用于基因疗法的纳米粒子组合物

1.本发明涉及用于基因疗法的纳米颗粒组合物。还设想了治疗皮肤遗传病症(例如隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb))的方法。


背景技术：

2.隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)目前除了姑息治疗外，尚未有临床疗法，因此非常需要一种通过使患者自身细胞表达vii型胶原从而恢复皮肤结构完整性的疗法。我们研究小组的专长在于设计将核酸引入到细胞和组织中的新方法。目前恢复vii型胶原表达的核酸治疗方法存在将治疗递送至细胞和组织的安全性和有效性问题。基因组编辑是一种对细胞的dna进行特定改变的方法，可用于通过修复引起疾病的突变来治疗rdeb等病症。先前的基因组编辑技术(zfn和talen)已经被用于rdeb的治疗方法。近年来，一种更安全、更通用的新的基因组编辑技术(crispr)因其对遗传疾病患者的高治疗潜力而引起了人们的极大兴趣。
3.因此，开发安全高效的递送系统对于crispr基因组编辑在临床中的成功非常重要。尽管潜力巨大，但克服有效递送的障碍对于实现安全有效的临床成功仍然很关键。目前将crispr递送到细胞中的方法是通过；(1)病毒载体；(2)细胞电穿孔；或(3)聚合物载体。通过非病毒递送瞬时表达治疗性cas9和向导rna避免了cas9持续表达引起的免疫反应，并减少了体内的脱靶效应。在crispr系统方法中，可以以温和的方式使用的安全的非病毒聚合物递送载体，矫正了rdeb患者的vii型胶原，避免了与这种使人衰弱的病症相关的大量并发症和侵入性程序。
4.o'keefe ahern等人(journal of investigative dermatology vol.138,no.5.19may 2018,pages s141-s141)描述了通过非病毒聚合物递送系统，特别是以静电方式与带负电荷的核酸(质粒dna)结合的高度支化聚(β-氨基酯)聚合物，将基于crispr/cas9的col7a1基因组编辑应用于治疗隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)。
5.zeng等人(nano letters,vol.19,no.1,19december 2018,pages 381-391)描述了包含dna和聚(β-氨基酯)聚合物的颗粒及其在成纤维细胞基因转染(质粒dna)中的用途。
6.zeng等人(acs applied materials&interfaces,vol.11,no.34,28august 2019,pages 30661-30672)描述了包含微环col7a1 dna和支化聚(β-氨基)酯的纳米粒子。
7.wo2019/104058描述了使用具有由磷脂双层包裹的聚(β-氨基酯)核的核壳结构纳米粒子递送核酸，包括核糖核蛋白。
8.kang等人(bioconjugate chem 2017,28,957-967)描述了使用纳米级crispr复合物的非病毒基因组编辑，所述复合物包含与cas9蛋白共价结合的pei，其然后与单-向导rna分子复合。
9.chen等人(acs applied materials&interfaces,2018,10,18515-18523)描述了在核酸(dna、rna或cas9/sgrna核糖核蛋白)和阳离子聚合物聚(天冬氨酸-(2-氨基乙基二硫化物)-(4-咪唑羧酸))-聚(乙二醇)之间形成的聚合复合物(polyplexes)。
10.wang等人(acs applied materials&interfaces,2018,10,31915-31927)描述了在核酸(dna、rna或cas9/sgrna核糖核蛋白)和阳离子共聚物聚(n'n'-双(丙烯酰基)胱胺-共-三亚乙基四胺)之间形成的聚合复合物。
11.本发明的目的是克服上面提到的至少一个问题。


技术实现要素：

12.本技术人已经发现，超支化聚(β-氨基)酯聚合物能够有效地将核糖核蛋白复合物缩合成纳米粒子，保护它们免于酶降解及促进其以有效且细胞相容(cytocompatible)的方式穿过细胞膜转运。已经表明，本发明的包含功能性crispr-cas9 vii型胶原外显子80切除系统的纳米颗粒组合物，能够以高的转染效率和矫正效率以及高细胞活力转染角质形成细胞(图5至7)。在体内局部和皮下注射2天后，这些组合物能够通过隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)的水疱穿透表皮基底层(图9)，在局部施用该组合物7天后，能够在体内和体外切除外显子80(图10)，并在体内恢复vii型胶原(图11)。与crispr-质粒系统相比，本发明的纳米颗粒组合物表现出更高的转染效率(图12)和更高的矫正效率(8.2％至43.2％-图13)。本发明广泛涉及包含疏水性阳离子聚合物和crispr-cas衍生物的核糖核蛋白复合物的纳米颗粒组合物、它们在基因疗法(尤其是皮肤遗传病症)中的用途，特别是用于治疗rdeb。
13.在第一方面，本发明提供包含复合在阳离子聚合物(例如超支化聚合物)中的基因编辑核糖核蛋白系统的纳米颗粒组合物(下文称为“纳米颗粒组合物”或“核糖聚合复合物”)。
14.在一个实施例中，超支化聚合物是聚(β氨基酯)超支化聚合物。
15.在一个实施例中，超支化聚合物是3-支化超支化聚合物或4-支化超支化聚合物。
16.在一个实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统是cas9-grna核糖核蛋白系统，例如crispr-cas9基因编辑系统，其通常配置为诱导靶基因组序列的删除，包括切除基因中的突变或外显子、替换基因突变或产生基因敲低或敲除。可用于本发明的其他基因编辑核糖核蛋白系统包括例如替代的crispr-cas衍生物，例如cas12a、cas14、crispr碱基编辑器、锌指核酸酶系统和talen系统。
17.在一个优选的实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统是crispr-cas9基因编辑系统。
18.在一个实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统配置用于外显子切除。在一个实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统是crispr-cas9基因编辑系统。在一个实施例中，基因编辑核糖核蛋白系统配置为切除编码vii型胶原蛋白的col7a1基因的外显子80。
19.在一个实施例中，本发明的核糖聚合复合物的平均尺寸是50-500、50-400、50-300、100-400、100-300、150-250nm和理想地是约200nm。测量纳米颗粒组合物平均尺寸的方法是例如动态光散射系统或透射电子显微镜。为了测量核糖聚合复合物的尺寸及衡量溶液中纳米粒子均匀性的多分散指数(pdi)，可以采用配备有173
°
散射角的malvern zetasizer nano zs(莫尔文仪器(malvern instrument))。核糖聚合复合物的尺寸测量在透明塑料一次性比色皿中进行。核糖聚合复合物这样制备：首先将sgrna和cas9核酸酶以1.1-9.0:1的所需比例混合组装核糖核蛋白。在组装核糖核蛋白之后，以1:1的体积/体积比混合聚合物和核糖核蛋白，在室温下孵育15分钟，形成核糖聚合复合物。孵育后，采用980μl分子水进一
步稀释核糖聚合复合物，并将其加入到透明塑料一次性比色皿中，在25℃的温度下进行测量。
20.另一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含根据本发明的第一纳米颗粒组合物和根据本发明的第二纳米颗粒组合物，所述第一纳米颗粒组合物包含第一cas9-grna核糖核蛋白系统，所述第二纳米颗粒组合物包含第二cas9-grna核糖核蛋白系统，其中第一cas9-grna核糖核蛋白系统的grna与第二cas9-grna核糖核蛋白系统的grna不同。这些组合物可用于外显子切除，其中第一和第二grna分子配置为在要切除的靶外显子的相对侧翼处退火。
21.本发明还提供偶联物，其包含根据本发明的核糖聚合复合物和其它分子，例如(a)配置为将纳米颗粒组合物靶向至特定靶细胞或组织类型的靶向配体或(b)成像标记或染料。其它分子可以与组合物的蛋白质或核酸元件偶联，并且可以共价偶联，或以另一种方式结合，例如通过静电相互作用结合。
22.本发明还提供药物组合物，其包含本发明的核糖聚合复合物或偶联物以及合适的药物赋形剂。
23.本发明还提供一种制备纳米颗粒组合物的方法，包括以下步骤：
24.提供在缓冲液中的基因编辑核糖核蛋白系统的溶液；
25.提供在合适的非水溶剂中的阳离子聚合物的溶液；
26.混合这些溶液，使得混合物中阳离子聚合物的质量相对基因编辑核糖核蛋白系统的质量是过量的；和
27.通常地静置混合物，使得形成纳米颗粒组合物。
28.在一个实施例中，阳离子聚合物溶液这样制备：将阳离子聚合物溶解在合适的溶剂(例如非水溶剂如dsmo)中，然后将此溶液在水性缓冲液中稀释。
29.在一个实施例中，阳离子聚合物以10-200mg/ml，优选50-150mg/ml，理想情况是约100mg/ml的浓度溶解在溶剂中。
30.在一个实施例中，用缓冲液稀释后的溶液包含0.1至100g阳离子聚合物。
31.在一个实施例中，所述方法包括组装基因编辑核糖核蛋白系统的步骤。
32.在一个实施例中，该步骤包括将sgrna与cas9核酸酶以1.1-9.0:1的摩尔比混合，得到通常包含0.1至100μg核糖核蛋白复合物的基因编辑核糖核蛋白系统。
33.在一个实施例中，将核糖核蛋白复合物在一定体积的给定缓冲液中稀释，使最终的核糖核蛋白复合物溶液不超过所需总施用体积的50％。
34.在一个实施例中，第一溶液和第二溶液以约1-100:1-100的体积比混合，使得聚合物的质量相对基因编辑核糖核蛋白系统的质量是过量的。
35.在一个实施例中，将缓冲液配置为ph值的范围是3至10。在一个实施例中，缓冲液包含浓度10-50mm，优选20-30mm的缓冲盐。在一个实施例中，缓冲液是乙酸钠缓冲液。
36.在一个实施例中，就质量而言，第二溶液中阳离子聚合物的含量比核糖核蛋白复合物的含量大1至100倍，其中第一溶液和第二溶液以约1-100:1-100的体积比混合。
37.本发明还提供包含复合在阳离子聚合物中的基因编辑核糖核蛋白系统的核糖聚合复合物，其用于治疗个体的遗传疾病(通常特征在于个体的基因发生突变)的方法中，其中在一个实施例中，所述基因编辑核糖核蛋白系统配置为编辑基因。编辑可以包括非同源
末端连接(nhej)(即用于大或小基因组删除或外显子切除)、敲低或敲除基因，用于同源定向修复(hdr)，将dna模板添加到核糖聚合复合物中。在优选的实施例中，编辑包括删除或替换突变或包含突变的基因部分。
38.在一个实施例中，核糖聚合复合物是局部施用或通过皮下注射施用。
39.在一个实施例中，遗传疾病选自皮肤遗传病症。实例包括大疱性表皮松解症(eb)、隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)、表皮松解性掌跖角化病、hailey-hailey病、达里埃病、局部常染色体隐性遗传性少毛症。其他皮肤病可能包括：替代eb亚型，例如单纯性eb和交界性eb、表皮松解性掌跖角化病、hailey-hailey病、达里埃病、局部常染色体隐性遗传性少毛症。
40.在一个实施例中，遗传疾病是隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)，其中基因编辑核糖核蛋白系统配置用于vii型胶原外显子80切除。优选地，基因编辑核糖核蛋白系统是crispr-cas9基因编辑系统。
41.另一方面，本发明提供治疗受试者的皮肤遗传疾病的方法，包括通过局部施用或皮下注射将根据本发明的纳米颗粒组合物施用至个体的皮肤的步骤，其中本发明的纳米颗粒组合物包括通常包含与阳离子聚合物复合的crispr核酸酶的基因编辑核糖核蛋白系统。通常，crispr核酸酶蛋白是cas9或cas9衍生物。
42.另一方面，本发明提供离体或体外遗传修饰细胞的方法，包括将细胞与根据本发明的纳米颗粒组合物一起孵育，从而所述基因编辑核糖核蛋白系统对细胞进行遗传修饰的步骤。在一个实施例中，所述方法包括从受试者分离细胞，然后将遗传修饰的细胞植入到受试者体内的步骤。在一个实施例中，受试者患有以细胞中基因突变为特征的遗传疾病，其中基因编辑核糖核蛋白系统配置为矫正所述突变或删除突变或包含突变的全部或部分外显子。
43.另一方面，本发明提供离体或体外遗传修饰组织样品的方法，包括将组织与根据本发明的纳米颗粒组合物一起孵育，从而所述基因编辑核糖核蛋白系统对组织的至少一些细胞进行遗传修饰的步骤。在一个实施例中，所述方法包括从受试者分离组织，然后将遗传修饰的组织植入到受试者体内的步骤。在一个实施例中，受试者患有以组织细胞中基因突变为特征的遗传疾病，其中基因编辑核糖核蛋白系统配置为矫正所述突变或删除突变或包含突变的全部或部分外显子。
44.另一方面，本发明提供根据本发明的方法在体外或离体遗传修饰的细胞或组织。
45.本发明还提供包含复合在阳离子聚合物内的基因编辑核糖核蛋白系统的核糖聚合复合物，用于治疗以炎症介质过表达为特征的个体的炎性疾病的方法中，其中基因编辑核糖核蛋白系统配置为编辑个体基因组以减少炎症介质的表达。
46.本发明的其他方面和优选实施例在以下列出的其他权利要求中定义和描述。
附图说明
47.图1：限定核糖聚合复合物的定义的示意图。
48.图2：核糖聚合复合物的作用途径。
49.图3：使用核糖聚合复合物的基因编辑策略的示意图。
50.图4：用于rdeb治疗的核糖聚合复合物的形成。
51.图5：胶原外显子80切除：核糖核蛋白(rnp)复合物在外显子80侧翼产生双链断裂，通过非同源末端连接(nhej)去除和修复dna链，及恢复vii型胶原的产生。
52.图6：用核糖聚合复合物转染72小时后，rdebk的细胞活力。与未处理的相比，采用用于vii型胶原外显子80切除的核糖聚合复合物转染的rdeb角质形成细胞(rdebk)显示出高活力。
53.图7：采用核糖聚合复合物转染rdebk 72小时后的tracrrna标记，标度为100um。荧光显微图像示出了在用hank's溶液洗涤后，采用2ug rnp复合物转染rdebk 72小时后的荧光红色标记(tracr)。与hpae相比，核糖聚合复合物显示出相同(p3聚合物)、更高(聚合物p1和p2)和更扩散(y4聚合物)的信号(图7)。
54.图8：转染细胞dna的pcr产物的凝胶电泳图。通过初级转染角质形成细胞dna的pcr产物的凝胶电泳图，证明了核糖聚合复合物的矫正效率。与hpae相比，采用核糖聚合复合物(y4和p2)时，外显子切除后得到的条带更短，效率更高。
55.图9：rdeb人类移植物中水疱的荧光图像，示出了荧光标记的红色tracrrna。在rdeb人体移植模型中体内施用使用不同聚合物的核糖聚合复合物，局部和皮下注射核糖聚合复合物2天后，荧光标记的红色tracrrna表明，核糖聚合复合物通过rdeb水疱渗透到表皮基底层中。
56.图10：采用4-支化聚合物基因编辑系统在体内和离体处理的人源化rdeb皮肤移植物扩增dna(pcr)的凝胶电泳图。在rdeb人移植物的诱导伤口模型中，在体内单次局部施用12天后，检测到超过8％的矫正(图10左侧)。将用于在动物中产生伤口的移植物切除部分浸入到应用于动物的相同核糖聚合复合物溶液中。浸泡6天后分析样品，外显子切除矫正达到33.65％(图10右侧)。
57.图11：采用4-支化聚合物基因编辑系统局部转染7天后，通过免疫组织化学对人rdeb皮肤移植样品开展vii型胶原荧光检测。通过与vii型胶原的阳性和阴性对照(图11左侧)进行比较，证明了人vii型胶原表达在采用p2聚合物处理2次后恢复(图11右侧)。采用2个氨基末端非胶原结构域nc1(红色)和nc2(绿色)的抗体，确保vii型胶原矫正表达的功能。外皮蛋白检测确保移植皮肤(红色)的人类来源。
58.图12：3-支化聚合物基因编辑系统的转染效率：质粒与核糖核蛋白(rnp)对比。采用crispr质粒/3-支化聚合物复合物及crispr-rnp/3-支化聚合物核糖聚合复合物转染含有突变外显子80的永生化人rdeb角质形成细胞。质粒系统(左图)实现了低转染效率，而rnp系统实现了高转染效率。
59.图13：3-支化聚合物基因编辑系统的矫正效率：质粒与核糖核蛋白(rnp)对比：图13示出了由于采用不同的引物系统而导致的两种不同pcr扩增子大小。在相同的w/w比下，使用3-支化聚合物和crispr dna质粒复合系统实现了8.2％的矫正效率，而使用crispr rnp复合系统的效率提高到43.2％。图12中的荧光显微图像和pcr结果表明rnp复合物实现了更高的转染和矫正效率。
60.图14：基因编辑核糖聚合复合物的转染效率：3-支化聚合物与4-支化聚合物对比。在猪原代角质形成细胞中，y4聚合物和crispr rnp复合系统的矫正效率达到65.98％，显著高于在永生化细胞中使用3-支化聚合物实现的矫正效率(图14左侧)。使用y4聚合物，甚至在rdeb人原代角质形成细胞(已知很难转染的细胞)中也能实现矫正效率(图14右侧)。
具体实施方式
61.本文提到的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献均通过引用整体并入本技术中用于所有目的，就好像每个独立的出版物、专利或专利申请特定地及个别地通过引用而整体并入本技术中一样。
62.定义和一般偏好
63.除非另外特别说明，本文使用的以下术语除本领域中可能具有的任何更广泛(或更窄)的含义之外，还旨在具有以下含义：
64.除非上下文另外要求，否则本文使用的单数应理解为包括复数，反之亦然。与实体相关的使用的术语“一(a)”或“一(an)”应理解为指代一个或多个该实体。因此，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。
65.如本文所使用的，术语“包括(comprise)”或其变化形式，例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应理解为包括任何列举的整体(例如特征、元素、特性、性质、方法/工艺步骤或限制)或整体组(例如特征、元素、特性、性质、方法/过程步骤或限制)，但不排除任何其他整体或整体组。因此，如本文所使用的，术语“包括(comprising)”是包含性的或开放式的，并且不排除其它的、未列举的整体或方法/工艺步骤。
66.如本文所使用的，术语“疾病”用于定义损害生理功能并与特定症状相关的任何异常状况。该术语用于广泛地包括生理功能受损的任何病症、病、异常、病理、不健康、状况或综合征，而不管病因的性质(或实际上是否确定该疾病的病因基础)。因此，它包括由感染、外伤、损伤、手术、放射消融、衰老、中毒或营养缺乏引起的状况。
67.如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指治愈、改善或减轻疾病症状或消除其病因(或减轻其影响)(例如，减少溶酶体酶病理水平的积累)的干预(例如向受试者施用药剂)。在这种情况下，该术语与术语“疗法”同义地使用。
68.此外，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指在治疗的群体中预防或延迟疾病的发作或进展或降低(或根除)其发病率的干预(例如向受试者施用药剂)。在这种情况下，术语治疗与术语“预防”同义地使用。
69.如本文所使用的，药剂的有效剂量或治疗有效剂量定义了可以向受试者施用且没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称，但足以提供所需效果(例如通过受试者状况的永久或暂时改善证明实现治疗或预防)的剂量。剂量因受试者而异，取决于个体的年龄和一般状况、给药方式和其他因素。因此，虽然不可能指定准确的有效剂量，但本领域技术人员将能够利用常规实验和背景常识确定任何个体合适的“有效”剂量。本文的治疗结果包括症状的消除或减轻、疼痛或不适的减轻、存活期延长、活动能力提高和临床改善的其他标志。治疗结果不一定是完全治愈。改善可以在生物/分子标记、临床或观察性改善方面观察到。在优选的实施例中，本发明的方法适用于人类、大型赛跑动物(马、骆驼、狗)和家养伴侣动物(猫和狗)。
70.在如上定义的治疗和有效剂量的情况中，术语“受试者”(在上下文允许的情况下，将被理解为包括“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”)定义对其进行治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人类、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、骆驼、野牛、牛、奶牛；灵长类动物，如猿、猴子、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动
物，如马、驴、斑马等；食用动物，如牛、猪和羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；和啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。在优选的实施例中，受试者是人类。如本文所使用的，术语“马”是指马科哺乳动物，包括马、驴(donkeys)、驴(asses)、西藏野驴和斑马。
[0071]“基因编辑核糖核蛋白系统”或“基因编辑rnp系统”是指由核糖体蛋白与一个或多个核酸序列结合形成的复合物，其能够通过，例如删除或替换基因或基因片段(例如外显子)中的突变、将寡核苷酸插入到基因内(插入诱变)或调节基因的表达(敲低或敲除突变)来编辑哺乳动物中的基因。核酸可以是rna，其形式包括但不限于crrna、tracna、sgrna。通常，核酸是包括crrna和tracrrna的sgrna。核糖体蛋白可以是crispr核酸酶蛋白，例如，cas9、cas12a、cas14或cas变体，例如失活核酸酶(dcas9)的修饰形式。基因编辑核糖核蛋白系统可以进一步补充以dna或rna或两者组合的形式添加的核酸。补充核酸可以被整合到基因编辑核糖核蛋白系统中，通过同源定向修复诱导基因增强、基因沉默、基因添加、基因敲低、基因敲除、基因编辑。在一些实施例中，核酸可以以包括但不限于rna寡核苷酸、反义寡核苷酸的形式使用。dna可以以包括但不限于dna寡核苷酸、反义寡核苷酸、单链dna供体寡核苷酸、质粒dna的形式使用。基因编辑系统可以是crispr相关的cas系统(sander and joung(2014)crispr-cas systems for editing,regulating and targeting genomes nature biotechnology 32(4):347-355)、talen系统(boch j(february 2011)；"tales of genome targeting".nature biotechnology.29(2):135
–
6.doi:10.1038/nbt.1767.pmid21301438)、大范围核酸酶系统或锌指核酸酶(zfn)系统(carroll,d(2011)"genome engineering with zinc-finger nucleases".genetics society of america.188(4):77378doi:10.1534/genetics.111.131433.pmc 3176093.pmid 21828278)。在一个实施例中，基因编辑系统配置为对细胞进行插入诱变，例如obligare系统和crispr-cpf1系统(maresca et al.(2013)obligate ligation-gated recombination(obligare):custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining genome res.23:539-546；亦参见wo2014/033644),fagerlund et al.(2015)the cpf1 crispr-cas protein expands genome-editing tools genome biology 16:251-253；ledford(2015)bacteria yield new gene cutter smaller crispr enzyme should simplify genome editingnature 526:17)。本发明的基因编辑核糖核蛋白系统可用于基因添加、基因替换、基因敲低和基因编辑。基因替换定义为提供功能健康的基因拷贝以替代包含致病基因的功能失调的突变体。基因添加定义为补充靶向疾病机制的特定方面的治疗性基因。基因敲低定义为抑制靶基因合成导致疾病的有毒/功能失调蛋白质的能力的过程。基因编辑定义为改变靶基因核苷酸序列，从而导致基因表达功能丧失/矫正/操纵的过程。所述基因编辑系统包括但不限于i)成簇规律间隔回文重复序列(crispr)相关(cas)系统；(ii)转录激活因子样效应物核酸酶(talen)系统；或(iii)锌指核酸酶(zfn)系统。
[0072]“阳离子聚合物”是指带正电荷的聚合物。例如lpae、hpae、lbpae、聚β氨基酯超支化聚合物、超支化聚合物、超支化聚β氨基酯聚合物和超支化peg聚合物。
[0073]“聚-β氨基酯超支化聚合物”是指通过支化单体(例如具有三个、四个或更多个可与丙烯酸酯或胺基反应的反应位点的单体)、二丙烯酸酯基团及第一胺组分和第二胺组分之间的无规聚合形成的阳离子聚合物，从而提供具有3-d结构和多个端基的高度支化的聚
(β-氨基酯)(hpae)。此术语包括3-支化超支化聚合物和4-支化超支化聚合物。
[0074]“3-支化超支化聚合物”是指通过将具有三个可与丙烯酸酯或胺基团反应的反应位点的单体(三支化单体)与二丙烯酸酯及第一胺组分和第二胺组分反应形成的聚合物。在一个实施例中，使用低聚物组合方法形成聚合物，其中二丙烯酸酯和第一胺组分一起反应形成第一低聚物，第一低聚物和第二胺组分一起反应形成第二低聚物，第二低聚物和四支化单体一起反应形成本发明的超支化聚合物。zeng等人(nano.lett.2019 19,381-391)详细描述了这种低聚物组合方法。在另一个实施例中，四支化单体、二丙烯酸酯组分和第一胺组分在迈克尔加成反应中一起反应形成第一聚合物，第一聚合物和第二胺组分(封端胺)在迈克尔加成反应中一起反应形成本发明的超支化聚合物。us2017216455和zeng等人对3-支化超支化聚合物的实例进行了描述。
[0075]
4-4-支化超支化聚合物可以通过以下组分一起反应制备：
[0076]
(i)具有四个可以与丙烯酸酯或胺基反应的反应位点的四支化单体；
[0077]
(ii)通常具有式(i)的二丙烯酸酯组分，
[0078][0079]
其中z2是1至30个碳原子的直链或支链碳链、含杂原子的1至30个原子的直链或支链碳链、含3至30个碳原子的碳环或含3至30个原子的杂环；
[0080]
其中z2未被取代或被卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基(sulphonamide group)、硫醇、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6醚、c1-c6硫醚、c1-c6砜、c1-c6亚砜、c1-c6伯酰胺、c1-c6仲酰胺、卤代c1-c5烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-oc(0)nr'r'、-n(r')c(0)nr'r、-n(r')c(0)0-c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c3-c6杂环基、c2-c5杂芳基和c6-c10芳基中的至少一种取代；其中每个r'独立地选自由氢和c1-c6烷基组成的组；
[0081]
(iii)通常包含3至20个原子的第一胺组分，
[0082]
其中所述胺组分通常未被取代或被卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、硫醇、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6醚、c1-c6硫醚、c1-c6砜、c1-c6亚砜、c1-c6伯酰胺、c1-c6仲酰胺、卤代c1-c6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-oc(0)nr'r'、-n(r')c(0)nr'r、-n(r')c(0)0-c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c3-c6杂环基、c2-c5杂芳基和c6-c10芳基中的至少一种取代；其中每个r'独立地选自由氢和c1-c6烷基组成的组；和
[0083]
(iv)通常包含3至20个原子的第二胺组分，
[0084]
其中所述胺组分通常未被取代或被卤素、羟基、氨基、磺酰基、磺酰胺基、硫醇、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6醚、c1-c6硫醚、c1-c6砜、c1-c6亚砜、c1-c6伯酰胺、c1-c6仲酰胺、卤代c1-c6烷基、羧基、氰基、硝基、亚硝基、-oc(0)nr'r'、-n(r')c(0)nr'r、-n(r')c(0)0-c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c3-c6杂环基、c2-c5杂芳基和c6-c10芳基中的至少一种取代；其中每个r'独立地选自由氢和c1-c6烷基组成的组。
[0085]
在一个实施例中，使用低聚物组合方法形成聚合物，其中二丙烯酸酯和第一胺组分一起反应形成第一低聚物，第一低聚物和第二胺组分一起反应形成第二低聚物，第二低
聚物和四支化单体一起反应形成本发明的超支化聚合物。zeng等人(nano.lett.2019 19,381-391)详细描述了这种低聚物组合方法。在另一个实施例中，四支化单体、二丙烯酸酯组分和第一胺组分在迈克尔加成反应中一起反应形成第一聚合物，第一聚合物和第二胺组分(封端胺)在迈克尔加成反应中一起反应形成本发明的超支化聚合物。
[0086]“四支化单体”是指具有四个可以与丙烯酸酯或胺基反应的反应位点的组分。四支化单体的实例包括二胺和四丙烯酸酯组分，其实例在上文中提供。支架还可以是4-臂peg组分、季戊四醇基团、四缩水甘油基团或四取代硅烷基团。反应性基团可以是任何丙烯酰胺组分(包括马来酰亚胺)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)组分、硫醇组分和环氧组分。以下是可用于本发明的工艺和产品中的四支化单体的具体实例：
[0087]
4-臂peg丙烯酰胺
[0088][0089]
4-臂peg-马来酰亚胺
[0090]
4-臂peg-琥珀酰亚胺碳酸酯nhs
[0091][0092]
四硫醇组分
[0093]
季戊四醇四(3-巯基丙酸酯)：
[0094][0095]
4-臂peg-硫醇：
[0096][0097]
四(2-巯基乙基)硅烷：
[0098]
[0099]
四环氧组分
[0100]
四缩水甘油基亚甲基二苯胺：
[0101][0102]
四缩水甘油基1,1'-亚甲基双(萘-2,7-二醇)：
[0103][0104]
季戊四醇四缩水甘油醚：
[0105][0106]
4-臂聚乙二醇环氧化物
[0107][0108]“接头”是指任何接头基团，包括芳基或烷基。优选的接头包括o、nh、ch2、烷基、低级烷基、烷氧基、低级烷氧基、o-烷基、ch2o、ch2nh和ch2nhcoch2、co、coo。
[0109]“二胺组分”是指具有通过接头连接的两个官能nh2基团的部分。“四丙烯酸酯”是指具有四个丙烯酸酯官能团的部分。
[0110]“低级烷基”是指如下定义的烷基，但在其主链结构中具有1-10个碳原子，更优选1-6个碳原子(例如“c-c-烷基”)。
[0111]“烷基”是指含有1至8个碳原子的基团，可以是直链或支链基团。烷基是任选取代的直链、支链或环状饱和烃基。当被取代时，烷基可以在任何可用的连接点被不超过四个取代基取代。当称烷基被烷基取代时，这与“支链烷基”可互换使用。示例性未取代的此类基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、α-丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。示例性的取代基可以包括但不限于以下一个或多个基团：卤素(例如f、cl、br、i)、卤代烷基(例如ccl3或cf3)、烷氧基、烷硫基、羟基、羧基(-cooh)、烷氧基羰基(-c(o)r)、烷基羰氧基(-ocor)、氨基(-nh2)、氨基甲酰基(-nhcoor-或-oconhr)、脲(-nhconhr-)或硫醇(-sh)。定义的烷基还可以包含一个或多个碳双键或一个或多个碳碳三键。
[0112]“低级烷氧基”是指o-烷基，其中烷基如上文所定义。烷氧基通过氧桥键合到核心化合物上。烷氧基可以是直链或支链；虽然优选是直链。其实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、异丙氧基等。优选烷氧基含有1-4个碳原子，特别优选烷氧基含有1-3个碳原子。最优选烷氧基是甲氧基。
[0113]“卤素”是指元素周期表第17族的非金属元素，即溴、氯、氟、碘和砹。
[0114]
术语“烷基”、“环烷基”、“杂环烷基”、“环烷基烷基”、“芳基”、“酰基”、“芳族多环(aromatic polycycle)”、“杂芳基”、“芳烷基”、“杂芳烷基”、“氨基酰基”、“非-芳香多环”、“混合芳基和非芳基多环”、“多杂芳基(polyheteroaryl)”、“非芳香多杂环”、“混合芳基和非芳基多杂环”、“氨基”和“磺酰基”在us6,552,065第4栏第52行至第7栏第39行定义。
[0115]“卤素”是指元素周期表第17族的非金属元素，即溴、氯、氟、碘和砹。
[0116]“纳米颗粒组合物”是指纳米尺寸范围的组合物。在一个实施例中，颗粒组合物的粒径小于2μm、1.5μm、1000nm，例如20-900nm、50-800nm、50-700nm、50-600nm、50-500nm、50-400nm、50-300nm、100-300nm、150-250nm或大约200nm。
[0117]“基因疗法/编辑”：本发明可用于以定向特异性方式编辑细胞基因组的一部分或采用外源dna插入物替换细胞基因组的一部分。
[0118]
因此，本发明可用于编辑或替换致病基因的缺陷部分(即用于基因修复)，或使表达与疾病相关的基因插入失活(即沉默)，或编辑或修饰基因，例如删除引起疾病的突变或修饰或添加基因正常发挥功能所需的残基。
[0119]
因此，本发明在如本文所定义的基因疗法中得到应用。
[0120]
根据本发明的基因疗法可以靶向生物体中的所有细胞，或者可以靶向细胞亚群(例如，靶向选定的器官、组织或细胞)。
[0121]
根据本发明的基因疗法可以特异性靶向体细胞。
[0122]
根据本发明的基因疗法可以排除靶向生殖细胞。它可以排除靶向全能细胞。它可以排除靶向人类胚胎。
[0123]
在根据本发明的基因疗法应用于选定器官、组织或细胞的情况下，所述方法可以离体应用于分离的器官、组织或细胞(例如血液、血细胞、免疫细胞、骨髓细胞、皮肤细胞、神经组织、肌肉等)。
[0124]
基因疗法可用于治疗任何遗传性病症，尤其是单基因突变引起的病症。因此，基因疗法特别应用于治疗溶酶体贮积病、肌营养不良症、囊性纤维化病、马凡综合征、镰状细胞贫血症、侏儒症、苯丙酮尿症、神经纤维瘤病、亨廷顿病、成骨不全症、地中海贫血症和血色素沉着病。
[0125]
可能适用于根据本发明的基因疗法的其他疾病包括：血液、凝血、异质性皮肤病、细胞增殖和失调、瘤形成(包括癌症)、炎性过程、免疫系统(包括自身免疫疾病)、新陈代谢、肝、肾、肌肉骨骼、神经、神经元和眼组织发生的疾病和病症。
[0126]
示例性皮肤病包括隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)，这是一种由col7a1基因中的双等位基因功能丧失突变引起的罕见异质性皮肤病。其他皮肤病可能包括：替代eb亚型，例如单纯性eb和交界性eb、表皮松解性掌跖角化病、hailey-hailey病、达里埃病、局部常染色体隐性遗传性少毛症。
[0127]
示例性血液和凝血疾病和病症包括：贫血症、裸淋巴细胞综合征、出血性病症、因子h、因子h样1、因子v、因子viii、因子vii、因子x、因子xi、因子xii、因子xiiia、因子xiiib缺乏症、范可尼贫血、噬血细胞性淋巴细胞增多症、血友病a、血友病b、出血性病症、白细胞缺乏症、镰状细胞贫血症和地中海贫血症。
[0128]
免疫相关疾病和病症的实例包括：艾滋病；自身免疫性淋巴增生综合征；联合免疫缺陷；艾滋病毒-1；hiv易感性或感染；免疫缺陷和严重联合免疫缺陷(scld)。本发明可以治疗的自身免疫性疾病包括格雷夫斯病、类风湿性关节炎、桥本氏甲状腺炎、白癜风、i型(早发性)糖尿病、恶性贫血、多发性硬化、肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮(sle，狼疮)和干燥综合征。其他自身免疫性疾病包括硬皮病、牛皮癣、强直性脊柱炎、重症肌无力、天疱疮、多发性肌炎、皮肌炎、葡萄膜炎、格林-巴利综合征、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎(通常统称为炎症性肠病(ibd))。
[0129]
其他示例性疾病包括：淀粉样神经病；淀粉样变性；囊性纤维化；溶酶体贮积病；肝腺瘤；肝功能衰竭；神经系统病症；肝脂肪酶缺乏症；肝母细胞瘤、癌症或癌；髓质囊性肾病；苯丙酮尿症；多囊肾；或肝病。
[0130]
示例性肌肉骨骼疾病和病症包括：肌营养不良症(例如duchenne型和becker型肌营养不良症)、骨质疏松症和肌肉萎缩症。
[0131]
示例性神经和神经元疾病和病症包括：als、阿尔茨海默病；自闭症；脆性x综合征、亨廷顿病、帕金森病、精神分裂症、分泌酶相关病症、三核苷酸重复障碍、肯尼迪病、弗里德里希共济失调、马查多-约瑟夫病、脊髓小脑共济失调、强直性肌营养不良和齿状核红核苍白球路易体萎缩症(drpla)。
[0132]
示例性眼部疾病包括：年龄相关性黄斑变性、角膜混浊和营养不良、先天性扁平角膜、青光眼、莱伯先天性黑蒙和黄斑营养不良。
[0133]
根据本发明的基因疗法特别适用于治疗溶酶体贮积症。下面列出了示例性溶酶体贮积症和相应的有缺陷的酶：
[0134]
[0135][0136]
根据本发明的基因疗法还特别适用于治疗蛋白质静力学疾病(proteostatic diseases)，包括聚集性和错误折叠蛋白质静力学疾病，例如朊病毒病、各种淀粉样变性和神经退行性疾病(例如帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病)、某些形式的糖尿病、肺气肿、癌症和囊性纤维化。
[0137]
根据本发明所述的基因疗法特别适用于治疗囊性纤维化。当cftr基因发生突变导致离子通道活性降低(通过错误折叠的cftr蛋白的清除增加)时，就会发生囊性纤维化。
[0138]
根据本发明所述的基因疗法特别适用于治疗扩增cag重复序列疾病。这些疾病源于特定基因cag重复序列的扩增，其中编码的蛋白质具有相应的多聚谷氨酰胺束，导致在神经元细胞核和细胞质中聚集和积累。突变亨廷顿蛋白的聚集氨基末端片段对神经元细胞有毒，并被认为介导神经变性。实例包括亨廷顿病(hd)，其特征在于主要在皮质和纹状体中的选择性神经元细胞死亡。在至少七种其他遗传性神经退行性病症中也发现了cag扩增，包括例如脊髓和延髓肌肉萎缩症(sbma)、肯尼迪病、某些形式的肌萎缩性侧索硬化症(als)、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(drpla)和1、2、3、6和7型脊髓小脑共济失调(sca)。
[0139]
根据本发明的基因疗法特别适用于治疗任何瘤形成，包括增殖性疾病、良性、癌前和恶性瘤形成、增生、化生和发育异常。因此，本发明可用于治疗增殖性疾病，包括但不限于癌症、癌症转移、平滑肌细胞增殖、系统性硬化病、肝硬化、成人呼吸窘迫综合征、特发性心肌病、红斑狼疮、视网膜病(例如糖尿病性视网膜病)、心脏增生、良性前列腺增生、卵巢囊肿、肺纤维化、子宫内膜异位症、纤维瘤病、错构瘤、淋巴管瘤病、结节病和硬纤维瘤。涉及平滑肌细胞增殖的瘤形成包括脉管系统中细胞的过度增殖(例如内膜平滑肌细胞增生、再狭窄和血管闭塞，尤其包括生物或机械介导的血管损伤(例如血管成形术)后的狭窄)。此外，
内膜平滑肌细胞增生可包括除脉管系统外的平滑肌增生(例如，肾间质纤维化患者的胆管、支气管气道和肾脏的阻塞)。非癌性增殖性病症还包括皮肤细胞过度增殖(例如牛皮癣及其各种临床形式)、赖特综合征、毛发红糠疹及角化病的各种过度增殖形式(包括光化性角化病、老年性角化病和硬皮病)。特别优选的是治疗恶性瘤形成(癌症)。
[0140]
施用
[0141]
本发明的组合物可适用于局部、口服、直肠、肠胃外、肌肉内、腹膜内、动脉内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻内、阴道、颊、眼部或舌下施用途径。对于口服施用，特别使用压制片剂、丸剂、片剂、滴剂和胶囊剂。优选地，这些组合物每剂含有0.01至250mg，更优选0.1-10mg的活性成分。其他施用形式包括溶液或乳剂，它们可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、腹膜内或肌肉内注射，并且由无菌或可杀菌的溶液配制。本发明的药物组合物还可以是混悬剂、乳剂、洗剂、软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾、喷雾剂、溶液或撒粉的形式。本发明的组合物可配制用于局部递送。局部递送通常指递送至皮肤，但也可指递送至衬有上皮细胞的体腔，例如肺或气道、胃肠道、颊腔。具体地说，用于局部递送的制剂在david osborne和antonio aman、taylor&francis编辑的《局部药物递送制剂》(topical drug delivery formulations)中进行了描述，其全部内容通过引用并入本发明中。用于递送至气道的组合物或制剂在o’riordan等人的论文(respir care,2002,nov.47)、ep2050437、wo2005023290、us2010098660和us20070053845中进行了描述。将活性剂递送至回肠，尤其是近端回肠的组合物和制剂包括微粒和微胶囊，其中活性剂被包封在由聚合物或乳蛋白形成的保护性基质中，所述基质具有耐酸性，但在碱性更强的回肠环境中易于溶解。这种递送系统的实例在ep1072600.2和ep13171757.1中进行了描述。另一种经皮施用方式是使用皮肤贴剂。例如，可以将活性成分掺入到由聚乙二醇或液体石蜡的水乳液组成的乳膏中或掺入到水凝胶中。还可以将活性成分以1-10重量％的浓度掺入到由白蜡或白软石蜡基质以及可能需要的稳定剂和防腐剂组成的软膏中。
[0142]
可注射形式每剂可含有10-1000mg，优选10-250mg的活性成分。
[0143]
可以以单位剂量形式配制组合物，即以含有单位剂量或多个单位剂量或亚单位单位剂量的独立部分形式配制。
[0144]
本领域普通技术人员无需过度实验即可很容易地确定向受试者施用的本发明组合物的适当剂量。通常，医生将确定最适合个体患者的实际剂量，这取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄率、药物组合、特定病症的严重程度以及接受疗法的个体。本文公开的剂量是平均情况的示例。当然，可能存在需要更高或更低剂量范围的个别情况，这些都在本发明的范围内。根据需要，所述药剂的施用剂量是0.01至50mg/kg体重，例如0.1至10mg/kg，更优选0.1至1mg/kg体重。
[0145]
术语“药学上可接受的赋形剂”是指与聚合复合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。所述药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用该药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射的液体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、石灰石、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，
所述组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂，或皮肤渗透促进剂。这些组合物可以采取溶液、混悬剂、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。
[0146]
实施例
[0147]
现在将参考具体实例描述本发明。这些实例只是示例性的，仅用于说明目的：它们并非旨在以任何方式限制所要求保护的垄断范围或所描述的发明。这些实例构成了目前设想的实践本发明的最佳方式。
[0148]
阳离子聚合物(y聚合物(4-支化二胺))的合成
[0149]
根据以下方案1，采用bda、eda(或hmda)、s5和da(或data)单体制备4-支化二胺超支化阳离子聚合物的实施方案。
[0150]
采用以下单体：bda、eda(或hmda)、s5和da(或data)合成阳离子y聚合物。通过“a2 b4 c2”迈克尔加成策略，使用市售单体共聚形成y聚合物。反应系统中每个选择的单体在最终的y4聚合物中都发挥非常关键的作用。采用二胺单体(b4)作为支化单元，通过与线性二丙烯酸酯单体(a2)结合而生成高度支化的聚合物。进一步的合成后改性涉及采用其它(胺单体，c2)封端聚合物末端基团，以脱除任何未反应的乙烯基。将单体加入到带有磁力搅拌的圆底烧瓶中。将烧瓶部分浸没在油浴中，并在90℃开展聚合反应。通过采用凝胶渗透色谱(gpc)测定分子量、转化率和pdi，跟踪聚合物合成反应的进程。聚合物分子量(mw)接近10-20kda时，通过从热源撤出并用dmso稀释使反应停止。通过使聚合物溶液与胺封端剂在室温下反应48小时，来实现y聚合物链终止。封端后，通过在过量二乙醚中沉淀两次来纯化y聚合物，从而脱除任何剩余的残留单体、未反应的封端剂和小的低聚物。为了获得最终产品，将y聚合物在真空烘箱中干燥48小时，以脱除残留溶剂。
[0151]
阳离子聚合物(p聚合物(4-支化四丙烯酸酯，p1、p2和p3))的合成
[0152]
根据以下方案2，采用bda、ptta(或dtta)、s5和da(或data)单体制备4-支化四丙烯酸酯超支化阳离子聚合物的实施方案。
[0153]
将bda、ptta(或dtta)和s5混合到含有dmso作为溶剂的烧瓶中。反应在90℃进行，直到达到目标mw。通过撤走反应烧瓶的热源并用冰冷却使反应停止。将封端单体da(或data)加入到含有dmso的烧瓶中，在室温下与丙烯酸酯残余物反应48小时。然后，将反应混合物沉淀到过量的乙醚中两次，以脱除单体和低聚物。通过在真空烘箱中干燥，得到mw分别是7kda和10kda的p1和p2聚合物(bda ptta s5 da)。通过相同的程序，得到mw为10kda的p3聚合物(bda ptta s5 data)。
[0154]
阳离子聚合物(hpae聚合物-3-支化三丙烯酸酯)的合成
[0155]
将4-氨基-1-丁醇(s4)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(tmpta)和双酚a乙氧基化二丙烯酸酯(be)通过一锅“a2 b3 c2”型迈克尔加成进行聚合。然后，通过封端引入官能性3-吗啉代丙胺(mpa)，进一步增强hpae作为基因载体的特性和功能(wo2016/020474)。
[0156][0157]
方案1
[0158][0159]
方案2
[0160][0161]
方案3
[0162]
本发明的纳米颗粒组合物(核糖聚合复合物)的合成
[0163]
核糖聚合复合物这样形成：在使用前，首先在合适的溶剂(例如25mm乙酸钠)中配制聚合物水溶液和核糖核蛋白复合物溶液，将溶解的核糖核蛋白和溶解的聚合物以1:1v/v的比例混合在一起，将聚合物-核糖核蛋白复合物溶液在室温下孵育10分钟，形成核糖聚合复合物。应剧烈混合核糖聚合复合物水溶液，确保溶液均匀。将核糖核蛋白复合物与不同的阳离子聚合物(上述p1、p2和p3)复合。
[0164]
针对这一特定应用，开发了核糖核蛋白复合物用于治疗隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)。使用核糖聚合复合物治疗rdeb遵循的策略是使用由cas9和2个单向导rna与荧光标记的红色tracrrna复合形成的rnp复合物，切除vii型胶原外显子80(图5)。vii型胶原外显子80含有大量产生终止密码子的rdeb突变，例如最常见的一个突变是c.6527insc。切除外显子后，获得的vii型胶原完全发挥作用，仅产生30％的矫正蛋白即可改善症状。
[0165]
crrna和tracrrna均使用不含核酸酶的双重缓冲液稀释至100μm，其中hifi cas9核酸酶按照制造商的说明以62μm的原液浓度使用。制备rnp复合物，从而sgrna(crrna tracrrna)：cas9的摩尔比是1-9:1。将预混液在热循环仪中在95℃加热5分钟，使crrna和tracrrna退火。然后，将它们从热源中取出，并在工作台上冷却至室温。向每个预混液中加入hifi cas9核酸酶，并让其在室温下避光复合15分钟。以与基于质粒dna的转染类似的方式，制备聚合物：rnp聚合复合物(核糖聚合复合物)用于转染。如前所述，将聚合物在25mm乙酸钠缓冲液中稀释至所需浓度。每次转染使用等量的每种rnp预混液1和2。为了计算聚合物
的w/w比，使用rnp复合物的总重量。为了形成复合物，将聚合物溶液与rnp溶液以1:1v/v的比例混合。通过上下移液混合在一起后，将复合物在室温下孵育15分钟，允许聚合物-rnp相互作用。一旦孵育完成，就可以将核糖聚合复合物溶液在适当的细胞培养基中稀释并添加到细胞中。转染4小时后，更换培养基，并替换为新鲜培养基。采用tracrrna上的atto 550nm荧光团作为转染效率的指标。
[0166]
转染细胞的活力
[0167]
采用定量测定细胞增殖和代谢健康的alamarblue
tm
测定法，评估不同聚合复合物条件诱导的细胞毒性。在细胞转染实验后48-72小时，评估细胞活力。从孔板的细胞中除去培养基，每孔采用hbss(汉克斯平衡盐溶液)洗涤细胞。然后，将100μl alamarblue
tm
工作溶液(10％alamarblue
tm hbss溶液)添加到每个孔中，并在正常细胞培养条件下避光孵育2小时。孵育后，将alamarblue
tm
溶液转移到新的平底96孔板中，并采用spectramax m3多功能酶标仪记录570nm和600nm处的吸光度。从每个样品中减去作为背景读数的仅含alamarblue
tm
试剂的孔的读数。未处理的细胞用于标准化荧光值，并绘制为100％活力。
[0168]
细胞转染效率
[0169]
细胞在转染前24小时至48小时接种，以允许附着在孔板和烧瓶上。细胞以优化的细胞密度接种。在转染当天，制备聚合物-dna复合物，并在复合后与适当的细胞培养基混合，使最终的聚合复合物溶液不超过总培养基体积的20％。将含有聚合物-dna复合物的细胞培养基添加到细胞中，4小时后去除该培养基，并用新鲜培养基替换以去除复合物。
[0170]
在rdeb人移植模型中，体内施用采用不同聚合物的核糖聚合复合物
[0171]
可以在已建立的基于生物工程人类皮肤移植免疫缺陷小鼠的皮肤人源化小鼠模型系统中评估核糖聚合复合物的体内效率，其中将从皮肤活检中分离的人成纤维细胞和角质形成细胞在体外扩增以产生rdeb人类生物工程皮肤。然后将组织生物工程皮肤等效物移植到无胸腺小鼠中。基于此设置的稳定植入的皮肤人源化小鼠模型代表了模型病理生理过程和测试创新治疗方案的有用的临床前平台。在用凡士林划定治疗表面或在移植物内的模拟伤口中划定治疗表面后，将核糖聚合复合物悬浮液局部和/或皮内施用于rdeb移植物。一定时间后，可以通过机械拉动移植物来测试移植物的结构稳定性，也可以进行2mm穿孔活检来评估矫正效率。在评估结束时，通过pcr(图10)、vii型胶原免疫荧光(图11)、组织学评估的检测和通过透射电子显微镜(tem)确认锚定原纤维来评估移植组织的矫正条带。
[0172]
3-支化聚合物基因编辑系统的转染效率：质粒和核糖核蛋白(rnp)对比
[0173]
将含有突变外显子80的永生化rdeb角质形成细胞接种到孔板上。24小时后，使用crispr-cas9质粒或crispr-cas9-rnp复合物进行转染，通过使用双rna向导系统切除突变外显子80来矫正角质形成细胞。将孔板与复合物一起孵育4小时，然后以新鲜培养基补充培养基。转染48小时后，拍摄荧光图像，其中来自crispr-cas9质粒系统的报告gfp蛋白(绿色)和荧光tracrrna(红色)标记已转染的细胞(图12)。在胰蛋白酶化细胞后，提取dna并进行pcr扩增。将pcr产物在琼脂糖凝胶电泳上运行，通过存在代表缺失外显子80的dna的较小条带产物，确认col7a1矫正成功。图13示出了由于采用不同的引物系统而导致的两种不同pcr扩增子大小。在相同的w/w比下，使用3-支化聚合物和crispr dna质粒实现了8.2％的矫正效率，而使用crispr rnp复合系统的效率提高到43.2％。荧光显微图像和pcr结果表明rnp复合物实现了更高的转染和矫正效率。
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基因编辑核糖聚合复合物的转染效率：3-支化聚合物与4-支化聚合物对比
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采用相同的crispr-cas9 rnp复合物，及采用与3-支化聚合物转染永生化rdeb角质形成细胞的相同方案，将来自不同来源(健康猪和rdeb人)的原代角质形成细胞进行转染。值得注意的是，3-支化聚合物用于转染已被证实比原代细胞更容易转染的永生化细胞。转染48小时后，提取dna并进行pcr扩增；琼脂糖凝胶电泳显示了外显子80切除导致的矫正条带(由于针对细胞来源使用不同的引物，扩增子具有不同的大小)。在猪原代角质形成细胞中，y4聚合物和crispr rnp复合系统的矫正效率达到65.98％，显著高于3-支化聚合物在永生化细胞中实现的矫正效率(图14左侧)。使用y4聚合物甚至在rdeb人原代角质形成细胞(已知很难转染的细胞)中也能实现矫正效率(图14右侧)。
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等同物
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前面的说明详细描述了本发明的当前优选实施方案。在考虑这些说明后，本领域技术人员预期在其实践中可以进行许多修改和变化。这些修改和变化都旨在包含在本文所附权利要求中。