可用于diva的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒
技术领域
1.本发明主要涉及生物检测技术领域。具体而言，本发明涉及一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于区分猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪只和猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
背景技术：
2.猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)引起的猪严重传染病，是我国农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》规定的二类动物疫病。
3.猪圆环病毒pcv是迄今发现的最小的动物病毒，其基因组为单股负链环状dna分子，现已知其有两个血清型，即pcv1和pcv2，pcv1为非致病性的病毒，pcv2为致病性的病毒。pcv2感染猪只后可造成仔猪断奶后多系统衰竭综合征(pmws)、母猪繁殖障碍、育肥猪的呼吸道疾病、猪皮炎和肾病综合征及猪的先天性震颤等严重疾病。
4.当前，我国主要采用接种各种类型的pcv疫苗(主要有pcv2灭活疫苗、pcv2病毒样颗粒疫苗、pcv2 cap蛋白亚单位疫苗)来预防和控制猪圆环病毒病，即免疫无疫(接种疫苗的条件下没有疫情爆发)。但是，免疫无疫是动物疫病防控的初级阶段，动物疫病防控的高级阶段是非免疫无疫(未接种疫苗的条件下没有疫情爆发)。所述非免疫无疫的实现要求指定区域内(包括宿主动物和环境)不存在致病病原体，这可通过动物疫病净化来实现。
5.所谓动物疫病净化是指在一定区域对携带某种动物疫病病原体的动物有计划地实施消灭，从而消灭该动物疫病病原体，以达到该区域内动物个体不发病和无感染的状态。
6.2021年10月，我国农业农村部于发布了《农业农村部关于推进动物疫病净化工作的意见》，该《意见》明确，我国将在当前和今后一段时期内，对一系列重大动物疫病开展净化。
7.动物疫病净化的一个关键步骤是通过diva(differentiating infected from vaccinated animals)，从免疫群体中区分出野毒感染的个体，进行扑杀，从而从群体中清除致病病原体。
8.通常，可通过抗体检测来进行diva。pcv2的cap蛋白是pcv2的主要免疫原，也是目前普遍采用的用于检测pcv2抗体的生物探针(抗原)。但是对于猪圆环病毒病使用cap蛋白亚单位疫苗进行免疫防控的动物疫病而言，因为cap蛋白亚单位疫苗与野毒活病毒在结构上都包含cap蛋白、且cap蛋白是主要免疫原，导致它们在动物体内诱发的抗体模式相近，使用pcv2的cap蛋白作为生物探针无法进行区分。
9.因此，如何开发在使用cap蛋白亚单位疫苗进行免疫的情况下也能进行猪圆环病毒病(pcv2)的diva的抗体检测试剂盒，是猪圆环病毒病净化工作中面临的一个重要课题。
技术实现要素：
10.抗原表位是蛋白抗原中与抗体结合的区域，一个蛋白抗原中可能存在多个抗原表位。抗原表位肽是包含抗原表位的多肽，可通过人工合成获得，抗原表位肽也可以用于检测
能够与之结合的抗体。
11.发明人经过深入研究，找到了一组来自猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，pcv2)cap蛋白(capsid protein)的抗原表位肽，其对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪生物样本的响应在免疫后73天左右会消失，而此后如感染pcv2野毒则响应会再次出现，因此能够用于针对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群进行diva。
12.即，本发明包括：
13.1.一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其包含抗体检测芯片，
14.所述抗体检测芯片包含固相载体，以及分别固定在所述固相载体上的seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4所示的多肽。
15.seq id no：1(mmrfnindflppgggsnp)；
16.seq id no：2(tkataltydpyvnyssrh)；
17.seq id no：3(ftpkpvldstidyfqpnnk)；
18.seq id no：4(refnlkdpplnp)。
19.2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于检测猪来源的生物样本中的猪圆环病毒2型抗体。这里，所述生物样本只要包含猪圆环病毒2型抗体即可，可以是例如全血、血浆、血清。
20.3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于区分猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪只和猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
21.4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于从猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群中区分出猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。这里，所述猪圆环病毒2型野毒感染的猪只包括猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫失败而被猪圆环病毒2型野毒感染的猪只，也包括猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫成功但仍被猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
22.5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其中，所述固相载体上还固定有猪圆环病毒2型的cap蛋白。
23.6.抗体检测芯片在制备猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒中的用途，
24.所述抗体检测芯片包含固相载体，以及分别固定在所述固相载体上的seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4所示的多肽。
25.7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒用于检测猪来源的生物样本中的猪圆环病毒2型抗体。
26.8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒用于区分猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪只和猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
27.9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒用于从猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群中区分出猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
28.10.根据权利要求6所述的用途，其中，所述固相载体上还固定有猪圆环病毒2型的cap蛋白。
具体实施方式
29.pcv2的全长cap蛋白是目前普遍采用的用于检测pcv2抗体的抗原，现有研究表明，
其对于pcv2野毒感染和各种类型的pcv2疫苗免疫引起的抗体都有响应，且响应模式基本相同。因此，pcv2的全长cap蛋白不能用于pcv2的diva。
30.发明人经过深入研究，发现一组来自pcv2的cap蛋白的抗原表位肽对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫引起的抗体的响应模式与pcv2的全长cap蛋白的响应模式显著不同。具体而言，pcv2的全长cap蛋白对pcv2cap蛋白亚单位疫苗免疫引起的抗体持续有响应(响应持续到免疫后至少100天以上)，而这组抗原表位肽对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫引起的抗体的响应在免疫后73天左右就会消失。因此，这组抗原表位肽可以用作区分pcv2野毒感染和pcv2cap蛋白亚单位疫苗免疫的工具。即，对于用pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群，可在免疫后持续用本发明的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体监测，如在免疫约73天后的任意时间点检出猪圆环病毒2型抗体，则表示该猪只已被猪圆环病毒2型野毒感染。
31.在本说明书中，“响应”是指snr大于或等于2，所述snr(信噪比)＝(抗原点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。当所述seq id no：1～4的抗原表位多肽点中有两个或两个以上有响应时，判定为检出pcv2抗体；否则，判定为未检出pcv2抗体。
32.实施例1.多肽的制备与确认
33.seq id no：1～4的多肽由金斯瑞生物合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
34.seq id no：1(mmrfnindflppgggsnp)；
35.seq id no：2(tkataltydpyvnyssrh)；
36.seq id no：3(ftpkpvldstidyfqpnnk)；
37.seq id no：4(refnlkdpplnp)。
38.实施例2.抗体检测芯片(试剂盒)的制备
39.采用常规方法在常规的elisa用固相载体上分别点样上述seq id no：1～4所示的多肽的溶液，另外点样一个猪igg作为阳性质控点以及一个pb缓冲液点作为阴性质控点，制备了抗体检测芯片。
40.相应地，制备了猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其除了包含所述抗体检测芯片外，还包含浓缩清洗液、样本稀释液、酶标抗体溶液、发光底物液等用于进行抗体检测的试剂。
41.实施例3.用试剂盒进行抗体检测
42.检测步骤
43.(1)用纯化水将20
×
浓缩清洗液(tbst：0.4m tris-hcl，2.74m nacl，2％tween20，ph7.2
±
0.2)按1:20进行稀释，得到清洗液。为使检测芯片表面完全浸润，用移液枪将约100μl清洗液加到检测芯片表面，并浸泡检测芯片一定时间。
44.(2)用样本稀释液(0.05mpbs，1％bsa，0.2％pvp，0.5％tween20，ph7.2
±
0.2)将待检血清样本按照1:1000稀释。
45.(3)对于弃去了清洗液的检测芯片，在表面完全湿润的状态下，吸取100μl稀释后的血清样本加入到检测芯片上。
46.(4)在恒温摇床中以500转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为37摄氏度。
47.(5)弃去血清样本，用清洗液清洗检测芯片的表面。
48.(6)清洗后，在检测芯片上加入100μl的酶标抗体溶液(兔抗猪igg-hrp，sigma，
a5420)，在恒温摇床中以500转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为37摄氏度。
49.(7)弃去酶标抗体溶液，用清洗液将检测芯片表面清洗干净。
50.(8)清洗完成后，在检测芯片表面上均匀铺展20μl的发光底物液(thermo，prod#37074)。
51.(9)将用凝胶成像仪对检测芯片进行化学发光成像，并判定结果。
52.(10)结果判定：
53.对于每一份血清，抗体检测芯片上抗原表位多肽点的snr大于或等于2时，为有“响应”；否则，为无响应。
54.当所述seq id no：1～4的抗原表位多肽点中有两个或两个以上有响应时，判定为检出pcv2抗体；否则，判定为未检出pcv2抗体。
55.实施例4.抗体检测结果
56.将10头用其它方法确定为pcv2抗体阴性的猪平均分成攻毒组和对照组，两组均用pcv2 cap蛋白亚单位疫苗进行免疫，免疫后第85天，两组均用其它方法确定为pcv2抗体阳性，但使用上述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体检测，均未检出pcv2抗体。
57.完成上述检测后，在免疫后第85天对攻毒组用pcv2野毒进行强攻毒，然后每2天用上述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体检测，在攻毒后的第14天全部检出了pcv2抗体，而且在检出pcv2抗体前后数日通过临床观察确认攻毒组全部感染了pcv2野毒。对照组每2天用上述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体检测，一直未检出pcv2抗体。
技术领域
1.本发明主要涉及生物检测技术领域。具体而言，本发明涉及一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于区分猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪只和猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
背景技术：
2.猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)引起的猪严重传染病，是我国农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》规定的二类动物疫病。
3.猪圆环病毒pcv是迄今发现的最小的动物病毒，其基因组为单股负链环状dna分子，现已知其有两个血清型，即pcv1和pcv2，pcv1为非致病性的病毒，pcv2为致病性的病毒。pcv2感染猪只后可造成仔猪断奶后多系统衰竭综合征(pmws)、母猪繁殖障碍、育肥猪的呼吸道疾病、猪皮炎和肾病综合征及猪的先天性震颤等严重疾病。
4.当前，我国主要采用接种各种类型的pcv疫苗(主要有pcv2灭活疫苗、pcv2病毒样颗粒疫苗、pcv2 cap蛋白亚单位疫苗)来预防和控制猪圆环病毒病，即免疫无疫(接种疫苗的条件下没有疫情爆发)。但是，免疫无疫是动物疫病防控的初级阶段，动物疫病防控的高级阶段是非免疫无疫(未接种疫苗的条件下没有疫情爆发)。所述非免疫无疫的实现要求指定区域内(包括宿主动物和环境)不存在致病病原体，这可通过动物疫病净化来实现。
5.所谓动物疫病净化是指在一定区域对携带某种动物疫病病原体的动物有计划地实施消灭，从而消灭该动物疫病病原体，以达到该区域内动物个体不发病和无感染的状态。
6.2021年10月，我国农业农村部于发布了《农业农村部关于推进动物疫病净化工作的意见》，该《意见》明确，我国将在当前和今后一段时期内，对一系列重大动物疫病开展净化。
7.动物疫病净化的一个关键步骤是通过diva(differentiating infected from vaccinated animals)，从免疫群体中区分出野毒感染的个体，进行扑杀，从而从群体中清除致病病原体。
8.通常，可通过抗体检测来进行diva。pcv2的cap蛋白是pcv2的主要免疫原，也是目前普遍采用的用于检测pcv2抗体的生物探针(抗原)。但是对于猪圆环病毒病使用cap蛋白亚单位疫苗进行免疫防控的动物疫病而言，因为cap蛋白亚单位疫苗与野毒活病毒在结构上都包含cap蛋白、且cap蛋白是主要免疫原，导致它们在动物体内诱发的抗体模式相近，使用pcv2的cap蛋白作为生物探针无法进行区分。
9.因此，如何开发在使用cap蛋白亚单位疫苗进行免疫的情况下也能进行猪圆环病毒病(pcv2)的diva的抗体检测试剂盒，是猪圆环病毒病净化工作中面临的一个重要课题。
技术实现要素：
10.抗原表位是蛋白抗原中与抗体结合的区域，一个蛋白抗原中可能存在多个抗原表位。抗原表位肽是包含抗原表位的多肽，可通过人工合成获得，抗原表位肽也可以用于检测
能够与之结合的抗体。
11.发明人经过深入研究，找到了一组来自猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，pcv2)cap蛋白(capsid protein)的抗原表位肽，其对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪生物样本的响应在免疫后73天左右会消失，而此后如感染pcv2野毒则响应会再次出现，因此能够用于针对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群进行diva。
12.即，本发明包括：
13.1.一种猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其包含抗体检测芯片，
14.所述抗体检测芯片包含固相载体，以及分别固定在所述固相载体上的seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4所示的多肽。
15.seq id no：1(mmrfnindflppgggsnp)；
16.seq id no：2(tkataltydpyvnyssrh)；
17.seq id no：3(ftpkpvldstidyfqpnnk)；
18.seq id no：4(refnlkdpplnp)。
19.2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于检测猪来源的生物样本中的猪圆环病毒2型抗体。这里，所述生物样本只要包含猪圆环病毒2型抗体即可，可以是例如全血、血浆、血清。
20.3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于区分猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪只和猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
21.4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其用于从猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群中区分出猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。这里，所述猪圆环病毒2型野毒感染的猪只包括猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫失败而被猪圆环病毒2型野毒感染的猪只，也包括猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫成功但仍被猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
22.5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其中，所述固相载体上还固定有猪圆环病毒2型的cap蛋白。
23.6.抗体检测芯片在制备猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒中的用途，
24.所述抗体检测芯片包含固相载体，以及分别固定在所述固相载体上的seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3和seq id no：4所示的多肽。
25.7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒用于检测猪来源的生物样本中的猪圆环病毒2型抗体。
26.8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒用于区分猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪只和猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
27.9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒用于从猪圆环病毒2型cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群中区分出猪圆环病毒2型野毒感染的猪只。
28.10.根据权利要求6所述的用途，其中，所述固相载体上还固定有猪圆环病毒2型的cap蛋白。
具体实施方式
29.pcv2的全长cap蛋白是目前普遍采用的用于检测pcv2抗体的抗原，现有研究表明，
其对于pcv2野毒感染和各种类型的pcv2疫苗免疫引起的抗体都有响应，且响应模式基本相同。因此，pcv2的全长cap蛋白不能用于pcv2的diva。
30.发明人经过深入研究，发现一组来自pcv2的cap蛋白的抗原表位肽对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫引起的抗体的响应模式与pcv2的全长cap蛋白的响应模式显著不同。具体而言，pcv2的全长cap蛋白对pcv2cap蛋白亚单位疫苗免疫引起的抗体持续有响应(响应持续到免疫后至少100天以上)，而这组抗原表位肽对pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫引起的抗体的响应在免疫后73天左右就会消失。因此，这组抗原表位肽可以用作区分pcv2野毒感染和pcv2cap蛋白亚单位疫苗免疫的工具。即，对于用pcv2 cap蛋白亚单位疫苗免疫的猪群，可在免疫后持续用本发明的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体监测，如在免疫约73天后的任意时间点检出猪圆环病毒2型抗体，则表示该猪只已被猪圆环病毒2型野毒感染。
31.在本说明书中，“响应”是指snr大于或等于2，所述snr(信噪比)＝(抗原点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。当所述seq id no：1～4的抗原表位多肽点中有两个或两个以上有响应时，判定为检出pcv2抗体；否则，判定为未检出pcv2抗体。
32.实施例1.多肽的制备与确认
33.seq id no：1～4的多肽由金斯瑞生物合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
34.seq id no：1(mmrfnindflppgggsnp)；
35.seq id no：2(tkataltydpyvnyssrh)；
36.seq id no：3(ftpkpvldstidyfqpnnk)；
37.seq id no：4(refnlkdpplnp)。
38.实施例2.抗体检测芯片(试剂盒)的制备
39.采用常规方法在常规的elisa用固相载体上分别点样上述seq id no：1～4所示的多肽的溶液，另外点样一个猪igg作为阳性质控点以及一个pb缓冲液点作为阴性质控点，制备了抗体检测芯片。
40.相应地，制备了猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒，其除了包含所述抗体检测芯片外，还包含浓缩清洗液、样本稀释液、酶标抗体溶液、发光底物液等用于进行抗体检测的试剂。
41.实施例3.用试剂盒进行抗体检测
42.检测步骤
43.(1)用纯化水将20
×
浓缩清洗液(tbst：0.4m tris-hcl，2.74m nacl，2％tween20，ph7.2
±
0.2)按1:20进行稀释，得到清洗液。为使检测芯片表面完全浸润，用移液枪将约100μl清洗液加到检测芯片表面，并浸泡检测芯片一定时间。
44.(2)用样本稀释液(0.05mpbs，1％bsa，0.2％pvp，0.5％tween20，ph7.2
±
0.2)将待检血清样本按照1:1000稀释。
45.(3)对于弃去了清洗液的检测芯片，在表面完全湿润的状态下，吸取100μl稀释后的血清样本加入到检测芯片上。
46.(4)在恒温摇床中以500转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为37摄氏度。
47.(5)弃去血清样本，用清洗液清洗检测芯片的表面。
48.(6)清洗后，在检测芯片上加入100μl的酶标抗体溶液(兔抗猪igg-hrp，sigma，
a5420)，在恒温摇床中以500转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为37摄氏度。
49.(7)弃去酶标抗体溶液，用清洗液将检测芯片表面清洗干净。
50.(8)清洗完成后，在检测芯片表面上均匀铺展20μl的发光底物液(thermo，prod#37074)。
51.(9)将用凝胶成像仪对检测芯片进行化学发光成像，并判定结果。
52.(10)结果判定：
53.对于每一份血清，抗体检测芯片上抗原表位多肽点的snr大于或等于2时，为有“响应”；否则，为无响应。
54.当所述seq id no：1～4的抗原表位多肽点中有两个或两个以上有响应时，判定为检出pcv2抗体；否则，判定为未检出pcv2抗体。
55.实施例4.抗体检测结果
56.将10头用其它方法确定为pcv2抗体阴性的猪平均分成攻毒组和对照组，两组均用pcv2 cap蛋白亚单位疫苗进行免疫，免疫后第85天，两组均用其它方法确定为pcv2抗体阳性，但使用上述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体检测，均未检出pcv2抗体。
57.完成上述检测后，在免疫后第85天对攻毒组用pcv2野毒进行强攻毒，然后每2天用上述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体检测，在攻毒后的第14天全部检出了pcv2抗体，而且在检出pcv2抗体前后数日通过临床观察确认攻毒组全部感染了pcv2野毒。对照组每2天用上述猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒进行抗体检测，一直未检出pcv2抗体。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
