1,5-脱水山梨醇在制备治疗和预防SARS-CoV-2病毒所致疾病药物中的应用

1,5-脱水山梨醇在制备治疗和预防sars-cov-2病毒所致疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及化合物1,5-脱水山梨醇在制备治疗和预防sars-cov-2病毒所致疾病药物中的应用。


背景技术：

2.新冠病毒疫情在全球大流行，已成为一个严重的公共健康问题，目前还没有特效药物。虽然已有疫苗进行接种，但是由于病毒持续的突变，导致疫苗的保护能力不够理想。
3.目前急需研发能够治疗sars-cov-2病毒所致疾病的药物。发明人发现1,5-脱水山梨醇(1,5-anhydro-d-glucitol；1,5ag)对sars-cov-2感染具有强烈的抑制作用，有可能能成为治疗sars-cov-2感染的候选药物。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何制备预防和/或治疗sars-cov-2病毒所致疾病或sars-cov-2病毒感染的药物，和/或如何制备sars-cov-2病毒抑制剂。
5.为了解决以上技术问题，本发明的第一个目的是提供1,5-脱水山梨醇的下述任一种应用：
6.u1、1,5-脱水山梨醇在制备预防和/或治疗sars-cov-2病毒所致疾病或sars-cov-2病毒感染的药物中的应用；
7.u2、1,5-脱水山梨醇在制备sars-cov-2病毒抑制剂中的应用。
8.上述应用中，所述sars-cov-2病毒所致疾病可为呼吸系统感染和/或消化系统感染。所述呼吸系统感染为呼吸道感染和/或肺部感染，所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎，所述肺部感染可为肺炎。所述消化系统感染可为腹泻。sars-cov-2病毒感染的患者表现出非典型病毒性肺炎症状，特征为高烧，呼吸困难，淋巴细胞减少，胸片可见肺部阴影进展迅速，病毒会引起细胞因子风暴导致急性肺损伤，重症患者出现急性呼吸窘迫综合征，甚至呼吸衰竭。
9.本发明的第二个目的是提供1,5-脱水山梨醇在制备抑制sars-cov-2病毒增殖或复制产品中的应用。
10.本发明的第三个目的是提供1,5-脱水山梨醇在制备抑制动物个体、动物器官、动物组织或动物细胞中sars-cov-2病毒增殖或复制产品中的应用。
11.上述应用中，所述动物为哺乳动物。
12.上述应用中，所述细胞为人或非洲绿猴细胞。所述细胞可为vero细胞、caco-2细胞或ace2-293t细胞。
13.本发明还提供sars-cov-2病毒抑制剂，所述sars-cov-2病毒抑制剂的活性成分含有1,5-脱水山梨醇。
14.所述sars-cov-2病毒抑制剂可只为1,5-脱水山梨醇，也可还含有载体或赋形剂。
15.这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中具体的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
16.本发明通过对1,5-脱水山梨醇分别在vero细胞、caco-2细胞、ace2-293t细胞中对sars-cov-2病毒的抑制效果的研究，发现了1,5-脱水山梨醇可作为sars-cov-2病毒感染的防治候选药物。本发明对感染sars-cov-2病毒的治疗具有应用价值。
附图说明
17.图1为实施例1中1,5-脱水山梨醇在vero细胞抑制sars-cov-2病毒复制结果图。数据为平均值
±
标准差，重复数为6，图中**的含义为与1,5-脱水山梨醇处理浓度为0μm的mock相比，差异极显著(p《0.01)。
18.图2为实施例2中1,5-脱水山梨醇抑制sars-cov-2病毒增殖的结果图。
19.图3为实施例3中1,5-脱水山梨醇半抑制浓度测定结果图，数据为平均值
±
标准差，重复数为3。
20.图4为实施例4中1,5-脱水山梨醇在caco-2细胞抑制sars-cov-2病毒复制结果图。
数据为平均值
±
标准差，重复数为6，图中*的含义为差异显著(p《0.05)，**的含义为差异极显著(p《0.01)。
21.图5为实施例5中1,5-脱水山梨醇在ace2-293t细胞抑制sars-cov-2病毒复制结果图。数据为平均值
±
标准差，重复数为6，图中**的含义为差异极显著(p《0.01)。
具体实施方式
22.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
23.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
24.sars-cov-2病毒来自深圳市疾病预防控制中心，编号为shenzhen03，记载于非专利文献“genomic epidemiology of sars-cov-2in guangdong province,china.cell.2020；181(5):997-1003.e9.”。公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
25.vero细胞为非洲绿猴肾细胞系，记载于非专利文献“flavivirus ns1 protein in infected host sera enhances viral acquisition by mosquitoes.nature microbiology,2016,1(9):16087”。公众可从清华大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
26.caco-2细胞为结肠癌细胞系，记载于非专利文献“proteomics of sars-cov-2-infected host cells reveals therapy targets.nature.2020jul；583(7816):469-472”。公众可从清华大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
27.ace2-293t细胞为稳定整合ace2受体的293t细胞系，记载于非专利文献“sars-cov-2cell entry depends on ace2 and tmprss2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.cell.2020apr 16；181(2):271-280.e8”。公众可从清华大学获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
28.1,5-脱水山梨醇(货号：m1203)为apexbio公司产品，cas化学号：154-58-5。
29.下述实施例中添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的dmem完全培养基是以dmem培养基为基础培养基，添加fbs(胎牛血清)、链霉素和青霉素的培养基，在该培养基中fbs的含量为10％(体积百分含量)，链霉素的浓度为100mg/ml，青霉素的浓度为100u/ml。dmem培养基(货号12100046)为invitrogen公司产品。
30.下述实施例中终浓度为1％低熔点琼脂糖的含2％血清的dmem培养基是以dmem培养基为基础培养基，添加低熔点琼脂糖和血清，在该培养基中低熔点琼脂糖的含量为1％(体积百分含量)，血清的含量为2％(体积百分含量)。
31.下述实施例中添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的rpmi1640完全培养基是以rpmi1640完全培养基为基础培养基，添加fbs(胎牛血清)、链霉素和青霉素的培养基，在该培养基中fbs的含量为10％(体积百分含量)，链霉素的浓度为100mg/ml，青霉素的浓度为100u/ml。rpmi1640(货号：21875034)为invitrogen公司产品。
32.下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的所有数据均采用graphpad\prism 7软件student’s t-test进行显著性分析。
33.实施例1：1,5-脱水山梨醇在vero细胞抑制sars-cov-2病毒复制
34.本实施例研究1,5-脱水山梨醇在vero细胞中对sars-cov-2病毒复制的影响，1,5-脱水山梨醇设置0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)共5个浓度梯度的处理，具体步骤如下：
35.(1)在37℃，5％co2的恒温培养箱中培养vero细胞系，培养基用添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的dmem完全培养基。将生长状态良好的vero细胞种于48孔板中，细胞密度为1
×
104个/ml。
36.(2)感染病毒之前提前1h在各孔加入200μl的1,5-脱水山梨醇溶液，使1,5-脱水山梨醇在mock中的终浓度为0μm，在处理一中的终浓度为100μm、在处理二中的终浓度为200μm、在处理三中的终浓度为300μm、在处理四中的终浓度为400μm。
37.(3)将sars-cov-2病毒按0.0001m.o.i.接种到vero细胞中，相应浓度的dmso(二甲基亚砜)作为对照，37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育2h。每个浓度的处理和每个浓度的对照均设置6个重复。
38.(4)去掉细胞上清，用pbs缓冲液冲洗细胞三次，最后一次时吸干残留的pbs。加入400μl的1,5-脱水山梨醇溶液，浓度分别为0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)。37℃，5％co2的恒温培养箱中继续培养40h。
39.(5)去掉细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，每孔加入400μl ri溶液(公司：axygen,货号ap-mn-ms-rna-250)，充分裂解细胞后，转移到1.5ml离心管中，-80℃冻存。
40.(6)取冻存的样品，用rna提取试剂盒(货号ap-mn-ms-rna-250，axygen公司产品)提取rna并用反转录试剂盒(bio-rad公司产品)将rna反转录为cdna。
41.(7)利用sybr green qpcr技术检测样品中的病毒载量，gapdh值作为内参。
42.用于检测sars-cov-2的引物对如下：
43.上游引物：5
’‑
agaagattggttagatgatgatagt-3’(如序列表序列1所示)；
44.下游引物：5
’‑
ttccatctctaattgaggttgaacc-3’(如序列表序列2所示)。
45.用于检测gapdh基因的引物对如下：
46.上游引物：5
’‑
agcctcaagatcatcagcaatg-3’(如序列表序列3所示)；
47.下游引物：5
’‑
atggactgtggtcatgagtcctt-3’(如序列表序列4所示)。
48.结果如图1所示：与对照组相比，加入1,5-脱水山梨醇的vero细胞病毒载量明显下降，且呈现剂量依赖性。
49.实施例2：1,5-脱水山梨醇抑制sars-cov-2病毒增殖(免疫荧光)
50.本实施例研究1,5-脱水山梨醇在vero细胞中对sars-cov-2病毒增殖的影响，1,5-脱水山梨醇设置0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)共5个浓度梯度的处理，具体步骤如下：
51.(1)预先将洗干净灭菌的玻片置于24孔板内，每孔加入1ml添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的dmem完全培养基。接种vero细胞0.5-2
×
103个，使其在感染时完全贴壁，且细胞密度达50～60％。在37℃，5％co2的恒温培养箱中培养vero细胞。
52.(2)感染病毒之前提前1h在各孔加入200μl的1，5-脱水山梨醇溶液，使1，5-脱水山梨醇在mock中的终浓度为0μm，在处理一中的终浓度为100μm、在处理二中的终浓度为200μm、在处理三中的终浓度为300μm、在处理四中的终浓度为400μm。
53.(3)将sars-cov-2病毒按0.0001m.o.i.接种到vero细胞中，相应浓度的dmso(二甲基亚砜)作为对照，37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育2h。每个浓度的处理和每个浓度的对照均设置3个重复。
54.(4)去掉细胞上清，用pbs缓冲液冲洗细胞三次，最后一次时吸干残留的pbs。加入400μl的1,5-脱水山梨醇溶液，浓度分别为0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)的1,5-脱水山梨醇溶液，继续培养40h。
55.(5)去掉细胞上清，用pbs洗3遍，向24孔板加入1ml的4％新鲜配制的多聚甲醛作为固定液，常温固定60min。去固定液，用洗涤液洗3次，每次3-5min，吸尽液体。
56.(6)用2ml封闭液(bd,51-2091kz)封闭15min，可以在摇床上轻微摇动。去封闭液，用洗涤液洗3次，每次3-5min，吸尽液体。
57.(7)加入一抗(anti-sars-cov-2nucleocapsid，abcam公司产品，货号ab272852)孵育2h，用pbst洗3遍，去上清，用pbst洗3遍，加入cy3标记的二抗(invitrogen公司产品，货号a-11003)和dapi(abcam公司产品，货号ab228549)，37℃孵育1h。
58.(8)吸弃上清，加入pbst洗3次，每次3-5min，吸尽液体。将盖玻片取出置于干净纸巾上，加20μl抗淬灭剂于载玻片上，将玻片细胞面朝下，放置于避免气泡产生。等玻片周围干燥后，在玻片边缘加20μl中性树胶封片，将玻片放置于荧光显微镜下观察，并拍照。
59.结果如图2所示：加入了1,5-脱水山梨醇的实验组发荧光的细胞数量明显少于对照组。
60.实施例3：1,5-脱水山梨醇半抑制浓度(ic
50
)测定
61.本实施例测定1,5-脱水山梨醇半抑制浓度(ic
50
)，1,5-脱水山梨醇设置400μm，300μm，200μm，100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm，3.125μm共9个浓度梯度，具体步骤如下：
62.(1)将1,5-脱水山梨醇分别配制成400μm，300μm，200μm，100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm，3.125μm的溶液。
63.(2)在37℃，5％co2的恒温培养箱中培养vero细胞系，培养基用添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的dmem完全培养基。将生长状态良好的vero细胞种于48孔板中，细胞密度为1
×
104个/ml。
64.(3)感染病毒之前提前1h在各孔加入200μl的1,5-脱水山梨醇溶液，使1,5-脱水山梨醇的终浓度分别为400μm，300μm，200μm，100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm，3.125μm。
65.(4)将sars-cov-2病毒按0.0001m.o.i.接种到细胞中，相应浓度的dmso作为对照，37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育2h。每个浓度的处理和每个浓度的对照均设置3个重复。
66.(6)去掉细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，最后一次时吸干残留的pbs。各浓度的处理加入上述步骤(1)配好的对应浓度的1,5-脱水山梨醇溶液，继续培养40h。细胞上清转移到1.5ml离心管中，-80℃冻存。
67.(7)将生长状态良好的vero细胞种于6孔板中，细胞密度为4.5
×
105/ml，培养基用添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的dmem完全培养基。37℃，5％co2培养箱培养过夜。
68.(8)将上述步骤(6)得到的细胞上清分别稀释100倍，1000倍，10000倍，加入6孔板，与vero细胞于37℃孵育2小时。
69.(9)去掉细胞上清，并用pbs洗一遍，每孔加入2.5ml配好的终浓度为1％低熔点琼脂糖的含2％血清的dmem培养基，并将孔板室温放置20分钟，让凝胶培养基充分凝固。
70.(10)将凝固后的6孔板放回37℃，5％co2培养箱中继续培养3-4天。通过显微镜观测，有明显细胞裂解的空斑形成时，在每孔中加入1ml 4％的甲醛溶液，室温固定1小时。
71.(11)待细胞固定好后，抠出板孔中的凝胶，用水洗掉剩余的甲醛溶液，再向每孔中加入500μl 1％的结晶紫溶液，室温染色5分钟。
72.(12)弃去结晶紫染料，用水反复冲掉剩余的结晶紫，在吸水纸上扣干多于水分，正面放置晾干。
73.计算、数每孔中的的空斑数量。使用graphpad\prism 7软件进行ic50作图和分析。结果见图3：ic
50
＝27.44μm。
74.实施例4：1,5-脱水山梨醇在caco-2细胞抑制sars-cov-2病毒复制
75.本实施例研究1,5-脱水山梨醇在caco-2细胞中对sars-cov-2病毒复制的影响，1,5-脱水山梨醇设置0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)共5个浓度梯度的处理，具体步骤如下：
76.(1)在37℃，5％co2的恒温培养箱中培养caco-2细胞系，培养基用添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的rpmi1640完全培养基。将生长状态良好的caco-2细胞种于48孔板中，caco-2细胞密度为1
×
104/ml。
77.(2)感染病毒之前提前1h加入200μl的1,5-脱水山梨醇溶液，使1,5-脱水山梨醇在mock中的终浓度为0μm，在处理一中的终浓度为100μm、在处理二中的终浓度为200μm、在处理三中的终浓度为300μm、在处理四中的终浓度为400μm。
78.(3)将sars-cov-2病毒按0.0001m.o.i接种到细胞中，相应浓度的dmso作为对照，37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育2h。每个浓度的处理和每个浓度的对照均设置6个重复。
79.(4)去掉细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，最后一次时吸干残留的pbs。加入400μl的1,5-脱水山梨醇溶液，浓度分别为0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)。37℃，5％co2的恒温培养箱中继续培养40h。
80.(5)去掉细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，每孔加入400μl ri溶液，充分裂解细胞后，转移到1.5ml离心管中，-80℃冻存。
81.(6)取冻存的样品，用rna提取试剂盒(货号ap-mn-ms-rna-250，axygen公司产品)提取rna并用反转录试剂盒(bio-rad公司产品)将rna反转录为cdna。
82.(7)利用sybr green qpcr技术检测样品中的病毒载量，gapdh值作为内参。
83.用于检测sars-cov-2的引物对如下：
84.上游引物：5
’‑
agaagattggttagatgatgatagt-3’(如序列表序列1所示)；
85.下游引物：5
’‑
ttccatctctaattgaggttgaacc-3’(如序列表序列2所示)。
86.用于检测gapdh基因的引物对如下：
87.上游引物：5
’‑
agcctcaagatcatcagcaatg-3’(如序列表序列3所示)；
88.下游引物：5
’‑
atggactgtggtcatgagtcctt-3’(如序列表序列4所示)。
89.结果如图4所示：与对照组相比，加入1,5-脱水山梨醇的caco-2细胞病毒载量明显
下降。
90.实施例5：1,5-脱水山梨醇在ace2-293t细胞抑制sars-cov-2病毒复制
91.本实施例研究1,5-脱水山梨醇在ace2-293t细胞中对sars-cov-2病毒复制的影响，1,5-脱水山梨醇设置0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)共5个浓度梯度的处理，具体步骤如下：
92.(1)在37℃，5％co2的恒温培养箱中培养ace2-293t细胞系，培养基用添加10％fbs及100mg/ml链霉素和100u/ml青霉素的dmem完全培养基。将生长状态良好的ace2-293t细胞种于48孔板中，细胞密度为1
×
104/ml。
93.(2)感染病毒之前提前1h在各孔加入200μl的1,5-脱水山梨醇溶液，使1,5-脱水山梨醇在mock中的终浓度为0μm，在处理一中的终浓度为100μm、在处理二中的终浓度为200μm、在处理三中的终浓度为300μm、在处理四中的终浓度为400μm。
94.(3)将sars-cov-2病毒按0.0001m.o.i接种到ace2-293t细胞中，相应浓度的dmso作为对照，37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育2h。每个浓度的处理和每个浓度的对照均设置6个重复。
95.(4)去掉细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，最后一次时吸干残留的pbs。加入400μl的1,5-脱水山梨醇溶液，浓度分别为0μm(mock)、100μm(处理一)、200μm(处理二)、300μm(处理三)、400μm(处理四)。37℃，5％co2的恒温培养箱中继续培养40h。
96.(5)去掉细胞上清，用pbs冲洗细胞三次，每孔加入400μl ri溶液，充分裂解细胞后，转移到1.5ml离心管中，-80℃冻存。
97.(6)取冻存的样品，用rna提取试剂盒(货号ap-mn-ms-rna-250，axygen公司产品)提取rna并用反转录试剂盒(bio-rad公司产品)将rna反转录为cdna。
98.(7)利用sybr green qpcr技术检测样品中的病毒载量，gapdh值作为内参。
99.用于检测sars-cov-2的引物对如下：
100.上游引物：5
’‑
agaagattggttagatgatgatagt-3’(如序列表序列1所示)；
101.下游引物：5
’‑
ttccatctctaattgaggttgaacc-3’(如序列表序列2所示)。
102.用于检测gapdh基因的引物对如下：
103.上游引物：5
’‑
agcctcaagatcatcagcaatg-3’(如序列表序列3所示)；
104.下游引物：5
’‑
atggactgtggtcatgagtcctt-3’(如序列表序列4所示)。
105.结果如图5所示：与对照组相比，加入1,5-脱水山梨醇的ace2-293t细胞病毒载量明显下降，且呈现剂量依赖性。
106.上述对1,5-脱水山梨醇分别在vero细胞、caco-2细胞、ace2-293t细胞中对sars-cov-2病毒的抑制效果的研究，表明1,5-脱水山梨醇可作为sars-cov-2病毒感染的防治候选药物。本发明对感染sars-cov-2病毒的治疗具有应用价值。
107.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。