一种艳山姜精油的用途

1.本发明涉及医药领域，尤其涉及一种艳山姜精油在制备治疗和预防神经系统疾病的药物或健康产品中的用途。


背景技术：

2.艳山姜是姜科山姜属植物艳山姜(alpinia zerumbet(pers.)burtt.et smith)的干燥成熟果实。艳山姜具有温中燥湿、行气止痛、截疟的功效，主治心腹冷痛、胸腹胀满、消化不良、呕吐腹泻等症状，已被收录于2003版《贵州省中药、民族药标准》。艳山姜作为贵州地产特色民族药材，常用于治疗胃溃疡等疾病。
3.艳山姜挥发油是艳山姜的有效活性部位，具有广泛的抗炎、抗氧化以及抑制内皮功能障碍等多方面的生物活性。但目前尚无文献提及艳山姜精油对神经系统疾病的预防、缓解或治疗作用。
4.癫痫是由大脑神经元高度同步化的异常放电引起的短暂性大脑功能障碍，该疾病具有反复发作的特点，若未及时的予以治疗，会引发神经元受损，对患者的生活质量造成严重的负面影响，甚至会造成智力障碍。癫痫是世界上最常见和最严重的脑部疾病之一，影响至少7000万人，一旦患上，就很难根治，需要终身进行药物治疗。
5.目前有超过25种批准的抗癫痫药物(asds)，但这些药物仅对约30-40％的癫痫患者有效，且三分之一的癫痫患者出现药物耐药性或严重的副作用。需要寻找高效低毒的治疗或预防癫痫的活性药物。
6.除了遗传因素外，癫痫发病的根本原因不明。目前流行的三大类机制为电压门控离子通道的调节、γ-氨基丁酸(gaba)介导的抑制性神经传递的增强和谷氨酸介导的兴奋性神经传递的衰减。普遍接受的理论是癫痫是某些调节膜兴奋性的神经递质和/或离子通道不平衡的结果。
7.近期，我们应用gaba拮抗剂戊四唑(ptz)诱导的癫痫斑马鱼体内筛选模型研究了300多种精油抗癫痫的效果，首次发现姜科山姜属植物艳山姜(alpinia zerumbet(pers.)burtt.et smith)精油能显著改善斑马鱼癫痫状态，可以用于治疗/预防或缓解包括阿尔茨海默病(ad)、脑疟疾(cm)、细菌性脑膜炎、脑外伤、焦虑、疼痛、压力引起的头痛、失眠、癫痫、抑郁症、精神病和癔症等中枢神经系统疾病。之前，此药理作用尚未被报道过。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种艳山姜精油在制备治疗和预防中枢神经系统疾病的药物或健康产品中的用途。
9.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案完成：一种艳山姜精油在制备治疗和预防神经系统疾病的药物和健康产品中的用途。
10.进一步地，所述艳山姜精油为姜科山姜属植物艳山姜的果皮、种子、全果实的挥发性成分。
11.进一步地，所述艳山姜精油通过水蒸气蒸馏法制备，具体包括以下步骤：
12.(1)采集艳山姜成熟的种子、果皮或全果实，阴凉干燥处晾干至水分质量含量低于5％，粉碎，过药典标准筛3号筛。
13.(2)将样品放入圆底烧瓶，加入7-9倍体积量的纯水，搅拌混匀，浸泡1-3h后采用水蒸气蒸馏法提取6-8小时，温度为60-70℃。
14.(3)收集蒸馏液，加入乙酸乙酯萃取3-5次，合并萃取液后，再加入无水硫酸钠除水，静置过夜，分离无水硫酸钠后得艳山姜精油。
15.进一步地，所述神经系统疾病包括阿尔茨海默病、脑疟疾、细菌性脑膜炎、脑外伤、焦虑、疼痛、压力引起的头痛、失眠、癫痫、抑郁症、精神病和癔症。
16.进一步地，所述神经系统疾病优选癫痫。
17.本发明所述的用途是将艳山姜精油作为制备治疗中枢神经系统疾病药物或健康产品的有效成分，还可以加入一种或多种药物或健康产品上可接受的辅料，并可将药物制成滴鼻剂、喷雾剂、贴剂、膜剂、片剂、凝胶剂、糊剂、漱口剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊片剂、内服液体制剂中的任何一种。
18.所述健康产品可以为化妆品、日用品、食品、保健品、消字号产品中的任何一种。
19.本发明的有益效果是：本发明首次发现艳山姜精油在中枢神经系统疾病中表现出活性。本发明通过斑马鱼体内癫痫模型进行筛选，首次发现艳山姜精油或含艳山姜精油的任意组合物在斑马鱼体内模型中能改善癫痫症状，艳山姜精油在1μg/ml至6μg/ml的浓度范围内，抗癫痫治疗效率随着浓度的增加而增加，呈现浓度依赖性，ec
50
为2.86μg/ml。且具有良好的脂溶性，易于通过血脑屏障，因此具有提高或改善的毒理学安全性(即毒性降低)、提高或改善的代谢稳定，较长的半衰期或较小的副作用的特点，同时产生类似或提高的生物活性(药效)。制备的药物可用于预防或治疗中枢神经系统(cns)疾病和病症，如阿尔茨海默病(ad)、脑疟疾(cm)、细菌性脑膜炎、脑外伤、癫痫、焦虑、疼痛、压力引起的头痛、失眠、抑郁症、精神病和癔症。
附图说明
20.图1是斑马鱼癫痫模型的建立中戊四唑(ptz)浓度的选择比较图；
21.图2是斑马鱼癫痫模型的建立中溶剂dmso浓度的选择比较图；
22.图3是斑马鱼癫痫模型的建立中阳性药苯妥英钠(ps)浓度的选择比较图；
23.图4是在斑马鱼癫痫模型中艳山姜精油和抗癫痫药物苯妥英钠抗癫痫活性比较图；
24.图5是在斑马鱼癫痫模型中艳山姜精油抗癫痫活性的半数有效量图。
具体实施方式
25.经研究发现，在gaba拮抗剂戊四唑诱导癫痫斑马鱼模型中，动物体内施用本发明的艳山姜精油能显著改善癫痫斑马鱼的快速运动。此外，也能在抑郁焦虑斑马鱼模型中，能有效改善斑马鱼的抑郁焦虑症状。也就是说，艳山姜精油通过多分子协调，多靶点作用，治疗/缓解脑功能及其障碍疾病的相关症状，也没有出现毒副作用。
26.许多脑功能及其障碍疾病的病理状态，例如阿尔茨海默病(ad)、脑疟疾(cm)、细菌
性脑膜炎、脑外伤、癫痫、焦虑、疼痛、压力引起的头痛、失眠、抑郁症、精神病和癔症等，发病机制复杂，单一成分或分子难与治愈或缓解。艳山姜精油由多个活性分子组成，因此，患有中枢神经系统病的个体可接受含有本发明中涉及的艳山姜精油，或含本发明中涉及的含艳山姜精油的组合物。
27.本发明可用来治疗癫痫性病症。也就是说，本发明的艳山姜精油以及药物配方和组合物显示出显著抗癫痫活性，其通过动物模型中癫痫的严重程度、数量或持续时间的减少得到证明。
28.本发明中的艳山姜精油可用作中枢神经系统疾病治疗的潜在药物。中枢神经系统(cns)疾病和病症意指神经系统的障碍或疾病，包括但不限于脑疟疾(cm)、细菌性脑膜炎、脑外伤、焦虑、疼痛、压力引起的头痛、失眠、抑郁症、精神病和癔症。神经退行性疾病意指诸如但不限于以下的疾病：老年痴呆等。
29.本发明涉及的艳山姜精油给药方式可为鼻腔给药、口腔给药、透皮给药、口服给药等途径。鼻腔给药的常见剂型包括滴鼻剂、喷雾剂、贴剂、膜剂等；口腔黏膜给药常用剂型包括片剂、贴剂、凝胶剂、糊剂、膜剂、喷雾剂、漱口剂、丸剂等；透皮给药常用剂型为贴剂；口服剂型包括片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、内服液体制剂。
30.本发明所述可药用载体包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖醇、山梨醇、淀粉、淀粉糊、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、糊精、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、植物油、聚乙二醇、无菌磷酸盐缓冲盐水、盐水、林格氏溶液以及它们的组合。
31.此外，本发明中的艳山姜精油还可以添加到食物和饮料中，用于口服施用，如配制成口香糖，以促进口服递送和吸收。本发明中的艳山姜精油或其组合物还可以添加到化妆品、洗浴用品或大健康产品中，用于香薰、嗅吸、按摩、涂抹、泡浴使用。
32.本发明涉及的艳山姜精油也可与其他药物活性成分联用，以制备其他的新药物组合物。
33.本发明的艳山姜精油或其组合用以缓解上述症状的证实性疗效和治疗相关活性，是通过斑马鱼癫痫模型试验和筛选方法进行证实的。
34.上述本发明的艳山姜精油或其组合的治疗作用、良好的药物代谢参数和通常无毒性使得本发明化合物成为用于治疗上述病症的理想药物。
35.下面将结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，应当理解为可以以各种形式实现本发明而不应该被所阐述的实施例限制。相反，提供这些实施例是为了更加透彻地理解本发明。实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
36.实施例1
37.采集产自云南的艳山姜(alpinia zerumbet(pers.)burtt.et smith)干燥成熟的果实，阴凉干燥处晾干，将干燥的艳山姜样品用水冷式增速高效流水粉碎机粉，过药典标准筛3号筛。将样品放入圆底烧瓶，加入8倍量纯水，搅拌混匀，浸泡1h后采用水蒸气蒸馏法提取7小时，温度为60-70℃。收集蒸馏液，加入少量乙酸乙酯萃取3次，再加入无水硫酸钠除水，静置过夜，使乙酸乙酯挥发，分离无水硫酸钠后得艳山姜精油，得率为0.83％。用气相色谱-质谱联用仪分析，并用nist.14谱库联合检索，确定艳山姜精油中的成分(如表1)。艳山
姜精油中鉴定出64个化合物，按质量百分比占98.14％，其中含量较高的化合物为β-侧柏烯(＞18％)、β-蒎烯(＞17％)、α-蒎烯(＞6％)、δ-杜松烯(＞6％)、β-石竹烯(＞3％)。
38.表1：艳山姜果实精油的gc-ms分析鉴定
39.40.[0041][0042]
实施例2
[0043]
采集产自云南的艳山姜(alpinia zerumbet(pers.)burtt.et smith)干燥成熟的果皮，阴凉干燥处晾干，将干燥的艳山姜样品用水冷式增速高效流水粉碎机粉，过药典标准筛3号筛。将样品放入圆底烧瓶，加入8倍量纯水，搅拌混匀，浸泡1h后采用水蒸气蒸馏法提取7小时，温度为60-70℃。收集蒸馏液，加入少量乙酸乙酯萃取3次，再加入无水硫酸钠除水，静置过夜，使乙酸乙酯挥发，分离无水硫酸钠后得艳山姜精油，得率为1.61％。用气相色谱-质谱联用仪分析，并用nist.14谱库联合检索，确定艳山姜精油中的成分(如表2)。艳山姜果皮精油中鉴定出51个化合物，按质量百分比占91.23％，其中含量较高的化合物为桉叶油素(＞15％)、樟脑(＞7％)、氧化石竹烯(＞7％)、龙脑(＞6％)、β-石竹烯(＞6％)、邻伞花烃(＞5％)。
[0044]
表2：艳山姜果皮精油的gc-ms分析鉴定
[0045]
[0046][0047][0048]
实施例3
[0049]
采集产自云南的艳山姜(alpinia zerumbet(pers.)burtt.et smith)干燥成熟的种子，阴凉干燥处晾干，将干燥的艳山姜样品用水冷式增速高效流水粉碎机粉，过药典标准筛3号筛。将样品放入圆底烧瓶，加入8倍量纯水，搅拌混匀，浸泡1h后采用水蒸气蒸馏法提取7小时，温度为60-70℃。收集蒸馏液，加入少量乙酸乙酯萃取3次，再加入无水硫酸钠除水，静置过夜，使乙酸乙酯挥发，分离无水硫酸钠后得艳山姜精油，得率为1.02％。用气相色谱-质谱联用仪分析，并用nist.14谱库联合检索，确定艳山姜精油中的成分(如表3)。从艳山姜种子精油中鉴定出77个化合物，按质量百分比占97.42％，其中含量较高的化合物为β-蒎烯(＞20％)、桧烯(＞16％)、( )-δ-cadinene(＞8％)、τ-muurolol(＞5％)、( )-γ-cadinene(＞5％)。
[0050]
表3：艳山姜种子精油的gc-ms分析鉴定
[0051]
[0052][0053]
实施例4：斑马鱼体内癫痫模型的建立及优化
[0054]
1、实验动物
[0055]
成年的野生型ab品系的斑马鱼，体外受精的方式进行斑马鱼胚胎的繁殖，在受精后6小时(即6hpf)和24hpf对胚胎进行清理(移除已死亡胚胎)。在28℃条件下用养鱼用e3水孵育胚胎，每24hpf换一次水。因为胚胎可以从自身的卵黄囊中获取营养物质，所以在受精后9天内(9dpf)不需要喂食。实验完成后，用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(avma)对动物麻醉处死的规范要求。
[0056]
2、模型建立条件
[0057]
采用7dpf的斑马鱼进行实验，此时的斑马鱼发育完善，且具有自由游泳的能力。采
用ptz(戊四唑)诱导斑马鱼癫痫，设置ptz浓度为1.25、2.5、5、10、20mm,结果如图2，10mm的ptz能诱导斑马鱼的快速运动显著提高且实验数据稳定。精油采用dmso做溶剂，分析溶剂dmso对斑马鱼的影响，选择0.1％，1％，3％的dmso进行实验，如图3，结果显示0.1％dmso几乎不对斑马鱼运动产生影响，故选择0.1％dmso进行实验。阳性药采用苯妥英钠，设置100、200、300、400、500、600、800μm的苯妥英钠进行实验，发现600μm时斑马鱼快速运动得到显著改善，如图4，故选择600μm的苯妥英钠作为阳性对照。故斑马鱼癫痫模型建立条件为10mm的ptz，选择阳性药浓度为600μm的苯妥英钠，溶剂采用0.1％dmso的e3溶液。
[0058]
3、实验方法
[0059]
戊四唑处理的斑马鱼为癫痫模型组；苯妥英钠与戊四唑处理的斑马鱼为阳性对照组；0.1％的dmso处理的斑马鱼为阴性对照组(溶剂对照组)；未处理的斑马鱼为空白对照组。每孔1条鱼，空白对照组加入e3水380μl，溶剂对照组加入0.1％dmso的e3溶液380μl，模型组加入0.1％dmso的e3溶液380μl，阳性药组加入600μm的苯妥英钠(溶于含0.1％dmso的e3)380μl。在28℃下预处理1h，再在空白对照组每孔加入e3水20μl，溶剂对照组加入0.1％dmso的e3溶液20μl，模型组和阳性药组加入200mm的ptz溶液20μl，利用行为分析仪记录黑暗条件下60min内斑马鱼的运动轨迹。
[0060]
对斑马鱼的快速运动(v》20mm/sec)距离进行定量分析，通过计算得到以下指标：
①
斑马鱼快速运动距离；
②
精油的抗癫痫治疗效率；
③
精油对斑马鱼快速运动影响的浓度变化曲线。对斑马鱼的运动距离进行定量分析，计算精油的抗癫痫治疗效率，并根据待测物癫痫治疗效率绘制剂量-效应曲线，计算化合物抗癫痫作用的ec
50
；用方差分析和t-检验进行统计学分析，p《0.05为显著性差异。
[0061]
测试结果符合质量控制标准：
①
整个实验过程中所有实验组均未出现斑马鱼死亡或畸形；
②
模型组和溶剂对照组比较具有统计学差异(p《0.001)；
③
所有实验中空白对照组与溶剂对照组相比无统计学差异(p》0.05)；
④
阳性对照组(苯妥英钠，ps)与模型组比较具有统计学差异(p《0.05)。
[0062]
实施例5
[0063]
以实施例1制备得到的艳山姜精油进行斑马鱼体内抗癫痫作用的评价
[0064]
1、艳山姜精油抗癫痫初筛
[0065]
本研究共设置5组实验，每组实验包括1个空白对照组、1个溶剂对照组、1个癫痫模型组、1个阳性对照组(苯妥英钠)、1个艳山姜精油。采用实施例7方法进行实验，戊四唑处理的斑马鱼为癫痫模型组；苯妥英钠与戊四唑处理的斑马鱼为阳性对照组；0.1％的dmso处理的斑马鱼为阴性对照组(溶剂对照组)；未处理的斑马鱼为空白对照组；阳性对照(苯妥英钠)和艳山姜精油溶于0.1％的dmso中，配制成浓度600μm的苯妥英钠溶液，艳山姜精油的初筛浓度为6μg/ml。
[0066]
所有实验癫痫模型组斑马鱼运动速度显著上升，运动距离(v＞20mm/s)与溶剂对照组比较均有统计学意义(p《0.001)；阳性药(ps)组斑马鱼运动距离(v＞20mm/s)显著下降，与模型组比较具有统计学意义(p《0.01或p《0.001)。以实施例1制备得到的艳山姜精油处理后的癫痫斑马鱼的运动距离与模型组相比显著下降(p《0.05,p《0.01或p《0.001)(表4)。
[0067]
表4：艳山姜果实精油对癫痫斑马鱼运动距离的治疗效率
[0068][0069]
2、艳山姜精油抗癫痫ec
50
测定
[0070]
将艳山姜果实精油配制成浓度为6μg/ml、4.5μg/ml、3μg/ml、1.5μg/ml的待测溶液。采用实施例4方法将上述待测溶液分别与戊四唑共同处理斑马鱼一段时间后，利用行为分析仪记录60min内斑马鱼的运动轨迹，然后对斑马鱼的快速运动(seizure，v》20mm/sec)距离进行定量分析，计算艳山姜精油的抗癫痫治疗效率，并根据艳山姜癫痫治疗效率绘制剂量-效应曲线，计算艳山姜精油抗癫痫作用的ec
50
；用方差分析和t-检验进行统计学分析，p《0.05为显著性差异。实验过程中各组斑马鱼均未出现死亡现象。由图4可知，艳山姜精油各浓度组与癫痫模型组相比，斑马鱼快速运动轨迹明显减少。图4为根据斑马鱼快速运动距离平均值mean
±
se绘制的柱形图，由图4可知，艳山姜精油各浓度组与溶剂对照组相比均具有统计学意义(p《0.001)，艳山姜精油与抗癫痫药物苯妥英钠比较，艳山姜抗癫痫活性强于苯妥英钠(600μm)。图5为艳山姜精油抗癫痫作用的剂量-效应曲线，由图5可知，艳山姜精油在1μg/ml至9μg/ml的浓度范围内，抗癫痫治疗效率随着浓度的增加而增加，呈现浓度依赖性，ec
50
为2.86μg/ml(表5、图4、图5)。
[0071]
表5：不同浓度的艳山姜精油对癫痫斑马鱼运动距离的治疗效率
[0072][0073]
实施例6
[0074]
以实施例2制备得到的艳山姜精油进行斑马鱼体内抗癫痫作用的评价。测试方法与实施例8相同，如表6所示，结果均表明，本发明制备得到的艳山姜精油显示出特别的神经活性作用，能显著改善戊四唑处理的斑马鱼的癫痫状态，快速运动轨迹明显减少，快速运动距离显著降低。
[0075]
表6：艳山姜果皮精油对癫痫斑马鱼运动距离的治疗效率
[0076]
[0077]
实施例7
[0078]
以实施例3制备得到的艳山姜精油进行斑马鱼体内抗癫痫作用的评价。测试方法与实施例8相同，如表7所示，结果均表明，本发明制备得到的艳山姜精油显示出特别的神经活性作用，能显著改善戊四唑处理的斑马鱼的癫痫状态，快速运动轨迹明显减少，快速运动距离显著降低。
[0079]
表7：艳山姜种子精油对癫痫斑马鱼运动距离的治疗效率
[0080][0081]
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。