核苷酸的正交去封闭的制作方法

核苷酸的正交去封闭
1.本技术是申请日为2016年7月8日，申请号：201680036416.6，发明名称为“核苷酸的正交去封闭”的中国发明专利申请的分案申请。


背景技术：

2.本公开一般涉及核酸分析，并且更具体地涉及核酸测序。
3.目前可用于对dna测序的商业平台相对昂贵。这些平台使用所谓的“合成测序”方法，因为dna聚合物是在检测添加到生长中的聚合物结构的每种单体(即核苷酸)的同时合成的。由于模板dna链严格指导新dna聚合物的合成，可以从在合成中添加到生长的链的一系列核苷酸单体来推测dna模板的序列。通过通常在生物系统中进行dna合成的生化组分的特殊工程化变体来促进检测单体添加的能力。这些工程化的成分制造相对昂贵，并且在合成测序期间相对大量消耗。此外，监测反应使用相对昂贵的硬件，例如激光器、检测光学器件(optics)和复杂的流体递送系统。即便在可以开始合成测序之前，迄今为止最成功的商业平台也需要昂贵的试剂和硬件来扩增dna模板。这些平台的复杂性和成本已经阻碍了它们在对技术有明确需求的临床和研究环境中的使用。
4.因此，需要对边合成边测试平台进行改进，使其更具成本效益、快速和便捷。本公开解决了这种需要并且还提供了其它优点。


技术实现要素：

5.本公开提供了用于鉴定核酸模板的方法。所述方法可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含至少两种不同核酸模板的混合物；(b)分别用含有不同可逆封闭部分的不同核苷酸类似物延伸在每个所述位点处与所述不同核酸模板杂交的引物，从而在每个位点处产生不同的引物延伸产物；(c)检测所述不同的引物延伸产物，以区分每个位点处的所述不同的核苷酸类似物；和(d)在每个所述位点处，使用对第一不同可逆封闭部分选择性的第一处理和对第二不同可逆封闭部分选择性的第二处理来从所述引物延伸产物除去所述不同可逆封闭部分。任选地，所述方法还包括(e)重复(b)至(d)以测定在每个位点处添加到每个所述不同延伸产物的不同核苷酸类似物的序列。
6.还提供了用于对核酸模板测序的方法，其可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与第二核酸模板的序列不同的序列，其中将第一引物与第一核酸模板结合，并且其中将第二引物与第二核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第二引物的；(b)通过添加附接至可逆封闭部分的第一核苷酸类似物来延伸所述第一引物，其中附接至第一核苷酸的可逆封闭部分与附接至第二引物的所述可逆封闭部分不同；(c)选择性除去附接至所述第二引物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第一引物的核苷酸类似物的可逆封闭部分；(d)通过添加附接至可逆封闭部分的第二核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(e)在每个位点处检测添加到第一引物的核苷酸类似物和添加到第二引物的核苷酸类似
物，从而在每个位点处测定第一模板和第二模板的不同序列。任选地，所述方法还可以包括步骤(f)选择性除去附接至添加到第一引物的第一核苷酸类似物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第二引物的第二核苷酸类似物的可逆封闭部分；(g)在(f)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第三核苷酸类似物来延伸所述第一引物；(h)选择性除去附接至添加到第二引物的第二核苷酸类似物的可逆封闭部分，而保留附接至添加到第一引物的第一核苷酸类似物的可逆封闭部分；(i)在(h)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第四核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第三核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第四核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(h)在每个位点处，检测添加到(g)中所述第一引物的核苷酸类似物和添加到(i)中所述第二引物的核苷酸类似物，从而在每个位点处测定第一模板和所述第二模板的不同序列。任选地，可以重复步骤(f)至(h)。
7.还提供的是用于对核酸模板测序的方法，其可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列，其中将第一引物与所述第一核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第一引物的，其中将第二引物与所述第二核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第二引物的，并且其中附接至所述第一引物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分不同；(b)选择性除去附接至所述第一引物的可逆封闭部分，而保留附接至所述第二引物的可逆封闭部分；(c)通过添加附接至可逆封闭部分的第一核苷酸类似物来延伸所述第一引物；(d)选择性除去附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；(e)通过添加附接至可逆封闭部分的第二核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(f)在每个所述位点处检测添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物和添加到所述第二引物的所述核苷酸类似物，从而在每个所述位点处测定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
8.本公开还提供了核酸阵列，其包含固体支持物上的多个位点，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有的序列不同于所述第二核酸模板的序列，其中第一引物结合至所述第一核酸模板，第一可逆封闭部分附接至所述第一引物，其中第二引物结合至所述第二核酸模板，第二可逆封闭部分附接至所述第二引物，和其中所述第一可逆封闭部分与所述第二可逆封闭部分是不同的。
附图说明
9.图1显示了在阵列的位点处对两个模板的混合物同时进行的合成测序的循环图，其中同时切割存在于相同延伸产物上的标记物部分和去封闭部分的子集(subset)。
10.图2显示了在阵列的位点处对两个模板的混合物同时进行的合成测序的循环图，其中同时切割存在于不同延伸产物(即在r1和r2反应两者中所产生)上的标记物部分。
具体实施方式
11.本公开提供了用于核酸的高密度检测的方法。本公开方法的具体实施方案利用已知技术来操作和检测核酸。然而，如下列出的改进提供了正交处理使得增加了使用这些技
术获得的信息密度。
12.基于引物延伸的检测技术的例子说明可以获得的增加的信息密度。具体而言，可将核酸的靶序列与引物杂交，并通过dna聚合酶延伸引物以添加标记的核苷酸类似物。可以使用具有多个位点的阵列形式，每个位点具有与在其它位点处存在的靶序列不同的单一靶序列。任选地，也可以使用数种不同的核苷酸类似物种类，每种具有可区分的标记物。引物延伸导致将标记的核苷酸类似物募集到具有靶序列的核酸。在使用不同标记的核苷酸类似物的阵列形式中，可以区分募集到每个位点处的标记物，并使用该信息来识别所述位点处的靶核酸。从该阵列形式获得的信息密度为每个位点处识别的一个目标序列。
13.在本公开的正交形式中，阵列的每个位点可以含有同时处理(例如用化学试剂或物理操作)和同时观察(例如，用分辨率太低而不能在空间上分辨混合物中的核酸的检测器)的两种或更多种不同靶序列的混合物。尽管如此，本文阐述的正交处理产生了允许不同靶序列可彼此区分的不同效应。在这种情况下，衍生自阵列的信息至少可以倍增。可以将两种不同的引物递送到阵列，并且由于差异性互补，它们将在各自单独的位点处与两个不同的模板序列分别杂交。第一引物可具有第一可逆封闭部分，该第一可逆封闭部分阻止它延伸，直到应用第一去封闭处理，并且第二引物可具有第二可逆封闭部分，该第二可逆封闭部分阻止它延伸，直到应用第二去封闭处理。在该示例中，与第二可逆封闭部分相比，第一去封闭处理对于第一可逆封闭部分是选择性的，并且与第一可逆封闭部分相比，第二去封闭处理对于第二可逆封闭部分是选择性的。这种选择性的去封闭能力提供了正交性(orthogonality)，使得引物(尽管暴露于每种去封闭处理)可以单独修饰用于延伸和检测。因此，即使分子本身不能充分分离以允许使用所使用的检测系统进行空间区分，两种引物，更重要的是指导它们延伸的模板可以通过这种化学转换加以区分。
14.如上示例的用于基于引物延伸的检测技术的正交性(orthogonality)的概念可以容易地应用于合成测序(sbs)技术。图1中示出了位点处用于两个模板(r1和r2)的正交sbs的示例性循环图。图中的第一列代表阵列所暴露的处理(即，将两个模板都暴露于处理)。第二和第三栏分别说明了所述处理对第一模板和第二模板的影响。在第一循环的第一步中，将引物的混合物与阵列接触，这导致与各自的引物结合位点的杂交。步骤1后，通过封闭物1来封闭杂交到r1模板的r1引物，并且r2引物缺乏封闭基团(优选地，可以通过正交封闭部分(封闭物2)来封闭引物r2)。如此，两个引物可以分开延伸。例如，在第一循环的第二步中，将具有封闭物2和标记物2的核苷酸递送到阵列，这导致未封闭的r2引物的选择性延伸(即，不延伸r1引物)。然后，在第一循环的第三步中，例如可以通过切割封闭物1(即不切割封闭物2)来将阵列暴露于处理，该处理选择性去封闭r1引物。在第一循环的第四步中，将具有封闭物1和标记物1的核苷酸递送到阵列，这导致了未封闭的r1引物的选择性延伸(即，不延伸r2引物)。然后可以使用检测装置来观察阵列，使得可以在每个位点处区分两种标记物。如图1所示，可以循环重复递送封闭且标记的核苷酸、切割封闭基团和标记物和检测的循环。
15.如以上和图1所示，用于延伸引物的核苷酸类似物可以包括可逆封闭部分，该部分是可选择性切割的，以通过合成测序过程的多个循环来提供正交对照。因此，核苷酸类似物可以以两组提供：第一组具有第一可逆封闭部分(例如与第一引物上的可逆封闭部分相同，封闭物1)和第二组具有第二可逆封闭部分(即封闭物2)。在一些实施方案中，第一组中的核苷酸类似物可以具有标记物，该标记物与第二组中的核苷酸类似物上的标记物可区分(例
如图1中，在标记物1处标示第一组，并且在标记物2处标示第二组)。生化反应性和标记物管理中的所得正交性允许在阵列的每个位点处彼此区分两个引物延伸事件。因此，可以可区分地检测两种靶序列。
16.应该理解，其它方法也可以从如下面更为详细阐述的正交操作和检测中受益。因此，本文阐述的组合物，装置和方法不需要限于测序应用。
17.可以利用正交性来将信息密度获取增加2倍或更多倍。例如，通过使用超过两个正交试剂组可以获得超过2倍的信息密度增加。作为例子，可以使用3个试剂组，其包含3种不同的去封闭处理，每种处理对于试剂组之一中的引物和/或核苷酸类似物是选择性的。
18.如上所示并且如下面将进一步详细阐述的，本公开提供了阵列的超分辨率成像(super-resolution imaging)的优点，其中在给定位置处同时可解析的靶序列的数目大于1。超分辨率成像可以提供同时区分大于阵列上的位点数目的不同靶核酸数目的益处。类似地，提供的超分辨率在于可以使用检测器在固相支持物上区分两个不同靶序列，所述检测器具有比空间分辨率更低的分辨率，所述空间分辨率在其它情况下将是区分基底上的两种靶序列需要的。
19.在具体的实施方案中，本公开提供了用于高效核酸检测的试剂和硬件配置。示例性的配置使用比在引物延伸步骤中要区分的核苷酸类似物种类的数目更少的标记物。例如，基于单个标记物种类的检测，可以区分四种核苷酸类似物。如下面进一步详细阐述的，这可以通过使用包含以下四个种类的第一组核苷酸类似物来实现：(1)具有第一标记物的种类，(2)具有配体的种类，(3)具有与所述第一标记物可切割连接的种类，和(4)缺少用于后续步骤的任何标记物或配体的种类，其中所有四个种类具有由第一处理选择性去封闭的封闭部分。核苷酸类似物的正交组可以包括以下四个种类(5)具有第一标记物的种类，(6)具有第一和第二标记物的混合物的种类，(7)具有与所述第二标记物可切割连接的种类，和(8)缺少用于后续步骤的任何标记物或配体的种类，其中所有四个种类具有由第二处理选择性去封闭的封闭部分。具体而言，第一处理不会导致第一组核苷酸类似物的实质性去封闭，并且第二处理不会导致核苷酸类似物的正交组的实质性去封闭。
20.基于在特定的流体步骤之后何种标记物出现或消失的适当计数，可以相互区分以上每组内的种类，并且基于两种不同的标记物，可以区分两个正交组的核苷酸类似物。更具体地，种类(1)和(5)可以基于不同的标记物彼此区分并且由于它们在初始标记步骤之后的出现(appearance)以及它们对各切割试剂的抗性而与其它种类区分；可以基于与标记的受体孵育后标记物的出现来区分种类(2)；可以基于不同标记物来相互区分种类(3)和(7)，并且基于标记物的初始表现和然后用各自的切割试剂处理后的消失来区分于所有其它种类；可以基于标记物两者在完全标记的种类的一半强度的强度来区分于所有其它种类；并且可以基于在已经检测到的各组中缺少任何其它的种类的推断区分种类(4)和(8)。许多其它配置可以改变标记物的数目，在检测阶段期间的流体操作的数目和/或区分特定数目标记物的检测设备的复杂程度。因此，可以调整配置以适应特定的方法或应用。
21.除非另有规定，本文使用的术语将被理解为具有其普通含义。本文使用的几个术语及其定义的实例如下所述。
22.如本文所用，当在提及核酸使用时的术语“扩增子”，是指复制核酸的产物，其中产物具有与核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互补的核苷酸序列。扩增子可以通过使用
核酸、或其扩增子作为模板的多种扩增方法的任一种产生，所述扩增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶链式反应(pcr)、滚环扩增(rca)、连接延伸、或连接链式反应。扩增子可以是具有特定核苷酸序列的单一拷贝(例如，pcr产物)，或核苷酸序列的多拷贝(例如，rca的多联体产物)的核酸分子。靶核酸的第一扩增子典型地是互补拷贝。生成第一扩增子后，后续的扩增子是从靶核酸或从另一个扩增子创建的拷贝。后续的扩增子可以具有与靶核酸基本上互补，或与靶核酸基本相同的序列。
23.如本文所用，术语“阵列”是指位点的群，其可以根据相对位置彼此区分。在阵列的不同位点处的不同分子可根据阵列中位点的位置彼此区分。阵列的单独位点可包括特定类型的一个或多个分子。例如，位点可以包括具有特定序列的单一靶核酸分子，或位点可以包括具有相同序列(和/或其互补序列)的数个核酸分子。或者，位点例如可以包括靶核酸序列的混合物，使得单独分子各自含有两个或更多个不同的分子，或者使得两个或更多个分子各自含有混合物的单一靶序列。阵列位点可以是位于相同的基底上的不同特征。示例性特征包括但不限于，基底中的孔、基底中或其上的珠(或其它颗粒)、从基底的突起、基底上的脊或基底中的通道。阵列位点可以是各种携带不同分子的单独的基底。附接于单独基底的不同分子可以根据与基底相关联的表面上基底的位置，或根据在液体或凝胶中基底的位置鉴定。单独的基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中具有珠的那些。
24.如本文使用的，术语“附接”指的是两种事物被彼此连接(join)、扣紧、粘附、联接(connect)或结合的状态。例如，分析物，(如核酸)可以通过共价或非共价键附接至材料，例如凝胶或固体支持物。共价键的特征在于共享原子之间的电子对。非共价键是不包括共享电子对的化学键并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。核酸可以通过固体支持物上的凝胶涂层附接到固体支持物上。
25.如本文所用，当用于指核苷酸类似物时，术语“封闭部分”意指核苷酸类似物的部分，其抑制或阻止核苷酸类似物与第二核苷酸类似物形成共价连接。例如，在具有戊糖部分的核苷酸类似物的情况下，封闭部分可防止在核苷酸类似物的3’氧与第二核苷酸类似物的5’磷酸之间形成磷酸二酯键。封闭部分可以是核苷酸类似物(其是存在于核酸聚合物中的单体亚基)的部分，或者封闭部分可以是游离核苷酸类似物(如核苷三磷酸)的部分。作为核苷酸类似物的部分的封闭部分可以是可逆的，使得可以除去或修饰该封闭部分以提供能够与第二核苷酸类似物形成共价连接的核苷酸类似物。特别有用的可逆封闭部分是磷酸盐(phosphates)，磷酸酯，烷基叠氮化物，缩醛，酯，醚等。可以使用的可逆封闭部分的其它实例在下文和如下文阐述的参考文献中列出，所述参考文献通过引用并入本文。在具体的实施方案中，封闭部分(如可逆封闭部分)可以附接至核苷酸类似物的戊糖部分的3’位或2’位。
26.如本文所用，当提及核酸使用时，术语“簇”指附接到固相支持物以形成特征或位点的核酸群体。核酸通常是单一种类的，从而形成同质簇。然而，在一些实施方案中，核酸可以是异质的，如此使得具有不同序列的个体分子在位点或特征处存在。核酸通常例如经由它们的5’末端共价地附接至固体支持物，但在一些情况下，其它附接方式是可能的。簇中的核酸可以是单链或双链的。在一些但并非所有实施方案中，通过称为桥式扩增的固相扩增方法制备簇。簇的示例性构造和它们的制备方法在例如美国专利号5,641,658、美国专利公开号2002/0055100；美国专利号7,115,400；美国专利公开号2004/0096853；美国专利公开
号2004/0002090；美国专利公开号2007/0128624；及美国专利公开号2008/0009420中示出，其每一个通过引用并入本文。
27.如本文所用，术语“去封闭剂”意指能够修饰或除去封闭部分的催化剂、酶、试剂或其它物质。在具体的实施方案中，去封闭剂可以对特定的封闭部分具有特异性。如此，与另一种封闭部分相比，该去封闭剂可以从核苷酸类似物选择地除去特定封闭部分。示例性的去封闭剂包括但不限于：酶，如磷酸酯酶、酯酶、烷基转移酶或甲基转移酶；或化学试剂，如膦(phosphine)、质子，或化学催化剂，如钯催化剂等。去封闭剂的进一步实例在下面详细描述。
28.如本文所用，术语“不同”，当提及核酸使用时，是指核酸具有彼此不同的核苷酸序列。两种或更多种核酸可具有沿着其完整长度不同的核苷酸序列。或者，两种或更多种核酸可具有沿着其长度的实质部分不同的核苷酸序列。例如，两种或更多种核酸可具有彼此不同的靶核苷酸序列部分，同时还具有对于两者而言相同的通用序列区。通常，当本文中将两种种类称为“不同的“时，一种种类将具有与第二种种类的结构性质不相同的结构性质。例如，两种不同的聚合物种类(诸如两种蛋白质)可具有不同的单体亚基序列(诸如两种不同蛋白质的不同的氨基酸序列)。
29.如本文所用，术语“每个/各自(each)”，当提及物品的集合使用时，意指鉴定集合中的单个物品，但并不一定是指集合中的每一个物品。如果明确披露或上下文另有明确规定，则可能会有例外。
30.如本文所用，术语“核酸”意图与其在本领域中使用一致，并包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异的方式杂交至核酸，或能够作为模板用于复制特定的核苷酸序列。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯键的骨架。类似物结构可以具有替代的骨架连接，包括本领域已知的多种连接的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，在脱氧核糖核酸(dna)中发现)或核糖(例如，在核糖核酸(rna)中发现)。核酸可以包含本领域已知的这些糖部分的多种类似物的任一种。核酸可以包括天然或非天然碱基。在这方面，天然脱氧核糖核酸可以具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤所构成的组中的一个或多个碱基，且核糖核酸可以具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤所构成的组中的一个或多个碱基。可以包括在核酸中的有用的非天然的碱基是本领域已知的。术语“靶物”当提及核酸使用时意图作为本文所阐述的方法或组合物的上下文内的核酸的语义标识符，且不一定将核酸的结构或功能限定为超出其它情况中明确指出的。
31.如本文所用，术语“核酸模板”指能够用作引导以进行聚合酶催化的复制的核酸或其部分。核酸分子可包括沿其长度的多个模板，或可选地，在本文的具体的实施方案中仅使用每个分子的单个模板。核酸模板还可发挥引导功能以进行连接酶催化的引物延伸。
32.如本文所用，术语“核苷酸”或“核苷酸类似物”意图包括天然核苷酸、非天然核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸和称为核苷酸的其它分子。例如，本文中使用该术语以通常指包含碱基部分并且任选地附接到一个或多个磷酸部分的核苷部分(无论核糖、脱氧核糖或其类似物)。该术语可用于指存在于聚合物中的单体单元，例如，以鉴定存在于dna或rna链中的亚基。术语还可用于指不必需存在于聚合物中的单体分子，例如，能够通过聚合酶以模板依赖的方式掺入多核苷酸中的分子。
33.示例性的核苷酸类似物包括但不限于单磷酸核糖核苷酸(有时称为核糖核苷单磷酸)、二磷酸核糖核苷酸(有时称为核糖核苷二磷酸)、三磷酸核糖核苷酸(有时称为核糖核苷三磷酸)、单磷酸脱氧核苷酸(有时称为脱氧核苷单磷酸)、二磷酸脱氧核苷酸(有时称为脱氧核苷二磷酸)和三磷酸脱氧核苷酸(有时称为脱氧核苷三磷酸)。为了清楚，当期望将rna成分与dna成分区分时，术语“核糖核苷酸”可用于规定rna核苷酸，诸如核糖尿苷三磷酸、核糖鸟苷三磷酸、核糖胞苷三磷酸或核糖腺苷三磷酸；且术语“脱氧核苷酸”可用于规定dna核苷酸，诸如脱氧胸苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸或脱氧腺苷三磷酸。在具体的实施方案中，核苷酸是“可延伸的”，例如，在核苷酸上的3’羟基或任何其它位置上缺少延伸封闭部分。在其它实施方案中，核苷酸是“封闭”的，具有防止3’位置参与通过添加另一个核苷酸或寡核苷酸而延伸的部分。
34.如本文所用，术语“间距(pitch)”指阵列中两个位点的中心到中心的距离。位点的模式可以是常规的，使得平均间距左右的变异系数较小或者模式可以是非常规的，在该情况下变异系数可以相对较大。在任一情况下，平均间距例如可以是至少10nm、0.1μm、0.5μm,1μm,5μm、10μm、100μm或更大。或者/另外，平均间距例如可以是至多100μm、10μm、5μm,1μm、0.5μm、0.1μm或更少。当然，位点的特定模式的平均间距可以在从上述范围中选择的下限之一和上限之一之间。
35.如本文所用，术语“引物”意指具有与模板序列处或附近的引物结合位点结合的序列的核酸。通常，引物以允许例如经由引物的聚合酶延伸而复制模板的构造结合。引物可以是与核酸分子的第二部分结合的核酸分子的第一部分，所述第一部分是引物序列且所述第二部分是引物结合序列(例如，发夹引物)。或者，引物可以是与具有模板序列的第二核酸分子结合的第一核酸分子。引物可由dna、rna或其类似物组成。
36.如本文所用，术语“引物延伸产物”意指已经通过添加至少一个核苷酸类似物而被修饰的引物。例如，引物可通过向其3’端添加一个或多个核苷酸类似物(例如经由聚合酶催化)，从而形成引物延伸产物而修饰。或者，引物延伸产物可通过寡核苷酸与引物的3’或5’端的连接来制备。在这种情况下，引物延伸产物延伸了等同于寡核苷酸长度的长度。引物延伸产物可以比引物长至少1、2、5、10、500、1000或更多个核苷酸。或者/另外，引物延伸产物可以比引物长不多于1、2、5、10、500或1000个核苷酸。例如，使用封闭的核苷酸类似物提供了比引物长至少1个核苷酸且还比引物长不多于1个核苷酸的延伸产物。
37.如本文所用，提及与第二事物相比“选择性”操作第一事物意图指与对第二事物的作用相比该操作对第一事物具有更大的作用。操作不需对第二事物具有任何作用。操作可对第一事物具有比对第二事物的作用大至少1％、5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％或99％的作用。操作可对第一事物具有比对第二事物的作用高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1x103倍、1x104倍或1x106倍的作用。操作可包括例如修饰、接触、处理、改变、切割(例如，化学键的切割)、光化学切割(例如，化学键的切割)、形成(例如，化学键的形成)、光化学形成(例如，化学键的光化学形成)、共价修饰、非共价修饰、破坏、光消融(photo-ablating)、移除、合成、聚合、光聚合、扩增(例如，核酸的扩增)、复制(例如，核酸的复制)、延伸(例如，核酸的延伸)、连接(例如，核酸连接)或本文阐述的或本领域中另外已知的其它操作。
38.如本文所用，当提及核酸使用时术语“序列”指核酸中核苷酸(或碱基)的顺序。在
不同种类的核苷酸存在于核酸中的情况下，序列包含核酸中各个位置处的核苷酸(或碱基)种类的鉴定。序列是整个或部分核酸分子的性质。术语可相似地用于描述其它聚合物中单体单元诸如蛋白质聚合物的氨基酸单体单元的顺序和位置身份。
39.如本文所用，术语“位点”意指阵列中存在至少一种分析物分子的位置。位点可仅包含单一分析物分子或其可以包含相同种类的若干分析物分子的群体。在一些实施方案中，位点可以包含多个不同的分析物分子种类，每个种类以一个或多个拷贝存在。阵列位点通常是离散的。离散的位点可以是连续的或它们彼此之间可具有间隔。
40.如本文所用，术语“种类”或“类型”用于鉴定共享相同化学结构的分子。例如，核苷酸类似物的混合物可包括数个dctp分子。dctp分子将理解为彼此相同的种类或类型，但与datp、dgtp、dttp等相比不同的种类或类型。相似地，具有相同核苷酸序列的个别dna分子是相同种类或类型，而具有不同序列的dna分子是不同种类或类型。作为另一个实例，与rna聚合酶相比，dna聚合酶是不同的聚合酶种类或类型(即使两种聚合酶来源于相同生物体)。
41.如本文所用，术语“通用序列”是指两个或更多个核酸分子共有的序列，甚至其中分子还具有彼此不同的序列的区域。存在于分子集合的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的通用捕获核酸的群体捕获多个不同的核酸。相似地，存在于分子的集合的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的通用引物的群体复制或扩增多个不同的核酸。因此，通用捕获核酸或通用引物包括能够特异性地杂交通用序列的序列。靶核酸分子可以经修饰以附接例如在不同靶序列的一端或两端的通用衔接子。
42.鉴于以上定义，可以理解下文阐述以及在权利要求书中叙述的实施方案。
43.本公开提供了用于对核酸模板测序的方法。所述方法可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含至少两种核酸模板的混合物；(b)分别用含有不同可逆封闭部分的不同核苷酸类似物延伸在每个所述位点处与所述不同核酸模板杂交的引物，从而在每个位点处产生不同的引物延伸产物；(c)检测所述不同的引物延伸产物，以区分每个位点处的不同的核苷酸类似物；(d)在每个所述位点处，使用对第一不同可逆封闭部分选择性的第一处理和对第二不同可逆封闭部分选择性的第二处理来从所述引物延伸产物除去所述不同可逆封闭部分；和(e)重复(b)至(d)以测定在每个位点处添加到每个不同延伸产物的不同核苷酸类似物的序列。
44.如上阐述，本公开的方法可以包括提供第一和第二核酸模板的步骤，其中两个模板的序列是不同的。两个模板序列可以是单一核酸分子的部分，或者备选，两个模板序列可以位于分开的分子上。如在本文其它地方进一步详述，两个模板序列可以是邻近的，其过于接近而不能用所使用的检测系统在空间上解析。然而，本公开的正交检测方法允许区分这些模板序列。正交检测方案以两个模板序列为例，但可以与两个或更多个模板序列一起使用。因此，本文阐述的系统或方法可以包括至少2、3、4、5、10个或更多个模板序列，它们例如在阵列的单个位点处在单个核酸分子上极其接近，或者在其它情况中是邻近的，其过于接近而不能用所使用的检测系统在空间上解析。
45.本文使用的靶核酸可以由dna，rna或其类似物组成。靶核酸的来源可以是来自天然来源的基因组dna，信使rna或其它核酸。在一些情况中，可以扩增源自此类来源的靶核酸，之后在本文的方法或组合物中使用。
46.可以衍生靶核酸的示例性生物样品例如包括来自哺乳动物的那些，如啮齿类、小
鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄类动物、马、棉羊、猪、山羊、牛、猫、狗、灵长类、人或非人灵长类；植物，如拟南芥、玉米、高粱、燕麦、小麦、稻、芥花(canola)或大豆；藻类，如莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)；线虫，如秀丽隐杆线虫；昆虫，如黑腹果蝇(drosophila melanogaster)，蚊、果蝇(fruit fly)、蜜蜂或蜘蛛；鱼，如斑马鱼；爬行动物；两栖动物如蛙或非洲爪蟾；盘基网柄菌(dictyostelium discoideum)；真菌，如卡氏肺孢子虫(pneumocystis carinii)、红鳍东方鲀(takifugu rubripes)、酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母；或者恶性疟原虫。靶核酸还可以源自原核生物如细菌、大肠杆菌、葡萄球菌或肺炎支原体；古细菌；病毒如丙型肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒；或类病毒。靶核酸可以源自均质培养物或上述生物体的群体，或者备选地源自例如群落或生态系统中数种不同生物体的集合。可以使用本领域已知的方法分离核酸，例如包括sambrook et al.,molecular cloning: a laboratory manual,第3版,cold spring harbor laboratory,new york(2001)或于ausubel et al.,current protocols in molecular biology,john wiley and sons,baltimore,md.(1998)中描述的那些，其每一个通过引用并入本文。
47.在具体的实施方案中，可以修饰或制备核酸样品以用于本文阐述的一种或多种方法中。在一些情况下，期望向核酸添加一种或多种引物结合位点。已知的分子生物学技术可用于引入位于各自模板序列上游的引物结合位点，其例如通过插入具有引物结合位点的衔接子、创建引物结合位点的突变、连接具有引物结合位点的衔接子等实现。sambrook等人,同上和ausubel等人，同上中描述了有用的方法。美国专利申请公开号2015/0031560a1(其通过引用并入本文)提供了用于引入引物结合位点的基于标签片段化(tagmentation)的技术的例示。标签片段化对于引入一个或多个引物结合位点是特别有用的，并且例如可以使用美国专利号6,294,385和8,383,345,以及pct公开号wo 2012/106546(各自通过引用并入本文)中所列的技术实施。应当理解，在一些情况下在本文阐述的方法中，可以利用存在于各自模板序列上游的天然存在的序列区域作为引物结合位点。可以使用类似于以上针对引物结合位点举例说明的方法来引入其它期望序列元件，如用于基于rna聚合酶的延伸的启动子元件或标签序列。
48.通用引发位点对于本文阐述的方法的多重应用是特别有用的。通用引发位点提供了两个或更多个核酸分子共有的序列区域，其中分子还具有含不同序列的模板或靶区域。存在于分子集合的不同成员中的通用引发序列可以允许使用与通用引发序列互补的单一通用引物种类来复制、扩增或检测多个不同序列。因此，通用引物包括可以与通用引发序列特异性杂交的序列。可在美国专利公开号2007/0128624 a1(该专利通过引用并入本文)中找到将通用序列附接至靶核酸的集合的方法的实例。
49.在一些实施方案中，靶核酸可以作为一种或多种较大核酸的片段获得。可以使用本领域已知的多种技术中的任一种来实施片段化，所述技术例如包括雾化、超声处理、化学切割、酶促切割，或物理剪切。片段化也可以由使用特定的扩增技术产生，所述扩增技术通过仅复制较大核酸的一部分来产生扩增子。例如，pcr扩增产生具有由在用于扩增的侧翼引物之间的片段长度限定的大小的片段。
50.靶核酸或其扩增子的群体可以具有对于本文阐述的方法或组合物的特定应用期望或适当的平均链长度。例如，平均链长度可以低于约100,000个核苷酸、50,000个核苷酸、10,000个核苷酸、5,000个核苷酸、1,000个核苷酸、500个核苷酸、100个核苷酸，或50个核苷
酸。或者/另外，平均链长度可以高于约10个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、500个核苷酸、1,000个核苷酸、5,000个核苷酸、10,000个核苷酸、50,000个核苷酸，或100,000个核苷酸。靶核酸群体或其扩增子的群体的平均链长度可以在本文所列的最大值和最小值之间的范围中。应当理解，在扩增位点处生成(或在其它情况下本文中制备或使用)的扩增子可以具有从以上示例的数值选择的上限和下限之间的范围。
51.在一些情况下，可以产生或在其它情况下配置靶核酸群体以具有其成员的最大长度。例如，如本文中阐述的那样制备或使用的成员的最大长度可以小于约100,000个核苷酸、50,000个核苷酸、10,000个核苷酸、5,000个核苷酸、1,000个核苷酸、500个核苷酸、100个核苷酸，或50个核苷酸。或者/另外，可以在条件下产生或在其它情况下配置靶核酸或其扩增子的群体以具有其成员的最小长度。例如，在本文阐述的方法的一个或多个步骤中使用的成员的最小长度或存在于特定组合物中的成员的最小长度可以高于约10个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、500个核苷酸、1,000个核苷酸、5,000个核苷酸、10,000个核苷酸、50,000个核苷酸，或100,000个核苷酸。群体中靶核酸的最大和最小链长度可以在如上阐述的最大值和最小值之间的范围中。应当理解，在阵列位点处生成(或在其它情况中本文中制备或使用)的扩增子可以具有在如上示例的上限和下限之间范围的最大和/或最小链长。
52.多种已知的扩增技术的任一种可以用于增加存在的模板序列的量以用于本文阐述的方法。示例性的技术包括但不限于具有模板序列的核酸分子的聚合酶链式反应(pcr)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda)或随机引物扩增(rpa)。应当理解的是，在本文阐述的方法或组合物中使用之前靶核酸的扩增是任选的。如此，在本文阐述的方法和组合物的一些实施方案中使用之前不会靶核酸。靶核酸可任选地来源于合成文库。合成的核酸可具有天然dna或rna组成或可以是其类似物。还可使用固相扩增方法，包括例如在基于阵列的方法的上下文中的簇扩增、桥式扩增或以下阐述的其它方法。
53.在本文阐述的方法中使用的核酸可以是溶液相或固相。当在溶液相中时，核酸通常是可溶的，但也可以呈能够沉淀的悬浮形式，一些大核酸种类诸如染色体或核酸纳米球就是如此(参见，例如，美国专利公开号2007/0099208a1，其通过引用并入本文)。固相的核酸可存在于固相支持物中或固相支持物上。示例性的固相支持物包括由玻璃、硝化纤维素、二氧化硅、金属、塑料和本文其它部分例如就阵列形式和流动池而言阐述的其它材料制造的那些。相似地，核酸可以存在于半固体支持物诸如凝胶之中或之上。有用的示例性凝胶包括但不限于，具有胶体结构，诸如琼脂糖；聚合物网状结构，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺的那些。水凝胶尤其有用，诸如在美国专利公开号2011/0059865a1和美国专利号9,012,022中示出的那些，其每一个通过引用并入本文。
54.将核酸附接到支持物(无论是刚性或半刚性)可通过共价或非共价连接发生。示例性的连接在美国专利号6,737,236、7,259,258、7,375,234和7,427,678；及美国专利申请公开号2011/0059865a1中阐述，其每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中，核酸或其它反应成分可以附接到凝胶或其它半固体支持物，其继而附接或粘附到固相支持物。在此类实施方案中，核酸或其它反应成分将理解为固相。
55.多重反应可使用固相支持物(亦称为固体支持物)。固相支持物可以用于分离个别反应，使得可以分开或个别询问每个反应。例如，可将混合物中几种不同的核酸附接到固相支持物。可以将核酸以阵列形式附接到固相支持物。
56.在一些实施方案中，提供了位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，且其中第一核酸模板具有与第二核酸模板的序列不同的序列。在一些实施方案中，每个位点可以有多于2种不同的模板。可以为了在本文中使用而修饰的示例性阵列材料和制造方法包括但不限于从inc.(sandiego,ca)可得的beadchip阵列或诸如在美国专利号6,266,459、6,355,431、6,770,441、6,859,570或7,622,294或pct公开号wo00/63437中描述的那些的阵列，其每一个通过引用并入本文。可以使用的商品化阵列的进一步实例包括例如实例包括例如阵列或根据有时被称为vlsips
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(超大规模固定化聚合物合成(verylargescale immobilized polymer synthesis))技术的技术合成的其它阵列。根据一些实施方案，也可以使用点制阵列。示例性的点制阵列是从amersham biosciences可得的codelink
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阵列。另一个有用的阵列是使用喷墨印刷方法制造的阵列，所述喷墨印刷技术诸如从agilent technologies可得的sureprint
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技术。
57.可以使用的其它有用的阵列(例如通过修饰位点以包含多种不同的模板核酸序列)包括在核酸测序应用中使用的那些。例如，具有基因组片段的扩增子(通常称为簇)的阵列尤其有用，诸如在bentley et al.,nature 456:53-59(2008),pct公开号wo 04/018497,wo 91/06678,或wo 07/123744；美国专利号7,057,026,7,329,492,7,211,414,7,315,019,或7,405,281；或美国专利申请公开号2008/0108082a1中描述的那些，其每一个通过引用并入本文。
58.可通过固相扩增方法产生核酸簇。例如，可将具有一个或多个待检测的模板序列的核酸附接到表面，并使用桥式扩增进行扩增。有用的桥式扩增方法在例如美国专利号5,641,658或7,115,400；或美国专利申请公开号2002/0055100a1、2004/0096853 a1、2004/0002090 a1、2007/0128624 a1或2008/0009420a1中描述，其每一个通过引用并入本文。用于在表面上扩增核酸另一个有用的方法是滚环扩增(rca)，例如，如在lizardi et al.,nat.genet.19:225-232(1998)和美国专利申请公开号2007/0099208a1中描述的，其每一个通过引用并入本文。另一个有用的阵列类型是从乳液pcr扩增技术产生的颗粒阵列。实例在dressman et al.,proc.natl.acad.sci.usa 100:8817-8822(2003)、pct申请公开号wo05/010145或美国专利申请公开号2005/0130173 a1或2005/0064460 a1中描述，其每一个通过引用并入本文。尽管已经在测序应用的上下文中描述了以上阵列，但是应当理解的是可将阵列用于其它实施方案，包括例如使用非循环引物延伸技术的实施方案。
59.检测可在阵列上在总体或单分子水平上进行。总体水平检测是以下述方式发生的检测，使得在每个个别位点处检测单个模板序列的若干拷贝(如模板的多个扩增子)并且彼此不区分位点处的个别拷贝。因此，总体检测提供了来自位点处的特定模板序列的多个拷贝的平均信号。例如，位点可包含特定模板序列的至少10、100、1000或更多个拷贝。当然，位点可包含多个不同的模板序列，每个模板序列作为总体存在。或者，在单分子水平上的检测包括下述方式发生的检测，使得在阵列上单独解析个别的模板序列(各在不同位点处)。因此，单分子检测提供了来自个别分子的信号，其与可以源自内有所述个别分子存在的分子群体的一个或多个信号区分。当然，即使在单分子阵列中，位点可包含若干不同的模板序列(例如，沿着单核酸分子定位的两个或更多个模板序列区域)。
60.位点的阵列可表现为点或片的网格。位点可以以重复的模式或以不规则的非重复的模式定位。尤其有用的模式是六边形模式、直线模式、网格模式、具有反射对称的模式、具
有旋转对称的模式等。不对称模式也可以是有用的。
61.阵列中的位点的尺寸和/或位点之间的间距可不同以实现高密度、中等密度或较低密度。高密度阵列表征为具有以小于约15μm的间隔的位点。中等密度阵列具有含约15到30μm的间距的位点，而低密度阵列具有大于30μm的间隔的位点。在一些实施方案中有用的阵列可具有小于100μm,50μm,10μm,5μm,1μm,或0.5μm间距的位点。可将本文阐述的方法的实施方案用于以足以区分以以上密度或密度范围的位点的分辨率对阵列成像。然而，检测步骤将通常使用检测器，所述检测器具有的空间分辨率太低以至于无法分辨等同于个别位点处的第一模板(或与其杂交的第一引物延伸产物)和第二模板(或与其杂交的第二引物延伸产物)之间的间隔的距离处的点。在具体的实施方案中，阵列位点可各自具有大于约100nm2、250nm2、500nm2、1μm2、2.5μm2、5μm2、10μm2、100μm2，或500μm2的面积。或者/另外，阵列位点可各自具有小于约1mm2、500μm2、100μm2、25μm2、10μm2、5μm2、1μm2、500nm2,或100nm2的面积。事实上，位点可具有在从以上示例的那些数值选择的上限和下限之间的范围内的尺寸。
62.本文阐述的方法可使用阵列，所述阵列具有以多种密度中任一种的位点，包括例如至少约10个位点/cm2、100个位点/cm2、500个位点/cm2、1,000个位点/cm2、5,000个位点/cm2、10,000个位点/cm2、50,000个位点/cm2、100,000个位点/cm2、1,000,000个位点/cm2、5,000,000个位点/cm2或更高。
63.通常，阵列将具有含有不同核酸序列内容的位点。因此，阵列中的每个位点可以含有与阵列中其它位点的核酸序列相比独特的核酸序列。然而，在一些情况下，阵列可以具有冗余性，使得两个或更多个位点具有相同的核酸内容。
64.应当理解的是，本文阐述的方法的步骤可以以一定的方式实施以用处理暴露阵列的整个位点或多个位点。例如，可以通过将引物延伸试剂递送到阵列，使得在阵列的一个或多个位点的每处的多个核酸(如混合物中不同的核酸)与引物延伸试剂相接触，从而进行涉及引物延伸的步骤。类似地，可以通过用去封闭处理暴露阵列，使得在阵列的一个或多个位点的每处的多个核酸(如混合物中不同的核酸)与所述处理相接触，从而可以进行对封闭的引物延伸产物去封闭的步骤。
65.在合成测序，或其它引物延伸反应的任何给定点，存在于第一模板中与引物延伸位点互补的位置处的核苷酸种类可以与存在于第二模板中与引物延伸位点互补的位置处的核苷酸种类相同。换而言之，阵列的特定位点处的第一核酸模板可以包括至少一个碱基部分，该碱基部分与在第二核酸模板中该特定位点处的碱基部分是相同的种类，并且可以将互补核苷酸类似物添加到位于那些碱基部分所在的模板中位置处的每个引物。无论引物杂交的模板序列相同还是不同，都可以是这种情况。下面进一步详细描述的技术可以用来区分两个模板，例如使用具有相互可区分的标记物的不同组的核苷酸类似物。
66.多种聚合酶的任一种可用于本文阐述的方法或组合物中，例如，分离自生物系统的基于蛋白的酶及其功能变体。将理解的是，提及特定聚合酶诸如以下示例的那些聚合酶包括其功能变体，除非另有说明。聚合酶的尤其有用的功能是使用现有的核酸作为模板催化核酸链的聚合。其它有用的功能在本文其它部分描述。有用的聚合酶的实例包括dna聚合酶、逆转录酶和rna聚合酶。
67.具有固有的3’到5’的校正外切核酸酶活性的聚合酶对于一些实施方案可以是有用的。实质上缺少3’到5’校正外切核酸酶活性的聚合酶在一些实施方案例如在大多数测序
实施方案中也是有用的。外切核酸酶活性的缺乏可以是野生型特征或由变体或工程化的聚合酶结构赋予的特征。例如，exo minus klenow片段是突变形式的klenow片段，其缺少3’到5’校正外切核酸酶活性。
68.根据待使用的实施方案，聚合酶可以是嗜热的或热可失活的。嗜热聚合酶通常对于高温条件或在热循环条件诸如聚合酶链式反应(pcr)技术采用的热循环条件中是有用的。嗜热聚合酶的实例包括但不限于9
°
ndna聚合酶、taqdna聚合酶、dna聚合酶、pfudna聚合酶、rb69dna聚合酶、kod dna聚合酶和dna聚合酶。分离自非嗜热生物体的大多数聚合酶是热可失活的。实例是来自噬菌体的dna聚合酶。应当理解的是，可修饰来自多种来源的任一种的聚合酶以在增加或减少其对高温条件的耐受性。对于掺入具有标记物和/或可逆终止部分的核苷酸类似物的尤其有用的聚合酶在us2006/0281109a1中描述，其通过引用并入本文。
69.在本文阐述的方法和组合物的具体的实施方案中，仅使用单一种类的聚合酶。在此类实例中，阵列的每个位点在给定的时间只与一种聚合酶相互作用，即使多个聚合酶可以存在于该位点并且在每个位点处与多个引发的模板结合。例如，阵列的所有位点都可以与特定种类的dna聚合酶相互作用，并且其它聚合酶(如rna聚合酶)将不在阵列中。
70.可经修改而用于本文阐述的方法或组合物的其它延伸技术为基于连接酶的系统，该系统对于掺入寡核苷酸，而非通过以上描述的基于聚合酶延伸系统掺入的单体核苷酸是选择性的。使用第一组寡核苷酸的dna连接酶系统与使用第二组寡核苷酸的试剂系统是正交的，所述第一组寡核苷酸具有通过第一去封闭处理选择性地去封闭的可逆封闭部分，所述第二组寡核苷酸通过第二去封闭处理选择性地去封闭的可逆封闭部分。可以以正交形式进行用可逆封闭的寡核苷酸延伸的引物的去封闭，该正交形式很类似于本文中对于用可逆封闭的核苷酸类似物延伸的引物的去封闭例示的方式。可以在使用具有一或二碱基编码方案的部分随机探针寡核苷酸的群体的测序应用中进行连接延伸(extension by ligation)。可以修改以用于本文，如在测序的上下文中的基于连接的延伸技术在mckernan et al.,genome research 19(9):1527
–
41(2009)；shendure et al.,science 309:1728-1732(2005)；或美国专利号5,599,675或5,750,341中阐述，其每一个通过引用并入本文。
71.使用本文阐述的方法进行的核酸延伸反应或其它循环反应可进行一个或多个循环。在具体的实施方案中，多循环反应可包括至少2个循环、5个循环、10个循环、50个循环、100个循环、500个循环、1,000个循环、5,000个循环、10,000个循环或更多。或者/另外，反应可具有上限，其中发生不多于1个循环、2个循环、5个循环、10个循环、50个循环、100个循环、500个循环、1,000个循环、5,000个循环或10,000个循环。在一些实施方案中，每个循环将导致单一核苷酸类似物对延伸的引物中的掺入。在这种情况下，以上示例的最小循环数或最大循环数可以理解为例示聚合酶催化的反应中掺入延伸产物中的核苷酸的最小数目或最大数目。
72.一些实施方案可使用非循环延伸反应，诸如单碱基延伸(sbe)反应或等位基因特异性引物延伸(aspe)反应。可将可逆终止剂部分用于在非循环延伸形式中实现两个不同引物的正交延伸。由于去封闭步骤对于这些非循环反应(即一旦引物已经被延伸)的继续不是必需的，取而代之，可以非可逆地终止用于延伸步骤中的核苷酸类似物。例如，可使用双脱
氧核苷酸。用于sbe、aspe和其它有用的非循环延伸技术的示例性试剂和相关的技术在例如美国专利号7,670,810或美国专利申请公开号2003/0108867、2003/0108900、2003/0170684、2003/0207295或2005/0181394中描述，其每一个通过引用并入本文。使用非循环延伸技术并可以修饰以通过本文阐述的正交检测方法增加信息量的市售产品的实例是从illumina,inc.(sandiego,ca)可得的基因分型产品。
73.循环和非循环反应同样地可以包括将反应成分彼此分离或从反应环境中除去的步骤。可以例如通过将固相成分与液相成分分离，将一种或多种反应成分分离。可任选地包括洗涤步骤以更完全地从一种或更多种固相成分中除去不需要的一种或多种液相成分。对于此类分离尤其有用的反应容器是流动池，诸如在循环测序方法中通常使用的那些。示例性的流动池、其制造方法及其使用方法在美国专利申请公开号2010/0111768a1或2012/0270305a1；或pcr申请公开号wo05/065814中描述，其每一个通过引用并入本文。无论是否使用固相分离方法，可通过本领域中已知的多种其它技术的任一种除去反应成分，所述技术包括液液提取、固相提取、色谱、过滤、离心等。
74.可逆终止剂部分提供了控制延伸反应以仅将单个核苷酸添加到引物直至进行随后的去封闭步骤的简便方式。如本文阐述，使用正交封闭部分和去封闭处理提供了超级分辨率检测，其中可以监视和检测到的模板复杂性大于其它情况下使用非正交技术将允许的模板复杂性。可逆封闭部分和它们的去封闭条件的例子包括但不限于可以从3’位置处光可切割除去的部分，诸如邻硝基苄基醚(o-nitrobenzylethers)和烷基邻硝基苄基碳酸盐/酯；可以通过碱水解除去的酯部分；可以用nai、三甲基氯硅烷和na2s2o3或用于丙酮/水中的hg(ii)除去的烯丙基部分；可用膦(phosphines)，诸如三(2-羧乙基)膦(tcep)或三(羟丙基)膦(thp)切割的-叠氮基甲基(-ch
2-n3)；缩醛，诸如可用酸性环境切割的叔丁氧基-乙氧基；可用libf4和ch3cn/h2o切割的mom(—ch2och3)部分；可用亲核试剂诸如苯硫酚和硫代硫酸盐切割的2,4-二硝基苯亚磺酰基；可用ag(i)或hg(ii)切割的四氢呋喃醚；和可用磷酸酶(如多核苷酸激酶)切割的3’磷酸。其它有用的可逆部分包括酯、-f、-nh2、-och3、-n3、-nhcoch3，和2-硝基苯碳酸酯。有用的去封闭处理包括用光照射(如以诱导光可切割)、加热、暴露到化学试剂、暴露到催化剂、暴露到电流(如以诱导电解)等。
75.本文的方法的具体实施方案可以例如在多个循环过程(如合成测序)中利用可逆封闭的引物和可逆封闭的核苷酸类似物。如本文先前例示，特定的可逆封闭的引物和特定组的可逆封闭的核苷酸类似物可以对相同的去封闭条件易感。这可能是因为存在于引物上和存在于组内核苷酸类似物上的相同种类的可逆封闭部分。然而，也可以使用不同的封闭部分，不过所述封闭部分仍然对相同去封闭处理易感。
76.可以将可逆封闭部分附接至引物的3’核苷酸。通常，将可逆封闭部分附接于核糖部分的3’位置处。然而，取而代之，可以将封闭部分附接至备选位置，例如包括在核糖的2’位置处或在碱基部分上。还可以将封闭部分附接于引物的5’末端，例如在末端核苷酸的核糖的5’位置处，或5’磷酸部分处。5’末端封闭的引物可用于采用连接技术的实施方案。
77.可将引物的3’末端或5’末端附接至标记物部分，如光学标记物。可以存在标记物，无论引物上是否也存在可逆封闭部分。在一些情况下，特定部分可以既作为标记物又作为引物延伸的可逆封闭物发挥功能。
78.上文对引物例示的标记物和/或可逆封闭部分的相同附接点对于个别的核苷酸可
以是有用的。
79.关于封闭部分和去封闭处理的进一步示例指导例如描述于bentley et al.,nature 456:53-59(2008),pct申请公开号wo 04/018497、wo 91/06678或wo 07/123744；美国专利号7,057,026、7,329,492、7,211,414、7,315,019、8,088,575或7,405,281；或美国专利申请公开号2008/0108082 a1中，其每一个通过引用并入本文。
80.根据本公开内容的正交操作和检测不需要两个模板序列在沿其长度在每个位置处不同。确切地，相同的碱基部分可存在于分别在第一模板和第二模板上检测的位置处。可基于存在于正交试剂系统中的标记物的可区分的特征和用于延伸适当去封闭的引物的试剂系统的特异性区分两个位置。此信息继而可以用于可区分地检测两个不同的模板序列，即使这两个位置使用检测器同时检测，所述检测器具有的分辨率太低以至于无法分辨等同于两个模板序列的间隔的距离处的点。
81.可使用多种标记物的任一种。当用于检测核苷酸类似物时尤其有用的标记物部分可以是核苷酸类似物的任何部分，其当与其环境中存在的其它分子相比时提供可区分的特征。可区分的特征可以是例如光学信号诸如辐射的吸收、荧光发射、发光发射、荧光寿命、荧光偏振等；对配体或受体的结合亲和力；磁性性质；电性质；电荷；质量；放射性等。示例性的标记物部分包括但不限于荧光团、发光团、发色团、放射性同位素、质量标记物、电荷标记物、自旋(spin)标记物、受体、配体等。标记物部分可以是存在于核酸聚合物中的单体单元的核苷酸的部分，或标记物部分可以是游离核苷酸类似物(例如，核苷三磷酸)的一部分。
82.荧光团尤其有用并包括例如荧光纳米晶体；量子点、荧光素、若丹明、四甲基若丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、cy3、cy5、芪、lucifer yellow、cascade蓝、德克萨斯红、alexa染料、seta染料、atto染料、藻红蛋白、氟硼荧(bodipy)及其类似物。有用的光学探针在lakowicz,principles of fluorescence spectroscopy,第3版springer(2006)；haugland,handbook of fluorescent probes and research products第9版,molecular probes,inc,(2002)；shapiro,practical flow cytometry,第4版,john wiley&sons(2003)；pct专利申请公开号wo98/59066或wo91/06678；或美国专利申请公开号2010/0092957a1中描述，其每一个通过引用并入本文。
83.其它标记物(其中一些是非光学标记物)可用于本文阐述的方法和组合物的多种实施方案中。实例包括但不限于同位素标记物诸如天然非丰富的放射性或重同位素；磁性物质；富含电子的物质诸如金属；电化学发光标记物诸如ru(bpy)
32
；或可基于核磁、顺磁性、电、荷质比或热特征检测的部分。标记物还可包括磁性颗粒或光学编码的纳米颗粒。此类标记物可使用本领域技术人员已知的适当方法检测。例如，带电荷的标记物可使用电检测器检测，所述电检测器诸如在来自ion torrent(guilford,ct,life technologies子公司)的市售可得的测序系统或在美国专利申请公开号2009/0026082a1；2009/0127589a1；2010/0137143a1；或2010/0282617a1中描述的检测系统中使用的那些，其每一个通过引用并入本文。应当理解的是，对于一些实施方案，核苷酸类似物可以缺乏一个或多个本文阐述的标记物。
84.可以以多种方式将标记物部分附接到核苷酸。可用于核苷酸类似物的示例性的附接和标记物组成在bentley et al.,nature 456:53-59(2008),pct申请公开号wo 04/018497、wo 91/06678或wo 07/123744；美国专利号7,057,026、7,329,492、7,211,414、7,
315,019、8,088,575或7,405,281；或美国专利申请公开号2008/0108082a1中示出，其每一个通过引用并入本文。
85.本文阐述的方法的检测步骤可在本公开内容的方法中使用适用于使用的特定标记物的装置来进行。例如，可将光学检测器诸如荧光检测器、吸光度检测器、发光检测器等用于检测适当的光学标记物。针对基于阵列的检测设计的系统尤其有用。例如，可以将与本文阐述的方法一起使用的光学系统可以构建成包括各种元件和配件，如在美国专利号8,241,573、7,329,860或8,039,817；或美国专利申请号2009/0272914 a1或2012/0270305 a1中描述的，其每一个通过引用并入本文。
86.正交检测系统，诸如用于合成测序的系统，可使用不同标记物以区分添加到每种引物的不同核苷酸。在一个实施方案中，每个核苷酸种类将具有产生独特的信号以区分该核苷酸种类的独特的光学标记物。一个实例是8染料方法。在该实例中，第一组4种不同的核苷酸类似物各自具有彼此区分4种不同核苷酸类似物的每一种的不同荧光染料，其中第一组中的4种不同的核苷酸具有能由第一处理选择性去封闭的封闭部分。第二组4种不同的核苷酸类似物各自具有彼此区分4种不同核苷酸类似物的每一种的不同荧光染料，其中第二组中的4种不同的核苷酸具有能由第二处理选择性去封闭的封闭部分。在该情况下，第一处理对于第一组核苷酸中的封闭部分是选择性的，并且第二处理对于第二组核苷酸中的封闭部分是选择性的。这两组染料是独特的，如此使得该8种染料分别产生8种可区分的信号。
87.在其中所有核苷酸类似物被可区分地标记的实施方案，诸如上述8染料方法中，可将一对模板序列与所有核苷酸类似物接触，然后此后可进行检测。在此，由于独特的光学标记物区分所有核苷酸类似物的能力提供了相对简单的流体操作的益处，其中所有核苷酸类似物可递送到模板序列，如此使得它们同时存在。在相对简单且优选的实施方案中，同时递送所有8种核苷酸类似物；然而，如果需要的话，可顺序地递送一个或多个子集。检测可以在核苷酸类似物递送过程中或之后发生。该相对简单的流体过程通过具有区分所有不同信号的能力的相对复杂的检测装置提供。例如，可将能够区分8种不同荧光信号的荧光检测系统用于8染料方法。本领域技术人员将知晓或能够确定实现此类信号区分的适当的荧光检测装置。例如，可使荧光标记物的激发和发射性质与荧光计产生的激发波长和检测的发射波长的组合适当地匹配。对于可用于多波长荧光检测的光学器件和标记物的示例性的指导在lakowicz,principles of fluorescence spectroscopy,第3版springer(2006)；haugland,handbook of fluorescent probes and research products第9版,molecular probes,inc,(2002)；以及shapiro,practical flow cytometry,第4版,john wiley&sons(2003)中提供，其每一个通过引用并入本文。
88.以上对于所有核苷酸被可区分地标记的系统例示的原理可容易地扩展到阵列形式。当用引物延伸反应系统处理时，预期具有足够数目和种类的不同模板序列的阵列将掺入所有标记的核苷酸。更具体地，在具有阵列位点间的极其多种核酸并且具有两种不同的模板/位点的基于阵列的方法中，预期在所有8种核苷酸递送到阵列的引物延伸循环之后，所有可能的2-染料的染料组合在阵列上出现。可使用本领域中已知的光学装置在空间上区分位点，所述光学装置例如在美国专利号8,241,573、7,329,860或8,039,817；或美国专利申请公开号2009/0272914a1或2012/0270305a1中描述的那些，其每一个通过引用并入本文。可容易地将此类检测系统修改为适应如以上阐述的8色荧光检测。以这种方式修改的检
测系统将能够进行多重正交检测，如此使得在多个位点(例如通过测序)区分两种不同的模板，所述多个位点的每一个具有不同的序列组成。
89.在一些实施方案中，在特定方法中所区分的不同信号的数目少于在该方法中使用的不同核苷酸类似物种类的数目。例如，多个不同核苷酸类似物种类可具有相同的标记物和/或核苷酸种类的子集可以是未标记的。对于多个不同的核苷酸种类使用相同标记物的配置的实例是正交引物延伸方法的情况，其中第一组的4种不同的核苷酸类似物共享共同的第一标记物并对第一选择性去封闭处理易感，而第二组的4种不同的核苷酸类似物共享共同的第二标记物并对第二选择性去封闭处理易感。在该实例中，第一标记物与第二标记物在光学上是可区分的，第一处理对第一组核苷酸类似物是选择性的并且第二处理对第二组核苷酸类似物是选择性的。在该配置中，可以通过递送和检测的顺序循环(即每种不同的核苷酸类似物的单独循环)将第一组中4种不同的核苷酸彼此区分开。只要在该实例中的第一标记物和第二标记物是可区分的，就可在递送和检测的4个循环中成对(来自第一组的各1个单一核苷酸种类和来自第二组的各1个单一核苷酸种类)递送两组核苷酸的成员。因此，在引物延伸反应中使用的第一组核苷酸类似物的成员可仅包括一种类型的被检测的光学标记物，并且与第一组正交的第二组核苷酸类似物也可仅包括一种类型的被检测的光学标记物，其中在第一组中使用的标记物与在第二组中使用的标记物在光学上可区分。
90.灰度分级(greyscaling)允许使用具有相同标记物的多种不同核苷酸类似物种类。在此，可基于检测到的标记物信号的强度区分不同核苷酸类似物类型。例如，可将每种种类的核苷酸类似物作为标记和未标记形式的该核苷酸种类的独特成比例的混合物递送。对于每种种类的标记的:未标记的核苷酸类似物的比率的变化将导致每种混合物的独特地灰度分级的信号输出。通过更具体的实例，第一核苷酸类似物可以是完全标记的(无标记的和未标记的第一核苷酸类似物的混合)，第二核苷酸类似物可以是75％标记的(75％标记的和25％未标记的第二核苷酸类似物的混合物)，第三核苷酸类似物可以是50％标记的(50％标记的和50％未标记的第三核苷酸类似物的混合物)，以及第四核苷酸类似物可以是25％标记的(25％标记的和75％未标记的第四核苷酸类似物的混合物)。基于信号强度的所得差异可区分这4种核苷酸类似物种类，其中(例如在阵列位点处)适当的去封闭引物群体将由于掺入第一核苷酸类似物而产生完全的信号；由于掺入第二核苷酸类似物而产生75％的信号；由于掺入第三核苷酸类似物而产生50％的信号；以及由于掺入第四核苷酸类似物而产生25％的信号。
91.在具体的实施方案中，核苷酸类似物种类的至少一种可以是完全未标记的。因此，在其中光学标记物存在于核苷酸类似物组中的其它核苷酸类似物上的情况下，还可存在“暗”核苷酸类似物。将引物延伸以掺入暗核苷酸类似物或在其它情况下未标记的核苷酸类似物可以通过基于标记物的缺乏的推断确定，所述标记物的缺乏当在组中的其它核苷酸类似物已经通过延伸反应而掺入时将是预期的。因此，在一些实施方案中，仅本文阐述的引物延伸反应中使用的核苷酸类似物的子集需要具有标记物。
92.可将完全未标记的核苷酸类似物种类的使用同灰度分级结合。例如，组(即可通过常规处理而去封闭的组)中四种不同的核苷酸类似物种类中的三种可具有可区分的非零量的特定标记物(例如，混合物中标记的和未标记的核苷酸类似物的比率)且第四种核苷酸类似物种类可缺少该标记物。或者/另外，可将灰度分级与几种光学上可区分的标记物的使用
结合。例如，一些核苷酸类似物种类可在延伸反应中作为混合物出现，所述混合物是同一类型但具有不同标记物的核苷酸的混合物。美国专利申请公开号no.2013/0079232 a1或2015/0031560 a1中示例了此类配置，其通过引用并入本文。
93.作为多种不同标记物、灰度分级，和/或未标记的种类的使用的备选或者除此之外，本文阐述的实施方案可以使用核苷酸类似物，该核苷酸类似物具有配体、可切割接头或由于限定处理而提供标记物的获得或丢失的其它部分。在美国专利申请公开号2013/0079232 a1或2015/0031560 a1中说明了这种类型的试剂系统，其中一些核苷酸类似物种类具有配体，使得可以基于可检测信号的初始缺失，之后在用适当标记的受体处理后的信号出现来将它们与其它核苷酸类似物区分开。这些参考文献还说明了核苷酸类似物的用途，所述核苷酸类似物可基于初始可检测的信号，此后由于用修饰标记物的试剂处理(如通过标记物和核苷酸部分之间接头的化学切割)而丢失或至少降低来加以区分。在这种情况下，组中其它核苷酸类似物种类对修饰不易感(如缺少可切割接头)并且基于处理后信号产生的持久性加以区分。
94.如以上示例，在一些实施方案中，可将标记物通过可切割的接头附接到核苷酸类似物。在具体的实施方案中，可使用光可切割的接头代替以上示例的化学可切割的接头。在一些实施方案中，接头选自酸不稳定的接头(包括双烷氧基苄基接头、sieber接头、吲哚接头、叔丁基sieber接头)、亲电子可切割的接头、亲核可切割的接头、光可切割的接头、在还原条件或氧化条件下切割的接头、保险栓接头及通过消除机制切割的接头。在一些此类实施方案中，接头选自二硫化物接头(-s-s-)、酯、硝基苯、亚胺、酶促或化学可切割的肽和多核苷酸，诸如dna。
95.在一些实施方案中，在引物延伸反应中使用的第一组核苷酸类似物的成员(例如通过第一常规处理选择性地去封闭的核苷酸类似物)将仅包括一种类型的被检测的光学标记物，且正交于第一组的第二组核苷酸类似物(例如通过第二常规处理选择性地去封闭的核苷酸类似物)也将仅包括一种类型的被检测的光学标记物，其中在第一组中使用的标记物与在第二组中使用的标记物在光学上可区分。在该实施方案中，可将所述一种类型的光学标记物附接到第一组中第一种类的基本上所有核苷酸类似物，可将一种类型的光学标记物附接到第一组中第二种类的核苷酸类似物的子集，可将第一组中第三种类的基本上所有核苷酸类似物附接到配体，并且不将第一组中第四种类的基本上所有核苷酸类似物附接到一种类型的光学标记物或配体。
96.在另一个实施方案中，在引物延伸反应中使用的第一组核苷酸类似物的成员(例如通过第一常规处理选择性地去封闭的核苷酸类似物)将仅包括两种类型的被检测的光学标记物，且与第一组正交的第二组核苷酸类似物(例如通过第二常规处理选择性地去封闭的核苷酸类似物)也将仅包括两种类型的被检测的光学标记物。在该实施方案中，可将所述两种类型的光学标记物的第一种附接到第一组中第一种类的基本上所有核苷酸类似物，可将所述两种类型的光学标记物的第二种附接到第一组中第二种类的基本上所有核苷酸类似物，可将所述两种类型的光学标记物的第一种和所述两种类型的光学标记物的第二种附接到第一组中第三种类的核苷酸类似物，并且不将第一组中第四种类的基本上所有核苷酸类似物附接到所述两种类型的光学标记物的一种或所述两种类型的光学标记物的第二种。
97.从以上实例将理解，减少正交检测系统中的不同标记物的数目可提供减少区分向
模板结合的引物添加的不同核苷酸所需要的检测装置的复杂性的优势。然而，在许多实施方案中，这通过如下来实现：增加流体步骤的复杂性，如此使得与当每个核苷酸种类具有独特的标记物时使用的流体步骤相比在检测步骤过程中使用的流体操作的数目增加。本方法的一般性优势在于本领域技术人员能够选择标记物、流体步骤和检测装置的适当组合以适应特定的应用或环境。
98.如上文阐述的实施方案例示，在一些情况下，分别在位点处与两种或多种不同的核酸模板杂交的两种或多种引物可以在引物延伸步骤期间同时存在。或者，可以将与位点处的两种或多种不同的模板杂交的两种引物中的第一个从该位点除去，之后延伸在位点处与两种或多种不同的模板杂交的两种或多种引物的第二个。
99.此外，由上述步骤产生的两种或更多种不同的引物延伸产物可以在检测步骤期间同时存在于位点处。或者，可以从位点处除去两种或多种不同的引物延伸产物的第一个，之后检测位点处的两种或多种不同的引物延伸产物的第二个。
100.此外，在去封闭步骤期间，可以同时存在两种或更多种各自具有不同可逆封闭部分的引物延伸产物。可以将去封闭步骤配置为选择性地除去(或在其它方面修饰)不同可逆封闭部分的一个或仅一个子集，使得在处理后至少保留(或未修饰)一个其它可逆封闭部分。或者，例如使用去封闭处理的组合或通用去封闭处理，可以除去所有同时存在的不同的可逆封闭部分。作为另一种备选，可以从位点处除去两种或更多种不同的引物延伸产物中的第一种，之后对两种或多种引物延伸产物中的第二种进行去封闭处理。
101.本公开提供了包含组分的各种组合的反应混合物(本文中还称为试剂系统)。在几种情况下，在如之前段落阐述的示例性方法的上下文中描述了反应组分和组分的几种组合。应当理解的是，反应混合物及其组分不需要限于在本文中例示的方法中使用。也可以考虑其它用途。因此，可以以各种有用的组合来组装组分，例如创建试剂盒。试剂盒可用于本文阐述成分的储存、运输或商业交易。试剂盒可以任选地包括用于实施本文所述的一种或多种方法的说明书。
102.在具体的实施方案中，本公开提供了用于对核酸模板测序的方法，其可以包括以下步骤：(a)提供位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列，其中将第一引物与所述第一核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第一引物的，其中将第二引物与所述第二核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第二引物的，并且其中附接至所述第一引物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分不同；(b)选择性除去附接至所述第一引物的所述可逆封闭部分，而保留附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分；(c)通过添加附接至可逆封闭部分的第一核苷酸类似物来延伸所述第一引物；(d)选择性除去附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；(e)通过添加附接至可逆封闭部分的第二核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(f)在每个所述位点处检测添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物和添加到所述第二引物的所述核苷酸类似物，从而在每个所述位点处测定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
103.在一些实施方案中，上述方法还可以包括以下步骤：(g)选择性除去附接至添加到
所述第一引物的所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第二引物的所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；(h)在(g)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第三核苷酸类似物来延伸所述第一引物；(i)选择性除去附接至添加到所述第二引物的所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第一引物的所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；(j)在(i)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第四核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第三核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第四核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及(k)在每个所述位点处，检测添加到(h)中所述第一引物的所述核苷酸类似物和添加到(j)中所述第二引物的所述核苷酸类似物，从而在每个所述位点处测定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。任选地，可以重复步骤(g)至(k)。
104.应当理解的是以上实施方案和本发明公开的其它实施方案中阐述的步骤不需要按照示例的顺序。以前述段落中的实施方案为例，步骤(f)(其描述了检测活动)不需要发生在步骤(e)之后。相反，在步骤(d)中延伸第二引物之前，可以检测步骤(c)中延伸的第一引物。通常，检测步骤可以在除去一个或多个不同的可逆封闭部分之前或之后发生。
105.可以改变其它步骤的顺序以适应方法的特定应用。通过比较图1和图2中的循环图来说明可采用类似步骤但以不同次序的两种方法的实例。在图1的循环图中，在标记物的去封闭和切割两者前检测引物延伸产物上的标记物。每组内核苷酸的去封闭和标记物切割显示为同时发生，例如当两者对相同的处理易感时或由于相容性处理，这可以是方便的。然而，去封闭和标记物切割可能分开发生。如图2的循环图示例，标记物切割和去封闭分开发生。在该实例中，同时切割在两个不同的反应(即r1和r2)中存在的不同的标记物。例如，当可以使用相同处理或用相容性处理切割两种类型的标记物时，这是方便的。对图1和图2中的循环图的比较也说明了其它差异。例如，图1中，两个反应(r1和r2)的延伸产物的去封闭发生在上一个循环的检测步骤之后，而在图2中，在前一个循环的检测步骤之前对r2延伸产物去封闭并且在前一个循环的检测步骤之后对r1延伸产物去封闭。可以在本文阐述的方法中使用多种步骤的不同排列和顺序。基于在此阐述的教导和所用试剂的已知反应特性，本领域技术人员将能够容易地确定期望的排列和顺序。
106.此外，如前文所述，可以序贯或同时本文阐述的方法的步骤。例如，可以同时或序贯地进行选择性除去不同的可逆封闭部分(例如前述段落中的步骤(b)和(d))。类似地，可以同时或序贯地发生不同的引物的延伸(如前述段落中的步骤(c)和(e))，所述引物已经使用各自不同的去封闭处理而去封闭。
107.通用引发位点对于本文阐述的方法的多重应用尤其有用。通用引发位点提供了两个或多个核酸分子所共有的序列区域，该区域中分子在其模板区域中也具有不同的序列。在分子集合的不同成员中存在的通用引发序列可允许使用与通用序列互补的单一通用引物种类复制、扩增或检测多个不同序列。将通用序列附接到靶核酸的集合的方法的实例可见于美国专利申请公开号2007/0128624a1，其通过引用并入本文。
108.在本公开的实施方案中，第一引物可以具有第一通用引物序列，该序列在位点处与第一模板的第一通用引发位点互补。对于阵列的不同位点处的多个不同第一模板可以存在相同的通用引发位点。因此，第一通用引物的单个种类可用于在位点处扩增或延伸不同的第一模板。继续这个例子，第二引物可以具有第二通用引物序列，该序列与在第一模板也
定位的位点处与第二模板的第二通用引发位点互补。对于阵列的不同位点处的多个不同第二模板可以存在相同的第二通用引发位点。因此，第二通用引物的单一种类可用于在位点处扩增或延伸不同的第二模板。
109.可将本文阐述的正交测序方法用于配对末端测序方法。通常，配对末端测序涉及确定在模板序列区域两端的序列，其中模板序列区域的长度是已知的。用于将靶核酸样品(例如，基因组dna样品)片段化、附接引物以适应配对末端读段及从片段的末端读取序列的方法是已知的，并可如例如在美国专利号7,754,429、8,017,335或8,192,930中描述的那样进行，其每一个通过引用并入本文。
110.在合成测序实施方案的情况下，可将核酸片段构建成具有两个模板序列，并且配对读段可从两个模板的每一个获得以从单个片段获得4个读段。用于从单个片段获得4个读段的示例性构建体以及用于制备该构建体的方法在美国专利公开号2015/0031560a1中阐述，其通过引用并入本文。
111.本公开还提供了核酸阵列，其包含在固相支持物上的多个位点，其中每个阵列包含第一核酸模板和第二核酸模板，其中所述第一核酸模板具有的序列不同于所述第二核酸模板的序列，其中第一引物结合至所述第一核酸模板，第一可逆封闭部分附接至所述第一引物，其中第二引物结合至所述第二核酸模板，第二可逆封闭部分附接至所述第二引物，和其中所述第一可逆封闭部分与所述第二可逆封闭部分是不同的。核酸阵列还可以包括在本公开的方法的背景下描述的一种或多种组分。在一些实施方案中，意图认为内在源自本文中阐述的方法的产物是核酸的组分。
112.在具体的实施方案中，核酸阵列将包含在位点处与第一引物和第一核酸模板结合的第一聚合酶。另外，可以将第二聚合酶与位点处的第二引物和第二核酸模板结合。在一些情况下，第一聚合酶和第二聚合酶是相同种类的聚合酶。然而，在一些实施方案中，第一和第二聚合酶是不同的种类(如dna聚合酶和rna聚合酶)也是有用的。
113.本公开的核酸阵列可以存在于检测装置如核酸测序装置中。示例性检测装置在本文中以及通过引用并入本文的参考文献中进行了描述。一般来说，检测装置可以包含核酸阵列和定位为检测阵列中的一个或多个位点的检测器。通常，检测器将具有空间分辨率，所述空间分辨率太低而不能解析与在每个所述位点处所述第一引物和所述第二引物之间的间隔等同的距离处的点。然而，使用正交引物去封闭和延伸允许解析两种引物。检测器可以被配置为观察如本文例示的多种信号中的任何一个。例如，在一些实施方案中，所述检测器是光学检测器。阵列位点可以具有可由光学检测器检测的光学标记物。可以延伸每个位点处的不同引物以掺入不同的光学标记物，并且可以配置光学检测器以在光学上区分不同的标记物(如由于光吸收波长、发光激发波长，或发光发射波长的差异)。在一些配置中，将检测器的像素配置为同时获取来自所述第一引物和所述第二引物两者的信号。
114.遍及本技术引用了多个出版物、专利和专利申请。在此这些出版物的公开内容通过引用以其整体并入本技术。
115.术语“包括”在本文中预期是开放式的，不仅包括提及的要素，另外还包括任何另外的要素。
116.已经描述了许多实施方案。然而，应理解可进行多种修改。因此，其它实施方案在所附权利要求书的范围内。
117.1.用于对核酸模板测序的方法，其包括：
118.(a)提供位点阵列，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，
119.其中所述第一核酸模板具有与所述第二核酸模板的序列不同的序列，
120.其中将第一引物与所述第一核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第一引物的，
121.其中将第二引物与所述第二核酸模板结合，可逆封闭部分是附接至所述第二引物的，并且
122.其中附接至所述第一引物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分不同；
123.(b)选择性除去附接至所述第一引物的所述可逆封闭部分，而保留附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分；
124.(c)通过添加附接至可逆封闭部分的第一核苷酸类似物来延伸所述第一引物；
125.(d)选择性除去附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；
126.(e)通过添加附接至可逆封闭部分的第二核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及
127.(f)在每个所述位点处检测添加到所述第一引物的所述核苷酸类似物和添加到所述第二引物的所述核苷酸类似物，从而在每个所述位点处测定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
128.2.项1的方法，其还包括：
129.(g)选择性除去附接至添加到所述第一引物的所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第二引物的所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；
130.(h)在(g)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第三核苷酸类似物来延伸所述第一引物；
131.(i)选择性除去附接至添加到所述第二引物的所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分，而保留附接至添加到所述第一引物的所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分；
132.(j)在(i)后，通过添加附接至可逆封闭部分的第四核苷酸类似物来延伸所述第二引物，其中附接至所述第三核苷酸类似物的所述可逆封闭部分与附接至所述第四核苷酸类似物的所述可逆封闭部分不同；以及
133.(k)在每个所述位点处，检测添加到(h)中所述第一引物的所述核苷酸类似物和添加到(j)中所述第二引物的所述核苷酸类似物，从而在每个所述位点处测定所述第一模板和所述第二模板的不同序列。
134.3.项2的方法，其还包括重复步骤(g)至(k)。
135.4.项1或2的方法，其中所述检测使用具有空间分辨率的检测器，所述空间分辨率太低而不能解析与在每个所述位点处所述第一引物和所述第二引物之间的间隔等同的距离处的点。
136.5.项1-4中任一项的方法，其中所述检测器是光学检测器。
137.6.项1-5中任一项的方法，其中所述核苷酸类似物包含光学标记物。
138.7.项6的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，并且其中所述第一组核苷酸类似物的所述光学标记物与所述第二组核苷酸类似物的光学标记物不同。
139.8.项1-7中任一项的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，并且其中所述第一组核苷酸类似物中所述核苷酸类似物的亚组包含光学标记物。
140.9.项8的方法，其中所述第二组核苷酸类似物中所述核苷酸类似物的亚组包含光学标记物。
141.10.项9的方法，其中所述第一组核苷酸类似物中核苷酸类似物的亚组包含光学标记物，所述光学标记物与所述第二组核苷酸类似物中所述核苷酸的亚组的所述光学标记物不同。
142.11.项1-7中任一项的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，其中所述第一组核苷酸类似物仅包含在步骤(f)中检测的一类光学标记物，并且所述第二组核苷酸类似物仅包含在步骤(f)中检测的一类光学标记物。
143.12.项11的方法，其中将所述一类光学标记物附接至所述第一组中第一种类的基本上所有的核苷酸类似物，
144.将所述一类光学标记物附接至所述第一组中第二种类的所述核苷酸类似物的亚组，
145.将所述第一组中第三种类的基本上所有的核苷酸类似物附接至配体，以及
146.不将所述第一组中第四种类的基本上所有的核苷酸类似物附接至所述一类光学标记物或所述配体。
147.13.项1-7中任一项的方法，其中所述第一核苷酸类似物来自第一组核苷酸类似物，其中所述第二核苷酸类似物来自第二组核苷酸类似物，其中所述第一组核苷酸类似物仅包含在步骤(f)中检测的两类光学标记物，并且所述第二组核苷酸类似物仅包含在步骤(f)中检测的两类光学标记物。
148.14.项13的方法，其中仅将所述两类光学标记物之一附接至所述第一组中的第一种类的基本上所有核苷酸类似物，
149.仅将所述两类光学标记物中的第二种附接至所述第一组中的第二种类的基本上所有核苷酸类似物，
150.将所述两类光学标记物之一和所述两类光学标记物中的第二种附接至所述第一组中第三种类的核苷酸类似物，和
151.不将所述第一组中的第四种类的基本上所有的核苷酸类似物附接至所述两类光学标记物之一或所述两类光学标记物中的所述第二种。
152.15.项1-14中任一项的方法，其中所述检测器的像素同时获取来自所述第一引物和所述第二引物两者的信号。
153.16.项1-15中任一项的方法，其中所述第一核酸模板包含至少一个碱基部分，所述
碱基部分与所述第二核酸模板中的碱基部分是相同种类。
154.17.项1-16中任一项的方法，其中步骤(b)和(d)同时进行。
155.18.项1-16中任一项的方法，其中步骤(b)和(d)序贯进行。
156.19.项1-18中任一项的方法，其中步骤(c)和(e)同时进行。
157.20.项1-18中任一项的方法，其中步骤(c)和(e)序贯进行。
158.21.项1-20中任一项的方法，其中单核酸分子含有所述第一核酸模板和所述第二核酸模板。
159.22.项1-20中任一项的方法，其中所述第一核酸模板和所述第二核酸模板在不同的核酸分子上。
160.23.项1-22中任一项的方法，其中所述位点具有100μm2或以下的面积。
161.24.项1-23中任一项的方法，其中所述位点包含所述第一核酸模板的多个扩增子和所述第二核酸模板的多个扩增子。
162.25.项24的方法，其中所述多个扩增子包含核酸簇。
163.26.项1-25中任一项的方法，其中所述多个位点具有10μm或以下的间距(pitch)。
164.27.项1-26中任一项的方法，其中所述多个位点包含至少1x106个位点。
165.28.项1-27中任一项的方法，其中每个所述位点包含核酸序列，该核酸序列与所述多个中的其它位点处的所述核酸序列相比是独特的。
166.29.项1-28中任一项的方法，其中所述第一引物包含第一通用引物序列并且所述多个位点中每个位点处的所述第一核酸模板包含与所述第一通用引物序列互补的第一通用引物结合序列。
167.30.项29的方法，其中所述第二引物包含第二通用引物序列并且所述多个位点中每个位点处的所述第二核酸模板包含与所述第二通用引物序列互补的第二通用引物结合序列，其中所述第一通用引物结合序列与所述第二通用引物结合序列不同。
168.31.项1-30中任一项的方法，其中通过相同的聚合酶或相同种类的聚合酶来进行步骤(c)和(e)。
169.32.项1-31中任一项的方法，其中使用叠氮基甲基和叔丁氧基-乙氧基作为可逆封闭部分。
170.33.项32的方法，其中通过膦(phosphine)处理来选择性除去所述叠氮基甲基，并且通过用酸处理来选择性除去所述叔丁氧基-乙氧基。
171.34.项1-31中任一项的方法，其中所述可逆封闭部分的所述选择性除去包括化学处理、热处理、照射或电处理。
172.35.项1-34中任一项的方法，其中附接至所述第一引物的所述可逆封闭部分与附接至所述第一核苷酸类似物的所述可逆封闭部分是相同种类。
173.36.项35的方法，其中附接至所述第二引物的所述可逆封闭部分与附接至所述第二核苷酸类似物的所述可逆封闭部分是相同种类。
174.37.用于对核酸模板测序的方法，其包括：
175.(a)提供位点阵列，其中每个位点包含至少两种不同核酸模板的混合物；
176.(b)分别用包含不同可逆封闭部分的不同核苷酸类似物延伸在每个所述位点处与所述不同核酸模板杂交的引物，从而在每个位点处产生不同的引物延伸产物；
177.(c)检测所述不同的引物延伸产物，以区分每个位点处的所述不同的核苷酸类似物；
178.(d)在每个所述位点处使用对所述不同可逆封闭部分中的第一种选择性的第一处理和对所述不同可逆封闭部分中的第二种选择性的第二处理来从所述引物延伸产物除去所述不同可逆封闭部分；并且
179.(e)重复(b)至(d)以测定在每个所述位点处添加到每个所述不同延伸产物的不同核苷酸类似物的序列。
180.38.项37的方法，其中与所述不同核酸模板杂交的所述引物在(b)的所述延伸期间同时存在。
181.39.项37至38中任一项的方法，其中所述不同引物延伸产物在(c)的所述检测期间同时存在。
182.40.项37至39中任一项的方法，其中所述不同可逆封闭部分中的第一种和所述不同可逆封闭部分中的第二种在(d)的所述除去期间同时存在于所述引物延伸产物上。
183.41.项37的方法，其中从所述位点阵列除去与所述不同核酸模板中的第一种杂交的第一引物，之后延伸与所述不同核酸模板中的第二种杂交的第二引物。
184.42.项37的方法，其中从所述位点阵列除去所述不同引物延伸产物中的第一种，之后检测所述不同引物延伸产物中的第二种。
185.43.项37的方法，其中在所述第二处理前，从所述位点阵列除去所述不同引物延伸产物中的第一种。
186.44.项37-43中任一项的方法，其中(c)在(d)之后进行。
187.45.项37-43中任一项的方法，其中所述检测使用具有空间分辨率的检测器，所述空间分辨率太低而不能解析与在每个所述位点处所述不同引物延伸产物之间的间隔等同的距离处的点。
188.46.项37-45中任一项的方法，其中所述检测器是光学检测器。
189.47.项37-46中任一项的方法，其中所述核苷酸类似物包含光学标记物。
190.48.项37-47中任一项的方法，其中将第一组核苷酸类似物添加到所述不同引物延伸产物中的第一种，并且将第二组核苷酸类似物添加到所述不同引物延伸产物中的第二种，其中所述第一组核苷酸类似物包含光学标记物，所述光学标记物与所述第二组核苷酸类似物的光学标记物不同。
191.49.项37-48中任一项的方法，其中检测器的像素同时获取来自所述第一引物延伸产物和所述第二引物延伸产物两者的信号。
192.50.项37-49中任一项的方法，其中所述第一核酸模板包含至少一个碱基部分，所述碱基部分与所述第二核酸模板中的碱基部分是相同种类。
193.51.项37-50中任一项的方法，其中单核酸分子含有至少两种不同的核酸模板。
194.52.项37-50中任一项的方法，其中所述至少两种不同的核酸模板中的第一核酸模板和第二核酸模板在不同的核酸分子上。
195.53.项37-52中任一项的方法，其中所述位点具有100μm2或以下的面积。
196.54.项37-53的方法，其中所述位点包含所述至少两种不同核酸模板中每种的多个扩增子。
197.55.项54的方法，其中所述多个扩增子包含核酸簇。
198.56.项37-55中任一项的方法，其中所述多个位点具有10μm或以下的间距。
199.57.项37-56中任一项的方法，其中所述多个位点包含至少1x106个位点。
200.58.项37-57中任一项的方法，其中每个所述位点包含核酸序列，该核酸序列与所述多个中其它位点处的所述核酸序列相比是独特的。
201.59.项37-58中任一项的方法，其中相同的聚合酶或相同种类的聚合酶在每个所述位点处进行与所述不同核酸模板杂交的所述引物的延伸。
202.60.项37-59中任一项的方法，其中所述选择性处理包括使用膦处理来选择性除去包含叠氮基甲基的可逆封闭部分，以及使用酸处理来选择性除去包含叔丁氧基-乙氧基的可逆封闭部分。
203.61.项37-59中任一项的方法，其中所述可逆封闭部分的选择性除去包括化学处理、热处理、照射或电处理。
204.62.核酸阵列，其包含：
205.固体支持物上的多个位点，其中每个位点包含第一核酸模板和第二核酸模板，
206.其中所述第一核酸模板具有的序列不同于所述第二核酸模板的序列，
207.其中第一引物结合至所述第一核酸模板，第一可逆封闭部分附接至所述第一引物，
208.其中第二引物结合至所述第二核酸模板，第二可逆封闭部分附接至所述第二引物，和
209.其中所述第一可逆封闭部分与所述第二可逆封闭部分是不同的。
210.63.项62的核酸阵列，其中所述固体支持物上每个位点占据100μm2或更小的面积。
211.64.项62或63的核酸阵列，其中所述多个位点具有10μm或以下的间距。
212.65.项62-64中任一项的核酸阵列，其中所述多个位点包含至少1x106个位点。
213.66.项65的核酸阵列，其中每个所述位点包含核酸序列，该核酸序列与多个中其它位点处的所述核酸序列相比是独特的。
214.67.项62-65中任一项的核酸阵列，其中将所述第一可逆封闭部分附接至所述第一引物的3’核苷酸。
215.68.项67的核酸阵列，其中将所述第一引物的3’核苷酸附接至第一光学标记物。
216.69.项67-68中任一项的核酸阵列，其中将所述第二可逆封闭部分附接至所述第二引物的3’核苷酸。
217.70.项69的核酸阵列，其中将所述第二引物的3’核苷酸附接至第二光学标记物，其中所述第二光学标记物与所述第一光学标记物在光学上是可区分的。
218.71.项67-70中任一项的核酸阵列，其中所述第一和第二光学标记物包含荧光团。
219.72.项62-71中任一项的核酸阵列，其中所述第一核酸模板和所述第二核酸模板包含dna。
220.73.项62-72中任一项的核酸阵列，其中单核酸分子含有所述第一核酸模板和所述第二核酸模板。
221.74.项62-73中任一项的核酸阵列，其中所述第一核酸模板和所述第二核酸模板位于不同的核酸分子上。
222.75.项62-74中任一项的核酸阵列，其中所述位点包含所述第一核酸模板的多个扩增子和所述第二核酸模板的多个扩增子。
223.76.项75的核酸阵列，其中所述多个扩增子包含核酸簇。
224.77.项62-76中任一项的核酸阵列，其中所述第一引物包含第一通用引物序列并且在所述多个位点中的每个位点处的所述第一核酸模板包含与所述第一通用引物序列互补的第一通用引物结合序列。
225.78.项77的核酸阵列，其中所述第二引物包含第二通用引物序列，并且在所述多个位点中的每个位点处的所述第二核酸模板包含与所述第二通用引物序列互补的第二通用引物结合序列，其中所述第一通用引物结合序列与所述第二通用引物结合序列是不同的。
226.79.项62-68中任一项的核酸阵列，其中将第一聚合酶与所述第一引物和所述第一核酸模板结合。
227.80.项79的核酸阵列，其中将第二聚合酶与所述第二引物和所述第二核酸模板结合，并且其中所述第一聚合酶和所述第二聚合酶是相同种类的聚合酶。
228.81.项62-80中任一项的核酸阵列，其中所述第一可逆封闭部分包含叠氮基甲基并且其中所述第二可逆封闭部分包含叔丁氧基-乙氧基。
229.82.检测装置，其包含
230.项62-81中任一项的核酸阵列，和
231.定位为检测多个位点的检测器。
232.83.项82的检测装置，其中所述检测器具有空间分辨率，所述空间分辨率太低而不能解析与在每个所述位点处所述第一引物和所述第二引物之间的间隔等同的距离处的点。
233.84.项82或83的检测装置，其中所述检测器是光学检测器。
234.85.项82-83中任一项的检测器，其中所述检测器的像素配置为同时获取来自所述第一引物和所述第二引物两者的信号。