双硫仑在抗人冠状病毒NL63感染中的应用的制作方法

双硫仑在抗人冠状病毒nl63感染中的应用
技术领域
本发明涉及药学的技术领域，具体说是双硫仑在抗人冠状病毒nl63感染中的应用。


背景技术：

2003年sars疫情爆发之后不久，一种新型的冠状病毒hcov-nl63在荷兰的一家医院中被分离出，研究人员将其归属于α属冠状病毒。hcov-nl63在欧洲、亚洲、北美洲和大洋洲多地均有发现，通常会导致诸如发烧、咳嗽、喉咙痛和鼻炎等上呼吸道疾病，严重时可引起细支气管炎、细支气管内膜炎等下呼吸道疾病，甚至危及生命，最快可在病发5天内令患者死亡。此外，在感染hcov-nl63的儿童中，患哮吼的几率是未感染的儿童的6.6倍。还有研究显示，hcov-nl63可能与川崎病发病相关。在胃肠道疾病方面，虽然在部分腹泻患者粪便样本中检测到hcov-nl63，但并无确切证据表明该病毒感染与腹泻有关，仅在儿童急性肠胃炎中具有较小的病因。hcov-nl63已成为引发人类呼吸道感染的重要病原体之一，但目前仍没有针对此病毒的特效药物，因此对其进行抑制剂的研究，找到相应的药物迫在眉睫。病毒蛋白酶对于其发病机理和毒力至关重要，人冠状病毒nl63基因组可以编码一种半胱氨酸蛋白酶-木瓜样蛋白酶2(hcov-nl63 pl
pro
2)，切割冠状病毒orf1和orf1b编码的复制酶复合物两个前体多聚蛋白pp1a和pp1ab，调节宿主功能从而促进病毒感染，且在病毒的转录、复制过程中起重要作用。hcov-nl63 pl
pro
2可以切割非结构蛋白nsp2|nsp3和nsp3|nsp4位点，释放nsp2和nsp3。hcov-nl63 pl
pro
2还可以使病毒逃避宿主免疫应答，通过去泛素化(dub)、去isg化和拮抗干扰素作用，促进病毒复制。因此，木瓜样蛋白酶2成为一个关键的抗人冠状病毒nl63的药物靶标，所以针对木瓜样蛋白酶2进行抑制剂筛选对人冠状病毒nl63感染的相关的药物研发具有重大意义。双硫仑，英文名为disulfiram，其体内代谢产物可以不可逆地抑制乙醛脱氢酶，使饮酒者血液中乙醛浓度升高，并由此产生强烈不适感，用药后再次饮酒会有更强不适感，因此目前临床上将双硫仑作为一种戒酒药物。但迄今为止，双硫仑并未应用于抗人冠状病毒nl63感染的探索和研究。


技术实现要素：

针对相关技术中的问题，本发明提供双硫仑在抗人冠状病毒nl63感染中的应用。本发明还提供了针对人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2的抑制剂。本发明所涉及双硫仑cas号为97-77-8，购买于上海麦克林生化科技有限公司。在分子水平上，通过设立阴性对照，发现双硫仑对人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2有很好的抑制活性，因此该化合物有望作为抑制人冠状病毒nl63感染的潜在药物。本发明提供一种用于预防或治疗人冠状病毒nl63的药物，其活性成分为双硫仑，该药物包含上述含有双硫仑以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成片剂、丸剂、胶囊、悬
浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径为口服。本发明具有的优点和积极效果是：本发明的针对人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2的抑制剂，这种抑制剂为双硫仑。双硫仑对人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2活性具有显著的抑制效果。
附图说明
图1是双硫仑对人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2的抑制作用示意图。图2双硫仑对人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2的ic
50
的测定示意图。图3是双硫仑对人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2的抑制剂类型示意图。
具体实施方式：
为了更好地说明本发明，在下面将详述本发明的具体实施方式。1.人冠状病毒nl63中木瓜样蛋白酶2的表达与纯化(1)将含有编码hcov-nl63 pl
pro
2基因的pet-28a( )载体转化escherichia coli bl21(de3)的菌株，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆。(2)在含有卡那霉素抗性的平板上挑取阳性克隆，加入5ml含有50mg/ml卡那霉素的lb液体培养基后37℃培养6h，之后转入0.8l lb培养基，37℃继续培养6h后，加入400μl 1mm iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)在16℃继续培养16小时。(3)4000rpm离心30min收集菌液后高压破菌；破菌后的菌液12000rpm离心1h后收集上清液。(4)将上清液加入破菌buffer(20mm tris-hcl,250mm nacl,ph 8.2)预平衡的ni-nta亲和层析柱中，用ni-nta亲和层析初步纯化蛋白。(5)用含有20mm咪唑的洗杂buffer对含有目的蛋白的介质进行杂蛋白清洗，之后用含250mm咪唑的洗脱buffer洗脱并收集目的蛋白，并用阴离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化来获得稳定均一的目的蛋白。2.hcov-nl63 pl
pro
2的活性测定
2.采用纯度大于95％的rlrgg-amc多肽底物(购自金斯瑞生物科技股份有限公司)；荧光测定的仪器为varioskan flash全波长酶标仪(thermofisher scientific)，设置360nm激发光和460nm发射光，检测荧光信号。蛋白buffer组分为50mm tris-hcl，ph 7.5，用缓冲液配制hcov-nl63 pl
pro
2(终浓度1.6μm)，加入双硫仑(终浓度为20μm),室温孵育2min，迅速加入底物rlrgg-amc浓度为160μm。300rpm震荡5s，检测荧光值。所有测定都做三次平行，在整个实验中保持合适的阳性和阴性对照。3.化合物双硫仑ic
50
的测定hcov-nl63 pl
pro
2终浓度为1.6μm，底物rlrgg-amc终浓度为160μm。我们首先根据筛选结果设定11个抑制剂浓度，双硫仑的终浓度分别是40μm、20μm、10μm、5μm、3μm、1μm、0.75μm、0.5μm、0.25μm、0.125μm、0.0625μm。先将hcov-nl63 pl
pro
2与双硫仑在室温孵育2min，加入10μl底物，记录时间与荧光值变化曲线。使用graphpad prism 9软件分析hcov-nl63 pl
pro
2反应初速率，得到双硫仑浓度与剩余活性的关系曲线，最终求出ic
50
值。4.化合物双硫仑抑制剂类型的测定
将双硫仑配制为浓度分别是0μm、0.75μm、1.5μm。用酶活buffer配制不同浓度的hcov-nl63 pl
pro
2，浓度为0μm、0.375μm、0.75μm、1.5μm、2μm和2.5μm。按之前所述活性测定方法，记录时间与荧光值变化曲线。通过graphpad prism 9软件得到蛋白酶吸光反应初速率，平行测定3组数据，得到抑制剂类型。本发明涉及药学的技术领域，具体说是双硫仑在抗人冠状病毒nl63感染中的应用，双硫仑在抑制人冠状病毒nl63木瓜样蛋白酶2时抑制率大于80％,在制备抗人冠状病毒nl63木瓜样蛋白酶2的小分子抑制剂方面有很大应用潜力，有望成为抗人冠状病毒nl63感染的潜在药物。以上所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常用的方法。以上仅为本发明的具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。