新霉素在制备治疗传染性脾肾坏死病药物中的应用的制作方法

1.本发明属于水产养殖病害及防治技术领域。更具体地，涉及新霉素在制备治疗传染性脾肾坏死病药物中的应用。


背景技术：

2.近年来，由虹彩病毒科肿大细胞病毒属的病毒引起的病害，严重威胁着世界范围内的鱼类养殖业的发展。肿大细胞病毒会导致感染的细胞肿胀，大小远远大于正常细胞，对鱼类的致死率高达100％，造成严重的经济损失。传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus，isknv)是肿大细胞病毒属的代表种，为直径150nm、横截面呈六角形的病毒，对鳜鱼、大口鲈、鲑鱼等数十种海洋和淡水鱼类的危害极大。isknv是肿大细胞病毒属首个完成基因组全序列测定的病毒，基因组全长11132bp，gc含量54.78％，含124个潜在的开放阅读框(open reading frame，orf)，编码含40～1208个氨基酸的蛋白。
3.控制病毒性疾病的手段主要有接种疫苗和使用抗病毒药物两种，目前已有关于抗传染性脾肾坏死病毒的疫苗等的报道。例如，中国专利cn102240399a公开了鳜传染性脾肾坏死病毒(isknv)orf093蛋白的应用，其发现鳜isknv orf093蛋白对鳜虹彩病毒病有较好的免疫预防作用，由orf093重组蛋白制备的抗血清对鳜虹彩病毒病也有较好的中和效果，可将orf093蛋白开发成为抗鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病新疫苗或新药物。中国专利cn104195119a则公开了一种抗传染性脾肾坏死病毒的病毒样颗粒和疫苗及其制备方法。但目前仍未有能够抑制传染性脾肾坏死病毒感染的药物。
4.新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阳性和阴性菌皆有效，但也未见有关新霉素能抑制传染性脾肾坏死病毒感染的报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是克服目前尚未有能够抗传染性脾肾坏死病毒，治疗传染性脾肾坏死病的药物的缺陷和不足，提供新霉素在制备治疗传染性脾肾坏死病药物中的应用。
6.本发明的第一个目的是提供新霉素在制备治疗传染性脾肾坏死病药物中的应用。
7.本发明的第二个目的是提供新霉素在制备抗肿大细胞病毒的药物中的应用。
8.本发明的第三个目的是提供新霉素在制备抗传染性脾肾坏死病毒的药物中的应用。
9.本发明的第四个目的是提供新霉素在制备抑制传染性脾肾坏死病毒增殖的药物中的应用。
10.本发明的第五个目的是提供新霉素在制备抑制传染性脾肾坏死病毒复制的药物中的应用。
11.本发明的第六个目的是提供一种治疗传染性脾肾坏死病的药物。
12.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
13.本发明通过实验发现，新霉素可以抑制isknv在mff-1细胞中的增殖，同时，新霉素是在isknv复制阶段抑制其增殖，而不是在通过阻止isknv入侵阶段来抑制病毒增殖。此外，新霉素处理还可以显著降低isknv感染的鳜鱼的死亡率。因此，本发明申请保护新霉素在以下方面的应用：
14.本发明申请保护新霉素在制备治疗传染性脾肾坏死病药物中的应用。
15.优选地，本发明申请保护新霉素在制备治疗鳜鱼传染性脾肾坏死病药物中的应用，见实施例3。
16.本发明还申请保护新霉素在制备抗肿大细胞病毒的药物中的应用。
17.本发明还申请保护新霉素在制备抗传染性脾肾坏死病毒的药物中的应用。
18.优选地，新霉素在药物中的浓度为4mg/l～20mg/l，见实施例3。
19.本发明还申请保护新霉素在制备抑制传染性脾肾坏死病毒增殖的药物中的应用。
20.优选地，其抑制传染性脾肾坏死病毒在mff-1细胞中的增殖，见实施例1。
21.本发明还申请保护新霉素在制备抑制传染性脾肾坏死病毒复制的药物中的应用。
22.优选地，新霉素的浓度为10μm，见实施例1和2。
23.本发明还提供一种治疗传染性脾肾坏死病的药物，其含有新霉素及其可接受的药物载体。
24.本发明具有以下有益效果：
25.本发明的实验结果表明，新霉素可以抑制isknv病毒在mff-1细胞中的增殖，抑制isknv病毒的复制。此外，新霉素处理还可以显著降低isknv感染的鳜鱼的死亡率，在治疗传染性脾肾坏死病方面具有很好的效果。新霉素可用于制备抑制isknv增殖和复制的药物，为传染性脾肾坏死病的有效防控提供基础指导，同时为水产养殖中防治肿大细胞病毒感染提供新策略。
附图说明
26.图1为新霉素对isknv感染的mff-1细胞的影响，其中图a为新霉素处理的isknv感染的mff-1细胞中isknv的拷贝数；图b为新霉素处理的isknv感染的mff-1细胞上清中isknv的拷贝数；图c为新霉素对isknv的mcp、orf023和orf092基因表达的影响。
27.图2为新霉素对isknv复制的影响，其中图a为新霉素处理细胞的时间策略；图b为对应时间策略下新霉素对isknv复制的影响。
28.图3为新霉素处理的isknv感染的鳜鱼脾脏组织的免疫荧光结果，其中图a为新霉素处理后感染isknv的鳜鱼的死亡率统计结果；图b为新霉素对鳜鱼脾脏中isknv-mcp在dna水平的影响；图c为新霉素对鳜鱼肾脏中isknv-mcp在dna水平的影响；图d为新霉素对鳜鱼脾脏中isknv-mcp在rna水平的影响；图e为新霉素对鳜鱼肾脏中isknv-mcp在rna水平的影响；图f和g为新霉素对鳜鱼脾脏中isknv-mcp蛋白水平的影响。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
31.实施例1新霉素对isknv感染的mff-1细胞的影响
32.(1)药物处理：接种mff-1细胞，待细胞粘附并生长至80％汇合后，以moi＝4的isknv感染mff-1细胞2h，随后去除病毒液，加入终浓度为10um的新霉素处理72h后收取细胞及细胞上清液；
33.(2)dna提取：分别取细胞及细胞上清液，每250μl的样品液加入4μl的ob蛋白酶、4μl的linear acrylamide和250μl的buffer bl，振荡混匀后65℃孵育10min；随后加入260μl无水乙醇，振荡混匀，将混合液转入hibind@dna mini column中，8,000g离心1min；弃离心液加入500μl buffer hb，8,000g离心1min；随后弃离心液加入700μl buffer hb，8,000g离心1min；重复一次；弃下清13,000g空转离心2min将column置于新的1.5ml离心管，加入100μl灭菌水于55℃条件下孵育10min，13,000g离心1min，dna置于-20℃保存；
34.(3)trizol抽提法提取rna：向180℃灭菌后的匀浆器中加入250μl的细胞样品及1ml的trizol冰上研磨，将研磨液转移至1.5ml rnase free离心管，加入氯仿200ml(trizol:氯仿＝1:1)，上下混匀，室温静置10min，12000rpm离心15min，4℃；离心分层后取上清400μl，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10min，12000rpm离心15min，4℃；取上清，加入1ml 75％的乙醇，弹起沉淀，12000rpm离心15min，4℃，重复一遍；上清，干燥rna沉淀，加入50μl depc水，55℃静置15min；用分光光度计测量提取rna的od值，若rna浓度过大，则进行稀释，-80℃保存；
35.(4)rna反转录成cdna：反转录使用艾科瑞公司的evo m-mlv反转录预混型试剂盒(货号ag11728)，参照产品说明书进行。在20μl的反转录体系中加入500～800ng提取的rna，加入5
×
evo m-mlv rt master mix 4ul，用水补至20μl。37℃水浴15min后，85℃水浴5s灭活，反转录产物置于-20℃冻存备用；
36.(5)定量pcr：以dna为模板，以isknv的mcp为目标基因，进行绝对定量pcr；以rna为模板，分别以isknv的mcp、orf023和orf092为目标基因，这三个基因为isknv的晚期基因，在病毒增殖晚期阶段。同时以鳜鱼18srrna作内参进行定量pcr检测；
37.定量pcr反应体系如下：5μl qpcr mix(2
×
)、0.4μl上游引物(10μm)、0.4μl下游引物(10μm)、1μl cdna模板，加3.2μl水补足至10μl。
38.所用引物序列如下所示(均为5
’‑3’
方向)：
39.mcp-q-f：tcccctccatcacatccagcaaga
40.mcp-q-r：catgcaggcgttccagaagtcaag
41.orf023-q-f：gatgggaattgtcattgggtcttg
42.orf023-q-r：cacagcgggtgaaacggaaa
43.orf092-q-f：tcattttattatcctgcttctgggc
44.orf092-q-f：aatggtgctcttgacactgtgctc
45.18srrna-q-f：cattcgtattgtgccgctaga
46.18srrna-q-r：caaatgctttcgctttcgtc
47.扩增反应条件为：95℃预变性10min；40个循环：95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸5s。反应完成后，以标准曲线方程y＝-3.5285x 40.137来计算病毒拷贝数；以阴性对照作为参照，使用的方法计算实验组和对照组isknv基因的相对表达量。
48.结果如图1所示，其中图1a为新霉素处理的isknv感染的mff-1细胞中isknv的拷贝数；图b为新霉素处理的isknv感染的mff-1细胞上清中isknv的拷贝数；图c为新霉素对isknv基因表达的影响。由图1可知，新霉素能显著抑制isknv在mff-1细胞中的增殖。
49.实施例2新霉素对isknv复制的影响
50.(1)药物处理：按照图2a中的时间策略分别进行处理；1：新霉素处理mff-1细胞2h后感染isknv；2：新霉素和isknv同时处理mff-1细胞；3：isknv感染mff-1细胞2h后加入新霉素；4：isknv感染mff-1细胞24h后加入新霉素。新霉素浓度均为10um，isknv处理mff-1细胞均为2h，在isknv处理mff-1细胞48h后收集细胞。
51.(2)dna的提取及绝对定量pcr操作同实施例1。
52.结果如图2所示，其中图a为新霉素处理细胞的时间策略；图b为对应时间策略下新霉素对isknv复制的影响。由图2可知，新霉素是在isknv复制阶段抑制其增殖，而不是在通过阻止isknv入侵阶段来抑制病毒增殖。
53.实施例3新霉素对鳜鱼体内isknv的影响
54.(1)药物处理：以10
7.5
copeis/ml的isknv病毒原液腹腔注射鳜，每尾100μl，注射后于独立循环水系统中养殖，分别在注射isknv后的24h、48h、72h、96h、120h时间点用新霉素(4mg/l、20mg/l)对鳜鱼进行药浴处理30min，对照组无药浴处理，观察在感染后312h内鳜鱼的死亡情况，统计死亡率。在isknv感染144h取鳜鱼的脾脏和肾脏组织，每组取6尾鱼，样品置于于rnalater中-20℃保存。
55.(2)dna提取、rna提取、反转录cdna及定量pcr操作同实施例1。
56.(3)组织蛋白样品制备：取脾脏组织于灭菌后的匀浆器中，加入1ml ripa裂解液，按1：100加入pmsf(苯甲基磺酰氟)，然后研磨，冰上裂解30min，随后12000rpm离心10min；取上清按比例加入5x sds-loading buffer，置于沸水中煮样10min，置于-80℃保存；
57.(4)western blotting免疫印记检测：首先制备12％分离胶(30％的丙烯酰胺2.0ml、ph8.8的1.5mmol/l tris 1.3ml、10％sds 50μl、10％过硫酸铵50μl、temed 2μl和水1.6ml)和5％浓缩胶(30％的丙烯酰胺0.33ml、ph6.8的1.5mmol/l tris 0.25ml、10％sds 20μl、10％过硫酸铵20μl、temed 2μl和水1.4ml)，静置20min，待凝固；在1
×
电泳缓冲液中加样，80v电泳30min后，调电压为120v，配1
×
转膜缓冲液对折3张滤纸，剪与胶大小一致的滤纸和0.28μm孔径nc膜，按照：负极-黑面-海绵-3层滤纸-胶-膜-3层滤纸-海绵-红面-正极，去除气泡后，置于冰盒中200ma转膜2h。封闭液4℃封闭1h，用tbst进行洗膜，共三次，每次15min；按1:1000稀释一抗，覆盖膜室温摇床1h；弃一抗，tbst洗膜三次，每次15min，按1:5000稀释二抗，室温摇床1h；用tanontm high-sig ecl western blotting substrate试剂盒显色检测。
58.结果如图3所示，其中图3a为新霉素处理后感染isknv的鳜鱼的死亡率统计结果；图3b为新霉素对鳜鱼脾脏中isknv-mcp在dna水平的影响；图3c为新霉素对鳜鱼肾脏中isknv-mcp在dna水平的影响；图3d为新霉素对鳜鱼脾脏中isknv-mcp在rna水平的影响；图3e为新霉素对鳜鱼肾脏中isknv-mcp在rna水平的影响；图3f和3g为新霉素对鳜鱼脾脏中isknv-mcp蛋白水平的影响。由图3a可知，与对照组相比，4mg/l和20mg/l的新霉素处理均可以显著降低isknv感染的鳜鱼的死亡率；而由图3b～3g可知，新霉素在dna水平、rna水平和蛋白水平均均可抑制isknv的增殖。
59.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。