防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗的制作方法

技术特征：
1.防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗，包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，其特征在于，所述的灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠孤病毒抗原、鸭肝炎病毒抗原和鸭腺病毒3型抗原；其中，用于制备鸭腺病毒病3型抗原的毒株是鸭腺病毒3型fz株，其微生物保藏编号为：cgmcc no.21928。2.根据权利要求1所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭圆环病毒抗原是将鸭圆环病毒cap基因经过原核或真核系统重组表达后得到的重组蛋白。3.按照权利要求2所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭圆环病毒抗原是将seq id n.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至真核表达质粒并转染cho细胞诱导表达，得到重组鸭圆环病毒cap蛋白；优选的，将seq id n.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至真核表达质粒并转染cho细胞诱导表达的方法包括：(1)将seq id no.1所示的密码子优化后的鸭圆环病毒cap基因克隆至puc-57载体上，采用pcr方法从puc-ducv-cap重组载体中扩增ducv-cap基因片段；(2)将pci-gs质粒载体和纯化后的pcr产物使用xhoⅰ、ecorⅰ酶切，回收酶切的pci-gs质粒以及ducv-cap基因片段并进行连接得到pci-ducv-cap-gs真核表达质粒；(3)将pci-ducv-cap-gs真核表达质粒转染cho细胞，诱导重组cap蛋白在cho细胞中表达，收集所表达的重组cap蛋白。4.根据权利要求1所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭呼肠孤病毒抗原是将鸭呼肠孤病毒s株在lmh细胞中进行增殖得到的病毒液；所述鸭呼肠孤病毒s株的微生物保藏编号为：cgmcc no.20000。5.根据权利要求1所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述鸭肝炎病毒抗原的制备是将1型和3型鸭肝炎病毒生产用毒种接种易感鸭胚，收获鸭胚液得到鸭肝炎病毒抗原。6.根据权利要求1所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述的鸭腺病毒3型抗原制备是将鸭腺病毒3型生产用毒种接种易感鸭胚，收获鸭胚液得到鸭腺病毒3型抗原。7.根据权利要求1所述的四联灭活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂为白油、司班-80、硬脂酸铝或吐温-80中的任何一种或多种。8.按照权利要求1所述的四联灭活疫苗，其特征在于，还含有冻干保护剂。9.一种制备权利要求1-8任何一项所述四联灭活疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)油相制备：取白油与司班-80混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝，搅拌后灭菌，备用；(2)水相制备：将灭活的鸭呼肠孤病毒抗原、鸭病毒性肝炎抗原、鸭腺病毒3型抗原以及重组鸭圆环病毒cap蛋白混合得到抗原混合液；抗原混合液与无菌吐温-80混匀直至吐温-80完全溶解；(3)乳化：取油相在组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相，加完水相后再搅拌，即得。10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将取白油与司班-80按照94：6的比例混合均匀加入2％的硬脂酸铝；所述的搅拌是搅拌至淡黄色且澄清透明后121℃高压蒸汽灭菌；步骤(2)中抗原混合液与无菌吐温-80按照97.5：2.5的比例震荡混匀直至吐温-80完全溶解；
步骤(3)中取油相3份放入组织匀浆机内慢速搅拌，同时加入水相2份，加完后再以10000r/min的转速搅拌4min-5min。

技术总结
本发明公开了防治鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎和鸭腺病毒3型的四联灭活疫苗，所述四联灭活疫苗包括免疫上有效量的灭活抗原和免疫佐剂，所述灭活抗原包括鸭圆环病毒抗原、新型鸭呼肠孤病毒抗原、鸭肝炎病毒抗原和鸭腺病毒3型抗原。本发明鸭圆环病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭腺病毒3型四联灭活疫苗安全性良好，不会产生抗原成份的相互干扰或影响。免疫保护效力试验证明，本发明四联灭活疫苗能够同时预防鸭呼肠孤病毒，鸭圆环病毒，鸭肝炎病毒和鸭腺病毒3型，可避免多次接种免疫出现的不良反应，具有制备方法简单、方便、多效、低成本、疫苗效价含量高等优点。等优点。


技术研发人员：宋扬 李应鹤 柴华 步帆 梁宛楠 于镭 徐刚 李贽 方超 张影 李婷婷
受保护的技术使用者：哈药集团生物疫苗有限公司
技术研发日：2021.12.30
技术公布日：2022/6/28