呼肠孤病毒部分
[0148]
雏鸭免疫后3周采血，用中和试验方法测定鸭呼肠孤病毒中和抗体水平，结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭的抗体水平在21日中和抗体效价均不低于1:256。
[0149]
表5鸭呼肠孤病毒抗体效价测定结果
[0150]
[0151][0152]
2.3鸭肝炎病毒部分
[0153]
雏鸭免疫后3周采血，用中和试验方法测定鸭肝炎病毒中和抗体水平，结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭的抗体水平在21日中和抗体效价均不低于1:128。
[0154]
表6鸭肝炎病毒抗体效价测定结果
[0155]
[0156][0157]
2.4鸭腺病毒3型部分
[0158]
雏鸭免疫后3周进行鸭腺病毒3型强毒攻毒试验。结果表明，与对照组相比，免疫组雏鸭100％保护；21攻毒对照组100％发病。
[0159]
表7鸭腺病毒3型攻毒保护结果
[0160][0161]
注：“ ”代表发病，
“‑”
代表健康。