用于治疗食物过敏的可降解缓释的复合微针及其制备方法

1.本发明涉及药物制剂技术领域，具体原料为用于治疗食物过敏的可降解缓释的复合微针及其制备方法。


背景技术：

2.食物过敏这种对食物过敏原的过激免疫反应会对患者的家庭生活、社会交往、工作表现等方面造成许多有害的影响。过敏原特异性免疫疗法(sit)是治疗食物过敏等各种过敏性疾病的理想方法。然而，超过3年的频繁就诊和潜在的不良副作用往往会降低患者的依从性。近年来，许多研究人员开始关注于微针(mn)，认为其有作为新型过敏原特异性免疫疗法的潜力。
3.微针的提出是在表皮免疫疗法中的一大突破，作为一种新型经皮给药系统，既继承了传统表皮疗法的优点，又改善了其缺点，在近几年引起了众多科研人员的关注。表皮免疫疗法最突出的优点是过敏原经表皮给药后，直接由真皮层中的朗格汉斯细胞等免疫细胞呈递给局部淋巴结，引起免疫反应，跳过了肝脏的首过效应，达到较为理想的治疗效果。微针不仅可以刺穿皮肤的角质层，直达真皮层，且可以通过持续作用，增强治疗疗效。
4.自1976年微针第一次应用于药物传递以来，已经开发了四类微针：固体微针、涂层微针、溶解微针和空心微针。固体微针和空心微针是不含药物的，通常由硅或金属制成，它们主要用于刺破皮肤形成微孔，作为表皮药物治疗的预处理或作为注入液体药物的通道。涂层和溶解微针是将药物层分别包覆在固体微针表面或将药物嵌入微针基质中形成的含药微针。固体微针、涂层微针与空心微针在应用过程中是重复利用或者会产生医疗垃圾的，容易出现交叉感染等安全隐患。而传统的溶解微针大多为单一的化合物制成，溶解微针的基质材料可分为可生物降解材料、可膨胀材料以及既可生物降解又可膨胀的材料，其在机体内的降解速度由化合物本身性质决定，存在释放药物过快或过慢的问题。
5.因此设计用于治疗食物过敏的可降解缓释的复合微针及其制备方法是十分有必要的。


技术实现要素：

6.针对上述传统给药方法效率低、患者依从性差等不足，提供了用于治疗食物过敏的可降解缓释的复合微针及其制备方法，本产品所述的微针贴剂为多层结构，包含基座和针尖。基座和针尖均采用可缓释可降解聚合物，基座在皮肤内的溶解速度比针尖的溶解速度更快，针尖作为药物库可在机体皮肤内长期释放预先包埋的过敏原，使机体内免疫应答水平维持在较高状态。本发明可以通过仅破坏皮肤角质层，实现无痛、安全、有效地递送过敏原，且该微针贴剂制作工艺简单，适用于工业化生产，成本低廉，经济环保，具有重要的社会意义。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：用于治疗食物过敏的可降解缓释的复合微针，包括基座和针尖，所述基座和所述针尖均采用可溶于水的聚合物材料，所述针尖
数目为1根以上，所述针尖内包埋有过敏原。
8.用于治疗食物过敏的可降解缓释的复合微针的制备方法，包括如下步骤：步骤一、母液配置；步骤二、包埋药物；步骤三、溶液浇筑；步骤四、离心干燥；
9.上述步骤一中，将降解较慢的聚合物、降解较快的聚合物分别配置成针尖母液和基底母液；
10.上述步骤二中，在步骤一所述的针尖母液中包埋药物制成针尖溶液；
11.上述步骤三中，针尖溶液浇筑于阴模具中，离心使得针尖溶液进入阴模具的微孔，吸取未进入微孔的多余液体，真空干燥或静置晾干；
12.上述步骤四中，基座溶液浇筑于阴模具中，离心后真空干燥或静置晾干，脱模制得可缓释可降解聚合物微针贴剂。
13.在一具体方案中，所述微针贴剂为双层结构，基座与针尖均采用可溶于水的聚合物材料，基座在皮肤组织内的降解速度优选为15～240min，进一步优选为15～60min，目的是使患者施加微针贴剂后，基座能快速溶解，皮肤表面无负担，不妨碍日常生活，针尖在皮肤组织内的降解速度优选为1～40d，更优选为6～14d，目的是使针尖在皮肤组织内作为药物库缓慢释放药物。
14.进一步地，针尖部分的聚合物优选的包括但不限于丝蛋白、聚乳酸乙醇酸、聚乳酸、壳聚糖、聚富马酸丙二醇酯、乙氧基乙醇、脯氨酸、明胶，最优选的为丝蛋白，其分子量优选的为大于50kda，水溶液浓度优选为1％～50％，进一步优选为5％～15％。
15.进一步地，基座部分的聚合物优选的包括但不限于透明质酸和聚乙烯醇，透明质酸分子量优选为50～1000kda，聚乙烯醇分子量优选为10～100kda，其水溶液浓度优选为1％～20％，进一步优选为15％的透明质酸溶液和10％的聚乙烯醇溶液。
16.进一步地，所述的针尖溶液包埋的过敏原分子量优选为10～500kda，浓度优选为0.1～500mg/ml，所述微针贴剂的过敏原总载量为0.01～30g/片，所包埋的浓度应结合免疫耐受所需的具体剂量确定。
17.进一步地，在步骤三中针尖溶液的浇筑量优选为10～500μl/微针阴模具，根据微针阴模具的尺寸，进一步优选的是100～200μl/微针阴模具。
18.进一步地，在步骤四中基座溶液的浇筑量为100～1000μl/微针阴模具，根据微针阴模具的尺寸，进一步优选的是200～500μl/微针阴模具，更优选的是250μl/微针阴模具。
19.进一步地，制作所得的微针贴剂含有1根以上的针尖，所述针尖的形状优选的包括但不限于棱锥形、圆锥形、类锥形和蛇齿形，进一步优选为棱锥形与圆锥形。
20.进一步地，所述针尖的高度优选为70～1200μm，进一步优选的是400～900μm，更优选的是700～800μm，针尖底径优选为20～800μm，进一步优选的是200～350μm，针尖密度优选为1～600根/cm2，进一步优选的是80～2000根/cm2，更优选的是100～150根/cm2。
21.进一步地，所述基座形状包括但不限于圆形和多边形，基座边长优选为1～200mm，进一步优选的是50～100mm。
22.进一步地，所述微针贴剂所包埋的过敏原包括但不限于多肽、蛋白质、核酸、疫苗等药物，还包含其它能激发机体免疫应答的物质。
23.采用上述方案得到的可缓释可降解聚合物微针贴剂可有效刺破皮肤角质层，实现真皮层内的过敏原递送，12h仅释放56.28％的过敏原，表明该微针贴剂可以实现缓释的效
果，应用于长时间的免疫耐受建立，且药物释放率较高，14d之后可释放95.72％的过敏原。
24.与现有技术相比，本发明提供了用于治疗食物过敏的可降解缓释的复合微针及其制备方法，具备以下有益效果：
25.1、经皮给药跳过了肝脏首过效应，比口服治疗的过敏原利用率更高，经济环保，治疗效果更佳。
26.2、相较于固体微针、空心微针、皮下注射等需要医务人员的治疗方法，可溶解聚合物微针贴剂所包埋的过敏原剂量是确定的，患者可以实现自我操作治疗，从而提高患者依从性。
27.3、制备材料采用可生物降解聚合物，整片贴剂均可直接降解于皮肤组织内，一次性使用且不会产生医疗垃圾，安全卫生无污染。
28.4、微针结构为多层结构，针尖材料采用可缓释聚合物，可在皮肤组织内作为药物库长期释放过敏原，使机体维持长期的免疫应答高水平，增强免疫耐受效果，适用于长期治疗。
附图说明
29.图1是新型可缓释可降解聚合物微针实物图。
30.图2是新型可缓释可降解聚合物微针贴剂的电子显微镜扫描图。
31.图3是新型可缓释可降解聚合物微针贴剂的共聚焦显微镜扫描图。
32.图4是微针过敏原释放效率对比图。
33.图5是微针中ova过敏原在制作成微针前后的变应原性的变化。
34.图6是在脱毛的balb/c小鼠皮肤上施加微针效果图，图a为施加微针处理1h内小鼠皮肤失水量的变化；图b为施加微针处理后和1h后的小鼠皮肤。
35.图7是小鼠在激发后的症状评分，其中“control”为对照组，“ova”为过敏阳性对照组，“mnit”为微针治疗组。
36.图8是小鼠激发后的肠道组织病理学分析结果。图a为小肠组织切片；图b为小肠中嗜酸性粒细胞数量；图c为小肠中肥大细胞的数量。其中“control”为对照组，“ova”为过敏阳性对照组，“mnit”为微针治疗组。
具体实施方式
37.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例一
39.(1)配制10％的丝蛋白溶液：50ml离心管中加入18ml蒸馏水，用称量纸在电子天平上称取2g丝蛋白，倒入离心管中，用干净的玻璃棒搅拌至充分混匀，制成均一的丝蛋白溶液，用记号笔标记备用；
40.(2)配制10％聚乙烯醇溶液：烧杯洗净后装入18ml蒸馏水，用称量纸于天子天平上称取2g聚乙烯醇，倒入烧杯中，烧杯放入沸水浴，并同时用玻璃棒搅拌，直至溶液质地均一，
无块状凝胶，取至室温冷却。聚乙烯醇溶液倒入离心管后，与等重的装有蒸馏水的离心管进行离心，转速设置为1500rpm，时间为5min，若还有气泡则继续离心，直至无气泡为止，记号笔标记后备用；
41.(3)包埋ova：用称量纸称量90mgova加入配制好的丝蛋白溶液；
42.(4)从盛有蒸馏水的烧杯中取出pdms阴模具后用纸吸干表面水分，倒置放入离心管中离心除水，转速设置为3000rpm，时间为5min；
43.(5)除水后的模具中加入150μl包埋有ova的丝蛋白溶液，用移液枪枪头缓慢铺开后，检查是否有气泡，若有则需吸取出来；
44.(6)模具放至离心管中，离心15min制备针尖，转速设置为3000rpm；
45.(7)将离心后的模具凹槽中多余的液体吸出至废液缸，注意不要吸取到针尖部分，吸取干净后放至室温通风干燥处干燥3-4h；
46.(8)移液枪吸取250μl聚乙烯醇溶液加至模具凹槽，检查气泡后离心15min，转速设置为3000rpm，目的是制备贴片基座，离心后再加入200μl聚乙烯醇溶液至凹液面处，干燥3-4h；
47.(9)再次加入100μl聚乙烯醇溶液至还未完全干透的贴片凹面，干燥14h后脱模，制成可缓释可降解聚合物微针贴剂。
48.通过微针贴剂的电子显微镜扫描图显示微针形态完整且良好，具备刺破皮肤的潜力(图2)，共聚焦显微镜扫描图显示药物能完整地存在于针尖部分，微针贴剂呈现明显的双层结构(图3)，针尖可以作为药物库在皮肤组织内缓慢释放所包埋的药物。
49.通过和纯聚乙烯醇制作的微针对比，可以看出复合结构的微针可以实现缓释的效果，且对药物利用率高，经济环保(图4)。
50.微针中ova过敏原在制作成微针前后的变应原性的变化如图5所示，可以看出微针贴剂的半抑制浓度虽然较高于微针母液的半抑制浓度，但是变化幅度不是很大，仅上升了0.0623μg/ml，可以认为ova在制作成微针贴剂之后仍然保留了较高的变应原性，可以激发机体的变态反应，即该微针贴剂的制作对药物的疗效影响不大。
51.在小鼠腹部皮肤施加微针处理1h后，小鼠皮肤并未出现明显泛红，针孔处无渗血、肿胀，皮肤状态良好，且表皮失水量恢复正常水平(图6)，显示了微针治疗作为一种微创治疗的极大潜力。
52.实施例二：可缓释降解微针作为食物过敏的脱敏疗法
53.材料与方法
54.建立了鼠类食物过敏模型。从第0周到第5周，每周给小鼠灌胃一次1mgova和10μg霍乱毒素的混合溶液以诱导小鼠产生对ova的过敏。在需要微针治疗的小鼠中每两周(从第6周到第10周)使用微针进行一次免疫治疗。首先使用戊巴比妥钠麻醉小鼠并用毛发修剪器和脱毛膏将小鼠背部的毛发去除。随后将微针贴片插入小鼠皮肤，并用拇指按压约5分钟以等待pva底座溶解。在第14周，用溶解有50mgova的300μl pbs溶液口服激发小鼠并处死。通过小鼠的过敏症状以及肠道组织病理学切片来对食物过敏的症状进行评价。过敏症状的评分标准为：0分，无症状；1分，鼻子和嘴唇周围出现浮肿；2分，小鼠呼吸增加，活动量降低；3分，小鼠呼吸困难、皮肤发绀、口眼周围有肿胀现象；4分，小鼠完全失去活动能力；5分，小鼠死亡。
55.在口服激发后处死小鼠并采集其小肠近端、中间和远端部分，将组织在多聚甲醛(10％,w/v)中固定过夜然后包埋在石蜡中以准备制作组织病理切片。然后，将石蜡块切片，并用苏木精和伊红(h&e)或甲苯胺蓝(0.01％)染料染色以进一步评估嗜酸性粒细胞浸润和肥大细胞浸润情况。计数时，肥大细胞和嗜酸性粒细胞的数量为每只小鼠组织中5个高倍视野中细胞数量的平均值。
56.结果
57.证实经过了微针治疗的小鼠产生了对于ova过敏原的耐受，于是缓解了激发后小鼠过敏的症状。(图7)
58.观察到接受了治疗的小鼠肠道组织形态更加完整，小肠绒毛没有脱落且肥大细胞和嗜酸性粒细胞的数量更低。(图8)
59.以上结果证实可缓释降解微针的免疫治疗成功治疗了食物过敏。
60.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。