小型化肌营养不良蛋白及其用途的制作方法

小型化肌营养不良蛋白及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2018年10月24日提交的美国临时申请号62/749982的优先权权益，将其通过引用以其整体并入本文。
1.技术领域
3.本发明公开的主题大体上涉及与小型化肌营养不良蛋白有关的多核苷酸、多肽、细胞、载体、用途和试剂盒。
2.

背景技术：

4.杜氏肌营养不良症(dmd)是一种隐性遗传的肌肉消耗性障碍，大约 3,500名男性中就有1名患病。dmd是由位于x染色体上的肌营养不良蛋白基因突变引起的。此基因的突变导致肌营养不良蛋白的异常或缺失表达。
5.肌营养不良蛋白是蛋白质复合物的关键组分，其负责调节肌肉细胞的完整性和功能。dmd患者通常在儿童期失去身体支持自己的能力，并随着时间的推移逐渐变得虚弱。骨骼肌的这种进行性消耗和心功能障碍通常会导致失去离床活动的能力和过早死亡，主要是由于心脏或呼吸衰竭。
6.过去曾进行过一些治疗dmd的尝试。然而，可用的治疗方案由于野生型肌营养不良蛋白cdna的大尺寸(大约13.9kb)而严重受限，所述cdna 不能使用标准病毒载体(包括腺相关病毒(aav)，它不能转移多于大约4.9kb 的异源dna)施用至dmd患者并在dmd患者体内表达。因此，需要开发一种重组肌营养不良蛋白基因，其可以有效地包装到用于基因疗法的载体中。
7.已显示腺相关病毒(aav)载体可用于旨在纠正导致蛋白质表达水平降低或完全消除的遗传缺陷的基因治疗方法(nathwani等人至a.m keeler等人)，并且可能用于基因敲除、基因组编辑或修饰，和非编码rna调节 (valdmanis等人,2017)。
8.由于肌营养不良蛋白cdna的大尺寸，因此将肌营养不良蛋白的肌肉特异性同种型的整个cdna包装到单个raav衣壳中可能并不容易实现。先前的研究集中于仅表达肌营养不良蛋白特定结构域的较小遗传构建体的开发。参见美国专利号6,869,777和8,501,920，其各自通过引用并入。然而，这些方法仅取得了有限的成功。
9.仍然需要更精确和有效的基因治疗工具来治疗具有肌营养不良蛋白基因突变的患者，并且特别地，需要开发一种可以有效地包装到用于基因疗法的载体中的重组肌营养不良蛋白基因。
3.

技术实现要素：

10.本公开文本提供了一种包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码小型化肌营养不良蛋白多肽，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c 端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰
链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽不包含肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列2。
11.在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽不包含血影蛋白重复序列2(r2)结构域、血影蛋白重复序列4(r4)结构域、血影蛋白重复序列5(r5)结构域、血影蛋白重复序列6(r6)结构域、血影蛋白重复序列7(r7)结构域、血影蛋白重复序列8(r8)结构域、血影蛋白重复序列9 (r9)结构域、血影蛋白重复序列10(r10)结构域、血影蛋白重复序列11 (r11)结构域、血影蛋白重复序列12(r12)结构域、血影蛋白重复序列13 (r13)结构域、血影蛋白重复序列14(r14)结构域、血影蛋白重复序列 15(r15)结构域、血影蛋白重复序列18(r18)结构域、血影蛋白重复序列19(r19)结构域、血影蛋白重复序列20(r20)结构域、血影蛋白重复序列21(r21)结构域、血影蛋白重复序列22(r22)结构域或血影蛋白重复序列23(r23)结构域或其任何组合。在一些实施方案中，所述r1结构域通过肽键直接与r3结构域融合。在一些实施方案中，所述r1结构域和所述 r3结构域通过氨基酸arg
‑
val(rv)融合。在一些实施方案中，所述h2 结构域和所述r16结构域通过接头融合。
12.在一些实施方案中，所述接头包含与seq id no:75(ihtvreetmmvmtedmp lei)至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列能够改善nnos信号传导。
13.在一些实施方案中，本文公开了一种包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码包含seq id no:75(ihtvree tmmvmtedmp lei) 的氨基酸序列，其中所述核酸分子与seq id no:100(atccacaccgtgcgggaagagacaatgatggtcatgacagaggacatgcccctggaaatc)至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同，其中所述氨基酸序列能够改善nnos信号传导。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是连接肌营养不良蛋白的第一结构域与肌营养不良蛋白的第二结构域的接头。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白的第一结构域是h2结构域，并且肌营养不良蛋白的第二结构域是r 16结构域。在一些实施方案中，所述氨基酸序列在n端处进一步包含seq id no:74的序列。
14.在一些实施方案中，所述核酸分子编码小型化肌营养不良蛋白多肽。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1)结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列 16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域。在一些实施方案中，所述r1结构域和所述r3结构域通过氨基酸arg
‑
val(rv)融合，并且其中所述h2 结构域和所述r16结构域通过组合的seq id no:74
‑
75中列出的氨基酸序列融合。在一些实施方案中，(i)所述h1结构域和所述r1结构域直接融合，(ii) 所述r3结构域和所述h2结构域直接融合，(iii)所述r16和r17结构域直接融合，(iv)所述r17和r24结构域直接融合，或(v)所述r24和h4结构域直接融合，或(vi)其任何组合。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步包含abd1结构域和/或cr结构域。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c端基本上由肌营养不良蛋白的abd1结构域、h1结构域、r1结构域、氨基酸rv、r3结构域、h2结构域、如seq idno:74
‑
75中列出的氨基酸序列、r16结构域、r17结构域、r24结构域、h4 结构域和cr结构域
组成或由其组成。
15.在一些实施方案中，所述h1结构域是与seq id no:69至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r1结构域是与seq id no:70至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r3结构域是与seq id no:72至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述h2结构域是与seq id no:73至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r16结构域是与seq id no:76至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r17结构域是与seq id no:77至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r24结构域是与seq id no:78至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述h4结构域是与seq id no:79至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步在n端处包含与seq id no:68至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步在c端处包含与seq id no:80至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq idno:118至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列包含与seq id no:133的核苷酸序列至少约 60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
16.在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽表现出选自以下的一种或多种特性：(i)与bxa
‑
027741相比具有较低的cd4增殖，(ii)与 bxa
‑
027741相比具有较低的cd8增殖，(iii)具有比bxa
‑
027741更高的小型化肌营养不良蛋白多肽的表达，和(iv)其任何组合。
17.在一些实施方案中，所述核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含血影蛋白重复序列1(r1)结构域和血影蛋白16(r16)结构域的小型化肌营养不良蛋白多肽，其中所述r1结构域和所述r16结构域通过包含 seq id no:84(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列的接头融合。
18.在一些实施方案中，所述核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码小型化肌营养不良蛋白多肽，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c 端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、
血影蛋白重复序列17(r17) 结构域、铰链3(h3)结构域、血影蛋白重复序列23(r23)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域和所述r16结构域通过seq id no:84(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列融合。
19.在一些实施方案中，(i)所述h1结构域和所述r1结构域直接融合，(ii)所述r16和r17结构域直接融合，(iii)所述r17和所述h3结构域直接融合，(iv) 所述r23和r24结构域直接融合，或(v)所述r24和h4结构域直接融合，或 (vi)其任何组合。
20.在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽不包含血影蛋白重复序列2(r2)结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、血影蛋白重复序列4(r4)结构域、血影蛋白重复序列5(r5)结构域、血影蛋白重复序列6(r6)结构域、血影蛋白重复序列7(r7)结构域、血影蛋白重复序列8 (r8)结构域、血影蛋白重复序列9(r9)结构域、血影蛋白重复序列10(r10) 结构域、血影蛋白重复序列11(r11)结构域、血影蛋白重复序列12(r12) 结构域、血影蛋白重复序列13(r13)结构域、血影蛋白重复序列14(r14) 结构域、血影蛋白重复序列15(r15)结构域、血影蛋白重复序列18(r18) 结构域、血影蛋白重复序列19(r19)结构域、血影蛋白重复序列20(r20) 结构域、血影蛋白重复序列21(r21)结构域和/或血影蛋白重复序列22(r22) 结构域。
21.在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步包含abd1 结构域和/或cr结构域。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c端基本上由肌营养不良蛋白的abd1结构域、h1结构域、r1结构域、seq id no:84中列出的氨基酸序列、r16结构域、r17结构域、h3结构域、r23结构域、r24结构域、h4结构域和cr结构域组成或由其组成。在一些实施方案中，所述h1结构域是与seq id no:82至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r1结构域是与seq id no:83至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r16结构域是与seq id no:85至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r17结构域是与seq id no:86至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述h3结构域是与seq id no:87至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r23结构域是与seq id no:88至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r24结构域是与seq id no:89至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述h4结构域是与seq id no:90至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
22.在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步在n端处包含与seq id no:81至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营
养不良蛋白多肽进一步在c端处包含与seq id no:91至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no: 132或其中c端结构域缺失的seq id no:132至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核苷酸序列包含与seqid no:147或seq id no:148或seq id no:149的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
23.在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽表现出比 bxa
‑
196481更高的小型化肌营养不良蛋白多肽的表达。
24.在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽的表达比 bxa
‑
196481多肽的表达高至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约 1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍或至少约3倍。
25.在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子驱动治疗性蛋白在肝细胞、肌细胞、内皮细胞、神经元细胞、窦状隙细胞或其任何组合中的表达。在一些实施方案中，所述启动子选自小鼠甲状腺素启动子 (mttr)、内源人因子viii启动子(f8)、人α
‑1‑
抗胰蛋白酶启动子(haat)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、三重四脯氨酸(ttp)启动子、 casi启动子、突触蛋白1基因启动子、cag启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、α1
‑
抗胰蛋白酶(aat)、肌肉肌酸激酶(mck)、肌球蛋白重链α (αmhc)、肌红蛋白(mb)、结蛋白(des)、spc5
‑
12、2r5sc5
‑
12、dmck、 tmck和磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子。
26.在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含内含子序列。在一些实施方案中，所述内含子序列定位于编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列的5'。在一些实施方案中，所述内含子序列定位于启动子的3'。在一些实施方案中，所述内含子序列包含合成内含子序列。
27.在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含转录后调节元件。在一些实施方案中，所述转录后调节元件定位于编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列的3'。在一些实施方案中，转录后调节元件包含突变的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)、微小rna结合位点或dna核靶向序列或其任何组合。
28.在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含3'utr多聚(a)尾序列。在一些实施方案中，3'utr多聚(a)尾序列选自bgh多聚(a)、肌动蛋白多聚(a)、血红蛋白多聚(a)及其任何组合。在一些实施方案中，3'utr 多聚(a)尾序列包含bgh多聚(a)。
29.在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含增强子序列。
30.在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含第一itr和/或第二itr。在一些实施方案中，所述第一itr和所述第二itr相同。在一些实施方案中，所述第一itr和/或所述第二itr源自腺相关病毒。
31.在一些实施方案中，所述核酸分子包含异源部分。在一些实施方案中，所述异源部
分选自白蛋白或其片段、免疫球蛋白fc区、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的c末端肽(ctp)、pas序列、hap序列、转铁蛋白或其片段、白蛋白结合部分或其衍生物或其任何组合。
32.在一些实施方案中，提供了一种包含本文公开的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体选自腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体。在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒 (aav)载体。在一些实施方案中，所述aav载体选自aav1、aav2、aav3、 aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11。在一些实施方案中，所述aav载体是aav9。
33.在一些实施方案中，本文公开的核酸分子或载体是用递送剂配制的。在一些实施方案中，所述递送剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，所述递送剂选自脂质体、非脂质聚合分子、内体及其任何组合。
34.在一些实施方案中，本文公开的核酸分子或载体经配制用于静脉内、透皮、真皮内、皮下、经肺或口服递送或其任何组合。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子或载体经配制用于静脉内递送。
35.在一些实施方案中，提供了一种由本文公开的核酸分子或载体编码的多肽。
36.在一些实施方案中，提供了一种包含本文公开的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，所述细胞是cho细胞、hek293细胞、hbk细胞、cos 细胞、nso细胞或ht1080细胞。
37.在一些实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含(a)本文公开的核酸、本文公开的载体、本文公开的多肽或本文公开的宿主细胞；和(b)药学上可接受的赋形剂。
38.在一些实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含本文公开的核酸、本文公开的载体、本文公开的多肽、本文公开的宿主细胞或本文公开的药物组合物，以及向有需要的受试者施用所述核酸分子的说明书。
39.在一些实施方案中，提供了一种产生小型化肌营养不良蛋白多肽的方法，所述方法包括：在合适的条件下培养本文公开的宿主细胞并且回收所述小型化肌营养不良蛋白多肽。
40.在一些实施方案中，提供了一种在有需要的受试者中表达小型化肌营养不良蛋白多肽的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的核酸、本文公开的载体、本文公开的宿主细胞或本文公开的药物组合物。
41.在一些实施方案中，提供了一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的核酸、本文公开的载体、本文公开的多肽、本文公开的宿主细胞或本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是由肌营养不良蛋白缺乏引起的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是肌肉减少症、心脏病、恶病质、杜氏肌营养不良症(dmd)、贝克肌营养不良症(bmd)、x
‑
连锁扩张型心肌病(xldc)、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、emery
‑
dreifuss型肌营养不良症、远端肌营养不良症和/或先天性肌营养不良症。在一些实施方案中，根据权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述核酸分子、所述载体、所述多肽、所述宿主细胞或所述药物组合物是静脉内、透皮、真皮内、皮下、口服或经肺或其任何组合施用的。在一些实施方案中，所述核酸分子、所述载体、所述多肽、所述宿主细胞或所述药物组合物是静脉内、透皮、真皮内、皮下、口服或经肺或其任何组合施用的。
42.在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用第二药剂。
43.在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，相对于施用前受试者体内的肌营养不良蛋白表达，向所述受试者施用所述核酸分子、所述载体、所述多肽、所述宿主细胞或所述药物组合物导致增加的肌营养不良蛋白表达，其中所述肌营养不良蛋白表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约 50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。
44.在一些实施方案中，本文公开了一种包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码包含铰链2(h2)结构域和血影蛋白16(r16)结构域的小型化肌营养不良蛋白多肽，其中所述h2结构域和所述r16结构域通过包含 seq id no:84(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列的接头融合。
4.附图说明
45.图1示出了全长人肌营养不良蛋白的示意图。abd1：肌动蛋白结合结构域
‑
1；h#(例如h1)：铰链区；r#(例如，r1)：血影蛋白样重复结构域； abd2：肌动蛋白结合结构域
‑
2；cr：富含半胱氨酸的结构域；c端：所述蛋白质的c端结构域。
46.图2示出了小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
027741、bxa
‑
027742、 bxa
‑
027743、bxa
‑
027744、bxa
‑
196480和bxa
‑
196481，以及作为参考点的图1的全长人肌营养不良蛋白的示意图。
47.图3示出了在转染表达所指示的小型化肌营养不良蛋白多肽的质粒后，人等基因诱导多能干细胞(ipsc)衍生的心肌细胞(icm)(在肌营养不良蛋白基因中携带阻止内源性肌营养不良蛋白表达的e2035x过早终止密码子)中小型化肌营养不良蛋白多肽表达与小型化肌营养不良蛋白mrna表达的比率。
48.图4示出了bxa
‑
027743(seq id no:132)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图，以及其接点j1和j7的氨基酸序列，其具有相对低的免疫原性，如所指示的。
49.图5示出了bxa
‑
027741(seq id no:129)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图，其中箭头指向其接点j10、j 11和j9。
50.图6a示出了直方图，其指示在所测试的40个样品细胞组中，用如所指示的各种接点肽脉冲并具有cd4 增殖细胞的样品比例(每个彩色正方形代表一个患者样品)。图6b示出了直方图，其指示在所测试的40个样品细胞组中，用如所指示的各种接点肽脉冲并具有cd8 增殖细胞的样品比例(每个彩色正方形代表一个患者样品)。
51.图7示出了bxa
‑
196473(seq id no:119)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。
52.图8a示出了bxa
‑
196477(seq id no:118)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。rv：r1与r3之间的精氨酸
‑
缬氨酸二肽；seaq：丝氨酸
‑
谷氨酸
‑
丙氨酸
‑
谷氨酰胺肽。图8b示出了小型化肌营养不良蛋白多肽 bxa
‑
027741(seq id no:129)的r1与r3之间的原始接点10周围的三维折叠(左)，以及小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
196477(seq id no:118) 的接点10的版本3周围的三维折叠(右)。
53.图9示出了在转染表达所指示的小型化肌营养不良蛋白多肽的质粒后，人等基因诱导多能干细胞(ipsc)衍生的心肌细胞(icm)(在肌营养不良蛋白基因中携带阻止内源性
肌营养不良蛋白表达的e2035x过早终止密码子)中小型化肌营养不良蛋白多肽表达与小型化肌营养不良蛋白mrna的比率。
54.图10示出了bxa
‑
196474(seq id no:120)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。
55.图11示出了bxa
‑
196475(seq id no:121)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。
56.图12示出了bxa
‑
196476(seq id no:122)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。
57.图13示出了bxa
‑
196478(seq id no:124)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。
58.图14示出了bxa
‑
196479(seq id no:125)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。
59.图15在用表达bxa
‑
196477和bxa
‑
213788的小型化肌营养不良蛋白多肽的aav9构建体感染的人dmd hipsc cm中的传导速度。图15a示出了在实验中使用的多电极阵列(mea)的照片(左)和mea的单个电极的照片(右)。图15b示出了在实验条件下来自mea的28个电极的信号。图15c示出了说明穿过所述阵列的脉冲传导的图形。图15d示出了bxa
‑
196477(seq id no: 118)和bxa
‑
213788(seq id no:152)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。图15e示出了其中将表达bxa
‑
196477(seq id no:118)和 bxa
‑
213788的小型化肌营养不良蛋白多肽的人dmd hipsc cm的传导速度绘制为转染后时间的函数的图形。图15f示出了指示在测量了传导速度的细胞中小型化肌营养不良蛋白多肽的表达的直方图。
60.图16示出了概述所进行的体内研究的实验设置的示意图。
61.图17 aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788的靶标接合。图17b示出了用aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的小鼠肌肉组织中小型化肌营养不良蛋白多肽和麦胚凝集素(wga)的表达的免疫荧光可视化。图 17a示出了直方图，其指示各种肌肉中小型化肌营养不良蛋白呈阳性的细胞的相对数量。具有斜纹图案的条＝作为wga阳性细胞的比例的 bxa
‑
196477小型化肌营养不良蛋白阳性细胞％；具有纵纹图案的的条＝作为wga阳性细胞的比例的bxa
‑
213788小型化肌营养不良蛋白的％。
62.图18在4周龄的mdx
4cv
小鼠中确定的aav9
‑
bxa
‑
196477或 aav9
‑
bxa
‑
213788的靶标接合。图18a示出了bxa
‑
196477(seq id no: 118)和bxa
‑
213788(seq id no:152)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。图18b示出了指示用aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的 mdx
4cv
小鼠的肌肉组织中病毒基因组的相对量的直方图。图18c示出了指示用 aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的mdx
4cv
小鼠的心脏中小型化肌营养不良蛋白mrna的相对量的直方图。图18d示出了指示用 aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的小鼠的肌肉组织中小型化肌营养不良蛋白的相对量的直方图。dia＝隔膜；gas＝腓肠肌；ta ＝胫骨前肌。将经处理的小鼠与野生型和mdx
4cv
未处理的小鼠进行比较。
63.图19a示出了指示用aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的 mdx
4cv
小鼠(4周)的血清中肌酸激酶的量的直方图。图19b示出了指示用 aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的mdx
4cv
小鼠(12周)的血清中肌酸激酶的量的直方图。将经处理的小鼠与野生型和mdx
4cv
未处理的小鼠进行比较。
64.图20 2月龄时的峰值强直收缩。图20a示出了指示用aav9
‑
bxa
‑
196477 或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的小鼠mdx
4cv
中的收缩特性(力，单位为牛顿米； nm)的图形。图20b示出了指示经处理的小鼠中的峰值强直收缩的直方图。图20c示出了指示经处理的小鼠中的ta质量的直方图。图20d示出了指示经处理的小鼠中的力/ta质量的直方图。将经处理的小鼠与野生型和mdx
4cv
未处理的小鼠进行比较。
65.图21保护免受收缩诱导的损伤。图21a示出了概述实验设置的图形。图 21b示出了指示用aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理的小鼠中的肌肉收缩特性(最大等长扭矩)的曲线图。将经处理的小鼠与野生型和mdx
4cv
未处理的小鼠进行比较。
66.图22a示出了bxa
‑
027741(seq id no:seq id no:129)的小型化肌营养不良蛋白多肽的示意图。图22b示出了指示接点肽1至12的免疫原性的直方图。
67.图23a示出了指示对接点肽的mhc i/cd8 免疫应答的直方图。此处的肽j11v3与图22b中的3号肽是相同的肽。
68.图23b示出了指示对接点肽的mhc ii/cd4 免疫应答的直方图。此处的肽j11v3与图22b中的3号肽是相同的肽。
5.具体实施方式
69.5.1概述
70.本公开文本涉及新型小型化肌营养不良蛋白或编码其的基因。所述小型化肌营养不良蛋白可以可操作地连接至调节盒。本公开文本还涉及治疗患有肌营养不良症、肌肉减少症、心力衰竭或恶病质的受试者的方法。此外，本公开文本涉及预防性治疗处于患上肌营养不良症、肌肉减少症、心力衰竭或恶病质的风险中的受试者的方法。用于治疗患有或有风险患上肌营养不良症、肌肉减少症、心力衰竭或恶病质的受试者的所述方法可以包括向所述受试者施用包括小型化肌营养不良蛋白基因和递送媒介物的药物组合物。
71.5.2定义
72.为了可以更容易地理解本公开文本，首先定义某些术语。如本技术所用，除非本文另外明确提供，否则以下术语中的每一个应当具有下文所阐述的含义。另外的定义贯穿本技术进行阐述。
73.在本文中使用的情况下，将术语“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中在短语如“a和/ 或b”中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样地，如在短语如“a、b和/或c”中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面中的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c； a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
74.应当理解，本文中无论用语言“包含”描述任何方面，还提供了以“由... 组成”和/或“基本上由...组成”描述的其他类似方面。
75.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开文本相关领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，concisedictionary of biomedicine and molecular biology,juo,pei
‑
show,第2版,2002, crc出版社；the dictionary of cell and molecular biology,第3版,1999,学术出版社；以及oxford dictionary of biochemistry and molecular biology,修订版,2000,牛津大学出版社为
技术人员提供了本公开文本中所用的许多术语的通用词典。
76.单位、前缀和符号以其国际单位制(si)认可的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书作为整体而获得。因此，通过从整体上参考说明书，可以更全面地定义下面紧接着定义的术语。
77.肌营养不良蛋白(dmd)是一种编码肌营养不良蛋白的大型人x连锁基因。蛋白质肌营养不良蛋白是一种427kda的细胞骨架蛋白，其定位于肌膜的胞质面，并在肌纤维中的肋节处富集。肌营养不良蛋白具有四个主要功能结构域：肌动蛋白结合氨基端结构域(abd1)；中央杆结构域，其包含一系列称为“血影蛋白重复结构域”的杆状物和铰链；富含半胱氨酸的结构域；和羧基端。
78.如本文所用，术语“小型化肌营养不良蛋白多肽”或“小型化肌营养不良蛋白肽”是指尺寸小于全长野生型肌营养不良蛋白多肽的多肽。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽能够将dmd动物模型中的肌肉生理学或解剖学的可测量值改变(视情况而定，增加或减少)野生型值的至少大约10％或20％，使得所述值更接近野生型值(例如，mdx小鼠的肌肉生理学或解剖学的可测量值是野生型值的50％，并且此值增加至野生型值的至少60％；或者mdx小鼠的肌肉生理学或解剖学的可测量值是野生型值的 150％，并且此值减小至野生型值的至多140％)。在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽能够将dmd动物模型中的肌肉生理学或解剖学的可测量值改变野生型值的至少大约30％。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽能够将dmd动物模型中的肌肉生理学或解剖学的可测量值改变至类似于野生型值的水平(例如，
±
4％)。
79.如本文所用，术语“血影蛋白重复序列”或“血影蛋白样重复序列”是指由大约100个氨基酸构成的肽，其负责许多结构蛋白(包括但不限于肌营养不良蛋白)的杆状形状，其中所述血影蛋白重复序列通常以多个拷贝存在。血影蛋白重复序列可以包括天然肽序列的突变，如氨基酸序列的保守和/或非保守变化，以及在血影蛋白重复序列的末端或血影蛋白重复序列内多达1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的添加或缺失。在一些实施方案中，每个血影蛋白重复序列(r1至r24中的每一个)均具有与天然存在的血影蛋白重复序列(天然存在的r1至r24中的每一个)至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
80.如本文所用，术语“血影蛋白重复序列编码序列”是指编码血影蛋白重复肽的核酸序列。此术语包括编码血影蛋白重复序列(例如，天然存在的和突变的血影蛋白重复肽两者)的天然和合成核酸序列。
81.如本文所用，术语“血影蛋白重复结构域”是指在小型化肌营养不良蛋白多肽中含有所述小型化肌营养不良蛋白多肽的血影蛋白重复序列的区域。
82.术语“融合的”是指框内连接至第二氨基酸序列的第一氨基酸序列，从而形成“融合”蛋白/多肽，所述第一氨基酸序列在自然界中通常不与所述第二氨基酸序列连接。通常存在于分开的蛋白质中的这些融合氨基酸序列可以在融合多肽中聚在一起，或者通常存在于相同蛋白质中的氨基酸序列可以以新的排列方式置于融合多肽中。例如，融合蛋白是通过化学肽合成或通过重组dna技术产生，在重组dna技术中由此产生多核苷酸，然后翻译，其中以所需的关系编码肽区域。融合蛋白还可以包含通过共价非肽键或通过非共价键与第一
氨基酸序列缔合的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，两个多肽之间的“融合”通过接头实现。接头可以是氨基酸或其他化学结构。在一些实施方案中，接头可以是合成的。
83.在一些实施方案中，两个多肽之间的“融合”是直接融合，即没有中间接头。术语“直接地融合”或“直接的融合”是指两条多肽链之间通过肽键连接。例如，当第一氨基酸通过肽键与第二氨基酸“融合”时，第一氨基酸与第二氨基酸“直接融合”。
84.分别关于作为更大多肽或多核苷酸的一部分的多肽部分或多核苷酸部分的“异源”和“异源部分”描述了来源于与所述多肽或多核苷酸分子的其余部分不同的多肽或多核苷酸的多肽或多核苷酸。所述多肽或多核苷酸的另外的异源组分可以分别来源于与本文所述的其余多肽或多核苷酸相同的生物体，或者所述另外的组分可以来自不同的生物体。例如，异源多肽可以是合成的，或源自不同物种、个体的不同细胞类型，或者不同个体的相同或不同的细胞类型。在一方面，异源部分是与另一多肽融合以产生多肽的多肽。在另一方面，异源部分是与多肽或蛋白质缀合的非多肽，如peg。
85.如本文所用，术语“肌肉细胞”是指源自肌肉组织的细胞，包括但不限于源自骨骼肌、平滑肌(例如，来自消化道、膀胱和血管)和心肌的细胞。所述术语包括体外、离体和体内的肌肉细胞。因此，例如，分离的心肌细胞将构成肌肉细胞，正如存在于受试者体内存在的肌肉组织中的细胞一样。此术语还包括终末分化和未分化的肌肉细胞两者，如肌细胞、肌管、成肌细胞、心肌细胞和成心肌细胞。
86.如本文所用，关于基因调节元件(例如，增强子序列、启动子序列)的术语“肌肉特异性的”意指与其他组织中的调节元件驱动的转录活性相比，所述调节元件主要在肌肉细胞或组织中驱动转录活性(例如，20:1)。确定调节元件的肌肉特异性的测定是本领域已知的(例如，使用用表达载体转染的鼠肌肉细胞和肝细胞的体外测定，所述表达载体包含驱动β
‑
半乳糖苷报告物表达的待测试的调节元件)。
87.如本文所用，术语“腺相关病毒”或“aav”包括但不限于1型aav、2 型aav、3型aav(包括3a型和3b型)、4型aav、5型aav、6型aav、7型 aav、8型aav、9型aav、10型aav、11型aav、12型aav、13型aav、蛇 aav、鸟类aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav、山羊aav、虾aav、灵长类动物aav、非灵长类动物aav和绵羊aav、由gao等人(j.virol. 78:6381(2004))和moris等人(virol.33:375(2004))披露的那些aav血清型和进化枝，以及现在已知或将来发现的任何其他aav。参见例如，fields等人virology,第2卷,第69章(第4版,lippincott
‑
raven publishers)。aav 是指细小病毒科(parvoviridae)中的dependoparvovirus。例如，aav可以是源自天然存在的“野生型”病毒的aav、源自包装到源自由天然存在的cap 基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的重组aav(raav)基因组和/或包装到源自由非天然衣壳cap基因编码的衣壳蛋白的衣壳中的raav基因组的aav。如本文所用，“aav”可以用来指病毒本身或其衍生物。除了另有明确指示的情况，否则所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的形式和重组形式两者。“灵长类动物aav”是指感染灵长类动物的aav，“非灵长类动物aav”是指感染除灵长类动物以外的动物的aav，“牛aav”是指感染牛类哺乳动物的aav 等。参见例如，bernard n.fields等人,virology,第2卷,第69章(第 3版，lippincott
‑
raven publishers)。
88.术语“raav”是指“重组aav”。在一些实施方案中，重组aav具有aav 基因组，其中rep和cap基因的一部分或全部已被异源多核苷酸序列替代。
89.如本文所用的“aav载体”或“腺相关病毒载体”是指包含非aav源的多核苷酸序列
(即，对于aav为异源的多核苷酸)的raav，所述多核苷酸序列通常是用于细胞遗传转化的目的序列。通常，异源多核苷酸的侧翼是至少一个并且通常是两个aav反向末端重复序列(itr)。
[0090]“无衣壳(capsid
‑
free)”或“无衣壳(capsid
‑
less)”(或其变型)病毒 (例如，aav)基因组或核酸分子是指不具有衣壳的基因组或核酸分子。在一些实施方案中，无衣壳基因组或核酸分子不含编码例如aav rep蛋白的序列。
[0091]“aav”或“aav病毒颗粒”或“aav载体”或“raav载体颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白(通常是野生型aav的所有衣壳蛋白)和包壳的多核苷酸构成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型 aav基因组以外的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则通常将其称为“raav载体颗粒”或简称为“aav载体”。
[0092]
aav的“辅助病毒”是指允许aav(例如，野生型aav)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于aav的多种此类辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(诸如牛痘)。腺病毒涵盖多种不同子群，但子群c的5型腺病毒是最常用的。人、非人哺乳动物和鸟类来源的许多腺病毒是已知的，并且可从诸如atcc的保藏机构获得。疱疹科病毒包括例如单纯疱疹病毒(hsv)和爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(ebv)，以及巨细胞病毒(cmv)和伪狂犬病病毒(prv)；所有这些病毒也可从诸如atcc的保藏机构获得。
[0093]
如本文所用，术语“反向末端重复序列”(或“itr”)是指核苷酸的单链序列，其下游跟随其反向互补体。初始序列与反向互补体之间的插入核苷酸序列可以具有任何长度，包括零。aav基因组通常在两个末端处包含反向末端重复序列(itr)，其中每个末端通常是回文的并且可以形成发夹。
[0094]
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指由共价键合成链的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。
[0095]
如本文所用的术语“向性”是指病毒(例如，aav)仅感染一种或多种特定细胞类型的能力，以及其如下能力：仅与特定细胞表面部分相互作用以实现细胞进入，任选地且优选地随后将病毒(例如，aav)所携带的序列表达(例如，转录并任选地翻译)到细胞中(例如，对于重组病毒，表达一个或多个异源核苷酸序列)。
[0096]
如本文所用，术语“转导”是指病毒(例如，aav)进入细胞中并将病毒内包含的遗传物质转移到细胞中，以从病毒基因组获得表达。通常，病毒 (例如，aav)根据其向性进入细胞。
[0097]“施用”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任何一种将治疗剂物理引入受试者。例如用于aav疗法的示例性施用途径包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外、胸骨内、口服、直肠、局部、表皮、粘膜、鼻内、阴道、直肠和舌下施用。施用还可以例如一次、多次和/或经一个或多个延长的时间段进行。
[0098]
受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或过程或者向受试者施用活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发。
[0099]
如本文所用，“治疗有效量”、“治疗剂量”、“有效剂量”(“effective dose”或“effective dosage”)意指实现如本文所述治疗目标的量或剂量。本领域普通技术人员将
进一步理解，治疗有效量等可以以单剂量施用，或者可以通过施用多剂量(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量)来实现。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力可以使用熟练开业者已知的各种方法来评价，如在临床试验期间在人受试者中，在预测于人体中的功效的动物模型系统中，或者通过在体外测定中测定药剂的活性来评价。
[0100]“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗和啮齿动物(诸如小鼠、大鼠和豚鼠)。在一些实施方案中，所述受试者是人。术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用。
[0101]
如本文所用，术语“ug”和“um”分别可与“μg”和“μm”互换使用。
[0102]
替代方案(例如，“或”)的使用应当理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一个/种”(“a”或“an”)应当理解为是指“一个/种或多个/种”任何所列举或枚举的组分或实体。
[0103]
大约或约：除非上下文另外陈述或者另有明确含义，否则如应用于一个或多个目的值的如本文所用术语“大约”或“约”是指与所陈述参考值相似并且在如下值范围内的值：落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内(除了这个数字会超过可能值的100％的情况以外)。当术语“大约”或“约”在本文中应用于特定值时，本文还公开了没有所述术语“大约”或“约”的值。
[0104]
如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任何整数及(在适当时)其分数 (诸如整数的十分之一和百分之一)的值。
[0105]
在以下小节中进一步详细描述了本公开文本的各个方面。
[0106]
5.3多核苷酸和多肽
[0107]
5.3.1小型化肌营养不良蛋白
[0108]
本公开文本涉及一种包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码小型化肌营养不良蛋白多肽。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含肌营养不良蛋白的至少三个铰链结构域和至少五个血影蛋白重复结构域。
[0109]
肌营养不良蛋白是一种杆状胞质蛋白，其将肌纤维的细胞骨架经由细胞膜与周围的细胞外基质连接。这种蛋白质主要位于用于运动的肌肉(骨骼肌) 中和心(心脏)肌肉中。少量的肌营养不良蛋白存在于大脑的神经细胞中。在骨骼肌和心肌中，肌营养不良蛋白是一组蛋白质(蛋白质复合物)的一部分，所述蛋白质共同作用以增强肌纤维，并在肌肉收缩和放松时保护肌纤维免受损伤。肌营养不良蛋白复合物起锚的作用，其将每个肌肉细胞的结构框架(细胞骨架)与细胞外的蛋白质和其他分子的网格(细胞外基质)连接。肌营养不良蛋白复合物还可以通过与发送和接收化学信号的蛋白质相互作用而在细胞信号传导方面发挥作用。
[0110]
编码全长肌营养不良蛋白的dmd基因是已知最长的人基因之一，其覆盖基因座xp21处的2.3兆碱基(人基因组的0.08％)。肌肉中的初级转录物测量约2,100千碱基，并耗费16小时进行转录；成熟的mrna测量14.0千碱基。 79
‑
外显子肌肉转录物编码具有3685个氨基酸残基的蛋白质。
[0111]
本文公开了肌营养不良蛋白的氨基酸和核苷酸序列。构成人野生型肌营养不良蛋
白(同种型dp427m)的氨基酸序列被称为uniprot标识符 np_003997.1，并在表1中示出。
[0112]
表1.全长肌营养不良蛋白的氨基酸序列(np_003997.1)。
[0113]
[0114][0115]
源自选择性剪接的各种其他肌营养不良蛋白同种型是本领域已知的。在一些实施方案中，构建体包含表2中所述的核苷酸序列。
[0116]
本文还公开了一种编码全长肌营养不良蛋白的核苷酸序列。
[0117]
表2.全长肌营养不良蛋白(同种型dp427m)的核苷酸序列。
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127][0128]
野生型全长肌营养不良蛋白(同种型dp427m)含有24个血影蛋白样重复序列、至少四个铰链区、肌动蛋白结合结构域(abd1)、富含半胱氨酸的结构域(cr)和c端结构域(c端)。各结构域的多肽序列在表3中示出，并且各结构域的核苷酸序列在表4中示出。
[0129]
表3.肌营养不良蛋白结构域的氨基酸序列
[0130]
[0131]
[0132]
[0133][0134]
表4.肌营养不良蛋白结构域的核苷酸序列
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139][0140]
本公开文本涉及一种小型化肌营养不良蛋白多肽，其小于全长肌营养不良蛋白(即同种型dp427m)，并且与天然存在的肌营养不良蛋白同种型不同，或者涉及一种包含编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列的核酸分子。当本公开文本公开了小型化肌营养不良蛋白多肽时，本公开文本还公开了包含编码相应的所公开的小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列的核酸分子，反之亦然。在一些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核酸分子适用于基因疗法。因此，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核酸分子不仅被构建成适合基因疗法载体，例如aav载体，或者适用于重组表达，而且当被
施用或体内表达时，减少针对所述小型化肌营养不良蛋白多肽的任何不想要的免疫应答(例如，体液免疫应答和/或细胞免疫应答，例如cd4和/或cd8)。在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1)结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2) 结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17) 结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽不包含肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列2(r2)结构域。在其他实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽不包含血影蛋白重复序列2(r2)结构域和(1)血影蛋白重复序列4(r4)结构域、(2)血影蛋白重复序列5(r5)结构域、(3)血影蛋白重复序列6(r6)结构域,(4)血影蛋白重复序列7(r7)结构域、(5)血影蛋白重复序列8(r8)结构域、(6)血影蛋白重复序列9(r9)结构域、(7)血影蛋白重复序列10(r10)结构域、(8)血影蛋白重复序列11(r11)结构域、 (9)血影蛋白重复序列12(r12)结构域、(10)血影蛋白重复序列13(r13) 结构域、(11)血影蛋白重复序列14(r14)结构域、(12)血影蛋白重复序列 15(r15)结构域、(13)血影蛋白重复序列18(r18)结构域、(14)血影蛋白重复序列19(r19)结构域、(15)血影蛋白重复序列20(r20)结构域、 (16)血影蛋白重复序列21(r21)结构域、(17)血影蛋白重复序列22(r22) 结构域或(18)血影蛋白重复序列23(r23)结构域或(19)其任何组合。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽不包含血影蛋白重复序列 2(r2)结构域、血影蛋白重复序列4(r4)结构域、血影蛋白重复序列5(r5) 结构域、血影蛋白重复序列6(r6)结构域、血影蛋白重复序列7(r7)结构域、血影蛋白重复序列8(r8)结构域、血影蛋白重复序列9(r9)结构域、血影蛋白重复序列10(r10)结构域、血影蛋白重复序列11(r11)结构域、血影蛋白重复序列12(r12)结构域、血影蛋白重复序列13(r13)结构域、血影蛋白重复序列14(r14)结构域、血影蛋白重复序列15(r15) 结构域、血影蛋白重复序列18(r18)结构域、血影蛋白重复序列19(r19) 结构域、血影蛋白重复序列20(r20)结构域、血影蛋白重复序列21(r21) 结构域、血影蛋白重复序列22(r22)结构域和血影蛋白重复序列23(r23) 结构域。
[0141]
在某些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域通过肽键与r3结构域直接融合，例如参见小型化肌营养不良蛋白多肽 bxa
‑
027741。
[0142]
在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域和所述r3结构域通过氨基酸arg
‑
val(rv)融合。
[0143]
在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述h2结构域和所述r16结构域通过接头融合。所述接头可以是本领域已知的任何接头。在其他实施方案
中，所述接头可以选自本文公开的任何接头。在其他实施方案中，所述接头可以是第5.3.2节中的接头。在一些实施方案中，所述接头可以包含与seq id no:75(ihtvree tmmvmtedmp lei)至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0144]
在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述h2结构域和所述r16结构域通过接头融合。在一些实施方案中，所述接头可以包含与组合的seq id no:74
‑
75(seaq ihtvree tmmvmtedmp lei)至少约 80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0145]
在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述h2结构域和所述r16结构域通过接头融合。在一些实施方案中，所述接头可以包含与 seq id no:74(seaq)至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0146]
在其他实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域和所述r3结构域通过氨基酸arg
‑
val融合，并且其中所述h2结构域和所述 r16结构域通过接头(例如，组合的seq id no:74
‑
75)融合。
[0147]
在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域和所述r3结构域通过氨基酸arg
‑
val融合，其中所述h2结构域和所述r16 结构域通过接头(例如，组合的seq id no:74
‑
75)融合，并且其中(i)所述h1结构域和所述r1结构域直接融合，(ii)所述r3结构域和所述h2结构域直接融合，(iii)所述r16和r17结构域直接融合，(iv)所述r17和r24结构域直接融合，或(v)所述r24和h4结构域直接融合，或(vi)其任何组合。在一些实施方案中，可用于本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至 c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、铰链2(h2)结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域和所述r3结构域通过氨基酸arg
‑
val融合，其中所述h2结构域和所述r16 结构域通过接头(例如，组合的seq id no:74
‑
75)融合，并且其中(i)所述h1结构域和所述r1结构域直接融合，(ii)所述r3结构域和所述h2结构域直接融合，(iii)所述r16和r17结构域直接融合，(iv)所述
r17和r24结构域直接融合，以及(v)所述r24和h4结构域直接融合。在一些实施方案中，可用于本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽进一步包含abd1结构域(任选地在n端处)和/或cr结构域(任选地在n端处)。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c端基本上由肌营养不良蛋白的 abd1结构域、h1结构域、r1结构域、氨基酸rv、r3结构域、h2结构域、组合的seq id no:74
‑
75中列出的氨基酸序列、r16结构域、r17结构域、r24 结构域、h4结构域和cr结构域组成或由其组成。
[0148]
所述小型化肌营养不良蛋白多肽中的每个结构域均可以具有来自相应野生型结构域的一个或多个变化。
[0149]
例如，所述小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
196477按顺序由以下蛋白质结构域组成：
[0150]
表5a.小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
196477的氨基酸序列和结构域结构。
[0151]
[0152][0153]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽中的h1结构域是与 seq id no:69至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约 100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r1结构域是与seq id no: 70至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r3结构域是与seq id no:72至少约 70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述h2结构域是与seq id no:73至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r16结构域是与seq id no:76至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约
99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r17结构域是与seq id no:77至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述r24结构域是与seq id no:78至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述h4结构域是与seq idno:79至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步在n端处包含与seq id no:68至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步在c端处包含与seq id no:80至少约70％、至少约 75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的多肽序列。
[0154]
表5b.小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
027743的氨基酸序列和结构域结构。
[0155]
[0156][0157]
在一些实施方案中，本公开文本提供了一种包含血影蛋白重复序列1 (r1)结构域和血影蛋白16(r16)结构域的小型化肌营养不良蛋白多肽，其中所述r1结构域和所述r16结构域通过包含seq id no:84 (ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列的接头融合。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种小型化肌营养不良蛋白多肽，其从n端至c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1(h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1) 结构域、血影蛋白重复序列16(r16)结构域、血影蛋白重复序列17(r17) 结构域、铰链3(h3)结构域、血影蛋白重复序列23(r23)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域和所述r16结构域通过seq id no:84(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列融合。
[0158]
在一些实施方案中，本公开文本包括一种包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码包含血影蛋白重复序列1(r1)结构域和血影蛋白16 (r16)结构域的小型化肌营养不良蛋白多肽，其中所述r1结构域和所述r16 结构域通过包含seq id no:84(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列的接头融合。在一些实施方案中，本公开文
本提供了一种包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码小型化肌营养不良蛋白多肽，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c端包含：肌营养不良蛋白的铰链1 (h1)结构域、血影蛋白重复序列1(r1)结构域、血影蛋白重复序列16(r16) 结构域、血影蛋白重复序列17(r17)结构域、铰链3(h3)结构域、血影蛋白重复序列23(r23)结构域、血影蛋白重复序列24(r24)结构域和铰链4(h4)结构域，其中所述r1结构域和所述r16结构域通过seq id no:84 (ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列融合。
[0159]
在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽具有以下特征：(i)所述h1结构域和所述r1结构域直接融合，(ii)所述r16和r17结构域直接融合，(iii)所述r17和所述h3结构域直接融合，(iv)所述r23和r24 结构域直接融合，或(v)所述r24和h4结构域直接融合，或(vi)其任何组合。在一些实施方案中，本公开文本的小型化肌营养不良蛋白多肽不包含血影蛋白重复序列2(r2)结构域、血影蛋白重复序列3(r3)结构域、血影蛋白重复序列4(r4)结构域、血影蛋白重复序列5(r5)结构域、血影蛋白重复序列6(r6)结构域、血影蛋白重复序列7(r7)结构域、血影蛋白重复序列8(r8)结构域、血影蛋白重复序列9(r9)结构域、血影蛋白重复序列10(r10)结构域、血影蛋白重复序列11(r11)结构域、血影蛋白重复序列12(r12)结构域、血影蛋白重复序列13(r13)结构域、血影蛋白重复序列14(r14)结构域、血影蛋白重复序列15(r15)结构域、血影蛋白重复序列18(r18)结构域、血影蛋白重复序列19(r19)结构域、血影蛋白重复序列20(r20)结构域、血影蛋白重复序列21(r21)结构域和/或血影蛋白重复序列22(r22)结构域。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步包含abd1结构域和/或cr结构域。
[0160]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽从n端至c端包含：肌营养不良蛋白的abd1结构域、h1结构域、r1结构域、seq id no:84 (ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列、r16结构域、r17 结构域、h3结构域、r23结构域、r24结构域、h4结构域和cr结构域，或者基本上由其组成或由其组成。
[0161]
在一些实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的h1结构域包含与seq id no:82至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在其他实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的r1结构域包含与seq id no:83至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0162]
在一些实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的r16结构域包含与seq id no:85至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0163]
在一些实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的r17结构域包含与seq id no:86至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0164]
在其他实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的h3结构域包含与seq id no:87至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0165]
在一些实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的r23结构域包含与
seq id no:88至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0166]
在其他实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的r24结构域包含与seq id no:89至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0167]
在一些实施方案中，对所述小型化肌营养不良蛋白多肽有用的h4结构域包含与seq id no:90至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0168]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步在n端处包含与seq id no:81至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽进一步在c端处包含与seq id no:91至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0169]
在一些实施方案中，编码每个结构域的核酸序列可以是以下：
[0170]
表6a：编码小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
196477的核苷酸序列(和结构域结构)。
[0171]
[0172]
[0173][0174]
在一些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽中的h1结构域的核酸序列是与seq id no:94至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述r1结构域的核酸序列是与seq id no:95至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述r3结构域的核酸序列是与seq id no:97至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述h2结构域的核酸序列是与seq id no:98至少约60％、至少约70％、至少
约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述r16结构域的核酸序列是与seq id no:101至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述r17结构域的核酸序列是与seq id no:102至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述r24结构域的核酸序列是与seq id no:103至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述h4结构域的核酸序列是与seq id no:104至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽中的abd1结构域的核酸序列是与seq id no:93至少约 60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。在一些实施方案中，编码所述cr/c端多肽的核酸序列是与seq id no:105至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。表6b：编码小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
027743的核苷酸序列(和结构域结构)。
[0175]
[0176]
[0177]
[0178][0179]
本公开文本的各种小型化肌营养不良蛋白多肽在表7中示出。
[0180]
表7.小型化肌营养不良蛋白构建体的氨基酸序列。
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189][0190]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no: 118
‑
132至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seqid no:118(bxa
‑
196477)、seq id no:119(bxa
‑
196473)、seq id no:120 (bxa
‑
196474)、seq id no:121(bxa
‑
196475)、seq id no:122 (bxa
‑
196476)、seq id no:124(bxa
‑
196478)或seq id no:125 (bxa
‑
196479)中的一种至少约70％、至少约75％、
至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:118至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:119至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:120至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:121至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:122至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:123至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:124至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no:125至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。
[0191]
在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no: 126至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq idno:127至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seqid no:128至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌
营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seqidno:129至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seqidno:130至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seqidno:131至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seqidno:132至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。
[0192]
在一些实施方案中，由所述核酸分子编码的小型化肌营养不良蛋白多肽具有式(i)：
[0193]
h1
‑
r1
‑
l1
‑
r3
‑
h2
‑
l2
‑
l3
‑
r16
‑
r17
‑
r24
‑
h4
[0194]
(i)
[0195]
其中：h1是肌营养不良蛋白的铰链1结构域；r1是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列1结构域；l1是氨基酸arg
‑
val(rv)；r3是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列3结构域；h2是肌营养不良蛋白的铰链2结构域；l2是seqidno:74(seaq)中列出的氨基酸序列；l3是seqidno:75(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的氨基酸序列；r16是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列16；r17是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列17；r24是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列24；h4是肌营养不良蛋白的铰链4结构域；并且(
‑
)是肽键。
[0196]
在一些实施方案中，由所述核酸分子编码的小型化肌营养不良蛋白多肽表现出选自以下的一种或多种特性：(i)与bxa
‑
027741相比具有较低的cd4增殖，(ii)与bxa
‑
027741相比具有较低的cd8增殖，和(iv)其任何组合。
[0197]
在一些实施方案中，由所述核酸分子编码的小型化肌营养不良蛋白多肽具有式(ii)：
[0198]
h1
‑
r1
‑
l
‑
r16
‑
r17
‑
h3
‑
r23
‑
r24
‑
h4
[0199]
(ii)
[0200]
其中：h1是肌营养不良蛋白的铰链1结构域；r1是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列1结构域；l是氨基酸seqidno:84(ihtvreetmmvmtedmplei)；r16是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列16；r17是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列17；h3是肌营养不良蛋白的铰链3结构域；r23是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列23；r24是肌营养不良蛋白的血影蛋白重复序列24；h4是肌营养不良蛋白的铰链4结构域；并且(
‑
)是肽键。
[0201]
在一些实施方案中，由所述核酸分子编码的小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seqidno:132至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。
[0202]
在一些实施方案中，所述核苷酸序列包含与seq id no:147的核苷酸序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
[0203]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽表现出比 bxa
‑
196481更高的小型化肌营养不良蛋白多肽的表达。在一些其他实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽的表达比bxa
‑
196481多肽的表达高至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5 倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍或至少约3倍。
[0204]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽可以由核苷酸序列编码。所述核苷酸序列的一些例子在表8中示出。
[0205]
表8.肌营养不良蛋白构建体的核苷酸序列。
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238][0239]
seq id no:148编码构建体bxa
‑
212371，其与构建体bxa
‑
027743相同，但是c端缺失。
[0240]
seq id no:149编码构建体bxa
‑
212372，其与bxa
‑
212371相同，但具有较短的3'utr。
[0241]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含或是表9中示出的构建体。
[0242]
表9.小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
213788的氨基酸序列。
[0243]
[0244][0245]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no: 152至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。
[0246]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含或是表10中示出的构建体。
[0247]
表10.小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
213780j11v3的氨基酸序列。
[0248]
[0249][0250]
seq id no:153编码构建体bxa
‑
213780j11v3，其与构建体bxa
‑
196477 相同，但是内部seaq接头(seq id no.74)的氨基酸a和q以及c端处的最后三个氨基酸在bxa
‑
213780j11v3中缺失。
[0251]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽包含与seq id no: 153至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。
[0252]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
213780j11v3可以由表11中示出的核苷酸序列编码。
[0253]
表11.小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
213780j11v3的核苷酸序列。
[0254]
[0255][0256]
在一些实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽具有铰链2(h2) 结构域与r16血影蛋白重复序列16(r16)结构域之间的接点，所述接点包含表12中列出的氨基酸序列。
[0257]
表12.接点的氨基酸序列
[0258][0259]
在其他实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id seq id no:133
‑
149至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约
96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽在从所述核苷酸序列表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在其他实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:133(bxa
‑
196 477)、seq id no:134(bxa
‑
196473)、seq id no:135(bxa
‑
196474)、 seq id no:136(bxa
‑
196475)、seq id no:137(bxa
‑
196476)、seq id no:139(bxa
‑
196478)、seq id no:140(bxa
‑
196479)、seq id no:148(bxa
‑
212371)或seq id no:149(bxa
‑
212372)至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约9 8％、至少约99％或约100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:133至少约6 0％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽在从所述核苷酸序列表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:134至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约9 7％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽在从所述核苷酸序列表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在一些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:135至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列。在某些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:136至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列。在某些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:137至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列。在某些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:138至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约9 8％、至少约99％或约100％相同的核酸序列，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽在从所述核苷酸序列表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:139至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽在从所述核苷酸序列表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:140至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽在从所述核苷酸序列表达时具有至少一种肌营养不良蛋白活性。在某些实施方案中，编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列包含与seq id no:141至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约9 7％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核酸序列，其中所述小型化肌营养不良蛋白多肽在从
no:99
‑
100至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含组合的seqidno:74
‑
75(seaqihtvreetmmvmtedmplei)。
[0262]
在一些实施方案中，核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含seqidno:75(ihtvreetmmvmtedmplei)的氨基酸序列，其中所述核酸分子与seqidno:100(atccacaccgtgcgggaagagacaatgatggtcatgacagaggacatgcccctggaaatc)至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同。
[0263]
在一些实施方案中，所述氨基酸序列可以用作连接肌营养不良蛋白的一个或多个结构域的接头。在一些实施方案中，所述接头连接肌营养不良蛋白的第一结构域和肌营养不良蛋白的第二结构域。在一些实施方案中，可以连接的肌营养不良蛋白的第一结构域和第二结构域是r1结构域和r16结构域。在其他实施方案中，可以连接的肌营养不良蛋白的第一结构域和第二结构域是r3结构域和r16结构域。在其他实施方案中，可以连接的肌营养不良蛋白的第一结构域和第二结构域是h2结构域和r16结构域。
[0264]
在一些实施方案中，本公开文本包括一种核酸分子，其包含与seqidno:99(agtgaagctcag)至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
[0265]
在一些实施方案中，本公开文本包括一种核酸分子，其包含与seqidno:100(atccacaccgtgcgggaagagacaatgatggtcatgacagaggacatgcccctggaaatc)至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的核苷酸序列。
[0266]
在一些实施方案中，本公开文本包括一种核酸分子，其包含与组合的seqidno:99和100(agtgaagctcagatccacaccgtgcgggaagagacaatgatggtcatgacagaggacatgcccctggaaatc)至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的编码氨基酸序列的核苷酸序列。
[0267]
在一些实施方案中，通过连接所述小型化肌营养不良蛋白多肽的两个结构域(例如，h2和r16结构域)，将所述接头置于本文公开的小型化肌营养不良蛋白多肽中。在一些实施方案中，所述接头位于包含abd1
‑
h1
‑
r1
‑
r3
‑
h2
‑
l
‑
r16
‑
r17
‑
r24
‑
h4
‑
cr
‑
c端的小型化肌营养不良蛋白多肽中的h2与r16结构域之间，其中abd1是肌动蛋白结合结构域1，h1是铰链1结构域，r1是血影蛋白重复序列1结构域，r3是血影蛋白重复序列3结构域，h2是铰链2结构域，l是接头，例如seqidno:74或seqidno:75(或两者组合)(或与这些序列至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列)，r16是血影蛋白重复序列16结构域，r17是血影蛋白重复序列17结构域，r24是血影蛋白24结构域，h4是铰链4结构域，cr是富含半胱氨酸的结构域，并且c端是任选的c端结构域(或其部分)。
[0268]
本公开文本还提供了一种包含ihtvreetmmvmtedmplei(seqidno:84)的接头。在一些实施方案中，通过连接所述小型化肌营养不良蛋白多肽的两个结构域(例如，r1和r16结构域)，将包含seqidno:75(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的序列(或与seqidno:84(ihtvreetmmvmtedmplei)中列出的序列至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约
100％相同的序列)的接头置于本文公开的小型化肌营养不良蛋白多肽中。在一些实施方案中，所述接头位于包含 abd1
‑
h1
‑
r1
‑
l
‑
r16
‑
r17
‑
h3
‑
r23
‑
r24
‑
h4
‑
cr
‑
c端的小型化肌营养不良蛋白多肽中的r1与r16结构域之间，其中abd1是肌动蛋白结合结构域1，h1是铰链1结构域，r1是血影蛋白重复序列1结构域，l是接头，例如seq id no:84， r16是血影蛋白重复序列16结构域，r17是血影蛋白重复序列17结构域，h3 是铰链3结构域，r23是血影蛋白23结构域，r24是血影蛋白24结构域，h4 是铰链4结构域，cr是富含半胱氨酸的结构域，并且c端是c端结构域(或其部分)。
[0269]
5.3.3非编码多核苷酸
[0270]
在一些方面，本文提供了核酸分子，例如，dna或rna，其包含编码小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列。
[0271]
在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含非编码组分。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含启动子。用于哺乳动物宿主细胞表达的某些示例性调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，如源自巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(admlp))和多瘤的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或β
‑
珠蛋白启动子。再进一步地，可以使用由不同来源的序列构成的调节元件，如sra启动子系统，其含有来自 sv40早期启动子和人t细胞白血病1型病毒的长末端重复序列的序列(takebe, y.等人(1988)mol.cell.biol.8:466
‑
472)。在某些实施方案中，所述调节序列包含组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子驱动所述目的基因在选自心脏、肝脏、肺、眼睛、神经系统、淋巴系统、中枢神经系统、神经元细胞、肌肉和干细胞的组织中表达。
[0272]
在一些实施方案中，本文公开的启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述启动子驱动治疗性蛋白在肝细胞、肌细胞、内皮细胞、窦状隙细胞或神经元细胞或其任何组合中的表达。在一些实施方案中，所述启动子选自突触蛋白1基因启动子、小鼠甲状腺素启动子(mttr)、内源人因子 viii启动子(f8)、人α
‑1‑
抗胰蛋白酶启动子(haat)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、三重四脯氨酸(ttp)启动子、casi启动子、cag启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、α1
‑
抗胰蛋白酶(aat)启动子、肌肉肌酸激酶(mck)启动子、肌球蛋白重链α(αmhc)启动子、肌红蛋白(mb) 启动子、结蛋白(des)启动子、spc5
‑
12启动子、2r5sc5
‑
12启动子、dmck 启动子、tmck启动子、α
‑
突触核蛋白启动子和磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子。
[0273]
在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含内含子序列。在一些实施方案中，所述内含子序列定位于编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列的5'。在一些实施方案中，所述内含子序列定位于启动子的3'。在一些实施方案中，所述内含子序列包含合成内含子序列。
[0274]
在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含转录后调节元件。在一些实施方案中，所述转录后调节元件定位于编码所述小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列的3'。在一些实施方案中，转录后调节元件包含突变的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)、微小rna结合位点或dna核靶向序列或其任何组合。
[0275]
在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含3'utr多聚(a)尾序列。在一些实施方案中，3'utr多聚(a)尾序列选自bgh多聚(a)、肌动蛋白多聚(a)、血红蛋白多聚(a)及其任
何组合。在一些实施方案中，3'utr 多聚(a)尾序列包含bgh多聚(a)。
[0276]
在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含增强子序列。在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含第一反向末端重复序列(itr)和/或第二 itr。在一些实施方案中，所述第一itr和所述第二itr相同。在一些实施方案中，所述第一itr和/或所述第二itr源自腺相关病毒。在一些实施方案中，所述第一itr源自腺相关病毒，并且所述第二itr源自腺相关病毒。
[0277]
进一步认识到，所述核酸分子可以包含有助于所述多肽翻译的另外的元件。此类序列包括，例如，与编码多肽的多核苷酸的5'末端附接的kozak序列。 kozak共有序列是在真核mrna上出现的序列，其在翻译过程的启动中起作用并且具有共有序列(gee)gccrccaugg(seq id no:150)；其中：(1)小写字母表示在一位置处最常见的碱基，其中所述碱基仍然可以变化；(2)大写字母表示高度保守的碱基，即'augg'序列是恒定的或很少(如果有的话)变化，除了iupac歧义码'r'，其表示在此位置通常观察到嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)；并且(3)括号中的序列((gee))意义不确定。
[0278]
在一个非限制性实施方案中，所述核酸分子包含kozak序列的功能性变体或其片段。当与缺乏前导序列的序列的翻译水平相比时，kozak序列的功能变体或其片段将保留增加蛋白质翻译的能力。这种功能片段可包含kozak 序列或者seq id no:150或seq id no:151(gccaccatgg)中列出的序列的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、 40个连续核苷酸。可替代地，功能变体可以包含与kozak序列或者seq id no: 150或seq id no:151中列出的序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
[0279]
5.3.4异源部分
[0280]
在一些实施方案中，本公开文本的多肽进一步可以包含另外的元件，例如，异源部分。此类元件可以帮助多肽的表达、帮助多肽的分泌、改善多肽的稳定性、允许更有效地纯化多肽和/或调节多肽的活性。在一些实施方案中，所述异源部分是多肽部分。在其他实施方案中，所述异源部分是非多肽部分。
[0281]
在一些实施方案中，所述多肽包含与所述多肽融合的异源部分。
[0282]
在一些实施方案中，本文公开的多肽包含一个或多个另外的异源部分。在一些实施方案中，所述异源部分是半衰期延长部分。在一些实施方案中，所述异源部分包含白蛋白或其片段、免疫球蛋白fc区、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的c末端肽(ctp)、pas序列、hap序列、转铁蛋白或其片段、白蛋白结合部分或其衍生物或其任何组合。
[0283]
在一些实施方案中，本文公开的多肽包含一个或多个另外的异源部分。在一些实施方案中，所述异源部分是半衰期延长部分。在一些实施方案中，所述异源部分包含白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其部分、免疫球蛋白结合多肽、免疫球蛋白g(igg)、白蛋白结合多肽(abp)、pas化部分、hes化部分、xten、peg化部分或fc区或其任何组合。
[0284]
5.4细胞
[0285]
在某些方面，本文提供了表达(例如，以重组方式)本文所述蛋白质的细胞(例如，宿主细胞)和包含编码本文所述蛋白质的核苷酸的表达载体。
[0286]
在一些实施方案中，所述宿主细胞包含本文所述的核酸分子。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含本文所述的载体。
[0287]
在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、转基因哺乳动物细胞和植物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述原核细胞是细菌细胞。
[0288]
在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于cho、vero、bhk、hela、mdck、hek 293、nih 3t3、 w138、bt483、hs578t、htb2、bt2o和t47d、ns0(不内源产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、crl7o3o、cos(例如，cos1或cos)、per.c6、vero、hss78bst、hek
‑
293t、hepg2、sp210、r1.1、b
‑
w、l
‑
m、 bsc1、bsc40、yb/20、bmt10、hbk、nso、ht1080和hss78bst细胞。
[0289]
5.5载体
[0290]
5.5.1腺相关病毒(aav)
[0291]
5.5.1.1概述
[0292]
本文提供了包含核酸分子的载体(例如，表达载体)，所述核酸分子包含编码用于在宿主细胞和治疗干预靶向的细胞中重组表达的小型化肌营养不良蛋白的核苷酸序列。如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运其所连接的另一核酸的核酸分子；或包含能够转运另一核酸的这种核酸分子的实体。一种类型的载体是“质粒”，它是指可以将另外的dna区段连接至其中的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的dna 区段连接至病毒基因组中。某些载体或作为载体一部分的多核苷酸能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在被引入宿主细胞中之后整合至宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或者简单地，“表达载体”)。一般来说，用于重组dna技术中的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以互换使用，这取决于上下文，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本文还公开了发挥同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0293]
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸使用腺相关病毒(aav)表达。 aav是细小病毒科的非包膜单链dna病毒。与细小病毒科的大多数其他成员相反，aav具有复制缺陷并且只能在辅助病毒(诸如腺病毒或疱疹病毒)的存在下进行有效复制。
[0294]
aav最早在1960年代中期作为腺病毒的病毒制剂的污染物被发现。参见 atchison r w,casto b c,hammon w m.science.149(3685),754
‑
756 (1965)。从那时起，已经开发出逐渐更安全且更有效的使用aav作为重组 dna载体的方法。参见例如，hermonat p.l.和muzyczka n.proc natl acad sciusa.81(20),6466
‑
6470(1984)。3.laughlin c.a.等人gene,23(1),65
‑
73(1983)。matsushita t.等人gene ther.5(7),938
‑
945(1998)。xiao x.等人journal ofvirology.72(3),2224
‑
2232(1998)。已显示少量aav基因组整合到宿主染色体中。参见cheung ak,hoggan md,hauswirth ww,等人integration of theadeno
‑
associated virus genome into cellular dna in latently infected humandetroit 6cells.j virol 1980；33:739
–
748。aav在免疫学上不同于任何已知的腺病毒抗原。aav衣壳含有单链dna(ssdna)基因组。参见rose ja,berns ki, hoggan md,等人proc natl acad sci usa1969；64:863
–
869。
[0295]
aav具有单链4.7kb dna基因组，其编码复制(rep)基因和衣壳(cap) 基因，所述基
因的侧翼是两个反向末端重复序列(itr)。它主要是非整合性的并且在非分裂组织中形成稳定的附加体。尽管其在成年人群体中具有高血清阳性率，但尚未发现aav与任何人疾病相关。参见m.virol.j.2, 43(2005)。aav在组织中的稳定表达、其致病性的缺乏、以及其高滴度产生的容易性使其成为非常有吸引力的载体和受欢迎的基因转移平台。
[0296]
重组aav(raav)是遗传操纵的aav，其中通常，rep和cap基因的一部分或全部已被异源转基因序列替代。重组aav也可以在有丝分裂后细胞中触发长期转基因表达，最有可能的原因是重组aav基因组在细胞核内主要作为环状附加体持久存在。产生raav所需的raav唯一dna顺式元件是aav反向末端重复序列(itr)，而rep、cap和腺病毒辅助基因可以反式提供。因此，在本文公开的一些实施方案中，raav仅含有侧翼为itr的异源转基因dna，并且此基因组包壳在血清型特异性aav衣壳内。
[0297]
aav具有的独特特征使其具有作为将外来dna递送至细胞中的载体系统的吸引力。对培养物中的细胞的aav感染通常是不致细胞病变的，并且人和其他动物的自然感染是沉默且无症状的。此外，aav感染许多不同类型的哺乳动物细胞，从而允许在体内靶向许多不同组织的可能性。aav还具有使其成为对于基因递送特别有吸引力的病毒系统的另外优点，包括促进与其他形式的基因递送相比相对温和的免疫应答，以及基于非整合的附加型载体 dna在分裂细胞和休眠细胞两者中持久表达。另外，aav耐受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续几小时)，从而使基于raav的疫苗的冷藏变得不太关键。
[0298]
整合到宿主细胞基因组中不需要病毒dna的复制，并且因此，此过程不需要辅助病毒。aav前病毒基因组的感染性与质粒中的克隆dna一样，这使得重组基因组的构建可行。此外，由于指导aav复制、基因组包壳和整合的信号包含在aav基因组的itr内，因此所述基因组内部的大约4.7kb(编码复制和结构衣壳蛋白，rep
‑
cap)可以被外来dna(如含有启动子、目的dna 和多聚腺苷酸化信号的基因盒)替代。
[0299]
aav载体可以包含以顺式或反式起作用的另外元件。在特定实施方案中，包含载体基因组的aav载体还具有侧接在供体序列的5'或3'端的一个或多个反向末端重复(itr)序列；驱动供体序列转录的表达控制元件(例如，启动子或增强子)，诸如组成型或可调节的控制元件，或组织特异性表达控制元件；内含子序列、填充片段(stuffer)或填充多核苷酸序列；和/或位于供体序列的3'的多腺嘌呤序列。
[0300]
在一些实施方案中，aav使用辅助病毒进行复制。用于aav的多种此类辅助病毒是本领域已知的，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒(诸如牛痘)。腺病毒涵盖多种不同子群，但子群c的5型腺病毒是最常用的。人、非人哺乳动物和鸟类来源的许多腺病毒是已知的，并且可从诸如atcc的保藏机构获得。疱疹科病毒包括例如单纯疱疹病毒(hsv)和爱泼斯坦
‑
巴尔病毒(ebv)，以及巨细胞病毒(cmv)和伪狂犬病病毒(prv)；它们也可从诸如atcc 的保藏机构获得。
[0301]
示例性aav载体包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、 aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav
‑
2i8中的任一种的衣壳序列，或aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、 aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav
‑
2i8的衣壳变体。本发明的重组aav载体还包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、 aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav
‑
2i8及其变体。特定的衣壳变体包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、 aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav
‑
2i8的衣壳变体，如具有氨基酸取代、缺失或插入/添
加的衣壳序列。在一个实施方案中，所述aav 载体是aav9。
[0302]
在一些方面，本公开文本涉及具有不同的组织靶向能力(例如，组织向性)的aav。在一些实施方案中，与非变体亲本衣壳多肽相比，变体aav衣壳多肽在一种或多种人干细胞类型中进一步展现出增加的转导或向性。在一些实施方案中，人干细胞类型包括但不限于胚胎干细胞、成年组织干细胞(即，体干细胞)、骨髓干细胞、祖细胞、诱导性多能干细胞和重编程干细胞。在一些实施方案中，成年干细胞可以包括类器官干细胞(即，源自体内任何目的器官或器官系统的干细胞)。在一些实施方案中，aav的靶组织是性腺、隔膜、心脏、胃、肝脏、脾脏、胰腺、肌肉或肾脏。在一些实施方案中，aav靶向身体器官，包括但不限于皮肤、毛发、指甲、感觉受体、汗腺、油腺、骨、肌肉、脑、脊髓、神经、脑垂体、松果体、下丘脑、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肾上腺、胰腺(胰岛组织)、心脏、血管、淋巴结、淋巴管、胸腺、脾脏、扁桃体、鼻、咽、喉、气管、支气管、肺、嘴、咽、食道、胃、小肠、大肠、直肠、肛管、牙齿、唾液腺、舌、肝脏、胆囊、胰腺、阑尾、肾脏、输尿管、膀胱、尿道、睾丸、输精管(ductus deferens)(输精管(vasdeferens))、尿道、前列腺、阴茎、阴囊、卵巢、子宫、输卵管(uterine tube) (输卵管(fallopian tube))、阴道、外阴、和乳腺(乳房)。身体的器官系统包括但不限于外皮系统、骨骼系统、肌肉系统、神经系统、内分泌系统、心血管系统、淋巴系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、和生殖系统。在一些实施方案中，与具有非变体衣壳多肽的aav相比，具有变体衣壳多肽的 aav的转导和/或向性增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、65％、约70％％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施方案中，转导和/或向性增加约5％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％或约30％至约60％。
[0303]
5.5.1.2复制、衣壳、和组装aav基因
[0304]
aav的单链基因组包含三个基因：rep(复制)、cap(衣壳)和aap(组装)。通过使用三种启动子、替代翻译起始位点和差异剪接，这三个基因产生至少九种基因产物。
[0305]
rep基因编码四种蛋白质(rep78、rep68、rep52和rep40)，它们是病毒基因组复制和包装所必需的。
[0306]
cap基因表达产生病毒衣壳蛋白(vp1；vp2；vp3)，所述病毒衣壳蛋白形成保护病毒基因组的外部衣壳外壳，并且主动参与细胞结合和内化。据估计，病毒外壳由排列成二十面体结构的60种蛋白质构成。
[0307]
aap基因在与cap基因重叠的交替阅读框中编码组装激活蛋白(aap)。这种核蛋白被认为为衣壳组装提供了支架功能，并且在一些aav血清型中在 vp蛋白的核仁定位中发挥作用。
[0308]
在一些实施方案中，rep、cap或aap基因中的一个或多个是天然存在的，例如rep、cap或app基因包括细小病毒rep、cap或aap基因的全部或一部分。在一些实施方案中，rep、cap或aap基因中的一个或多个包括合成序列。
[0309]
在一个实施方案中，rep基因包括合成序列。在一个实施方案中，cap基因包括合成序列。在一个实施方案中，aap基因包括合成序列。在一个实施方案中，rep和cap基因包括合成序列。在一个实施方案中，rep和aap基因包括合成序列。在一个实施方案中，cap和aap基因包括合成序列。在一个实施方案中，rep、cap和aap基因包括合成序列。
[0310]
在一些实施方案中，rep来自aav基因组，所述aav基因组选自aav1、 aav2、aav3、
aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、 aav11及其任何组合。在特定实施方案中，rep来自aav1基因组。在特定实施方案中，rep来自aav2基因组。在特定实施方案中，rep来自aav3基因组。在特定实施方案中，rep来自aav4基因组。在特定实施方案中，rep来自aav5 基因组。在特定实施方案中，rep来自aav6基因组。在特定实施方案中，rep 来自aav7基因组。在特定实施方案中，rep来自aav8基因组。在特定实施方案中，rep来自aav9基因组。在特定实施方案中，rep来自aav10基因组。在特定实施方案中，rep来自aav11基因组。
[0311]
在一些实施方案中，cap来自aav基因组，所述aav基因组选自aav1、 aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、 aav11及其任何组合。在特定实施方案中，cap来自aav1基因组。在特定实施方案中，cap来自aav2基因组。在特定实施方案中，cap来自aav3基因组。在特定实施方案中，cap来自aav4基因组。在特定实施方案中，cap来自aav5 基因组。在特定实施方案中，cap来自aav6基因组。在特定实施方案中，cap 来自aav7基因组。在特定实施方案中，cap来自aav8基因组。在特定实施方案中，cap来自aav9基因组。在特定实施方案中，cap来自aav10基因组。在特定实施方案中，cap来自aav11基因组。
[0312]
在一些实施方案中，aap来自aav基因组，所述aav基因组选自aav1、 aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、 aav11及其任何组合。在特定实施方案中，aap来自aav1基因组。在特定实施方案中，aap来自aav2基因组。在特定实施方案中，aap来自aav3基因组。在特定实施方案中，aap来自aav4基因组。在特定实施方案中，aap来自aav5 基因组。在特定实施方案中，aap来自aav6基因组。在特定实施方案中，aap 来自aav7基因组。在特定实施方案中，aap来自aav8基因组。在特定实施方案中，aap来自aav9基因组。在特定实施方案中，aap来自aav10基因组。在特定实施方案中，aap来自aav11基因组。
[0313]
应当理解，本文所述的特定aav基因组可以具有源自不同aav基因组 (例如，来自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、 aav9、aav10和aav11的基因组)的基因。因此，本文公开了包含任何可能排列/组合的rep、cap或aap的aav。
[0314]
在本文公开的一些实施方案中，aav是重组aav(raav)。在一些实施方案中，raav缺少rep基因、cap基因和aap基因中的一个或多个。在一些实施方案中，raav缺少rep基因。在一些实施方案中，raav缺少cap基因。在一些实施方案中，raav缺少aap基因。在一些实施方案中，raav缺少rep基因并且缺少cap基因。在一些实施方案中，raav缺少rep基因并且缺少aap基因。在一些实施方案中，raav缺少cap基因并且缺少aap基因。在一些实施方案中，raav缺少rep基因、cap基因和aap基因。
[0315]
在本文公开的一些实施方案中，修饰raav，使得rep基因、cap基因和aap 基因中的一个或多个发生突变，使得一个或多个aav基因的表达被修饰。在一些实施方案中，rep基因发生突变。在一些实施方案中，cap基因发生突变。在一些实施方案中，aap基因发生突变。在一些实施方案中，rep基因和cap 基因发生突变。在一些实施方案中，rep基因和aap基因发生突变。在一些实施方案中，cap基因和aap基因发生突变。在一些实施方案中，cap基因、rep 基因和aap基因发生突变。
[0316]
5.5.1.3反向末端重复序列
[0317]
在某些实施方案中，aav包含第一itr(例如5'itr)和第二itr(例如 3'itr)。通常，itr参与原核质粒中的细小病毒(例如，aav)dna复制和拯救或切除(samulski等人,1983,1987；senapathy等人,1984；gottlieb和 muzyczka,1988)。另外，据报道，itr是aav原病毒
整合以及将aav dna 包装到病毒体中所需的最小序列(mclaughlin等人,1988；samulski等人, 1989)。这些元件是细小病毒基因组的有效增殖所必需的。
[0318]
在一些实施方案中，itr包括天然存在的itr，例如itr包括细小病毒itr 的全部或一部分。在一些实施方案中，itr包括合成序列。在一个实施方案中，第一itr或第二itr包括合成序列。在另一个实施方案中，第一itr和第二itr各自包括合成序列。在一些实施方案中，第一itr或第二itr包含天然存在的序列。在另一个实施方案中，第一itr和第二itr各自包括天然存在的序列。
[0319]
在一些实施方案中，itr包括来自aav基因组的itr。在一些实施方案中， itr是选自以下的aav基因组的itr：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、 aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11及其任何组合。在特定实施方案中，itr是aav2基因组的itr。在另一个实施方案中，itr是经基因工程化以在其5'和3'端包括源自一个或多个aav基因组的itr的合成序列。在一些实施方案中，itr源自相同的基因组，例如源自相同病毒的基因组；或源自不同的基因组，例如源自两种或更多种不同aav基因组的基因组。在某些实施方案中，itr源自相同的aav基因组。在一个具体实施方案中，存在于本发明的核酸分子中的两个itr是相同的，并且特别地可以是aav2 itr。在一个特定实施方案中，第一itr和第二itr相同。
[0320]
在一些实施方案中，itr形成发夹环结构。在一个实施方案中，第一itr 形成发夹结构。在另一个实施方案中，第二itr形成发夹结构。仍然在另一个实施方案中，第一itr和第二itr二者都形成发夹结构。
[0321]
在一些实施方案中，本文所述的核酸分子中的itr是转录激活的itr。转录激活的itr可以包含已经通过包括至少一个转录活性元件而被转录激活的野生型itr的全部或一部分。多种类型的转录活性元件适合于在此背景下使用。在一些实施方案中，转录活性元件是组成型转录活性元件。组成型转录活性元件提供持续水平的基因转录，并且可以在希望持续表达转基因时使用。在其他实施方案中，转录活性元件是诱导型转录活性元件。诱导型转录活性元件通常在诱导物(或诱导条件)不存在下展现低活性，并且在诱导物存在下(或切换至诱导条件)上调。当希望仅在某些时间或在某些位置表达时或当希望使用诱导剂逐步增加表达水平时，可以使用诱导型转录活性元件。转录活性元件也可以是组织特异性的；也就是说，其仅在某些组织或细胞类型中表现出活性。
[0322]
可以以多种方式将转录活性元件掺入itr中。在一些实施方案中，将转录活性元件掺入itr的任何部分的5'或itr的任何部分的3'。在其他实施方案中，转录激活的itr的转录活性元件位于两个itr序列之间。如果转录活性元件包含必须被间隔开的两个或更多个元件，则那些元件可以与itr的部分交替。在一些实施方案中，itr的发夹结构缺失并且被转录元件的反向重复序列替代。这后一种排列将产生模拟结构中的缺失部分的发夹。多个串联转录活性元件也可以存在于转录激活的itr中，并且这些元件可以相邻或间隔开。另外，可以将蛋白质结合位点(例如，rep结合位点)引入转录激活的itr 的转录活性元件中。转录活性元件可以包含使得能够通过rna聚合酶受控转录dna以形成rna的任何序列，并且可以包含例如如下文所定义的转录活性元件。
[0323]
转录激活的itr向具有相对受限的核苷酸序列长度的核酸分子提供转录激活和itr功能二者，这有效地使可以携带并从核酸分子表达的转基因的长度最大化。将转录活性元件掺入itr中可以以多种方式来完成。对itr序列和转录活性元件的序列需求的比较可以
提供对编码itr内的元件的方式的了解。例如，可以通过在复制转录活性元件的功能元件的itr序列中引入特定变化将转录活性添加至itr。本领域中存在多种技术可有效添加、缺失和/或改变特定位点的具体核苷酸序列(参见例如，deng和nickoloff(1992)anal. biochem.200:81
‑
88)。产生转录激活的itr的另一种方式涉及在itr中的所希望的位置引入限制位点。另外，可以使用本领域中已知的方法将多个转录激活元件掺入转录激活的itr中。
[0324]
通过说明，可以通过包括一个或多个诸如以下等转录活性元件来产生转录激活的itr：tata盒、gc盒、ccaat盒、sp1位点、inr区、cre(camp 调节元件)位点、atf
‑
1/cre位点、apbβ盒、apbα盒、carg盒、ccac盒或如本领域中已知参与转录的任何其他元件。
[0325]
5.5.1.4目的基因和其他序列
[0326]
本公开文本的某些方面涉及向受试者施用aav疗法的方法。在一些实施方案中，aav包含目的基因(goi)。在一些实施方案中，goi是包含如本文所公开的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码如本文所公开的小型化肌营养不良蛋白多肽。
[0327]
被表达的goi可以是编码蛋白质的dna区段，其具有用户希望的任何必需的控制元件(例如，启动子、操纵子)；或是非编码dna区段，其转录产生某种含rna分子(如核酶或反义分子)的全部或一部分。
[0328]
在一些实施方案中，aav包含多于一个goi。在具有多于一个goi的aav 中，一些实施方案包括诸如ires或2a的元件，以从一个启动子共表达它们。在一些实施方案中，aav包含被ires元件分隔的两个目的基因。在一些实施方案中，aav包含被2a元件分隔的两个目的基因。在一些实施方案中，aav 包含三个目的基因，所述目的基因之间被ires元件分隔(例如， goi
‑
ires
‑
goi
‑
ires
‑
goi)。在一些实施方案中，aav包含三个目的基因，所述目的基因之间被2a元件分隔。
[0329]
在一些实施方案中，aav包含调节序列。在一些实施方案中，aav包含非编码调节dna。在一些实施方案中，aav基因组包含调节序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。此类调节序列描述于例如goeddel(gene expression technology. methods in enzymology 185,academic press,加利福尼亚州圣地亚哥 (1990))中。本领域技术人员应认识到，aav的设计(包括调节序列的选择) 可以取决于诸如有待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等因素。在一些实施方案中，所述aav基因组包含mrna剪接供体/剪接受体位点。用于哺乳动物宿主细胞表达的某些调节序列包括指导在哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如源自巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40 (sv40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(admlp))和多瘤的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或β
‑
珠蛋白启动子。再进一步地，调节元件由不同来源的序列构成，如sra启动子系统，其含有来自sv40早期启动子和人t细胞白血病1型病毒的长末端重复序列的序列(takebe,y.等人(1988)mol.cell.biol.8:466
‑
472)。在某些实施方案中，所述调节序列包含组织特异性启动子。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子驱动所述目的基因在选自心脏、肝脏、肺、眼睛、神经系统、淋巴系统、肌肉和干细胞的组织中表达。
[0330]
5.5.1.5aav配制品
[0331]
在一些实施方案中，所述aav载体是用递送剂配制的。在一些实施方案中，所述递送剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，所述递送剂选自脂质体、非脂质聚合分子、内体及其任何组合。
[0332]
5.5.2非aav载体
[0333]
本文还提供了包含与启动子可操作地连接的上述多核苷酸的载体。当表达控制序列控制并调节核苷酸序列的转录和翻译时，所述序列与所述表达控制序列(例如启动子)“可操作地连接”。当涉及核苷酸序列时，术语“可操作地连接”包括在待表达的核苷酸序列的前面具有适当的起始信号(例如 atg)，以及维持正确的阅读框以允许在表达控制序列的控制下表达所述序列并且产生由所述序列编码的所需产物。如果希望插入到重组核酸分子中的基因不含有适当的起始信号，则可以将这种起始信号插入到所述基因的前面。“载体”是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，另一个核酸区段可以附接于其上，以实现附接区段的复制。所述启动子可以是细菌、酵母、昆虫或哺乳动物的启动子，或与之相同。
[0334]
在一些实施方案中，所述载体可以是质粒、粘粒、酵母人工染色体 (yac)、噬菌体或真核病毒dna。可以采用本领域已知的用于表达蛋白质的其他许多载体骨架。此类载体包括但不限于：
[0335]
腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、猿猴病毒40(sv40)、巨细胞病毒(cmv)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv) 和莫洛尼鼠白血病病毒。此外，一类载体包含源自病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、杆状病毒、逆转录病毒或塞姆利基森林病毒的dna元件。此类载体可以商业获得或通过本领域熟知的方法由所述序列组装。
[0336]
在一些实施方案中，本文所述的载体是用递送剂配制的。在一些实施方案中，所述递送剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，所述递送剂选自脂质体、非脂质聚合分子、内体及其任何组合。
[0337]
5.6药学组合物
[0338]
可以将本文公开的各种多肽和多核苷酸(本文也称为“活性化合物”) 掺入适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含多肽或多核苷酸和药学上可接受的载体。如本文所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性化合物的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑其在组合物中的使用。补充性活性化合物也可掺入到组合物中。
[0339]
在一些实施方案中，公开了一种药物组合物，其包含(a)如本文所述的多肽和(b)药学上可接受的赋形剂。
[0340]
在一些实施方案中，公开了一种药物组合物，其包含(a)包含如本文所述多肽的组合物和(b)药学上可接受的赋形剂。
[0341]
在一些实施方案中，公开了一种药物组合物，其包含(a)如本文所述的多核苷酸和(b)药学上可接受的赋形剂。
[0342]
在一些实施方案中，公开了一种药物组合物，其包含(a)如本文所述的载体(例如，raav)和(b)药学上可接受的赋形剂。
[0343]
在一些实施方案中，公开了一种药物组合物，其包含(a)如本文所述的宿主细胞和(b)药学上可接受的赋形剂。
[0344]
本公开文本的药物组合物被配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外，例如静脉内、真皮内、皮下、口服、透皮(局部)和经粘膜，及其任何组合。另一种施用途径包括经肺施用。另外，可能需要向需要治疗的区域局部施用治疗有效量的药物组合物。这可以通过例如以下方式来实现：在外科手术期间局部或区域性输注或灌注、局部施加、注射、导管、栓剂或植入物(例如，由多孔、无孔或凝胶状材料(包括膜如唾液酸膜，或纤维)形成的植入物)等。在另一个实施方案中，在囊泡(如脂质体)中递送治疗有效量的药物组合物(参见例如，langer,science 249:1527
‑
33,1990；和treat等人,liposomes in the therapy of infectious disease and cancer,lopezberestein和fidler(编辑),liss,纽约,第353
‑
65页,1989)。
[0345]
在又另一个实施方案中，可以在控释系统中递送治疗有效量的药物组合物。在一个例子中，可以使用泵(参见例如，langer,science 249:1527
‑
33,1990； sefton,crit.rev.biomed.eng.14:201
‑
40,1987；buchwald等人,surgery 88:507
‑
16,1980；saudek等人,n engl.j med.321:574
‑
79,1989)。在另一个例子中，可以使用聚合材料(参见例如，levy等人,science 228:190
‑
92,1985； during等人,ann.neural.25:351
‑
56,1989；howard等人,j neurosurg. 71:105
‑
12,1989)。也可以使用其他控释系统，如由langer(science 249:1527
‑
33,1990)讨论的那些。
[0346]
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
‑
戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如edta；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物 (例如，锌
‑
蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如tween
tm
、 pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0347]
肠胃外制剂中使用的药学上可接受的载体包括水性媒介物、非水性媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮和分散剂、乳化剂、螯合(sequestering)或螯合(chelating)剂和其他药学上可接受的物质。水性媒介物的例子包括氯化钠注射剂、林格氏注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂、右旋糖和乳酸林格氏注射剂。非水性肠胃外媒介物包括植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂添加到包装于多剂量容器中的肠胃外制剂中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲液包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨醇酯80(80)。金属离子的螯合(sequestering)或螯合(chelating)剂包括edta。药物载体还包括用于水混溶性媒介物的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于调节ph的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
[0348]
用于肠胃外、真皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液(如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)；以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节ph。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0349]
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在具有水溶性的情况下)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor els(basf，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下必须稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合的混合物。例如，通过使用包衣 (如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所需粒度、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等) 来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
[0350]
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将所述活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可以是真空干燥和冷冻干燥，所述真空干燥和冷冻干燥由先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何另外的所需成分的粉末。
[0351]
对于通过吸入施用，可以从加压容器或分配器(其含有合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))或者喷雾器以气溶胶喷雾剂形式递送所述化合物。全身性施用也可以是通过经粘膜或透皮方式。
[0352]
对于经粘膜或透皮施用，在配制品中使用适合待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域已知的，并且例如对于经粘膜施用，包括洗涤剂、胆盐、以及梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，将活性化合物配制成如本领域通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。也可以以栓剂(例如，用常规栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂(以供直肠递送)的形式制备化合物。
[0353]
在一个实施方案中，用载体制备活性化合物，所述载体将保护化合物免于从身体迅速清除，如控释配制品，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制品的制备方法对本领域技术人员而言是清楚的。所述材料也可以从alza corporation和nova pharmaceuticals,inc.商购获得。脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载体。这些可以根据例如在美国专利号4,522,811中所述的本领域技术人员已知的方法来制备。
[0354]
以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物是尤其有利的，以便于施用和使剂量均
匀。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位，其中每个单位含有经计算与所需的药物载体联合可产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。本公开文本的剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及在调剂这种功能化合物用于治疗个体的技术中固有的限制。药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
[0355]
5.7用途和方法
[0356]
5.7.1产生小型化肌营养不良蛋白的方法
[0357]
本文还公开了产生小型化肌营养不良蛋白多肽的方法，所述方法包括：在合适的条件下培养本文所述的宿主细胞，并回收所述小型化肌营养不良蛋白多肽。
[0358]
如本文所用，“分离的”多核苷酸或核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源(例如，在小鼠或人)中的其他核酸分子分离的多核苷酸或核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，如cdna分子，在通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞材料或培养基，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。例如，语言“基本上不含”包括具有小于约15％、10％、5％、2％、 1％、0.5％或0.1％(特别是小于约10％)的其他材料(例如，细胞材料、培养基、其他核酸分子、化学前体和/或其他化学品)的多核苷酸或核酸分子制剂。在具体的实施方案中，编码本文所述的多肽的一种或多种核酸分子是分离的或纯化的。
[0359]
可以通过本领域已知的任何方法获得多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。可以使用本领域熟知的方法确定编码本文所述的多肽(例如表3和表4中所述的多肽)以及这些多肽的修饰形式的核苷酸序列，即，将已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码所述多肽的核酸的方式组装。这种编码所述多肽的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如在 kutmeier g等人,(1994),biotechniques 17:242
‑
6中所述)，其简要地涉及合成含有编码所述多肽的序列的部分的重叠寡核苷酸、退火和连接这些寡核苷酸，然后通过pcr扩增连接的寡核苷酸。
[0360]
可替代地，可以使用本领域熟知的方法(例如，pcr和其他分子克隆方法)从来自合适来源(例如，杂交瘤)的核酸产生编码本文所述的多肽的多核苷酸。例如，可以使用从产生目的多肽的杂交瘤细胞获得的基因组dna，使用可与已知序列的3'和5'末端杂交的合成引物进行pcr扩增。此类pcr扩增方法可用于获得包含编码例如il2、接头序列或il2
‑
rα的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达并进一步克隆，例如以产生多肽。
[0361]
如果无法获得含有编码特定多肽的核酸的克隆，但多肽分子的序列是已知的，则编码所述多肽的核酸可以化学合成或通过以下方式从合适的来源 (例如，cdna文库或从表达目的蛋白的任何组织或细胞(如选择来表达本文所述多肽的杂交瘤细胞)产生的cdna文库或从所述任何组织或细胞分离的核酸(优选聚a rna))获得：使用可与所述序列的3'和5'末端杂交的合成引物进行pcr扩增，或使用对特定基因序列具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆以鉴定例如来自cdna文库的编码所述多肽的cdna克隆。然后可以使用本领域熟知的任何方法将通过pcr产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
[0362]
编码本文所述的多肽的dna可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合至编码本文所述多肽的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序。杂交瘤细胞可以用作这种dna的来源。一旦分离，可以将dna置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞(如大肠杆菌
细胞、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞(例如，来自cho gs system
tm
(lonza)的cho细胞) 或原本不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中获得多肽的合成。
[0363]
5.7.1治疗用途和方法
[0364]
本文所述的小型化肌营养不良蛋白多肽、编码小型化肌营养不良蛋白多肽的多核苷酸、含有编码小型化肌营养不良蛋白多肽的多核苷酸的载体(例如，raav)和方法具有大量的体外和体内效用。例如，编码小型化肌营养不良蛋白多肽的核苷酸序列(例如，载体，例如，aav载体)或本文所述的多肽可以在体外或离体施用至培养的细胞，或施用至人受试者(例如，在体内)以治疗疾病。
[0365]
因此，本文公开了使用如本文所公开的小型化肌营养不良蛋白核酸分子、如本文所公开的多肽、如本文所公开的宿主细胞、如本文所公开的载体或如本文所公开的药物组合物或其任何组合中任一种的治疗方法。
[0366]
在一些实施方案中，本文公开了一种在有需要的受试者中表达小型化肌营养不良蛋白多肽的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所公开的核酸、如本文所公开的载体、如本文所公开的宿主细胞或如本文所公开的药物组合物。
[0367]
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所公开的核酸、如本文所公开的载体、如本文所公开的多肽、如本文所公开的宿主细胞或如本文所公开的药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症是由肌营养不良蛋白缺乏引起的。在一些实施方案中，所述疾病是杜氏肌营养不良症(dmd)、贝克肌营养不良症(bmd)、x
‑
连锁扩张型心肌病(xldc)、面肩肱型肌营养不良症、强直性肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、 emery
‑
dreifuss型肌营养不良症、远端肌营养不良症和/或先天性肌营养不良症。在其他实施方案中，有待治疗的疾病是肌肉减少症、心脏病、恶病质。
[0368]
在一些实施方案中，如本文所公开的核酸分子、如本文所公开的多肽、如本文所公开的载体(例如，raav)、如本文所公开的宿主细胞或如本文所公开的药物组合物是静脉内、透皮、真皮内、皮下、口服或经肺或其任何组合施用的。在一些实施方案中，如本文所公开的核酸分子、如本文所公开的多肽、如本文所公开的载体、如本文所公开的宿主细胞或如本文所公开的药物组合物经由局部、表皮粘膜、鼻内、口服、阴道、直肠、舌下、局部、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外或胸骨内途径施用。在一些实施方案中，如本文所公开的核酸分子、载体(例如，raav)、宿主细胞或所述多肽是静脉内施用的。
[0369]
在一些实施方案中，所述治疗方法进一步包括向所述受试者施用第二药剂。
[0370]
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本文描述的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一些实施方案中，所述受试者是人。
[0371]
在一些实施方案中，相对于施用前受试者体内的肌营养不良蛋白表达，向所述受试者施用所述核酸分子、所述载体(例如，raav)、所述多肽、所述宿主细胞或所述药物组合物导致增加的肌营养不良蛋白表达，其中所述肌营养不良蛋白表达增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至
少约11倍、至少约12倍、至少约13倍、至少约14倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约 25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。
[0372]
在本公开文本的某些方面，所述方法包括或进一步包括向受试者施用 aav疗法。在一些实施方案中，所述aav疗法包括施用重组aav。本领域已知和/或本文公开的任何重组aav可以用于本公开文本的方法。在一些实施方案中，所述aav疗法包括施用aav，所述aav选自1型aav、2型aav、3 型aav(包括3a型和3b型)、4型aav、5型aav、6型aav、7型aav、8型 aav、9型aav、10型aav、11型aav、12型aav、13型aav、蛇aav、鸟类aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav、山羊aav、虾aav、及其任何组合。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用1型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用2型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用3型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用4型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用5型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用6型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用7型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用8型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用9型aav。在某些实施方案中，所述aav 疗法包括施用10型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用11型 aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用12型aav。在某些实施方案中，所述aav疗法包括施用13型aav。
[0373]
在一些实施方案中，用如本文所公开的小型化肌营养不良蛋白核酸分子、如本文所公开的多肽、如本文所公开的宿主细胞、如本文所公开的载体或如本文所公开的药物组合物或其任何组合治疗受试者不会引起显著的炎症反应，例如，免疫介导的肺炎、免疫介导的结肠炎、免疫介导的肝炎、免疫介导的肾炎或肾功能不全、免疫介导的垂体炎、免疫介导的甲状腺功能减退和甲状腺功能亢进，或其他免疫介导的不良反应。在一些实施方案中，用如本文所公开的小型化肌营养不良蛋白核酸分子、如本文所公开的多肽、如本文所公开的宿主细胞、如本文所公开的载体、如本文所公开的药物组合物或其任何组合治疗受试者不会引起显著的心脏障碍，例如室性心律失常；眼部障碍，例如虹膜睫状体炎；输注相关反应；淀粉酶增加、脂肪酶增加；神经系统障碍，例如眩晕、周围神经病变和感觉神经病变；皮肤和皮下组织障碍，例如皮疹、瘙痒、剥脱性皮炎、多形性红斑、白癜风或银屑病；呼吸道、胸腔和纵隔障碍，例如咳嗽；疲劳；恶心；食欲下降；便秘；关节痛；或腹泻。
[0374]
5.8试剂盒
[0375]
本文还公开了试剂盒，其包含本文公开的一种或多种核酸分子、如本文所公开的一种或多种载体(例如，raav)、如本文所公开的一种或多种多肽，或如本文所公开的一种或多种宿主细胞，或其任何组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于向有需要的受试者施用前述任一者或其组合的说明书。
[0376]
如本文所用的术语“试剂盒”和“系统”旨在指本文公开的至少一种或多种核酸分子、如本文所公开的一种或多种载体(例如，raav)、如本文所公开的一种或多种多肽，或如本文所公开的一种或多种宿主细胞，或其任何组合，在具体的实施方案中，其与一种或多种其他类型的元件或组分(例如，其他类型的生化试剂、容器、包装(如旨在用于商业销售的包装)、使用说明书等)组合。
[0377]
在一些实施方案中，公开了一种试剂盒，其包含(a)以下中的一种或多种：如本文所述的小型化肌营养不良蛋白多肽、包含如本文所述的小型化肌营养不良蛋白多肽的组合
物、编码本文如所述的小型化肌营养不良蛋白多肽的核酸、载体(例如，raav)和/或宿主细胞；以及(b)向有需要的受试者施用前述任一者的说明书。在一些实施方案中，公开了一种试剂盒，其包含 (a)如本文所述的小型化肌营养不良蛋白多肽和(b)向有需要的受试者施用所述小型化肌营养不良蛋白多肽的说明书。在一些实施方案中，公开了一种试剂盒，其包含(a)包含如本文所述的小型化肌营养不良蛋白多肽的组合物和(b)向有需要的受试者施用所述组合物的说明书。在一些实施方案中，公开了一种试剂盒，其包含(a)编码如本文所述的小型化肌营养不良蛋白多肽的核酸和(b)向有需要的受试者施用所述核酸的说明书。在一些实施方案中，公开了一种试剂盒，其包含(a)如本文所述的载体和(b)向有需要的受试者施用所述载体的说明书。在一些实施方案中，公开了一种试剂盒，其包含(a)如本文所述的aav载体和(b)向有需要的受试者施用所述载体的说明书。在一些实施方案中，公开了一种试剂盒，其包含(a)如本文所述的宿主细胞和(b)向有需要的受试者施用所述宿主细胞的说明书。
[0378]
在具体的实施方案中，本文提供了一种药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，如本文提供的一种或多种小型化肌营养不良蛋白肽。在一些实施方案中，所述试剂盒含有本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，如本文所述的那些。在某些实施方案中，所述试剂盒可以含有t细胞促分裂原，如例如，植物血凝素(pha)和/或咐拜十四烷酯(pma)，或tcr复合物刺激抗体(如抗cd3抗体和抗cd28抗体)。任选地与这样一个或多个容器相连的可以是呈由管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映了所述机构对用于人施用的制造、使用或销售的批准。
[0379]
本文还提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器中的本文所述的小型化肌营养不良蛋白多肽，优选纯化的小型化肌营养不良蛋白多肽。在具体的实施方案中，本文所述的试剂盒含有基本上分离的小型化肌营养不良蛋白多肽作为对照。在另一个具体的实施方案中，本文所述的试剂盒进一步包含不与小型化肌营养不良蛋白多肽抗原反应的对照蛋白。在另一个具体的实施方案中，本文所述的试剂盒含有一种或多种用于检测所述小型化肌营养不良蛋白多肽与肌营养不良蛋白抗原的结合的元件(例如，所述小型化肌营养不良蛋白多肽可以与可检测底物(如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物)缀合，或者识别第一抗体的第二抗体可以与可检测底物缀合)。在具体的实施方案中，本文提供的试剂盒可以包括重组产生的或化学合成的小型化肌营养不良蛋白多肽。也可以将如在试剂盒中提供的针对本文公开的小型化肌营养不良蛋白多肽的抗原附接至固体支持物。在更具体的实施方案中，上述试剂盒的检测器件包括所述小型化肌营养不良蛋白多肽的抗原附接的固体支持物。这种试剂盒也可以包括未附接的报告物标记的抗人抗体或抗小鼠/大鼠抗体。在此实施方案中，所述小型化肌营养不良蛋白多肽与抗原的结合可以通过所述报告物标记的抗体的结合来检测。
[0380]
除非另有说明，否则本公开文本的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。此类技术在文献中有充分说明。参见例如， sambrook等人编(1989)molecular cloning a laboratory manual(第2版；coldspring harbor laboratory press)；sambrook等人编(1992)molecular cloning: a laboratory manual(cold springs harbor laboratory,
纽约)；d.n.glover 编,(1985)dna cloning,第i和ii卷；gait编(1984)oligonucleotide synthesis； mullis等人美国专利号4,683,195；hames和higgins编(1984)nucleic acidhybridization；hames和higgins编(1984)transcription and translation； freshney(1987)culture of animal cells(alan r.liss,inc.)；immobilized cells 和enzymes(irl press)(1986)；perbal(1984)a practical guide to molecularcloning；论文.methods in enzymology(academic press,inc.,纽约)；miller 和calos编(1987)gene transfer vectors for mammalian cells(cold springharbor laboratory)；wu等人编,methods in enzymology,第154卷和第155娟； mayer和walker编(1987)immunochemical methods in cell and molecularbiology(academic press,伦敦)；weir和blackwell编,(1986)handbook ofexperimental immunology,第i
‑
iv卷；manipulating the mouse embryo,coldspring harbor laboratory press,cold spring harbor.纽约,(1986)；crooks, antisense drug technology:principles,strategies and applications,第2版crcpress(2007)和ausubel等人(1989)current protocols in molecular biology (john wiley and sons.马里兰州巴尔的摩)。
[0381]
以上引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献和氨基酸或核苷酸序列(例如genbank号和/或uniprot号)通过引用以其整体并入本文。
[0382]
通过说明的方式而不是通过限制的方式，提供以下实施例。
[0383]
6.实施例
[0384]
6.1具有降低的免疫原性和增强的稳定性的新型小型化肌营养不良蛋白
[0385]
肌营养不良蛋白基因的突变通常会导致相应的肌营养不良蛋白的稳定性受损，进而导致不稳定的肌营养不良蛋白的蛋白体降解，以及营养不良的病理生理学。类似地，将编码肌营养不良蛋白的dna小型化以适应aav有限的包装能力可能会损害相应的小型化肌营养不良蛋白的稳定性。
[0386]
通过比较用相应的肌营养不良蛋白表达载体转染的细胞中肌营养不良蛋白:mrna比率，检查了各种小型化肌营养不良蛋白的稳定性。产生了男性人等基因诱导多能干细胞(ipsc)衍生的心肌细胞(icm)，其在肌营养不良蛋白基因中携带e2035x过早终止密码子，从而阻止了内源性肌营养不良蛋白表达。用各种表达小型化肌营养不良蛋白的小型化盒转染这些细胞，并在转染的细胞体外培养24天后检查肌营养不良蛋白:mrna的比率。通过meso scale discovery(msd)elisa测定检查蛋白质水平，并通过qrtpcr检查mrna水平。
[0387]
所测试的小型化肌营养不良蛋白和测试结果分别在图2和图3中示出。数据表明，小型化肌营养不良蛋白肽bxa
‑
027741(seq id no:129)和 bxa
‑
027743(seq id no:132)提供了最佳的蛋白质稳定性。
[0388]
随后，使用计算机免疫原性预测工具测试了在这两种最稳定设计中产生的新型接点的免疫原性。基于前述的计算机方法，确定bxa
‑
027743设计的新型接点(r1/接头r16(接点j1)、r17/h3和h3/r23(接点j7))(参见图4 并且未示出)具有最小的免疫原性风险。
[0389]
以类似的方式分析了bxa
‑
027741设计的新型接点(r1/r3(接点j10)、 h2/接头r16(接点j11)和r17/r24(接点j9))(参见图5)。确定接点j9具有最小的免疫原性风险，而接点j10和j11可以改善。
[0390]
使用如下所述的体外t细胞增殖测定，测试了bxa
‑
027741设计的前述接点及其接
点变体的潜在免疫原性。简言之，通过ficoll(ge healthcare)梯度离心从健康志愿者人受试者中分离外周血单核细胞(pbmc)样品，并使用聚合酶链式反应(pcr)扩增和与寡核苷酸探针(proimmune，佛罗里达州萨拉索塔)杂交的组合，对人淋巴细胞抗原(hla)i类和ii类表达进行表征。
[0391]
将来自40个供体的pbmc样品组用于进一步分析，这些样品具有与世界人口频率紧密匹配的hla表达谱。将pbmc样品用cfse(invitrogen，加利福尼亚卡尔斯巴德)标记以监测增殖，并在96孔板中在含有10％人ab (bioreclamation，纽约韦斯特伯)、非必需氨基酸和链霉素(gibco/fisherscientific两者)的rpmi(lonza，瑞士巴塞尔)中，以每孔200,000个细胞重复六次铺板。
[0392]
将bxa
‑
027741接点肽、其变体和对照肽各自与1μm的40个pbmc样品的组一起培养7天，之后洗去培养基，并用抗cd4和抗cd8 apc单克隆抗体 (bd biosciences，新泽西州富兰克林湖)标记细胞。在通过洗涤去除未结合的抗体后，用pbs中的3.7％福尔马林(sigma，密苏里州圣路易斯)固定细胞，并通过流式细胞术分析以确定增殖cd4 细胞或cd8 细胞的百分比。
[0393]
在具有不同bxa
‑
027741接点肽及其变体的培养中7天后显示阳性反应的样品的百分比(在40个供体样品中)在图6a(cd4 )和图6b(cd8 )中示出，所述阳性反应定义为与在没有接点肽或对照肽的培养基中孵育的 pbmc相比，cd4 或cd8 t增殖细胞的数量显著增加。使用的对照肽是： (1)avastin框架肽；(2)vl6
‑
vl cdr3肽；和(3)padre肽
‑
61309。
[0394]
发现接点j10的版本3(j10v3)优于接点j10及其其他测试版本，并且接点j11的版本12(j11v12)在免疫原性风险方面总体上优于接点j11。
[0395]
然后使小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
027741的c端结构域缺失，以产生小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
196473(seq id no:119)(图7)，以更好地适应 aav的有限包装容量。然后在小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
196473中使用 j10v3替代j10，并且使用j11v12替代j11，从而产生小型化肌营养不良蛋白 bxa
‑
196477(seq id no:118)(图8a和图8b)。为了产生j10v3和j11v12，在bxa
‑
196473(seq id no:119)中，分别将氨基酸rv插入氨基酸446与447 之间，并将氨基酸seaq插入氨基酸606与607之间(图8a和图8b)。
[0396]
如下用测试的其他接点版本对bxa
‑
196473(seq id no:119)进行了另外的修饰：
[0397]
bxa
‑
196474(seq id no:120)：接点9版本2(j9v2)和接点11版本12 (j11v12)
[0398]
bxa
‑
196475(seq id no:121)：接点9版本5(j9v5)和接点11版本12 (j11v12)
[0399]
bxa
‑
196476(seq id no:122)：接点9版本6(j9v6)和接点11版本12 (j11v12)
[0400]
bxa
‑
196478(seq id no:124)：接点10版本6(j10v6)和接点11版本 12(j11v12)
[0401]
bxa
‑
196479(seq id no:125)：接点11版本12(j11v12)
[0402]
j9v2是bxa
‑
196473中的r17结构域与r24结构域之间的氨基酸ler至 kni(即，氨基酸843至845)的取代。
[0403]
j9v5是bxa
‑
196473中的r17结构域与r24结构域之间(即，氨基酸842 与843之间)的k插入。
[0404]
j9v6是bxa
‑
196473中的r17结构域与r24结构域之间(即，氨基酸842 与843之间)的kni插入。
[0405]
j10v3是bxa
‑
196473中的r1与r3结构域之间(即，氨基酸446与447之间) 的rv插
入。
[0406]
j10v6是bxa
‑
196473中的r1与r3结构域之间(即，氨基酸446与447之间)的rvllqdi插入。
[0407]
j11v12是bxa
‑
196473中的h2结构域与r16结构域前的接头之间(即，氨基酸606与607之间)的seaq插入。
[0408]
然后如前所述测试所得小型化肌营养不良蛋白的稳定性(图9)。结果表明，bxa
‑
196477小型化肌营养不良蛋白设计(其含有j10v3和j11v12)不仅具有最低的免疫原性风险，而且也是最稳定的。
[0409]
此外，通过使最后三个c端氨基酸缺失，并且通过在bxa
‑
212371的氨基酸位置682后插入氨基酸接点变体序列kndl(j2v10；在血影蛋白重复序列17(r17)结构域与铰链3(h3)结构域之间)，对小型化肌营养不良蛋白多肽设计bxa
‑
212371进行了修饰(从而产生小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
213788，seqidno:152)，发现其具有更低的免疫原性风险。
[0410]
6.2体外生理学
[0411]
当使用多电极阵列与等基因野生型icm相比时，dmdicm具有较低的na 通道幅度、延长的cfpd(q
‑
t间隔)和更大的搏动速率变异性。与野生型icm相比，dmdicm还具有更高的ca2 转导和更低的阻抗，其中每种方法均证实了非起搏细胞中的搏动速率变异性。
[0412]
检查了携带e2035x突变的dmdicm中小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
196477的表达是否可以减轻dmd表型并改善细胞的生理性状。将多电极阵列、阻抗收缩测定和ca2 瞬变用于测量小型化肌营养不良蛋白表达的影响。我们还使bxa
‑
027743的c端结构域缺失以产生bxa
‑
212371，以更好地适应aav的有限包装容量。利用针对bxa196477提出的相同测定，检查了bxa
‑
212371减轻dmd表型和改善相同细胞的生理性状的功能能力。
[0413]
本研究中使用的hipsccm是从威斯康星州麦迪逊市的cellulardynamicsinternational购买的dmd(e2035x)icell。人心室成纤维细胞购自马里兰州沃克斯维尔的lonza。据报道，icellhipsccm具有接近原代成年心肌细胞的电生理特性，并且对一系列心脏离子通道抑制剂以及肾上腺素能和毒蕈碱受体激动剂和拮抗剂的反应相似。我们自己的工作表明，将hipsccm与成纤维细胞共培养，为多电极阵列(mea)上的电生理研究提供了更稳定的准备。将hipsccm用7％co2在0.1％明胶处理的6孔培养板上培养7天，然后将其胰蛋白酶化并用人成人心脏成纤维细胞以约5:1比率稀释。然后在层粘连蛋白涂布的9孔多电极阵列(mea)板(256
‑
9wellmea300/30ir
‑
ito
‑
mq；多通道系统)上共培养hipsccm和成纤维细胞的悬浮液。用aav9
‑
mdys表达构建体(表达小型化肌营养不良蛋白bxa
‑
196477和bxa
‑
213788，图15d)以1x106的moi感染hipsccm48小时，然后在感染后7天和9天评估hipsccm对细胞外场电位(fp)的影响。与dmdcm相比，bxa
‑
196477和bxa
‑
213788两者均使传导速度显著提高了约80％(双因素anova，***p<0.001，采用tukey事后检验，n＝6)(图15e)。肌营养不良蛋白elisa证实了肌营养不良蛋白在细胞中的表达(图15f)。
[0414]
mea技术使得能够对来自嵌入式基片集成细胞外电极的阵列的可兴奋细胞或组织进行高含量时空分析，可以将细胞在所述电极上培养或将组织置于所述电极上。细胞外场电位(fp)由每个电极记录，并对应于细胞动作电位。fp形态、持续时间和传导速度的评估提供对治疗的离子通道活动以及对复极化和传导的影响的描述。在mea板上培养hipsccm7天后，细胞在嵌入每个孔的记录电极上形成自发搏动的单层。使用usb
‑
mea256
‑
系统和mc
rack采集软件(多通道系统)以10khz的采样频率，从28个电极/孔(直径30 m，中心至中心间距300um)记录自发fp。在37℃的加湿环境中及恒定的5％ co2和95％o2供应下进行20分钟的平衡期后，在300μl维持培养基中用 aav9
‑
mdys表达构建体转染每个孔。监测并记录了小型化肌营养不良蛋白的表达对fp脉冲间间隔(ipi)的影响。用在matlab(mathworks)中编写的定制软件分析了数据。通过使用br＝60000/ipi来计算心率的替代项搏动速率 (搏动/分钟)，其中ipi是在每种条件下在稳态下100秒记录的平均ipi(毫秒)。待测量的电生理参数是场电位持续时间(复极化的替代项)和场电位传导速度。针对搏动速率变化(fpdc)校正了场电位持续时间。所有治疗重复了至少3次。
[0415]
通过在同步化单次传播搏动期间测量嵌入mea孔中的每个电极的场电位激活时间来量化传导速度。使用具有2.1ms窗口的21点最小二乘平滑多项式(savitsky和golay，1964)使来自每个电极的场电位的数字化记录平滑化。激活时间是每个场电位波形的负导数中的峰值。最早和最新两个激活时间之间的时间是场电位在单层心肌细胞上传播的传导时间，并且这两个电极之间的距离是传导距离。每次传播的传导时间除以传导距离是mea孔上的单层心肌细胞的每次搏动的传导速度(图15)。
[0416]
数据表明，两种小型化肌营养不良蛋白设计均显著改善了传导速度(图 15)。
[0417]
6.3骨骼肌生理学的体内恢复
[0418]
肌营养不良蛋白缺乏的骨骼肌产生较少的比力(每面积的力)，并且极易受到收缩引起的损伤。肌营养不良蛋白表达的恢复可以减轻这些障碍。在 2周龄时通过眶后注射用2e14vg/kg aav9
‑
c5
‑
12
‑
bxa
‑
196477或 aav9
‑
c5
‑
12
‑
bxa
‑
212371系统治疗营养不良的mdx小鼠。在8周龄时检查肢体肌肉生理学。简言之，将小鼠膝盖夹紧，并将脚置于箍筋中，并且在用针电极最大程度地收缩肌肉的同时移动箍筋。此测定测量峰值抽搐和强直性肌力产生以及收缩诱导的损伤。
[0419]
6.4营养不良病理的体内预防
[0420]
dmd的mdx小鼠模型中的骨骼肌通常从约3
‑
4周龄经历坏死和再生。再生肌肉通常在大小上更可变，并且在冷冻的横切面中含有位于中心的核。另外，纤维化在再生肌肉中变得更加普遍。在未经处理的mdx肌肉和用 aav9
‑
c5
‑
12
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
c5
‑
12
‑
bxa
‑
212371处理的mdx肌肉中测量肌纤维大小、位于中心的核的比例和纤维化。还量化了表达所述小型化肌营养不良蛋白的肌纤维的比例。使用halo和columbus成像计算机程序检查了隔肌、腓肠肌、胫骨前肌和心肌。
[0421]
6.5体内研究
[0422]
研究概要
[0423]
在2周龄时用2e14vg/kg aav9
‑
bxa
‑
196477或aav9
‑
bxa
‑
213788处理 mdx
4cv
小鼠。在施用后两周，终止了n＝3只小鼠，以检查小型化肌营养不良蛋白的靶标接合(生物分布和表达水平)。在2月龄时，类似于先前描述的 (khairallah等人，2012)，检查了右胫骨前肌的强度和对收缩诱导的损伤的抵抗力(n＝10)。在3月龄时终止小鼠，并检查了靶标接合和对营养不良的预防(图16)。
[0424]
靶标接合
[0425]
免疫荧光
‑
在oct中在液n2中在2
‑
甲基丁烷中冷冻肌肉。用与alexa
‑
647 缀合的针对肌营养不良蛋白的抗体(mandys106；dshb；1:200)和小麦胚芽凝集素对10um冷冻切片进
行免疫染色。将alexa
‑
488 igg2a抗体用于标记肌营养不良蛋白第一抗体。使用phoenix opera高含量筛选共聚焦显微镜 (perkin
‑
elmer)对切片进行成像，并使用columbus软件进行量化。简言之，将alexa
‑
647图像反转，使用m模式在<2000um2的横切面中的选定细胞群中查找细胞并计算形态。接下来，计算alexa
‑
488的强度，并选择强度大于mdx
4cv
对照肌肉的群体。在4周和12周的小鼠中，大于90％的肌肉对小型化肌营养不良蛋白呈阳性(图17)。
[0426]
mrna
‑
为了分离总rna，使用qiagen tissuelyzer将组织均质，并且使用 qiagen rneasy 96universal组织试剂盒(qiagen目录号74881)分离rna。将组织(约15)置于含有750ul的qiazol试剂和一个5mm钢珠的rneasy试剂盒收集微管中，使用tissuelyzer在30hz下均质2分钟，并重复此步骤直至均质，随后在4℃下以6000xg离心1分钟。向每个管中添加150ml氯仿，并使样品剧烈涡旋15秒。在室温下孵育3分钟后，将样品在4℃下以6000xg旋转15分钟。去除水相(约360ul)并转移至含有1体积无rna酶的70％etoh的新管中。将所有样品转移至96孔rneasy 96板中，并用airpore带密封板，并且在室温下以5600xg离心4分钟。每孔添加400ul的rw1缓冲液，并将板重新密封并以 5600xg旋转4分钟。在旋转过程中，通过在每个dna酶小瓶中添加550ul 无rna酶的水来制备dna酶i储备溶液。将670ul的dna酶i储备溶液稀释到 7.3ml rdd缓冲液中，混合并在4℃下储存。当离心完成后，将流通物丢弃，并将80ul的dna酶i混合物直接添加至每个孔的中心，并将板在室温下孵育 15分钟。在孵育后，将400ul的rw1添加至每个孔中，并将板密封，并且以 5600xg离心4分钟。丢弃流通物，并且每孔添加800ul rpe缓冲液，将板重新密封并以5600xg旋转4分钟。重复此过程，并将板以5600xg离心10分钟。然后通过向每个孔的中心添加60ul的无rna酶的水并以5600xg离心4分钟，将每个样品洗脱到新鲜管中。为了提高回收率，将60ul重新施加回板上，并以5600xg再离心4分钟。使用nanodrop 8000量化rna产量。
[0427]
rt
‑
pcr
‑
对于cdna合成和后续的pcr，将1ug rna添加至96孔板的1 个孔中的10ul h2o(plate
‑
axygen,pcr
‑
96
‑
c
‑
s)中。向每个孔中添加10u l的主混合物(高容量cdna逆转录试剂盒，applied biosystem)，并将板以1 000rpm离心。将cdna合成在25℃下进行10分钟，在37℃下进行120分钟，在85℃下进行5分钟，随后保持在4℃下。对于qpcr，在384孔透明反应板(a pplied biosystem；目录号4483285)中，用引物/探针组(正向引物5'
‑
tgga agattgctacgagcgc
‑
3'；反向引物5'
‑
caggtcgctgaacaggttct
‑
3'；探针
‑
6fam
‑
gcaagttcggcaagcagcaca
‑
mgbnfg)一式两份地运行每个样品。向每个反应中添加2ul cdna和8ul主混合物(5ul快速高级主混合物、0.5ul 20x fam引物探针混合物和2.5ul水)，并将板以1000rpm 离心1分钟。使用用于数据分析的viia7系统和quant studio实时pcr软件(a pplied biosystem)，将样品在95℃下孵育20秒，随后是在95℃下1秒和60℃下20秒的40个循环。
[0428]
载体基因组/基因组dna分离和qpcr
‑
对于基因组dna分离，使用qiag en tissuelyzer将组织均质，并使用qiagen dneasy 96血液和组织试剂盒(q iagen目录号69581)分离基因组dna。将组织(约10mg)置于含有200ul 蛋白酶k
‑
缓冲液atl和一个5mm钢珠的96孔板(costar测定块1ml，目录号 3958)中，使用tissuelyzer以30hz均质2分钟，重复直至均质。基因组dna 分离之后按制造说明进行。对于qpcr，在384孔透明反应板(applied biosys tem；目录号4483285)中，用引物/探针组(正向引物5'
‑
tggaagattgcta cgagcgc
‑
3'；反向引物5'
‑
caggtcgctgaacaggttct
‑
3'；探针
‑
6fam
‑ꢀ
gcaagttcggcaagcagcaca
‑
mgbnfg)一式两份地运行每个样品。向每个反应中添加2ul基因组dna(80ng)和8ul主混合物(5ul快速高级主混合物、0.5ul 20x fam引物探针混合物和2.5ul水)，并将板以1000rp m离心1分钟。使用用于数据分析的viia7系统和quant studio实时pcr软件 (applied biosystem)，将样品在95℃下孵育20秒，随后是在95℃下1秒和60 ℃下20秒的40个循环。
[0429]
msd
‑
elisa
‑
通过elisa测定确定了蛋白质表达。用碳酸氢盐缓冲液中浓度为2ug/ml的单克隆抗体manex 1011b预涂布多重测定384孔板(meso scalediscovery，目录号l21xb
‑
4)过夜。然后用封闭缓冲液(pbs中的5％bsa) 封闭板4小时，同时在室温下摇动。使用qiagen tissuelyzer将组织(约20mg) 以1mg组织/10ul裂解缓冲液(sigma，目录号r0278)的浓度在ripa缓冲液中用蛋白酶抑制剂混合物片(roche，目录号04 693 159 001)以30hz均质5分钟，并重复此步骤直至均质。在结合缓冲液(pbs中的1％bsa，0.05％tween 20， 20mm tris ph 7.5)中将组织ripa裂解物以1:3稀释。将组织裂解物和磺基缀合的mandys 106(0.2ug/ml)添加至预涂布的384孔板中，并在40℃下摇动孵育过夜。用含有0.05％tween 20的pbs洗涤板，并添加40ul具有表面活性剂的 msd读取缓冲液t(目录号r92tc
‑
1)。然后在msd sector 6000机器上读取板。
[0430]
数据显示，施用足够的病毒以在>90％的4周龄横纹肌细胞中实现表达 (mrna和蛋白质)(图18)。
[0431]
肌酸激酶
‑
使用市售试剂盒在血清中测量作为肌肉损伤指标的肌酸激酶。在4周龄(分娩后2周)时测量ck。另外，在3月龄时，即收缩诱导的损伤方案后1个月(参见下文)，测量ck。****p<0.001，单因素anova及tukey 事后检验，n＝10，与mdx
4cv
相比。数据显示，在用bxa
‑
196477或bxa
‑
213788 治疗的小鼠中，肌酸激酶水平和由此肌肉损伤显著降低(图19)。
[0432]
功能研究
[0433]
根据制造商的说明(aurora scientific)，通过体内(脚板)设备测试了胫骨前(ta)肌收缩特性。简言之，在力频率曲线中以150hz实现了峰值强直收缩(力以牛顿米表示的扭矩测量)。在用bxa
‑
196477或bxa
‑
213788处理的野生型、mdx4cv和mdx4cv小鼠中，峰值强直收缩相同。然而，mdx4cv 中的ta肌肉质量较大(****p<0.001，单因素anova及tukey事后检验，n＝ 10)，使得在mdx4cv小鼠中以及在经处理小鼠中在野生型水平下，峰值强直性力针对ta质量的归一化降低(与mdx4cv相比，***p<0.001；单因素anova 及tukey事后检验，n＝10)(图20)。
[0434]
根据制造商的说明(aurora scientific)，通过体内(脚板)设备测量了胫骨前(ta)肌损伤。在以150hz(最大等长扭矩)进行峰值强直收缩期间，将脚板从90
°
旋转至135
°
以拉紧肌肉。如前所述(khairallah等人，2012)，这种收缩每分钟重复20次收缩。在mdx
4cv
小鼠中，在即将拉紧之前的最大等长扭矩随着每次收缩而显著降低(与野生型相比，p<0.0001；双因素anova； n＝9
‑
10)。相比之下，bxa
‑
196477和bxa
‑
213788两者均以与野生型水平相似的水平防止收缩诱导的损伤(与mdx
4cv
相比，****p<0.0001bxa
‑
213788 和**p<0.01bxa
‑
196477，采用tukey事后检验，n＝9
‑
10)。数据表明，两种小型化肌营养不良蛋白设计均保护ta肌肉免受收缩诱导的损伤(图21)。
[0435]
本文实施例中描述的小型化肌营养不良蛋白构建体的体外和体内表达在c5
‑
12启动子的控制下(参见us 2004/0175727)，其中去除了前七个和后十三个核苷酸。所使用的aav是aav9，其中itr是aav2。
[0436]
6.6进一步的免疫原性研究
[0437]
使用计算机免疫原性预测工具测试了在小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
027741内的铰链2(h2)结构域与r16血影蛋白重复序列16(r16)之间产生的新型接点(参见表12：seqidno:156至166；seqidno:155是原始序列)的免疫原性。基于前述计算机方法，确定了新型接点seqidno:157(参见图22)具有最小的免疫原性风险。测试的接点序列编号如下：seqidno:155(1)、seqidno:156(2)、seqidno:157(3)、seqidno:158(4)、seqidno:159(5)、seqidno:160(6)、seqidno:161(7)、seqidno:162(8)、seqidno:163(9)、seqidno:164(10)、seqidno:165(11)、seqidno:166(12)(参见图22b)。
[0438]
使用如上所述的体外t细胞增殖测定，测试了bxa
‑
027741设计的前述接点及其接点变体的免疫原性潜力。数据表明，与其他测试的接点相比，接点j11v3(seqidno:157，图22b中的3号)引起显著更少的cd8 (图23a)和cd4 t(图23b)细胞增殖，并且因此更优越(图23)。修饰小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
196477以携带接点j11v3，使c端处的最后三个氨基酸缺失，并缩短3'utr，从而产生小型化肌营养不良蛋白多肽bxa
‑
213780(seqidno:153)和核苷酸序列seqidno:154。