一种C反应蛋白的检测试剂盒及其应用的制作方法

一种c反应蛋白的检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种c反应蛋白的检测试剂盒及其应用，属于免疫检测技术领域。


背景技术：

2.c反应蛋白(c-reactive protein，crp)是一种与肺炎链球菌非特异性菌体的多糖成分c-多糖发生凝集反应并于急性感染时出现的蛋白质，当机体处于应激状态下，il-6、il-1、tnf-ɑ
等炎性细胞因子可诱导肝细胞合成crp。在正常患者血清中，crp含量极微，并在人体内长期保持稳定。因此微量的crp变化就可以提示人体生理状况改变，连续检测结果前后比较更有意义。
3.普通crp检测方法的检测范围一般为10-320mg/l，在正常范围内低程度炎症反应(如心血管事件)的预测不够灵敏。新技术，如胶乳增强的免疫比浊法等，大大提高了分析的灵敏度(检测低限为0.005-0.10mg/l不等)，在低浓度测定范围内有一定的准确度。用这些方法所进行测定的crp称为高敏感或超敏感crp，一般简称为超敏或高敏crp(hs-crp)。因此不同的c反应蛋白检测上限差异很大，绝大部分在60mg/l以内。
4.临床上健康人crp的正常范围参考值一般＜10mg/l为正常，不同人群(年龄，生理状态)的参考范围略有不同。crp用于心血管疾病危险性评估标准：hs-crp《1mg/l为低度危险，1-3mg/l为中度危险，3mg/l以上为高度危险。研究表明，hs-crp≥3mg/l是中国人发生心血管疾病的有效预测因子。
5.虽然现有的试剂盒已能覆盖超敏c反应蛋白和普通c反应蛋白的检测范围，但1-10mg/l(中度危险至高度危险)是对于疾病危险性评估的有利范围，现有的试剂盒在该低值范围下的检测性能仍然较差，重复性不太理想且不适合用于连续检测。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种c反应蛋白的检测试剂盒，该试剂盒可测量全血、血清、血浆的全量程c反应蛋白，在测量低值时有良好的重复性同时能有较好的线性范围。
7.本发明的第二个目的在于提供一种上述c反应蛋白的检测试剂盒的应用。
8.实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种c反应蛋白的检测试剂盒，包括稀释溶液、缓冲溶液和抗血清；
9.稀释溶液包括稀释液，稀释液的浓度为0.01-0.2％w/稀释溶液v；稀释液用量影响crp检测的准确度，用量过高，会导致crp结果整体偏低；
10.缓冲溶液包括缓冲体系，缓冲体系的浓度为5-100mmol/稀释溶液l；
11.抗血清包括兔抗人crp抗体和/或羊抗人crp抗体，抗体的浓度为0.01-0.08％w/抗血清v。
12.进一步地，稀释液包括曲拉通x-100、吐温-20、吐温-80和十二烷基磺酸钠中的一种或两种。
13.进一步地，缓冲体系的ph为6.5-8.5，为氯化铵溶液、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或hepes缓冲液；ph可保证试剂盒的反应度不超过散射检测系统的检测范围。
14.进一步地，缓冲溶液还包括：
15.促进剂
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0.001-0.01％w/缓冲溶液v；
16.稳定剂
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0.1-3％w/缓冲溶液v；
17.防腐剂
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0.05-0.1％w/缓冲溶液v。
18.进一步地，促进剂为peg2000、peg6000、peg8000、peg20000或聚乙烯吡咯烷酮；促进剂浓度可以改善crp试剂盒的灵敏度，保证低值结果的准确性和重复性。
19.进一步地，稳定剂包括氯化钾、氯化钙、氯化钠、硫酸钾、硫酸钠、酪蛋白、牛血清白蛋白和明胶中的至少一种；稳定剂保证试剂盒反应平稳进行，提高重复性。
20.进一步地，防腐剂为proclin300或叠氮钠。
21.进一步地，缓冲体系为磷酸盐缓冲液；促进剂为peg6000或peg8000；稳定剂为氯化钠和牛血清蛋白；防腐剂为proclin300。
22.实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种上述的c反应蛋白的检测试剂盒的应用，c反应蛋白的检测试剂盒用于检测c反应蛋白，包括：
23.校准曲线制备步骤：将c反应蛋白校准品使用检测试剂盒得到c反应蛋白散射值-浓度的对应数据，制备校准曲线；
24.样本处理步骤：以稀释溶液对样本进行稀释，然后加入缓冲溶液和抗血清，得到样本散射值；
25.对比步骤：以样本散射值与校准曲线对比，得到样本中c反应蛋白的浓度。
26.进一步地，样本处理步骤中，以散射比浊法获得样本的散射值。
27.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
28.1、本发明c反应蛋白的检测试剂盒可测量全血、血清、血浆中crp，同时满足线性范围广且低值重复性好的要求；
29.2、本发明c反应蛋白的检测试剂盒用于检测c反应蛋白，使用方便，结果准确。
附图说明
30.图1为实施例1血清和全血的相关性图；
31.图2为实施例2理论值和平均值的相关性图。
具体实施方式
32.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
33.一种c反应蛋白的检测试剂盒，包括稀释溶液、缓冲溶液和抗血清；
34.稀释溶液包括：
35.磷酸盐缓冲液5-20mmol/稀释溶液l；
36.稀释液：十二烷基磺酸钠0.01-0.2％w/稀释溶液v；
37.稀释溶液用于对样本进行稀释、液化，其本身并不直接参与检测；
38.缓冲溶液包括：
39.缓冲体系：磷酸盐缓冲液20-50mmol/缓冲溶液l，ph为7.4-8.2；
40.促进剂：peg2000、peg6000、peg8000、peg20000或聚乙烯吡咯烷酮0.001-0.01％w/缓冲溶液v；
41.稳定剂：氯化钠0.05-1.5％w/缓冲溶液v和牛血清白蛋白0.05-1.5％w/缓冲溶液v；
42.防腐剂：proclin300 0.05-0.1％w/缓冲溶液v；
43.ph在此范围内可保证试剂盒在测量高浓度样本时反应度在测量范围内，满足高线性目的，而促进剂和稳定剂比例要合适，满足测量低值样本时重复性好的目的；
44.抗血清包括：
45.羊抗人crp抗体，抗体的浓度为0.01-0.08％w/抗血清v。
46.检测试剂盒的使用方式：
47.包括：
48.校准曲线制备步骤：取具溯源性的c反应蛋白校准品稀释成不同浓度，使用稀释液按比例对校准品进行稀释，加入到缓冲溶液中，然后加入抗血清进行混匀，具体过程可放到散射比浊法的特定蛋白分析仪上自动操作，得到各个浓度的散射值，建立c反应蛋白散射值-浓度对应数据库绘制c反应蛋白的校准曲线；
49.样本处理步骤：以稀释溶液对样本进行稀释，然后加入缓冲溶液和抗血清，具体过程可放到散射比浊法的特定蛋白分析仪上自动操作，得到样本散射值；
50.对比步骤：以样本散射值与校准曲线对比，得到样本中c反应蛋白的浓度。
51.实施例1：
52.一种c反应蛋白的检测试剂盒，包括稀释溶液、缓冲溶液和抗血清；
53.稀释溶液包括：
54.磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组成磷酸盐缓冲溶液15mmol/稀释溶液l；
55.稀释液：十二烷基磺酸钠0.1％w/稀释溶液v；
56.缓冲溶液包括：
57.缓冲体系：磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组成磷酸盐缓冲溶液30mmol/缓冲溶液l，ph为8-8.2；
58.促进剂：peg6000 0.009％w/缓冲溶液v；
59.稳定剂：氯化钠0.8％w/缓冲溶液v和牛血清白蛋白0.25％w/缓冲溶液v；
60.防腐剂：proclin300 0.06％w/缓冲溶液v；
61.抗血清包括：
62.羊抗人crp抗体，抗体的浓度为0.05％w/抗血清v。
63.使用方法同具体实施方式。
64.分别取血清和全血进行检测，得到样本的浓度如表格1所示，相关性图如图1所示：
65.表格1实施例1的同源样本浓度值
66.样本序号血清全血13.943.4727.987.78313.1310.78438.5136.51
55.795.57610.479.8772.583.01822.5822.8791.781.991017.5818.23
67.从上述数据可知，测量同源样本相关性好，结果接近，测量同源的血清、全血样本结果基本一致。
68.实施例2：
69.一种c反应蛋白的检测试剂盒，包括稀释溶液、缓冲溶液和抗血清；
70.稀释溶液包括：
71.磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组成磷酸盐缓冲溶液18mmol/稀释溶液l；
72.稀释液：十二烷基磺酸钠0.15％w/稀释溶液v；
73.缓冲溶液包括：
74.缓冲体系：磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组成磷酸盐缓冲溶液40mmol/缓冲溶液l，ph为7.4；ph为7.4时灵敏度最高；
75.促进剂：peg6000 0.005％w/缓冲溶液v；
76.稳定剂：氯化钠0.8％w/缓冲溶液v和牛血清白蛋白1.4％w/缓冲溶液v；
77.防腐剂：proclin300 0.06％w/缓冲溶液v；
78.抗血清包括：
79.羊抗人crp抗体，抗体的浓度为0.05％w/抗血清v。
80.使用方法同具体实施方式。
81.取约7mg/l的浓度的全血样本，以实施例2作为待测产品，市面产品使用深圳普门pa-800特定蛋白仪超敏c反应蛋白测定试剂盒(散射免疫比浊法)作为对照产品，重复测量10次，计算平均值、标准差(sd)及变异系数(cv％)，结果如下：
82.表格2低值重复性结果
83.[0084][0085]
由上述结果可知，使用本发明的低值重复性能达到小于3％。
[0086]
取线性下限浓度0.5mg/l的样本及线性上限浓度370mg/l的样本各一个，按照表格3取量，然后进行稀释至下述的稀释浓度：
[0087]
表格3线性范围稀释表
[0088]
上限浓度血清样本(μl)0201002505007501000下限浓度血清样本(μl)10009809007505002500稀释浓度(mg/l)0.00050.007890.037450.0928750.185250.2776250.37
[0089]
每个浓度测量3次，求出回归方程y＝a bx，计算线性回归的相关系数(r)，及算出绝对偏差及相对偏差，结果如表格4所示，理论值和平均值的相关性图如图2所示：
[0090]
表格4线性范围结果
[0091][0092][0093]
判断标准：
[0094]
a)0.5-370mg/l范围内，线性相关系数(r)≥0.990；
[0095]
b)样本浓度不大于10mg/l时，线性绝对偏差应不超过
±
1mg/l；样本浓度大于10mg/l时，线性相对偏差应不超过
±
15％。
[0096]
线性范围的相关系数r大于0.99，低值的绝对偏差小于1mg/l和其他浓度的相对偏差小于10％，均能达到要求。
[0097]
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。