一种子痫前期测定试剂盒、制备方法及应用与流程

1.本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体而言，涉及一种子痫前期测定试剂盒、制备方法及应用。


背景技术：

2.先兆子痫是临床上一类发病率较高的妊娠期特发疾病，子痫前期的患者容易出现血栓栓塞、出血等相关并发症，如若未能及时有效治疗，随着病情的发展可能会进一步加重心血管疾病的发生甚至发生死亡的情况，与此同时还会引起胎儿早产、肾脏损伤等情况的发生。
3.子痫前期的患者在诊断子痫前期时需要与其他疾病进行鉴别，例如，肾病、慢性高血压、免疫病以及肝病等。发生子痫时同样需要其他强直性-痉挛性抽搐疾病进行鉴别，可见，诊断子痫前期需耗费过长时间，难度较大。
4.基于此，提出一种子痫前期测定试剂盒，并将其应用于子痫前期的临床诊断具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种子痫前期测定试剂盒的应用，其可以双试剂的方式快速检测出患者是否患有子痫前期，使用方便快捷，使用范围广泛。
6.本发明的另一目的在于提供一种子痫前期测定试剂盒，该试剂盒包括sflt-1测定试剂和plgf测定试剂，通过sflt-1测定试剂和plgf测定试剂的共同测定，能够有效提升临床诊断的灵敏度及准度性，使用价值较高。
7.本发明的第三目的在于提供一种子痫前期测定试剂盒的制备方法，该制备方法简单易行，适合工业批量生产，经济效益较高。
8.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
9.第一方面，本发明提出一种子痫前期测定试剂盒的应用，将子痫前期测定试剂盒应用于子痫前期的临床检测，且子痫前期测定试剂盒包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂及人胎盘生长因子测定试剂。
10.第二方面，本发明提出一种子痫前期测定试剂盒，子痫前期测定试剂盒包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒及人胎盘生长因子测定试剂盒，可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测卡、样本稀释液、id卡；人胎盘生长因子测定试剂盒包括人胎盘生长因子检测卡、样本稀释液、id卡；id卡含有试剂曲线信息，用于上述试剂盒的定量检测。
11.第三方面，本发明提供一种子痫前期测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
12.制备含可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗体1检测线和质控c线的包被膜一，制备含荧光微球标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗体2的结合物膜一，再将包被膜一和结合物膜一组装成第一检测试剂条，然后将第一检测试剂条制作成可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂
卡；
13.制备含人胎盘生长因子抗体1检测线和质控c线的包被膜二，制备含荧光微球标记人胎盘生长因子抗体2的结合物膜二，将包被膜二和结合物膜二组装成第二检测试剂条，再将第二检测试剂条制成人胎盘生长因子检测试剂卡。
14.本发明实施例的子痫前期测定试剂盒、制备方法、应用及使用方法至少具有以下有益效果：
15.第一方面，本发明提出一种子痫前期测定试剂盒的应用，其可先于临床症状出现前鉴别正常妊娠和先兆子痫，检测快速，并可实现随到随诊，方便临床应用，实现对子痫患者早诊断、早治疗，具有较高的临床应用价值。
16.第二方面，本发明提出一种子痫前期测定试剂盒，具有成本低，灵敏度高的优势。
17.第三方面，本发明提供一种子痫前期测定试剂盒的制备方法，该制备方法简单便捷，适合批量化制作，经济效益高。
具体实施方式
18.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
20.第一方面，本发明提供一种子痫前期测定试剂盒的应用，具体地，将子痫前期测定试剂盒应用于子痫前期的临床检测，且子痫前期测定试剂盒包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂及人胎盘生长因子测定试剂。
21.具体地，可溶性fms样酪氨酸激酶-1和胎盘生长因子可用于对子痫前期患者的早期筛查，同时可对子痫前期患者的围产结局及新生儿结局情况进行判断。患先兆子痫的妇女可溶性fms样酪氨酸激酶-1水平高于正常妊娠水平，同时plgf水平低于正常妊娠水平。可溶性fms样酪氨酸激酶-1测试试剂卡检测其在血循环中的水平，人胎盘生长因子测试试剂卡检测其在血循环中的水平，先于临床症状出现前鉴别正常妊娠和先兆子痫，实现对妊娠高血压疾病患者早诊断、早治疗。由此可见，通过测定患者的可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量以及人胎盘生长因子的含量共同判断患者是否患有子痫前期，能够有效提升诊断的准确性，同时，将上述两种试剂制作为试剂卡并应用在子痫前期对的临床诊断时，可缩短检测时间，并无需与其他疾病进行鉴别，使用价值较高。
22.本技术中，可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂为定量检测试剂卡，人胎盘生长因子测定试剂为定量检测试剂卡。详细地，由于子痫前期的孕妇抗血管生成物质产生过多，如可溶性fms样酪氨酸激酶-1，因此，通过检测患者体内可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量能够预测患者是否患有子痫前期；而人胎盘生长因子水平可用于识别胎盘合体滋养层细胞存在的供氧压力，进而对子痫前期进行预测。鉴于上述原因，可通过定量检测的方式测定患者体内可溶性fms样酪氨酸激酶-1以及人胎盘生长因子的水平，并根据上述双试剂的含量，得到子痫前期的临床检测结果，预测的准确率更高，应用价值高。
23.本技术中，结合可溶性fms样酪氨酸激酶-1和人胎盘生长因子的不同孕周段的参考值区间及可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂盒测试值与人胎盘生长因子测定试剂盒测试值比值的参考区间，应用于临床子痫前期的辅助诊断。
24.详细地，患者的不同孕周段，可溶性fms样酪氨酸激酶-1和人胎盘生长因子的参考值不同，如人胎盘生长因子在孕20周-23周参考值为60pg/ml，孕24周-31周参考值为130pg/ml。因此，根据不同孕周段参考值区间和测定值的参考区间进行子痫前期的诊断，诊断的可靠性更高。
25.第二方面，本技术提供一种子痫前期测定子痫前期测定试剂盒包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂及人胎盘生长因子测定试剂，可溶性fms样酪氨酸激酶-1测定试剂包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测卡、样本稀释液、id卡；人胎盘生长因子测定试剂包括人胎盘生长因子检测卡、样本稀释液、id卡；id卡含有试剂曲线信息，用于试剂盒的定量检测。
26.本技术中，样本稀释液含有50mm-100mm缓冲液，缓冲液为磷酸盐缓冲液。其中磷酸盐缓冲液具体为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲对，以此使得样本的ph值稳定。
27.本技术中，试剂盒的测试方法为荧光免疫层析法。
28.第三方面，本技术提出一种子痫前期测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
29.制备含可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗体1检测线和质控c线的包被膜一，制备含荧光微球标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗体2的结合物膜一，再将包被膜一和结合物膜一组装成第一检测试剂条，然后将第一检测试剂条制作成可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂卡；
30.本技术中，可将可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂卡可由第一检测试剂条、塑料卡壳上盖、塑料卡壳下盖组装而成，安装简单，适合批量化工业生产，经济效益较高。
31.制备含人胎盘生长因子抗体1检测线和质控c线的包被膜二，制备含荧光微球标记人胎盘生长因子抗体2的结合物膜二，将包被膜二和结合物膜二组装成第二检测试剂条，再将第二检测试剂条制成人胎盘生长因子检测试剂卡。
32.同样，该人胎盘因子检测试剂卡可由第二检测试剂条、塑料卡壳上盖、塑料卡壳下盖组装而成。
33.本技术中，可将可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂卡和人胎盘生长因子检测试剂卡制作为一个试剂盒进行使用。当然，还可将可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂卡和人胎盘生长因子检测试剂卡分别制作为试剂盒进行使用。
34.本技术中，可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗体1为可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体，人胎盘生长因子抗体1为人胎盘生长因子单克隆抗体。本技术中，荧光微球标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗体2为sflt-1单克隆抗体，荧光微球标记人胎盘生长因子抗体2为人胎盘生长因子单克隆抗体。
35.在此需要注意的是，还可根据具体的使用情况选择其他类型的抗体，如可溶性fms样酪氨酸激酶-1多克隆抗体、人胎盘生长因子多克隆抗体。
36.第四方面，该试剂盒的使用方法如下：以待测孕妇的血清和/或血浆作为检测样本，再使用样本稀释液对检测样本进行稀释，制得混合液，再将混合液加入至可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂和人胎盘生长因子检测试剂中，得到检测结果。
37.可见，该试剂盒的使用方法是以患者的血样作为样本，稀释后，加入检测卡中以荧光免疫分析仪进行检测，获得检测结果，使用方法简单快速，能够在子痫前期症状发作之前检测出患者是否患有子痫前期，便捷性强。
38.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
39.实施例1
40.本实施例的目的在于提供一种子痫前期测定试剂盒的制备方法，具体如下：
41.第一检测试剂条包括pvc底板、吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样本垫，吸水纸和结合垫中间为硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜上有检测线(t线，包被有sflt单克隆抗体1)和质控c线(c线，包被有羊抗鼠igg)。结合垫喷涂有sflt单克隆抗体2标记的荧光微球。
42.第二检测试剂条包括pvc底板、吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样本垫，吸水纸和结合垫中间为硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜上有检测线(t线，包被有plgf单克隆抗体1)和质控线(c线，包被有羊抗鼠igg)。结合垫喷涂有plgf单克隆抗体2标记的荧光微球。
43.(1)荧光微球的标记
44.a.荧光微球的活化
45.取荧光微球加入活化缓冲液，离心后去上清，加入活化缓冲液超声重悬，取一定量edc和nhs溶解后加入微球中活化。
46.b.抗体偶联
47.离心去上清，加入偶联缓冲液超声重悬，加入一定量的待标记抗体2，反应1h-4h。
48.c.封闭
49.加入封闭液反应0.5h-1h。
50.d.保存
51.离心去上清，加入保存液重悬至原体积，2℃-8℃保存备用。
52.(2)硝酸纤维素膜的处理
53.将硝酸纤维素膜贴至pvc底板特定位置，用连续式划膜仪将抗体1和羊抗鼠igg喷涂到硝酸纤维素膜上，分别作为t线和c线，50℃高温干燥箱干燥过夜。
54.(3)结合垫的处理
55.用三维喷金划膜仪将荧光微球结合物喷涂到结合垫上，50℃高温干燥箱干燥2h。
56.(4)组装
57.将步骤(2)的硝酸纤维素膜、步骤(3)的结合垫、吸水纸、样品垫组装好后，切割成4mm的第一检测试剂条/第二检测试剂条，扣上上盖和下盖后组成可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂卡/人胎盘生长因子检测试剂卡，加入干燥剂8℃-30℃保存。
58.实施例2
59.本实施例的目的在于提供上述试剂盒的性能测试方法和结果，具体如下：
60.(1)测试方法：在室温平衡的条件下，取出待测样本和检测试剂盒。取出试剂盒中id卡，插入荧光免疫分析仪中，读取曲线信息。取100ul样本加入样本稀释液中，充分混匀后加入上述两种检测试剂卡的加样孔中进行检测，(15
±
1)min后用荧光免疫分析仪测定结果。
61.(2)性能测试结果
62.sflt-1试剂盒：
63.a.空白限：≤15pg/ml；
64.b.线性范围：在线性范围为(30～10000)pg/ml时，剂量反应曲线的相关系数r应≥0.990；
65.c.重复性：随机抽取同一批号的20张检测卡，分别对两个不同浓度的重复性参考品进行检测，其变异系数cv(％)值应≤15％；
66.d.批间精密度：取三个批号的试剂，每个批号取20张检测卡并分别对两个浓度的重复性参考品进行检测，其变异系数cv(％)值应≤20％；
67.e.准确度：回收率在85％～115％之间。
68.plgf试剂盒：
69.a.空白限：≤12pg/ml；
70.b.线性范围：试剂的线性范围为(20～3500)pg/ml时，剂量反应曲线的相关系数r应≥0.990；
71.c.重复性：随机抽取同一批号的20张检测卡，分别对两个不同浓度的重复性参考品进行检测，其变异系数cv(％)值应≤15％；
72.d.批间精密度：取三个批号的试剂，每个批号取20张检测卡并分别对两个不同浓度的重复性参考品进行检测，其变异系数cv(％)值应≤20％；
73.e.准确度：回收率在85％～115％之间。
74.以上可看出，本发明提供的试剂盒性能检测结果优良，由此可知子痫前期测定试剂盒应用价值较高。
75.实施例3
76.本实施例的目的在于提供一种子痫前期测定试剂盒的临床应用效果，具体如下：
77.用实施例1制备而得的子痫前期测定试剂盒检测临床样本，根据试剂盒不同孕周段参考区间判定结果，不同孕周段参考区间见下表：
78.表1子痫前期测定试剂盒参考区间
79.[0080][0081]
表2临床样本检测结果
[0082]
[0083][0084]
表2中，临床诊断结果中“ ”表示阳性，临床诊断结果中
“‑”
表示阴性；而检测结果中
“‑”
表示阴性，
“↓”
表示plgf的检测水平低于正常妊娠水平，
“↑”
表示sflt-1的检测水平高于正常妊娠水平，而s/p(即为sflt-1检测值/plgf检测值)中
“↑”
则表示检测结果呈阳性。
[0085]
由表1和表2可知，临床诊断阳性样本11例，阴性样本14例。本技术提出的试剂盒检测出10例阳性样本，灵敏度高达90％，12例阴性样本，与临床结果一致。另外有g8、g24两例临床阴性样本试剂盒检测为阳性，需进行更多的临床观察检测。
[0086]
由此可见，本技术提供的子痫前期测定试剂的临床应用，先于临床症状出现前鉴别正常妊娠和先兆子痫，成本低，准确性高，操作简便、快速，可实现随到随诊，方便临床应用，实现对子痫患者早诊断、早治疗，具有较高的临床应用价值。
[0087]
综上，第一方面，本发明提出一种子痫前期测定试剂盒的应用，其可先于临床症状出现前鉴别正常妊娠和先兆子痫，检测快速，并可实现随到随诊，方便临床应用，实现对子痫患者早诊断、早治疗，具有较高的临床应用价值。第二方面，本发明提出一种子痫前期测定试剂盒，具有成本低，灵敏度高的优势。第三方面，本发明提供一种子痫前期测定试剂盒的制备方法，该制备方法简单便捷，适合批量化制作，经济效益高。
[0088]
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。