一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料及其制备方法与流程

1.本发明涉及医用敷料技术领域，特别涉及一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料及其制备方法。


背景技术：

2.创面愈合需要经过凝血期、炎症期、增生期和重塑期的四个阶段，最终实现有效的愈合。而愈合结果不理想，通常是停滞于炎症期或增生期，进而引发持续性的炎症反应，最终导致创面久久未愈。现有医用敷料的结构和功能多种多样，尽管医用敷料有了突破性的进展，但不能够为创面的修复和愈合形成良好的保护屏障环境，以维持创面适量的血液和养分的运输，促进细胞活力和皮肤修复再生能力，进而避免停滞于炎症期引发的持续性炎症，降低机体的免疫能力，延长创面愈合的时间，造成慢性创面的形成。
3.合适的敷料可以避免创面受到细菌或其他物质的污染，同时避免物理损伤，以及保持创面的湿润性，并为创面愈合提供最佳环境以增强其功能恢复，最重要的是降低感染的发生和炎症反应的产生，以提高创面愈合速度，减少患者的痛苦。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明的目的在于提出一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料及其制备方法，这种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料作用于皮肤创面，能够起到有效的防止恢复过程中的微生物感染，可达到充分地保护新生组织的作用，进而促进创面快速愈合，同时避免物理损伤，以及保持创面的湿润性，并为创面愈合提供最佳的恢复环境，减少患者的痛苦。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白12-32份、增韧凝胶材料4-8份、霍霍巴油1-5份、水飞蓟籽油2-8份、山苍子提取物4-10份、鼠李糖脂1-3份、左旋肉碱0.5-2份、氨基酸组合物0.6-1.8份、透明质酸6-10份、薄荷烷甲酰乙胺0.8-1.5份、甘油10-20份和水100-300份。
7.优选的，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白22份、增韧凝胶材料6份、霍霍巴油3份、水飞蓟籽油4份、山苍子提取物7份、鼠李糖脂2份、左旋肉碱1.2份、氨基酸组合物1.2份、透明质酸8份、薄荷烷甲酰乙胺1.1份、甘油15份和水200份。
8.本发明选用鼠李糖脂、甘油，有利于融合类贻贝粘蛋白、霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物的活性成分，促进其从表皮层渗入皮肤的速率，提高皮肤的营养供给，滋养和润滑皮肤，左旋肉碱、氨基酸组合物、透明质酸，可提高皮肤修复因子的活性，舒缓和修复皮肤，氨基酸是人体所需的生物物质，有助于提高免疫能力，促进创面的愈合；组分间相互协同，具有良好的细胞相容性和亲和力，有效减轻创面感染和炎症反应。
9.进一步的，所述氨基酸组合物由缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸组成；所述缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和
甘氨酸的质量比为0.8-1：0.2-0.3：0.2-0.3：0.5-0.55：0.3-0.4：0.3-0.4：0.6-0.8：0.6-0.8。
10.进一步的，所述增韧凝胶材料由质量比2：9-13的β-植物油和泊洛沙姆组成。
11.进一步的，所述类贻贝粘蛋白的蛋白含量45-60％，分子量为1.2-2.5kda。
12.进一步的，所述类贻贝粘蛋白是一种发酵提取物，为翡翠贻贝经纳豆菌和海洋红酵母发酵，再经热水浸提后，异丙醇醇沉提取所得。
13.进一步的，所述水飞蓟籽油的提取方法为：取水飞蓟烘干粉碎，加入复合酶，超声酶解，采用质量浓度35-45％乙醇溶液提取，收集油相，取水相重复提取2-3次，合并油相，浓缩，得水飞蓟籽油；所述复合酶由质量比2：1的果胶酶和β-葡聚糖酶组成。
14.进一步的，所述山苍子提取物的制备方法为：取山苍子烘干粉碎，过60-80目，加入6-8m盐酸溶液浸泡，于70-80℃浸泡40-60min后，先加入纤维素酶，30-40℃酶解1-3h，再加入木聚糖酶，350-450w微波酶解20-40min，离心，取上清液，浓缩，得山苍子提取物。
15.该含有类贻贝粘蛋白的的制备方法，包括以下步骤：
16.步骤s1：在类贻贝粘蛋白中加入增韧凝胶材料和水，于45-55℃、400-600w超声分散40-60min，得预分散溶液；
17.步骤s2：将霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂和甘油混合，于30-40℃搅拌溶解，得油相溶液；
18.步骤s3：将左旋肉碱、氨基酸组合物和透明质酸混合，得水相溶液；
19.步骤s4：将油相溶液和水相溶液混合，以6000-10000r/min均质6-10min后，加入预分散溶液，以200-400r/min搅拌30-50min后，于45-55℃、200-400w二次超声分散20-30min，加入薄荷烷甲酰乙胺，混合，得含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料；本发明先将类贻贝粘蛋白和增韧凝胶材料进行超声分散，得到预分散溶液，再根据原料特性分别制备油相溶液和水相溶液，最后经过均质和二次超声分散，能够增强混合体系的分散稳定性，提高组分的混合均匀度时，提高系统的分子力学稳定性，进一步提高保湿性能。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
21.本发明选用类贻贝粘蛋白、增韧凝胶材料、霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂、左旋肉碱、氨基酸组合物、透明质酸和薄荷烷甲酰乙胺等组分，优选配比，制备含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，能够增进成纤维细胞的增殖活性，提高细胞活力，可促进受伤部位皮肤的再生能力，有利于改善创面愈合程度，并为创面愈合提供最佳的环境以增强其功能的恢复；同时，组分间相互协同，使获得的含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，不仅生物活性高、无毒性、性能良好，能够起到有效的防止恢复过程中的微生物感染，可达到充分地保护新生组织的作用，进而促进创面快速愈合。
22.本发明选用核心有效成分类贻贝粘蛋白属于非动物源材料，是由生物发酵技术提取获得，安全性较高。科学配方和独特工艺使含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料可长期稳定、有效的保存，并在使用时与其他原料协同作用，效果更佳，促进皮肤创面的及时修复和再生愈合能力。
23.此外，本发明采用纳豆菌和海洋红酵母发酵翡翠贻贝，发酵产物再经热水浸提后，异丙醇醇沉提取，获得高蛋白含量和高分子量的类贻贝粘蛋白，以及采用超声酶解、低浓度乙醇提取获得水飞蓟籽油，高酸高热浸泡、依次酶解获得山苍子提取物，类贻贝粘蛋白、水
飞蓟籽油和山苍子提取物的生物活性成分高，成分可有机结合，更有利于提高细胞的活力，促进细胞的增殖活性，并维持和调节细胞的生长稳定期；本发明还选用β-植物油和泊洛沙姆组合作为增韧凝胶材料，使敷料具有良好的细胞亲和力和组织粘附性，能够增强其分子力学的稳定程度。
具体实施方式
24.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
25.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
26.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.实施例1
28.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白22份、增韧凝胶材料6份、霍霍巴油3份、水飞蓟籽油4份、山苍子提取物7份、鼠李糖脂2份、左旋肉碱1.2份、氨基酸组合物1.2份、透明质酸8份、薄荷烷甲酰乙胺1.1份、甘油15份和水200份。
29.氨基酸组合物由缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸组成；所述缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的质量比为0.9：0.2：0.2：0.5：0.3：0.3：0.6：0.6。
30.增韧凝胶材料由质量比2：11的β-植物油和泊洛沙姆组成。
31.类贻贝粘蛋白是一种发酵提取物，提取方法为：翡翠贻贝经纳豆菌和海洋红酵母发酵，发酵产物再经热水浸提后，异丙醇醇沉提取，得类贻贝粘蛋白，经测定，类贻贝粘蛋白的蛋白含量51.8％，分子量为1.86kda。
32.水飞蓟籽油的提取方法为：取水飞蓟烘干粉碎，加入质量比2：1果胶酶和β-葡聚糖酶的复合酶，超声酶解，采用质量浓度40％乙醇溶液提取，收集油相，取水相重复提取3次，合并油相，浓缩，得水飞蓟籽油。
33.山苍子提取物的制备方法为：取山苍子烘干粉碎，过70目，加入7m盐酸溶液浸泡，于75℃浸泡50min后，先加入纤维素酶，35℃酶解2h，再加入木聚糖酶，400w微波酶解30min，离心，取上清液，浓缩，得山苍子提取物。
34.该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下步骤：
35.步骤s1：在类贻贝粘蛋白中加入增韧凝胶材料和水，于50℃、500w超声分散50min，得预分散溶液；
36.步骤s2：将霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂和甘油混合，于35℃搅拌溶解，得油相溶液；
37.步骤s3：将左旋肉碱、氨基酸组合物和透明质酸混合，得水相溶液；
38.步骤s4：将油相溶液和水相溶液混合，以8000r/min均质8min后，加入预分散溶液，以300r/min搅拌40min后，于50℃、300w二次超声分散25min，加入薄荷烷甲酰乙胺，混合，得含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料。
39.实施例2
40.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白12份、增韧凝胶材料4份、霍霍巴油1份、水飞蓟籽油2份、山苍子提取物4份、鼠李糖脂1份、左
旋肉碱0.5份、氨基酸组合物0.6份、透明质酸6份、薄荷烷甲酰乙胺0.8份、甘油10份和水100份。
41.原料和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
42.实施例3
43.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白32份、增韧凝胶材料8份、霍霍巴油5份、水飞蓟籽油8份、山苍子提取物10份、鼠李糖脂3份、左旋肉碱2份、氨基酸组合物1.8份、透明质酸10份、薄荷烷甲酰乙胺1.5份、甘油20份和水300份。
44.原料和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
45.实施例4
46.氨基酸组合物由缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸组成；所述缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的质量比为1：0.3：0.3：0.55：0.4：0.4：0.8：0.8。
47.增韧凝胶材料由质量比2：13的β-植物油和泊洛沙姆组成。
48.原料配比和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
49.实施例5
50.类贻贝粘蛋白的提取方法为：翡翠贻贝经纳豆菌和枯草芽孢杆菌发酵，发酵产物再经热水浸提后，异丙醇醇沉提取，得类贻贝粘蛋白，经测定，类贻贝粘蛋白的蛋白含量32.8％，分子量为0.8kda。
51.原料配比和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
52.实施例6
53.类贻贝粘蛋白的提取方法为：翡翠贻贝经纳豆菌和海洋红酵母发酵，发酵产物再经热水浸提后，乙醇醇沉提取，得类贻贝粘蛋白，经测定，类贻贝粘蛋白的蛋白含量43.7％，分子量为1.2kda。
54.原料配比和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
55.实施例7
56.水飞蓟籽油的提取方法为：取水飞蓟烘干粉碎，加入果胶酶，超声酶解，采用质量浓度85％乙醇溶液提取，收集油相，取水相重复提取3次，合并油相，浓缩，得水飞蓟籽油。
57.山苍子提取物的制备方法为：取山苍子烘干粉碎，过7目，加入水，于75℃浸泡50min后，加入纤维素酶和木聚糖酶，400w微波酶解2h，离心，取上清液，浓缩，得山苍子提取物。
58.原料配比和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
59.对比例1
60.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白45份、增韧凝胶材料6份、霍霍巴油3份、水飞蓟籽油12份、山苍子提取物15份、鼠李糖脂2份、左旋肉碱1.2份、氨基酸组合物1.2份、透明质酸8份、薄荷烷甲酰乙胺1.1份、甘油15份和水200份。
61.原料和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
62.对比例2
63.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，采用市售贻贝粘蛋白替换类贻贝粘蛋白，包括以下重量份的原料：贻贝粘蛋白22份、增韧凝胶材料6份、霍霍巴油3份、水飞蓟籽油4份、山苍子提取物7份、鼠李糖脂2份、左旋肉碱1.2份、氨基酸组合物1.2份、透明质酸8份、薄荷烷甲酰乙胺1.1份、甘油15份和水200份。
64.贻贝粘蛋白为市售原料，纯度98％。
65.原料和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
66.对比例3
67.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白22份、增韧凝胶材料6份、霍霍巴油3份、鼠李糖脂2份、左旋肉碱1.2份、氨基酸组合物1.2份、透明质酸8份、薄荷烷甲酰乙胺1.1份、甘油15份和水200份。
68.原料和该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料的制备方法同实施例1。
69.对比例4
70.一种含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下重量份的原料：类贻贝粘蛋白22份、泊洛沙姆6份、霍霍巴油3份、水飞蓟籽油4份、山苍子提取物7份、鼠李糖脂2份、左旋肉碱1.2份、氨基酸组合物1.2份、透明质酸8份、薄荷烷甲酰乙胺1.1份、甘油15份和水200份。
71.该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下步骤：
72.步骤s1：将类贻贝粘蛋白、泊洛沙姆、霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂和甘油混合，于35℃搅拌溶解，得油相溶液；
73.步骤s2：将左旋肉碱、氨基酸组合物、透明质酸和水混合，得水相溶液；
74.步骤s3：将油相溶液和水相溶液混合，以8000r/min均质8min后，加入薄荷烷甲酰乙胺，混合，得含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料。
75.试验例1细胞活力试验
76.采用mtt比色法进行细胞增殖活力的试验测定：
77.细胞：小鼠成纤维细胞l929；
78.细胞生长培养基：10％胎牛血清dmem中(含4000mg/l d-葡萄糖、2mm的l-谷氨酰胺，1.5g/l nahco3，0.1mm非必需氨基酸，1.0mm丙酮酸钠)，ph值7.4；
79.培养条件：在37℃、5％co2气氛、湿度90％以上培养，每3天传代一次，细胞接种密度为1
×
105个/ml；
80.试验：将培养获得的成纤维细胞l929吹打均匀，以接种密度为1
×
104个/ml，接种于96孔板培养，37℃、5％co2气氛、湿度90％以上培养12h，加入2mg/ml含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料10μl，分别培养24、36、48h后，每孔加mtt溶液10μl，继续培养4h，弃去培养上清液，每孔加dmso液100μl，振荡10min，采用酶标仪于570nm波长测定和记录光度值，重复测定三次，以添加细胞生长培养液为空白组，以未添加含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料为对照组，以添加含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料为试验组，细胞活力(％)＝(试验组-空白组)/(对照组-空白组)
×
100，结果如下表：
[0081][0082]
由上表可知，本发明获得的含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料对细胞活力24h为103～118％，36h为130～149％，48h达到129～158％，表明本发明选用类贻贝粘蛋白、增韧凝胶材料、霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂、左旋肉碱、氨基酸组合物、透明质酸和薄荷烷甲酰乙胺等组分，优选配比，制备含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，能够增进成纤维细胞的增殖活性，提高细胞活力，可促进受伤部位皮肤的再生能力，并为创面愈合提供最佳的环境，加快创面愈合。
[0083]
实施例1与实施例5和6，与对比例2相比，本发明进一步发现，翡翠贻贝经纳豆菌和海洋红酵母发酵，再经热水浸提后，异丙醇醇沉提取，获得的类贻贝粘蛋白的蛋白含量和分子量较高，同时，添加蛋白含量45-60％，分子量为1.2-2.5kda的类贻贝粘蛋白，更有利于提高成纤维细胞的活力。
[0084]
实施例1与实施例7，与对比例3相比，本发明还发现，采用超声酶解、低浓度乙醇提取获得的水飞蓟籽油，高酸高热浸泡、依次酶解的山苍子提取物，不仅有利于提高细胞活力，还能够维持和调节成纤维细胞的生长稳定期。
[0085]
实施例1与对比例4相比，表明采用β-植物油和泊洛沙姆组成增韧凝胶材料，使制备含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料具有良好的细胞亲和力和组织粘附性，增强机械结构的稳定程度，避免机械形变产生裂纹或破碎，影响其力学性能。
[0086]
试验例2创面愈合试验
[0087]
选择健康大白兔50只(平均体重4kg)，随机分成5组，注射麻醉，背部剪毛，75％酒精擦拭消毒皮肤后，采用皮肤活检器在背部进行人工创面，创面形状为2cm
×
2cm的圆形，圆内切除0.2cm深的组织，包括皮肤、皮下及肌肉组织。清洗创面，在创面表面分别涂抹实施例和对比例制备获得的含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，采用无菌纱布包扎，每2d换药重新包扎一次，并用碘伏消毒伤口，采用imagel软件测量创面的面积，观察5d，计算创面缩小率(％)＝(s
0-s1)/s0×
100，式中，s0为创面治疗前面积，s1为创面治疗后面积，并于给药后的1d和3d抽兔耳静脉血检测c反应蛋白(c-reactive protein,crp)，取伤口组织做组织病理切片，采用光学显微镜计算中性多形核白细胞(polymorphonu-clear granulocytes,pmn)的数量。
[0088][0089][0090]
由上表结果可知，本发明获得的含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，创面缩小率为96.2％，pmn在第3d下降至1.33个，crp值在第3d为5.23mg
·
l-1
，组分间相互协同，具有优良的抗感染能力，可快速降低创面组织的炎细胞，并加速创面的收缩和愈合速度，表明本发明选用类贻贝粘蛋白、增韧凝胶材料、霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂、左旋肉碱、氨基酸组合物、透明质酸和薄荷烷甲酰乙胺等组分，优选配比，组分间相互协同，制备的含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，生物活性高、无毒性、性能良好，能够起到有效的防止恢复过程中的微生物感染，可达到充分地保护新生组织的作用，进而促进创面快速愈合。
[0091]
实施例1与对比例1-3相比，表明类贻贝粘蛋白、水飞蓟籽油和山苍子提取物对创面治疗具有一定的愈合和抗炎功效。
[0092]
实施例1与对比例4相比，表明β-植物油和泊洛沙姆组成增韧凝胶材料对创面恢复具有增效作用，能够提高产品的生物相容性、粘弹性和可持续性。
[0093]
实施例8
[0094]
该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下步骤：
[0095]
步骤s1：在类贻贝粘蛋白中加入增韧凝胶材料和水，于50℃、500w超声分散50min，得预分散溶液；
[0096]
步骤s2：将霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂和甘油混合，于35℃搅拌溶解，得油相溶液；
[0097]
步骤s3：将左旋肉碱、氨基酸组合物和透明质酸混合，得水相溶液；
[0098]
步骤s4：将油相溶液和水相溶液混合，以8000r/min均质6-10min后，加入预分散溶液，以200-400r/min搅拌30-50min后，加入薄荷烷甲酰乙胺，混合，得含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料。
[0099]
原料配比和制备方法同实施例1。
[0100]
实施例9
[0101]
该含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，包括以下步骤：
[0102]
步骤s1：将类贻贝粘蛋白、增韧凝胶材料、霍霍巴油、水飞蓟籽油、山苍子提取物、鼠李糖脂和甘油混合，于35℃搅拌溶解，得油相溶液；
[0103]
步骤s2：将左旋肉碱、氨基酸组合物、透明质酸和水混合，得水相溶液；
[0104]
步骤s3：将油相溶液和水相溶液混合，以8000r/min均质8min后，加入薄荷烷甲酰乙胺，混合，得含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料。
[0105]
原料配比和制备方法同实施例1。
[0106]
试验例3保湿性能试验
[0107]
将实施例1、8、9制备的含有类贻贝粘蛋白的再生修复敷料，置于温度25
±
2℃、相对湿度55
±
5％的环境下24h，采用称重法计算保湿率，结果如下表：
[0108]
项目实施例1实施例8实施例9保湿率/％88.685.970.0
[0109]
由上表可知，实施例1、8的保湿率达到85％以上，而实施例9为70％，显著低于实施例1、8，表明本发明先将类贻贝粘蛋白和增韧凝胶材料进行超声分散，得到预分散溶液，再根据原料特性分别制备油相溶液和水相溶液，最后经过均质和二次超声分散，能够增强混合体系的分散稳定性，提高组分的混合均匀度时，提高了系统的分子力学稳定性，进一步提高了保湿性能。
[0110]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。