特异识别金葡菌肠毒素B的核酸适配体3-2和2-27的序列及应用

特异识别金葡菌肠毒素b的核酸适配体3-2和2-27的序列及应用
发明领域：
1.本发明涉及两条特异识别金葡菌肠毒素b的核酸适配体3-2、2-27的序列和修饰，以及 修饰后的3-2、2-27在识别金葡菌肠毒素b方面的应用。本发明涉及3-2、2-27在生物医药 方面的应用。3-2、2-27作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于金葡菌肠毒素b的检测 或者抗金葡菌感染发生、发展、进程相关的基础研究及靶向药物研制等。


背景技术：

2.指数富集的配基系统进化技术，简称selex(systematic evolution of ligands byexponential enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。 应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssdna文库和rna文库)，结合pcr体外扩增技术，以 指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的核酸适 配体(aptamer)基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合。由于核酸适配体具有 精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、 临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。尤其是近年来兴起的复合靶selex技术， 使得对未知靶分子进行筛选成为可能，并且通过引入消减筛选步骤，能够获得特异识别两组 复合靶子中差异存在分子的核酸适配体，并能利用该配基反过来对差异靶分子进行研究，这 就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物开辟了新的途径。
3.金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins，ses)是由金黄色葡萄球菌和化脓性 链球菌分泌的超级抗原。ses是免疫系统的有效激活剂。金黄色葡萄球菌肠毒素b(seb)和 相关的超抗原毒素是免疫系统的有效激活剂。这些蛋白质毒素直接与抗原呈递细胞上的主要 组织相容性复合物(mhcii)类分子和t细胞受体(tcr)的特定vβ区结合，导致单核细 胞、巨噬细胞和t淋巴细胞均被激活，引发早期的“细胞因子风暴”和大规模的多克隆t细 胞增殖。使得促炎细胞因子：肿瘤坏死因子α(tnf-α)，白介素1(il-1)，il-2，干扰素γ (ifn-γ)和巨噬细胞趋化蛋白1等大量释放，引起发热，炎症，多器官损伤，低血压和致 死性休克等疾病。seb被美国疾病控制与预防中心(centersfordiseasecontrolandprevention，简 称cdc)认定为b类精选制剂。seb中毒通常是在食用加工过的肉类或奶制品后(处理和储存 不当)而引起的食物中毒。除了造成食物中毒，seb还被用作生物战剂，吸入seb后2小时 内可引起以下症状：头痛、肌肉疼痛、心动过速、咳嗽、恶心、呕吐、腹泻和结膜刺激。这些 形式的失能发生在毫微克水平，而微克的seb可能是致命的。
4.本发明是通过selex技术获得了两条核酸适配体3-2、2-27。经鉴定，核酸适配体3-2、 2-27能够特异识别金葡菌肠毒素b，而不结合其他蛋白，对照核酸序列与上述蛋白均无结合， 目前虽见到文献有报道特异结合金葡菌肠毒素b的核酸适配体的相关研究报道，但是我们筛 选获得的适配体序列与文献报道的适配体序列并不一样，类似于针对同一抗原可以有不同结 合位点的抗体，由于其筛选的初始文库不同，因此针对同一靶标seb，不同的适配体与其结 合的位点也会不同。因此本发明中的适配体3-2、2-27的序列具有独创性和
24.注：n代表a、t、g、c任意一种。
25.2.elisa方法鉴定生物素标记的3-2、2-27特异识别金葡菌肠毒素b
26.2.1将一定量的金葡菌肠毒素b融于ph 9.7的碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联 条中，4℃包被蛋白过夜；
27.2.2弃包被液，每孔加入100μl含2％bsa封闭液，室温封闭60min；
28.2.3将不同浓度的bio-2-27、bio-3-2和无关对照序列bio-gp30溶解于合适体积的缓冲液中 (1
×
pbs-1mmolmgcl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
29.2.4将经过变性处理后的bio-2-27、bio-3-2和无关对照序列(bio-gp30文库)加入酶联条 中，使核酸适配体与包被的金葡菌肠毒素b共同孵育37℃2h；
30.2.5弃去孔内液体，每孔用350μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内 液体完全甩干；
31.2.6每孔加入100μl按照1∶100稀释好的hrp酶，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5 次，方法同上；
32.2.7每孔加入100μl tmb显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μl终止 液，酶联仪读数。
33.3.滤膜-化学发光法鉴定bio标记的3-2、2-27对seb的特异识别
34.3.1将一定量的seb点在hawp膜上，并室温平衡30min；
35.3.2将一定浓度的bio-标记的3-2、2-27和无关对照序列(bio-gp30文库)溶解于合适 体积的缓冲液中(1
×
pbs-1mmolmgcl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
36.3.3洗膜：将上述滤膜侵泡在洗涤缓冲液中并置于摇床上缓慢摇动，共洗3次，每次2min；
37.3.4将上述滤膜放入加有1∶100稀释好的hrp酶缓冲液中，室温孵育40min，洗膜，方法同 上，共洗3次；
38.3.5上述滤膜与tmb显色液孵育5min，37℃避光显色，化学发光仪检测并留图。
39.4.elisa方法鉴定生物素标记的3-2、2-27特异识别金葡菌培养上清中的肠毒素b
40.4.1将一定量的金葡菌培养上清融于ph 9.7的碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联 条中，4℃包被蛋白过夜；
41.4.2弃包被液，每孔加入100μl含2％bsa封闭液，室温封闭60min；
42.4.3将不同浓度的bio-2-27、bio-3-2和无关对照序列(bio-gp30文库)溶解于合适体积的 缓冲液中(1
×
pbs-1mmolmgcl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；
43.4.4将经过变性处理后的bio-3-2、bio-2-27和无关对照序列(bio-gp30文库)加入酶联条 中，使核酸适配体与包被的金葡菌肠毒素b共同孵育37℃2h；
44.4.5弃去孔内液体，每孔用350μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内 液体完全甩干；
45.4.6每孔加入100μl按照1∶100稀释好的hrp酶，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5 次，方法同上；
46.4.7每孔加入100μl tmb显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μl终止 液，酶联仪读数。
47.5、3-2、2-27与seb蛋白结合的平衡解离常数(kd值)的测定
48.将100nm bio标记的适配体溶解于上样液中(1
×
pbs，1mmol/l mgcl2，0.02％吐温 20)进样，随后分别与最高浓度为2μm的等比稀释的不同浓度seb溶液(上样液溶解)结合， 最后用上样液解离。整个上样、结合、解离过程均在分子相互作用仪中进行。舍去偏离曲线 较远的点绘制图像。适配体-seb相互作用的曲线和解离常数(kd)为使用软件计算和绘制得 到。
49.实验结果：
50.以上实验方法均证明核酸适配体3-2、2-27特异结合seb
51.由图1可以得到结论：elisa实验证明3-2、2-27特异识别seb，而对照序列则 与seb无结合。
52.由图2可以得到结论：滤膜-化学发光法实验证明3-2、2-27能够特异结合seb， 而对照序列与seb无结合。
53.由图3可以得到结论：elisa实验证明3-2、2-27特异识别金葡菌培养上清中的 seb，而对照序列则无结合。
54.由图4可以得到结论：3-2与seb结合的平衡解离常数kd值，约为1.11e-05m。
55.由图5可以得到结论：2-27与seb结合的平衡解离常数kd值，约为4.55e-05m。
56.总之，核酸适配体3-2、2-27能够特异识别seb，具有广泛临床应用价值。