一种装载IL-33的DNA水凝胶的制备方法及其产品与应用

一种装载il-33的dna水凝胶的制备方法及其产品与应用
技术领域
1.本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种装载il-33的dna水凝胶的制备方法及其产品与应用。


背景技术：

2.皮肤及其深度组织受到损伤后出现离断或缺损会导致伤口的形成，伤口的恢复愈合过程一般称为伤口愈合或创伤愈合，通过伤口处各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成的复杂组合，表现出各种过程的协同作用实现。伤口愈合也就是伤口再生修复的过程，伤口愈合的基本过程包括急性炎症期、细胞增生期、瘢痕形成期和表皮及其他组织再生期。但有些伤口会由于其自身的特殊性，使得伤口持续处于急性炎症期并加重炎症过程，如褥疮/压疮和烧伤/烫伤愈合不良；或作为糖尿病、血管功能不全和免疫缺陷等疾病的并发症等都会导致伤口愈合困难，出现伤口慢性溃疡和继发坏疽，严重时甚至会危及患者的生命。现目前缺少针对伤口愈合困难行之有效的治疗方法，导致伤口愈合困难引起的一系列并发症的发病率和死亡率居高不下，对患者的身心健康造成影响，并给其带来了巨大的经济负担，还给国家和社会造成了巨大的医疗负担。
3.水凝胶是一种高吸水高保水材料，用途较广，在多种技术领域中均有应用，其本身所具有高抗感染力、吸收伤口渗出液、保持伤口处湿润平衡、允许气体交换及装载、保护和输送生物活性分子的能力，其中通过单链dna聚合形成的三维网络为物理交联的dna水凝胶，其没有采用任何化学连接物或是化学修饰，并且具有低细胞毒性、免疫原性和良好的生物相容性等特点，因此dna水凝胶作为理想伤口敷料之一使用的效果更为理想。
4.目前的研究指出，细胞因子免疫治疗在调节免疫系统中具有重要意义，特别是在促进糖尿病等疾病引起的并发症而导致的伤口愈合困难方面发挥了重要作用。其中白介素-33(il-33)被认为能够促进伤口愈合，主要是利用其通过诱导m2巨噬细胞极化和调节性t细胞的增殖来抗炎的特性实现。但是由于白介素-33存在半衰期短和稳定性差的特点导致其在用于皮肤创伤的治疗中效果不尽人如意，限制了其在伤口愈合治疗中的效果。


技术实现要素：

5.鉴于此，本发明目的在于提供一种装载il-33的dna水凝胶的制备方法及其产品与应用，其制备所采用的工艺简单，其产品应用于伤口愈合中时具有缓释、抗氧化及自我降解能力，该产品还能够特别针对于治疗糖尿病等伤口愈合困难的情况。
6.发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
7.s1)备料：包括重组小鼠il-33和如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4及seq id no.5所示的5种单链dna；
8.s2)溶解：将s1)中所述的5种单链dna各自分别溶解于pbs缓冲液中；
9.s3)构建单体：将s2)中通过如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的单链dna分别溶解于pbs缓冲液得到的溶解液混合后得到的混合液依次通过恒温处理、降温处理进行反应得到y单体，将s2)中通过如seq id no.4和seq id no.5所示的单链dna分别溶解于pbs缓冲液得到的溶解液混合后得到的混合液依次通过恒温处理、降温处理进行反应得到l单体；
10.s4)孵育和混合：将s3)中得到的y单体与重组小鼠il-33混合孵育后得到产物a，再将s3)中得到的l单体与重组小鼠il-33混合孵育后得到产物b，然后将产物a和产物b混合。
11.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个具体实施方式，所述s2)中的pbs缓冲液为1xpbs缓冲液。
12.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个优选实施方式，所述pbs缓冲液中添加有1～2mmol/l的mgcl2，所述pbs缓冲液的ph为7.2～8.0，s2)中将所述的5种单链dna各自分别溶解于pbs缓冲液后其最终浓度均为1～2mmol/l。
13.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个进一步的实施方式，所述s3)中的恒温处理均为：将混合液在95℃的条件下静置1～3min；所述s3)中的降温处理均为：将恒温处理后的混合液在95℃的条件下，每0.06s降低0.1℃，直至温度降低至25℃，然后将得到的y单体和l单体进行贮存，贮存温度为4～8℃。
14.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个进一步的实施方式，所述通过如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的单链dna分别溶解于pbs缓冲液得到的溶解液混合后得到的混合液的浓度为250～300μmol/l，所述通过如seq id no.4和seq id no.5所示的单链dna分别溶解于pbs缓冲液得到的溶解液混合后得到的混合液的浓度为375～500μmol/l。
15.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个进一步的实施方式，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法或液相色谱-质谱联用的测定方法对s3)中构建的y单体或/和l单体进行处理，用于判断y单体或/和l单体是否构建成功。
16.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个进一步的实施方式，所述s3)中y单体的浓度与l单体的浓度比为2:3，所述s4)中y单体与小鼠il-33的体积比为24:1，l单体与小鼠il-33的体积比为24:1。
17.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个进一步的实施方式，所述s1)中重组小鼠il-33的浓度为0.5～1ng/μl。
18.根据本发明一种装载白介素il-33的dna水凝胶的制备方法的一个进一步的实施方式，所述s4)中在20～30℃的条件下将产物a和产物b通过摇床振荡1min～2min混合。
19.本发明还提供一种装载il-33的dna水凝胶，所述装载il-33的dna水凝胶通过上述的制备方法得到。
20.本发明还提供一种装载il-33的dna水凝胶在伤口治疗中的应用，所述装载il-33的dna水凝胶通过上述的制备方法得到。
21.与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
22.a)本发明的工艺简单，得到的装载il-33的dna水凝胶对il-33具有缓释作用，能够改善il-33本身半衰期短和稳定性差的特性，一次用药就能够长期保持伤口处il-33的浓度，以满足持续抗炎并促进伤口愈合的条件，减少了上药周期，提高了一次用药所能够达到
id no.4及seq id no.5所示的5种单链dna，所述重组小鼠il-33的浓度为0.5ng/μl；
38.s2)溶解：将s1)中所述的5种单链dna各自分别溶解于1xpbs缓冲液中，得到的溶解液的最终浓度均为1mmol/l，该1xpbs缓冲液中添加有1mmol/l的mgcl2，所述1xpbs缓冲液的ph为7.2；
39.s3)构建单体：将s2)中通过如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的单链dna分别溶解于s2)中所述的1xpbs缓冲液得到的溶解液混合后得到浓度为250μmol/l的混合液先通过恒温处理，即将混合液在95℃的条件下静置2min，然后再通过降温处理，即将恒温处理后的混合液在95℃的条件下，每0.06s降低0.1℃，共计进行700次之后将温度降低至25℃得到y单体，所述y单体的浓度为160μmol/l；将s2)中通过如seq id no.4和seq id no.5所示的单链dna分别溶解于s2)中所述的1xpbs缓冲液得到的溶解液混合后得到浓度为375μmol/l的混合液先通过恒温处理，即将混合液在95℃的条件下静置1min，然后再通过降温处理，即将恒温处理后的混合液在95℃的条件下，每0.06s降低0.1℃，共计进行700次之后将温度降低至25℃得到l单体，所述l单体的浓度为240μmol/l，然后将得到的y单体和l单体在4℃的条件下进行贮存；
40.s4)通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法或液相色谱-质谱联用的测定方法判断y单体或/和l单体是否构建成功；
41.s5)孵育和混合：将s3)中得到的y单体与重组小鼠il-33在20℃的条件下混合孵育后得到产物a，其中需要24μl的y单体和1μl的il-33；再将s3)中得到的l单体与重组小鼠il-33在20℃的条件下混合孵育后得到产物b，其中需要24μl的l单体和1μl的il-33，然后将产物a和产物b通过摇床在20℃的条件下振荡1min混合。
42.实施例2
43.参见图1。本实施例中所描述的一种装载il-33的dna水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
44.s1)备料：包括重组小鼠il-33和如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4及seq id no.5所示的5种单链dna，所述重组小鼠il-33的浓度为1ng/μl；
45.s2)溶解：将s1)中所述的5种单链dna各自分别溶解于1xpbs缓冲液中，得到的溶解液的最终浓度均为2mmol/l，该1xpbs缓冲液中添加有2mmol/l的mgcl2，所述1xpbs缓冲液的ph为8.0；
46.s3)构建单体：将s2)中通过如seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示的单链dna分别溶解于s2)中所述的1xpbs缓冲液得到的溶解液混合后得到浓度为300μmol/l的混合液先通过恒温处理，即将混合液在95℃的条件下静置3min，然后再通过降温处理，即将恒温处理后的混合液在95℃的条件下，每0.06s降低0.1℃，共计进行700次之后将温度降低至25℃得到y单体，所述y单体的浓度为180μmol/l；将s2)中通过如seq id no.4和seq id no.5所示的单链dna分别溶解于s2)中所述的1xpbs缓冲液得到的溶解液混合后得到浓度为500μmol/l的混合液先通过恒温处理，即将混合液在95℃的条件下静置3min，然后再通过降温处理，即将恒温处理后的混合液在95℃的条件下，每0.06s降低0.1℃，共计进行700次之后将温度降低至25℃得到l单体，所述l单体的浓度为270μmol/l，然后将得到的y单体和l单体在8℃的条件下进行贮存；
47.s4)通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法或液相色谱-质谱联用的测定方法判断y单
体或/和l单体是否构建成功；
48.s5)孵育和混合：将s3)中得到的y单体与重组小鼠il-33在30℃的条件下混合孵育后得到产物a，其中需要24μl的y单体和1μl的il-33；再将s3)中得到的l单体与重组小鼠il-33在30℃的条件下混合孵育后得到产物b，其中需要24μl的l单体和1μl的il-33，然后将产物a和产物b通过摇床在30℃的条件下振荡2min混合。
49.实施例3
50.本实施例中所描述的一种非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法，用于判断实施例1中s3)中所述的y单体和l单体是否构建成功，其步骤包括：
51.a)配制page胶电泳缓冲液；
52.b)配制非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳所需的分离胶和浓缩胶；
53.c)进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
54.d)分析电泳结果，根据一般的标准分析方法判断y单体和l单体是否构建成功。
55.实施例4
56.本实施例中所描述的一种液相色谱-质谱联用的测定方法，用于判断实施例1中s3)中所述的y单体和l单体是否构建成功，通过液相色谱-质谱联用仪对y单体和l单体进行处理，根据一般的标准分析方法对处理结果进行分析，以此判断y单体和l单体是否构建成功。
57.实施例5
58.本实施例中所描述的一种装载il-33的dna水凝胶，通过实施例1中所述的制备方法得到。
59.实施例6
60.参见图6。本实施例中所描述的一种装载il-33的dna水凝胶在伤口治疗中的应用，并且能够特别针对用于糖尿病患者伤口愈合的治疗，本实施例中所述的装载il-33的dna水凝胶通过实施例1中所述的制备方法得到。
61.实施例7
62.本实施例中所描述的一种转载il-33的dna水凝胶对糖尿病小鼠全层伤口的愈合实验，本实验中所得数据为6组独立实验所得结果的平均值
±
sem，包括：
63.(a)空白组、水凝胶组、il-33组及装载il-33的dna水凝胶组在第0、3、7、14天的代表性伤口照片；
64.(b)空白组、水凝胶组、il-33组及装载il-33的dna水凝胶组在第0、3、7、14天的伤口愈合轨迹图；
65.(c)空白组、水凝胶组、il-33组及装载il-33的dna水凝胶组在第0、3、7、14天的伤口愈合率分析比较结果；
66.(d)空白组、水凝胶组、il-33组及装载il-33的dna水凝胶组在he染色下观察到的各组新生肉芽组织切片，其中箭头长度表示肉芽组织的厚度，图中的比例尺为200μm；
67.(e)空白组、水凝胶组、il-33组及装载il-33的dna水凝胶组在第14天的肉芽组织的厚度定量分析结果。
68.根据实验结果来看，在(a)中，装载il-33的dna水凝胶组在第7天和第14天时对糖尿病小鼠的伤口治疗效果明显优于空白组、水凝胶组和il-33组；在(b)中，装载il-33的dna
水凝胶组对糖尿病小鼠的伤口治疗时其伤口愈合轨迹在第0、3、7、14天时均有较好的治愈效果；在(c)中，第7天时空白组与装载il-33的dna水凝胶组和第14天时空白组与装载il-33的dna水凝胶组的伤口愈合率分析比较结果的显著性水平均为***p《0.001，第7天时水凝胶组与装载il-33的dna水凝胶组、第7天时il-33组与装载il-33的dna水凝胶组、第14天时水凝胶组与装载il-33的dna水凝胶组和第14天时il-33组与装载il-33的dna水凝胶组的伤口愈合率分析比较结果的显著性水平均为**p《0.01；在(d)中，装载il-33的dna水凝胶组中肉芽组织的厚度最大；在(e)中，空白组与il-33的dna水凝胶组、水凝胶组与il-33的dna水凝胶组、il-33组与il-33的dna水凝胶组在第14天的肉芽组织的厚度定量分析结果的显著性水平均为***p《0.001。
69.从本实验得出，装载il-33的dna水凝胶组对糖尿病小鼠的伤口各方面的治愈能力和治愈效果要优于空白组、水凝胶组和il-33组。
70.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。