系列多通道显微术的制作方法

系列多通道显微术


背景技术：

1.本发明涉及通过重复荧光标记和靶部分的成像而不在成像步骤之间降解荧光标记来检测生物试样的样品上不同的靶部分的方法。
2.目前用于重复荧光标记和成像的方法是循环方法，其中对靶染色，拍摄图像，并且在开始新的染色轮之前通过氧化或辐射去除染色。
3.例如，ep3037821公开了根据例如荧光信号用具有用于可逆荧光标记的可酶降解的间隔物的缀合物检测和分离靶部分的方法。
4.pct/ep2019/060403公开了包含可酶降解的间隔物的缀合物可释放标记，其中通过在可释放间隔物和荧光染料之间插入包含一个或多个聚乙二醇的连接基团单元增加用于检测的荧光量子产率。
5.从ep 0810428、ep1181525、ep 1136822或ep1224472中进一步了解重复成像方法，其中生物试样的样品在序列周期中与偶联到荧光部分的抗原识别部分接触，通过荧光部分检测抗原的位置，并消除荧光部分。通过重复标记-检测-消除步骤，可以对蛋白质网络作图，可以定位不同的细胞类型，并且可以分析蛋白质组中的疾病相关的变化。
6.所有这些技术都涉及在成像步骤之间的脱色步骤。脱色可以涉及用化学品(如氧合试剂)或辐射处理以破坏荧光标记。除了由于这种处理对生物试样的不期望的压力之外，脱色是耗时的过程，其显著增加总的方法时间。
7.已经显示，通过首先加入一种试剂，随后拍照，加入第二试剂并拍照的两步过程，可以产生具有多个信息的图像。这样的方法例如由以下公开：jennifer pankratz等人: "reaiease technology: controlled release of antibody-fluorochrome conjugates for maximal flexibility in flow sorting and fluorescence microscopy appiications", cancer research, 第79卷, 第13期, suppi., 2019年5月1日(2019-05-01), 第4048页; song等人: " expression of drebrin e in migrating neuroblasts in adult rat brain: coincidence between drebrin e disappearance from cell body and cessation of migration", neuroscience, new york, ny, us, 第152卷, 第3期, 2008年1月19日(2008-01-19), 第670-682页以及christoph herbel等人: "macsima(tm) imaging platform provides new insights into cancer biology and target discovery by cyclic immunofluorescence-based imaging", macs & more, 第18卷, 第1期, 2019年8月2日(2019-08-02), 第16-20页。
8.这些出版物描述了其中第一试剂识别一种基因产物的分子的子集并且第二试剂识别一种基因产物的所有分子的方法。在该出版物中，随后显示如何通过在第一和第二染色之间的简单图像减法来在各种形式之间区分。在该出版物中，由于选择的程序，每个步骤的程序耗时几个小时。
9.然而，已知荧光染料具有可变的光稳定性性质和/或用于染色的缀合物具有可变的与相应的靶的结合常数。此外，当被光激活时，一些荧光染料与其它荧光染料相比衰减更快。由于“被光激活”包括激发辐射，不能避免发射随时间的衰减，并且仅仅减去图像可能导
致错误的或误导性的差分图像。荧光发射随时间的衰减在下文中称为“采集漂白”。


技术实现要素：

10.因此，本发明的目的是提供用于通过重复荧光标记和成像来检测生物试样的样品上的不同的靶部分的方法，所述方法不涉及成像步骤之间的脱色，并且任选地考虑采集漂白。
11.发现可以从彼此不同的周期中减去图像，从而为每个靶部分产生单独的图像并同时考虑采集漂白。因此，减法方法去除脱色的需要。
12.因此，本发明涉及用于检测生物试样的样品中的靶部分的方法，所述方法通过由以下组成的以下周期：a)使所述样品与包含第一抗原识别部分y和第一荧光部分x的第一缀合物接触，从而使所述第一缀合物的至少一部分结合到被所述第一抗原识别部分y识别的所述靶部分b)从所述样品中去除未结合到所述靶部分的所述第一缀合物c)获得所述样品的第一图像，从而检测用所述第一缀合物标记的所述靶部分用包含第二抗原识别部分y’和第二荧光部分x’的至少一种第二缀合物重复步骤a)至c)，从而获得至少一个第二图像，并且其中所述第一和第二抗原识别部分y’结合到不同的靶部分，其特征在于所述第一图像的强度因降解函数而降低，并随后从所述至少一个第二图像中减去。
13.图1显示用八种不同的缀合物进行“数字”染色的示意图，其中包括每个图像暴露20%的采集漂白。这意味着一轮的特异性染色在后一轮中减弱20%，等等。
14.第一行显示用四种不同的缀合物的四轮染色1、2、3、4。在每轮染色后拍摄图像。随后从前一轮的图像中减去后一轮的图像。第二行显示仅显示在第二轮加入的特定信号的所得图像。
15.第三行显示来自1号和5号染色重叠的情况。在5个周期期间1号染色已经被拍摄的5个图像减弱，并且在随后的周期中变得不可见。如在图像行的第四行的第一图像中所示，该部分重叠允许提取第5轮中的特定信号。
16.在本发明的方法中，在荧光显微镜中拍摄系列图像，并且在每次暴露后，染色强度取决于所用的相应的荧光染料的稳定性而降低。当拍摄荧光图像时，荧光染料随着时间而降解。每种荧光染料的降解函数用于增强图像减法的精度。
17.根据由song等人在biophysical journal，第68卷，1995年6月，第2588-2600页中公开的方法，可以将降解函数计算为强度降低。
18.在更简化的方法中，估计荧光染料随时间的降解遵循随时间的线性函数。由于本发明的染色和洗涤过程通常在1-10分钟的相当的时间范围内进行，可以使用简化的降解函数而不丢失太多信息。在本发明的这个变体中，将降解函数计算为强度降低5-50%，优选10-30%。
19.在两种变体中，术语“强度降低”或“采集漂白”是指两个图像之间荧光染料的发射强度降低。换句话说，强度降低取决于图像的处理时间。处理时间或所拍摄的图像序列越快，则强度降低和降解函数将越小。
20.为了校准的目的，应当根据利用的荧光染料来测量两个图像之间的荧光染料的发
射强度降低。这可能导致对不同的荧光染料使用不同的降解函数。
21.在该实施方案中，对于在每次暴露时的一系列图像中的每个图像，可以预测荧光染料的衰减，并随后用于基于前一染色和衰减参数使用图像中的像素的特定光稳定性性质来进行另外的图像处理。这特别允许在多个染色系列中及时隔开类似的标记，并且使两个图像之间的差分图像最大化。
22.通过使用通常不在相同细胞上或相同位置处表达的抗体组合，在该过程中彼此相邻，本发明的方法提供了图像，其中通过将染色加入到在前一步骤中未染色的区域，将在图像中建立染色。通过染色的这种物理分离，将实现图像减法结果的进一步改进。
23.通过使用荧光抗体，由于称为采集漂白的性质，每次拍摄图像时荧光抗体的染色强度将降低。由此，一个染色周期的染色强度在每个随后的周期之后将更弱。
24.本发明的系列方法允许该方法的微型化，并且可以在非常小的室中在单一视野上进行。这种微型化允许该方法与多个样品分析的平行化。
附图说明
25.图1显示根据本发明的具有8个周期的示意性染色过程。
26.图1显示通过4种不同的缀合物对试样的重复染色，其中a)缀合物1；b)缀合物1 2；c)缀合物1 2 3；和d)缀合物1 2 3 4。
27.图2显示图1的图像的减法，其中a)图1a)的染色；b)图1b-1a的染色；c)图1c-(1b 1a)的染色；和d)图1d-(1c 1b 1a)的染色。
28.图3显示11个染色周期的模拟，包括作为拍摄图像的结果的20%采集漂白的假设。
具体实施方式
29.在系列多通道显微术中，有两个重要因素，抗原识别部分试剂占据的空间和抗原识别部分的强度范围。系列多通道显微术要求测量或定义空间(区域)或由相机在给定的空间(区域)上捕获的强度范围的分数。第一参数可以通过增加显微镜的分辨率来增加，第二参数可以通过在周期中抗原识别部分试剂浓度的精确间隔来影响。
30.图1通过举例的方式显示本发明的方法，其示意图为用八种不同的缀合物对“数字”进行染色以证明原理。第一行显示用四种不同的缀合物的四轮染色1、2、3、4。在每轮染色后拍摄图像。随后从前一轮的图像中减去后一轮的图像。第二行显示仅显示在第二轮加入的特定信号的所得图像。在图1所示的示意图中，包括每次图像暴露20%的采集漂白。这意味着一轮的特异性染色在后一轮中减弱20%，等等。
31.图的示意图中的第三行显示来自1号和5号的重叠染色的情况。在5个周期期间1号的染色已经被拍摄的5个图像减弱，并且在随后的周期中变得不可见。如图像行的第四行的第一图像中所示，该部分重叠允许提取第5轮中的特定信号。通过在标记物的选择中将重叠区域隔开，甚至可以观察存在于试样的相同区域中的标记物。
32.在本发明的第一实施方案中，在至少2个周期中重复步骤a)至c)，其中在每个周期中获得图像，并且其中在每个周期之后，从当前周期的图像中减去前一周期的图像。换句话说，在至少2个周期中重复步骤a)至c)，其中在每个周期中获得图像，并且其中在每个周期之后，获得当前图像和前一个周期的图像的差分图像。
33.在本发明的第二实施方案中，在至少2个周期中重复步骤a)至c)，其中在每个周期中获得图像，并且其中在最后一个周期之后，从相应的前一个周期的图像中减去每个周期的图像。换句话说，在至少2个周期中重复步骤a)至c)，其中在每个周期中获得图像，并且其中在最后一个周期之后，获得每个周期和相应的前一个周期的差分图像。
34.优选地，在2-500个周期、优选在2-100周期中重复步骤a)至c)，。
35.在本发明的第三实施方案中，图像作为像素图形图像获得，并且图像的减法通过像素的减法算法获得。
36.可以通过洗涤从样品中去除未结合到靶部分的缀合物。
37.在最简单的情况下，相同的抗原或相同的位置被多次识别，在该程序中第二试剂随时间的使用间隔允许扩展强度范围，因为在多次图像暴露时，前一试剂的荧光强度将衰减。例如，如song等人在biophysical journal，第68卷，1995年6月，第2588-2600页中所讨论的，作为衰减基础的函数最可能是多指数函数。取决于光源和荧光染料的强度，可以在1分钟内或高达60分钟内观察到衰减。只有特殊的光敏电阻半导体基染料(例如量子点)即使在几个小时后也不会显示衰减。
38.在另一个实施方案中，缀合物的荧光部分通过暴露于辐射而衰减。发射的所得衰减可以按照song等人在biophysical journal，第68卷，1995年6月，第2588-2600页中所公开的方法计算，并且可以用于在图像减法期间“隔开”不同的染色周期的强度。我们自己的测量揭示了实现每周期至少10%的发射衰减。
39.通过隔开使用第二试剂，第一染色的剩余强度与第二试剂的另外的荧光强度之间的差异减小，导致更大的差异。
40.图像处理循环多通道显微术要求在每次染色后通过各种手段去除荧光染色。该步骤需要时间。本文公开的程序允许以系列方式进行若干通道染色，因为需要荧光染色的主动去除步骤。由此，加速多通道显微术的采集。
41.当样品用荧光检测试剂染色时，标记由试剂检测的区域，并在显微镜中用必要的光和检测器系统检测标记。
42.利用本发明的方法，检测在第一染色和图像采集之后的第二染色之后的染色的增加。通过用已经公开的软件进行简单的图像处理，第一和第二染色后的图像之间的差分图片揭示第二荧光染色的另外的染色。取决于试剂的特异性和强度的选择，多个系列染色和图像采集步骤是可能的。另外，通过选择荧光染料的颜色的小的改变，如果需要，可以使用另外的信息来进一步改进两个染色步骤之间的灵敏度和选择性。
43.该方法可以用于静态系列染色和图像采集步骤，或者在通过向流体系统加入试剂来控制染色试剂的加入和去除的条件下，在连续流和连续成像下使用。
44.由荧光显微镜拍摄的图像可以使用已知的软件处理，例如使用开放源软件程序“fiji”。“fiji”提供模块“图像计算器”，其可以用于通过函数“加”将两个图像相加，并且通过函数“减”将两个图像相减。随后在新窗口中显示图像操作的结果，并将其保存在新的图像文件中。减去两个图像是许多成像处理程序的特征，并且可以容易地获得这样的软件。
45.与软件类似，图像可以由技术人员由已知的任何照相机拍摄，例如得自allied vision的prosilica gt 6600。
46.通过对样品染色获得的染色强度取决于所使用的染色试剂的量。可以以染色是可见的以检测染色的存在或不存在，而不是通过引入达到图像检测装置的总容量的强染色的方式来调整所使用的染色试剂的量。在随后的染色中，可以在第一染色的顶部上以非常良好调节的染色试剂量进行另外的染色，导致在两种试剂结合的位置处的重叠染色图案的情况下强度增加。随后可以使用图像计算程序，基于图像之间染色强度的比较，区分单染色的像素相对于双染色的像素。
47.本发明的系列多通道显微术方法也可以与已知方法组合，其中通过已知的程序(如辐射、酶的氧化去除荧光染料或染色试剂)来去除荧光试剂的染色。系列染色程序还允许以系列方式使用其它标记技术，如通过荧光寡核苷酸探针标记染色试剂。优选地，在本发明的方法的最后一个周期之后利用这样的其它标记技术。
48.在本发明的另一个实施方案中，未结合到相应的靶部分的第一和第二缀合物的图像用于校准通过暴露于辐射的衰减。为此，样品的支持物可以涂布有被缀合物识别的蛋白质。在不用于染色细胞的通道中，可以确定荧光染料衰减因子。利用该衰减因子，可以改进图像减法结果。
49.在本发明的另一个实施方案中，使用在略微不同的波长处具有略微不同的吸收光谱或至少最大吸收的第一和第二缀合物。当使用具有重叠吸收光谱的荧光染料时，可以不同时使用它们，而是一个接一个地使用它们。通过不同的光谱，它将再次改进图像减法结果。因此，根据本发明的方法可以包括提供最大吸收相差至少10 nm的至少两个荧光部分y。
50.在本发明的另一个实施方案中，所述方法作为连续过程进行，并且周期性地拍摄图像而不考虑染色步骤。结果是，染色和染色衰减的图像可以组合成电影状序列。这种方法将允许优化不同的染色之间的时间安排。该“电影”可以是每分钟拍摄几幅图像的慢动作电影，其足以提取必要的信息。增加的可用于拍摄图像的时间将增加图像的灵敏度。图像数量的增加将改进给定周期中的特异性染色的差分计算的结果。
51.用于本发明的缀合物通常，细胞荧光标记领域中已知的任何缀合物都可以用于本发明的方法中。这包括提供有荧光部分x和抗原识别部分y的任何缀合物。作为抗原识别部分y，可以利用直接或经由与荧光部分x连接的间隔物的任何高亲和力(如抗体)或低亲和力(如fab分子)单元。本发明的方法中使用的缀合物可以具有通式(i) x
o-ym或(ii) (x
o-l)
n-ym或(iii) (x
o-l)
n-p-ym。此外，缀合物可以包含允许从靶细胞中去除标记的单元，例如通过加入酶和/或增加荧光量子产率的连接基团单元。这样的缀合物可以具有通式(iv) (x
o-l)
n-p(l)
l
(x)
x-ym。在通式(i)至(iv)中，p代表可酶降解的间隔物，l代表共价结合的连接基团单元l，并且x代表共价结合的荧光部分x。l和x是0-100之间的整数，并且n、o、m是1-100之间的整数。
52.靶部分待用本发明的方法检测的靶部分可以在任何生物试样上，如组织切片、细胞聚集体、悬浮细胞或粘附细胞。细胞可以是活的或死的。优选地，靶部分是在生物试样(如完整动物、器官、组织切片、细胞聚集体或无脊椎动物(例如秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇)、脊椎动物(例如斑马鱼、非洲爪蟾)和哺乳动物(例如小家鼠和其它亚种、家鼠属各种亚种、人类)的单细胞)上细胞内或细胞外表达的抗原。
53.荧光部分
术语x和x’是指不同的荧光部分，并且对于x所公开的所有特征也适用于x’，并且反之亦然。
54.合适的荧光部分是免疫荧光技术领域已知的，例如流式细胞术或荧光显微术。在本发明的这些实施方案中，用缀合物标记的靶部分通过激发荧光部分x并检测所得发射(光致发光)来检测。有用的荧光部分可以是小的有机分子染料，例如呫吨染料(如荧光素)、或罗丹明染料、香豆素染料、花青染料、芘染料、噁嗪染料、吡啶基噁唑染料、pyromethene染料、吖啶染料、噁二唑染料、carbopyronine染料、苯并吡喃染料、芴染料、或金属有机络合物(例如ru、eu、pt络合物)。除了单分子实体之外，小的有机分子染料、荧光低聚物或荧光聚合物(例如聚芴)的簇也可以用作荧光部分。另外，荧光部分可以是基于蛋白质的(例如藻胆蛋白)、纳米颗粒(例如量子点、上转换纳米颗粒、金纳米颗粒、染色的聚合物纳米颗粒)。
55.荧光部分x可以共价偶联到连接基团单元l。共价缀合的方法是本领域技术人员已知的。荧光部分x或连接基团单元l上的活化基团与连接基团单元l或荧光部分x上的官能团直接反应，或者经由异双函数连接基团分子，其首先与一个反应并随后与另一个结合配偶体反应是可能的。
56.例如，荧光染料可以具有对氨基或硫醇基具有反应性的基团，例如与连接基团单元上的氨基反应的活性酯，例如n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)、磺基二氯苯酯(sdp)、四氟苯酯(tfp)和五氟苯酯(pfp)，或与连接基团单元上的硫醇基反应的迈克尔受体或卤代乙酰基，例如马来酰亚胺基团、碘乙酰胺基团和溴马来酰亚胺基团。大量异双函数化合物可用于与实体连接。说明性实体包括：叠氮苯甲酰肼、n-[4-(对-叠氮水杨氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺)、双-磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯、二甲基己二亚酰胺化物、二琥珀酰亚胺酒石酸酯、n-y-马来酰亚氨基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、n-羟基磺基琥珀酰亚胺-4-叠氮苯甲酸酯、n-琥珀酰亚胺[4-叠氮苯基]-1,3'-二硫代丙酸酯、n-琥珀酰亚胺[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛、琥珀酰亚胺-[(n-马来酰亚氨基丙酰胺基)聚乙二醇]酯(nhs-peg-mal)和琥珀酰亚胺4-[n-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-羧酸酯。优选的连接基团是3-(2-吡啶基二硫代)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(spdp)或4-(n-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(smcc)，其中在荧光部分上具有反应性巯基，并且在连接基团单元上具有反应性氨基。
[0057]
用于本发明的方法的缀合物可以包含1-100个，优选2-30个荧光部分x。
[0058]
抗原识别部分y术语“抗原识别部分y”是指以足够高的亲和力与在生物试样上的细胞内或细胞外表达的靶部分结合以在洗去未结合的抗原识别部分后保留在靶上的任何种类的分子。术语y和y’是指不同的抗原识别部分，并且y所公开的所有特征也适用于y’，并且反之亦然。
[0059]
术语“抗原识别部分y”尤其涉及抗体、片段化的抗体、片段化的抗体衍生物、靶向tcr分子的肽/mhc络合物、细胞粘附受体分子、共刺激分子或人工工程改造的结合分子的受体、肽、凝集素或适体、rna、dna、寡核苷酸及其类似物。
[0060]
片段化的抗体衍生物是例如fab、fab'、f(ab')2、sdab、scfv、di-scfv、纳米抗体。这样的片段化的抗体衍生物可以通过重组程序来合成，包括含有这些种类的分子的共价和非共价缀合物。
[0061]
在本发明的方法中使用的缀合物可以包含1-100个，优选1-20个抗原识别部分y。
抗原识别部分与靶部分的相互作用可以是高或低亲和力的。单个低亲和力抗原识别部分的结合相互作用太低而不能提供与抗原的稳定结合。低亲和力抗原识别部分可以通过与可酶降解的间隔物p缀合而多聚化以提供高活动性。
[0062]
优选地，术语“抗原识别部分y”是指针对由生物试样(靶细胞)细胞内(如foxp3、cd154、ki67)或细胞外(如cd3、cd14、cd4、cd8、cd25、cd34、cd56和cd133)表达的抗原的抗体或fab。
[0063]
抗原识别部分y(尤其是抗体)可以通过侧链氨基或巯基偶联到间隔物p。在一些情况下，抗体的糖苷侧链可以被高碘酸盐氧化，产生醛官能团。
[0064]
抗原识别部分y可以共价或非共价偶联到间隔物p。共价或非共价缀合的方法是本领域技术人员已知的，并且与用于荧光部分x的缀合所提及的方法相同。
[0065]
方法的用途本发明的方法可以用于研究、诊断和细胞疗法中的各种应用。
[0066]
在本发明的第一种用途中，检测或分离生物试样(如细胞)用于计数目的，即建立来自具有被缀合物的抗原识别部分识别的特定组抗原的样品的细胞的数目。
[0067]
在第二种用途中，分离一个或多个生物试样群体用于纯化靶细胞。这些分离的纯化的细胞可以用于多种下游应用，如分子诊断、细胞培养或免疫疗法。
实施例
[0068]
对比实施例用与荧光染料偶联的4种不同的单克隆抗体对小鼠脾脏切片进行染色。每张切片的染色使用一种抗体，并拍摄图像。随后通过计算机计算，将图像在彼此的顶部上相加以模拟切片的染色而不擦除染色。在下一步骤中，通过从第二虚拟双染色图像中减去第一单染色图像再次揭示单独的染色图像的图像处理揭示了单独的染色图像，等等。
[0069]
所用抗体是可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea 1162抗体(1)获得的nk1.1、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea 1016抗体(2)获得的klrg1、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为单克隆抗体(其克隆名为rb6-8c5)获得的gr-1抗体、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea 616 (4)获得的cd38抗体。
[0070]
图2a和b显示用4种不同的缀合物重复染色试样而没有采集漂白，其中a)缀合物1；b)缀合物1 2；c)缀合物1 2 3；和d)缀合物1 2 3 4。
[0071]
作为本发明的方法的结果，图2b显示图2a的图像的减法，其中a) a)染色；b)图像b-a的染色；c) c-(b a)的染色；和d) d-(c b a)的染色。
[0072]
根据本发明的实施例在该实施例中，使用与图2中相同的组织切片，但是这次如图1中证明的将采集漂白包括在图像的模拟中。使用以下11种抗体进行染色：可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea 183抗体获得的ki67 (a1,a2，周期1)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea 1016抗体获得的klrg1 (b1,b2，周期2)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea 1162抗体获得的nk1.1(c1,c2，周期3)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea601抗体获得的cd8a (d1,d2，周期4)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea593获得的cd11b (a3,a4，周期5)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea126获
得的f4/80 (b3,b4，周期6)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea107获得的cd184 (c3,c4，周期7)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为单克隆抗体(其克隆名为rb6-8c5)获得的gr-1 (d3,d4，周期8)、得自biolegend的cd15抗小鼠克隆mc-480抗体(a5,a6，周期9)、可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为real436获得的ly-49a (b5,b6，周期10)和可从miltenyi biotec b.v. & co. kg作为rea979获得的igm (c5,c6，周期11)。
[0073]
在每次染色之后，拍摄图像，并随后进行下一次染色，并再次拍摄图像。在每一轮之后，由于采集漂白，前一轮的染色减少20%(a和c行)。通过图像减法，可以揭示单独的染色(c和d行)。由于采集漂白作用，随后可以进行的染色的数量与图1中所示的实施例相比大大增强。所用的抗体染色存在于组织中的不同的细胞类型。借此，有可能以在直接后一轮中染色不是相同细胞类型的方式来选择抗体。
[0074]
图3显示11个染色周期，包括作为拍摄图像的结果的20%采集漂白的假设。
[0075]
图像被组织为网格。1、3和5行是合成图像，并且2、4和6行显示如图1示意性描述计算的差分图像。用荧光染料缀合物对试样进行染色。在图像中可以看到，例如在周期4，1d中，在图像的右上部分上可以看到强染色。这种强染色在随后的周期5 (区域3a)、6 (区域3b)、7 (区域3c)和8 (区域3d)上减弱，在区域中所示的周期8中不再可见。