一种持续血管紧张素II灌注引起的小鼠高血压眼底病变模型的制备方法及其应用

一种持续血管紧张素ii灌注引起的小鼠高血压眼底病变模型的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种持续血管紧张素ii灌注引起的小鼠高血压眼底病变模型的制备方法及其应用。


背景技术：

2.系统性高血压病是影响眼部结构和功能的重要危险因素，其中动脉血压的升高是引起高血压视网膜病理生理改变和出现临床症状的主要原因。在40岁以上的成年人群中，3％～14％存在高血压视网膜病变。高血压视网膜病变的主要临床表现包括视网膜动脉变细反光增强、动静脉比例减小、动静脉交叉压迫征、沿血管走行的片状出血、棉絮斑、严重者出现视神经视盘水肿及动脉硬化的各种并发症。其病理生理基础为血压增高引起的视网膜旁中心凹的小动静脉数量减少、视网膜动脉硬化、毛细血管前微动脉直径变化、视网膜微血管异常、脉络膜循环血量减少、眼压增加等。
3.随着高血压视网膜病变的病情发展，视网膜的灌注压达到超负荷状态，生理性自我调节机制破坏严重，血-视网膜屏障破坏，血管通透性增加明显，出现血管壁破损、渗漏、导致缺血状态。视网膜荧光造影可发现视网膜血管渗漏，毛细血管扩张，局部无灌注区，侧支血管伴念珠样血管改变，视网膜组织荧光着染等。
4.高血压视网膜病变的动物模型主要为大鼠自发性高血压模型、大鼠肾上主动脉缩窄模型、大鼠dtgr转基因模型、猴肾上主动脉缩窄模型等。但这些模型仍存在局限性：
①
动物模型集中在大鼠、猴子等大型动物中，对研究场地、研究经费的要求较高；
②
动物模型的构建周期较长，如自发性高血压大鼠的构建需要至少15个月的周期；
③
动物模型的操作难度较大，如肾上大动脉缩窄模型具有较高的技术难度，且需要配备相应的手术间以满足无菌要求，从而减少因感染等因素造模失败的比例。
5.目前就高血压视网膜病变，尚无小鼠模型的构建案例。而小鼠具有繁殖能力强、繁殖周期快、经济适用性佳、均一性好、遗传干扰因素少等特点，如在小鼠中构建高血压视网膜病变模型，将缩小研究所需空间和时间，进而极大的提高研究效率和产出。
6.肾素-血管紧张素系统(ras)是经典的全身血压调节体系，血管紧张素ⅱ(angⅱ)是ras的主要效应肽，通过作用于血管紧张素受体亚型1(at1-r)产生收缩血管、促进醛固酮释放、增加血容量、升高血压的效应。越来越多的证据表明，ras参与到一些眼病的发病机制中。抑制ras可以缓解视网膜细胞炎症和凋亡等变化。
7.angⅱ作为ras的效应蛋白，能够参与视网膜循环系统的调节，其在早产儿视网膜病变、增殖性糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管形成等视网膜血管疾病的发病机制中起着重要的作用。angⅱ能促进视网膜增殖、炎症，上调生长因子水平。


技术实现要素：

8.本技术要解决的技术问题为如何在实验小鼠中短时、简便、高效的构建高血压视
网膜病变模型。基于现有研究模型现状的局限，本发明结合高血压视网膜病变的发病特点和规律，设计小鼠颈后皮下埋置植入式微量泵持续灌注血管紧张素ii(ang ii)的方法，使ang ii在小鼠体内定量持续释放，以达到升高小鼠收缩压进而形成高血压视网膜病变的小鼠模型。
9.其中，ang ii为肾素-血管紧张素系统(ras)的主要效应肽，通过作用于血管紧张素受体亚型1(at1-r)产生收缩血管、促进醛固酮释放、增加血容量、升高血压的效应。除了升高系统血压以外，ang ii还能够参与视网膜循环系统的调节，其在增殖性糖尿病视网膜病变等多种视网膜脉络膜血管疾病的发病机制中起着重要的作用。ang ii与at1-r结合后促进微血管内皮细胞增殖和迁移，并上调vegf表达水平，且能够促进视网膜增殖、炎症，上调生长因子水平。本发明的小鼠模型模拟了高血压视网膜病变的炎症反应、氧化应激、电生理等改变。
10.为解决上述技术问题，本技术提供的技术方案包括：
11.一种高血压视网膜病变小鼠动物模型的制备方法，包括：
12.将灌注有灌注液的植入式微量泵皮下埋入小鼠，灌注液持续泵入小鼠体内；所述灌注液内含有血管紧张素ii；
13.所述血管紧张素ii的泵入剂量为2500～3500ng/kg/min，泵入时间为3～4周。
14.可选地，所述小鼠的鼠龄为8～12周龄，优选为10周龄。
15.可选地，所述小鼠的品系为c57bl/6j。
16.可选地，所述小鼠的性别为雄性。
17.可选地，所述血管紧张素ii的泵入剂量为3000ng/kg/min，泵入时间为3周。
18.可选地，将所述植入式微量泵皮下埋入小鼠的后颈部。
19.可选地，所述灌注液的溶剂选0.02％乙酸，ph值为5～8，优选ph值为6.5；
20.所述灌注液中血管紧张素ii的浓度为30～50ug/ul。
21.可选地，所述灌注液持续泵入3～5天后检测小鼠的鼠尾收缩压大于140mmhg，3～4周后视网膜血管造影或眼底照相出现高血压性的视网膜血管损伤特征即为造模成功。
22.本技术还提供了一种上述制备方法制备得到的小鼠动物模型在高血压性视网膜病变研究中的应用。
23.本发明应用小鼠作为模型对象，应用植入式微量泵持续泵入血管紧张素ii以提高小鼠收缩压、增加视网膜炎症进而引起高血压视网膜病变，模拟了人体高血压视网膜病变的基本病理特征，包括视网膜增厚、血管动静脉比例变化及形态改变、视网膜电生理改变、氧化应激增加、炎性细胞因子上调等现象。本模型可以为高血压视网膜病变的基础研究和药物开发提供了更好的动物模型筛选平台。
24.本发明通过对造模中应用的ang ii的剂量、作用时间、小鼠品系和鼠龄的选择，使本发明的方法高效的获得目标动物模型。
25.本发明中的ang ii因其具有促进中央视网膜增厚、视网膜内层炎症聚集、氧化应激的作用，不仅能通过作用于血管紧张素受体使小鼠系统血压增高，并且能够诱导视网膜组织快速形成高血压视网膜病变。
26.本发明明确了小鼠建模的最优性别和周龄，取10周龄c57bl/6j雄鼠建模为最佳。
27.本发明明确了模型构建成功的时间为微量泵植入3周后。其依据为本发明对中央
视网膜厚度和白介素1、白介素6表达进行了持续观察，发现它们在微量泵植入后逐渐上升至第3周达到高峰，随后在第4周稍有下降，但3～4周并无统计学差异，故本发明将微量泵植入后3周作为造模的标准时间。
28.本发明明确了模型构建的标准，微量泵置入3天后检测小鼠的鼠尾收缩压大于140mmhg，3周后视网膜血管造影或眼底照相出现高血压性的视网膜血管损伤特征(中央视网膜增厚大于40微米、血管动静脉比例下降至0.6以下及形态改变、视网膜电生理改变、氧化应激增加、炎性细胞因子上调)即为造模成功。
29.本技术能产生的有益效果包括：
30.①
本发明应用小鼠作为模型对象，利于大规模研究且经济节约，而现有技术主要集中于大鼠、猴子等大型动物中，费用、场地要求高，不利于基因编辑和大规模开展研究工作。
31.②
本发明应用植入式微量泵持续泵入血管紧张素ii以提高小鼠收缩压、增加视网膜炎症与血管改变进而引起高血压视网膜病变，而现有技术主要通过对实验动物行肾上大动脉缩窄术、或应用基因编辑来实现升高血压、引起视网膜病变的目的，操作复杂。
32.③
本发明构建模型的时间较短仅为3周，目前现有的技术造模时间长短不一，短则1个月，长至22个月，耗时长。
33.④
本发明构建的小鼠高血压视网膜病变模型出现中央视网膜增厚大于40微米、血管动静脉比例下降至0.6以下及形态改变、视网膜电生理改变、氧化应激增加、炎性细胞因子上调，模拟了人体高血压视网膜病变的基本病理特征。
附图说明
34.图1为盐水对照组与血管紧张素ii组鼠尾血压测量图。
35.图2a为盐水对照组与血管紧张素ii组视网膜结构随时间变化图；图2b为中央视网膜厚度随时间变化的定量统计分析图；图2c为白介素6随时间变化的定量统计分析图；图2d为白介素1β随时间变化的定量统计分析图。
36.图3a为盐水对照组与血管紧张素ii组诱导三周后视网膜结构变化图；
37.图3b为诱导三周后中央区视网膜厚度的定量统计分析图；图3c为诱导三周后中央区内从状层厚度的定量统计分析图；图3d为诱导三周后中央区内核层厚度的定量统计分析图；图3e为诱导三周后周边区视网膜厚度的定量统计分析图。
38.图4a为盐水对照组与血管紧张素ii组诱导三周后视网膜炎症因子变化图；图4b为诱导三周后iba1阳性细胞的定量统计分析图；图4c为诱导三周后白介素1β的定量统计分析图；图4d为诱导三周后白介素6的定量统计分析图。
39.图5a为盐水对照组与血管紧张素ii组诱导三周后视网膜氧化应激变化图；图5b为活性氧荧光比诱导三周后的定量统计分析图；图5c为诱导三周后nadph氧化酶1的定量统计分析图；图5d为诱导三周后nadph氧化酶4的定量统计分析图。
40.图6a为盐水对照组与血管紧张素ii组诱导三周后视网膜血管造影图；图6b为诱导三周后视网膜动静脉比的定量统计分析图；图6c为诱导三周后相对荧光强度的定量统计分析图。
41.图7a为盐水对照组与血管紧张素ii组诱导三周后视网膜电生理检查图；图7b为诱
导三周后震荡电位振幅的定量统计分析图；图7c为诱导三周后b波电压振幅的定量统计分析图。
具体实施方式
42.下面结合实施例详述本技术，但本技术并不局限于这些实施例。
43.一种高血压视网膜病变小鼠动物模型的制备方法，包括以下步骤：
44.1、小鼠的准备：c57bl/6j背景的野生型10周龄雄性小鼠常规饲养，共15只，于血管紧张素ii灌注前一天测量血压(尾套血压测量仪bp-98a，softron，日本)，选取体重大约在25g且血压处于正常范围、收缩压相似的10只小鼠分笼并标记为1～10号。其中1～5号为盐水对照组，6～10号为血管紧张素ii组。
45.2、植入式微量泵(alzet 1004micro-osmotic pumps,durect,cupertino,ca,usa)的激活：灌注前48小时，超净台内将植入式微量泵体部共10枚取出，置于两个生理盐水培养皿中各5枚，分别标记用于灌注血管紧张素ii或生理盐水及激活时间。移至37℃培养箱内孵育48小时。
46.3、计算并配制血管紧张素ii(sigma，货号a9525)灌注液，泵入剂量3000ng/kg/min；
47.每支植入式微量泵每小时泵出的溶液体积：0.11ul/h(固定)；
48.每支植入式微量泵体积：100ul；
49.单只小鼠每小时血管紧张素ii的泵入质量：3000ng/kg/min
×
25g
×
60min＝4.5ug/h；
50.每支植入式微量泵内血管紧张素ii的浓度：4.5ug/h
÷
0.11ul/h＝40.91ug/ul；
51.5只小鼠所需血管紧张素ii总质量：40.91ug/ul
×
600ul(5 1只)＝24.55mg；
52.血管紧张素ii储存浓度50ug/ul；
53.需血管紧张素ii储液体积：24.55mg
÷
50ug/ul＝491ul；
54.超净台内配制0.02％乙酸溶液，调节ph值为6.5，使用滤器过滤细菌及杂质；
55.所需乙酸溶液(稀释液)体积：600ul-491ul＝109ul；
56.4、灌注植入式微量泵：于超净台内，按照第3步计算的血管紧张素ii剂量配制灌注溶液。将激活的植入式微量泵取出，按照培养皿标识，将1～5号植入式微量泵体部注入100ul生理盐水，6～10号植入式微量泵体部注入100ulang ii灌注液，盖上微量泵帽，重新放置于原培养皿中。
57.5、植入式微量泵的体内植入：动物房手术超净台操作，使用无菌手术器械，0.1％戊巴比妥钠(0.25ml/kg)麻醉小鼠。局部备皮，酒精消毒小鼠背部至颈部，铺无菌洞巾，眼科剪剪开颈后皮肤约6mm，钝性游离皮下组织，轻提切口，将微量泵小心植入背部皮下囊区，尽量使微量泵远离切口。针带线间断缝合切口，对皮。手术结束，将小鼠置于37℃恒温板上，待苏醒后转移至鼠笼。麻醉期间保护眼部，必要时应用卡波姆眼用凝胶涂于小鼠角膜区。
58.ang ii灌注液持续泵入3周，3周后视网膜血管造影或眼底照相出现高血压性的视网膜血管损伤特征即为造模成功。
59.具体的，对本技术构建模型的验证结果如下：
60.图1：血管紧张素ii组小鼠与盐水对照组小鼠的收缩压相比，明显增高。
61.图2：观察应用血管紧张素ii(3000ng/kg/min)处理c57bl/6j小鼠后1～4周视网膜变化和炎性细胞因子的变化。从图2a、图2b可知，视网膜厚度从第2周开始增厚，在第3周出现厚度峰值，与盐水对照组相比具有统计学差异(p《0.05)，而后第4周视网膜厚度略下降；炎性细胞因子白介素6(图2c)和白介素1β(图2d)在血管紧张素ii灌注后第1、2周出现增高，在第三周达到峰值，与盐水对照组相比具有统计学意义(p《0.05)，而后在4周时出现略微下降；而视网膜厚度和炎性细胞因子在第3、4周均无显著差异。所以本技术定义高血压视网膜病变成模时间为接受血管紧张素ii灌输后第3周。
62.图3：血管紧张素ii灌注三周后明显引起的小鼠中央视网膜增厚。将盐水对照组和血管紧张素ii组小鼠视网膜切片进行苏木素伊红染色(图3a)，对视网膜中心区厚度(图3b、图3c、图3d)和周边区厚度(图3e)进行定量分析，*p《0.05，**p《0.01vs盐水对照组。
63.图4：血管紧张素ii灌注引起视网膜炎症增加。将盐水对照组和血管紧张素ii组小鼠视网膜切片进行iba1(小胶质/巨噬细胞特异性蛋白抗体)免疫组化染色(图4a)，箭头所示为iba1阳性信号，并对其定量分析(图4b)；炎性细胞因子白介素1β(图4c)和白介素6(图4d)信使核糖核酸表达在血管紧张素ii灌注组升高；**p《0.01vs盐水对照组。
64.图5：血管紧张素ii灌注引起的视网膜氧化应激增加。将盐水对照组和血管紧张素ii组小鼠视网膜切片进行超氧化物阴离子探针检测视网膜活性氧水平(图5a)，并对活性氧阳性信号定量分析(图5b)；nadph氧化酶1(图5c)、nadph氧化酶4(图5d)的核糖核酸表达在血管紧张素ii组升高；**p《0.01vs盐水对照组。
65.图6：血管紧张素ii灌注引起小鼠眼底血管迂曲扩张。对盐水对照组和血管紧张素ii组小鼠进行眼底血管造影检测(图6a)，并对视网膜血管动静脉比(图6b)和渗漏造成的荧光强度(图6c)进行分析，**p《0.01vs盐水对照组。
66.图7：血管紧张素ii灌注引起小鼠视网膜血管功能改变。对盐水对照组和血管紧张素ii组小鼠进行视网膜电生理检测(图7a)，并对震荡电位振幅(图7b)和b波电压振幅(图7c)进行统计分析，*p《0.05vs盐水对照组。
67.以上所述，仅是本技术的几个实施例，并非对本技术做任何形式的限制，虽然本技术以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本技术，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。