制备用于CRISPR的个性化的靶标不相关的向导RNA池的方法与流程

制备用于crispr的个性化的靶标不相关的向导rna池的方法
技术领域
1.本发明涉及使用用于sgrna引导的核酸结合蛋白的合成单链向导rna(sgrna)获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法，并且涉及获得用于sgrna引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的方法。还提供了包含通过本发明的方法可获得的sgrna的池的试剂盒，通过本发明的方法可获得的sgrna的池的应用以及监测疾病状况的方法。


背景技术：

2.下一代测序(ngs)是包括尤其在癌症医学领域中的现代诊断在内的遗传学和分子研究的主要驱动力。该技术为研究dna或rna样品提供了强有力的方法。已开发出新的和改进的方法和规程以支持各种应用，包括遗传变异和样品特异性差异的分析。为了改进这种方法，已开发出了旨在通过聚焦于特定序列、转录本、基因或基因组子区域或通过消除不需要的序列来靶向富集测序文库的方法。
3.靶向富集在一些情况下可以是有用的，例如，需要分析整个基因组的特定部分的情况。完整外显子组(所有转录序列)的有效测序是此方法的典型实例。其他实例包括特定转录本的富集，突变热点的富集或干扰核酸物质的排除。具体地，在个性化序列确定或基于患者的分子监测的背景中，这些靶向富集策略是重要的，其中(i)将分析和监测患者的转录组文库和(ii)文库中仅序列亚组具有诊断相关性。
4.当前用于靶向富集的技术包括(i)杂交捕获，其中来源于输入样品的核酸链在溶液中或在固体载体上和与所关心的靶标区互补的预先制备的dna片段特异性杂交，从而可以物理捕获并分离所关心的序列；(ii)选择性环化或分子反转探针(mip)，其中通过间隙填充和连接化学以高度特异性方式形成了包括靶标区序列的单链dna环，从而产生了具有常见dna元件的结构，然后将其用于选择性扩增所关心的靶标区；和(iii)聚合酶链反应(pcr)扩增，其中通过并行进行多重长距离pcr、有限数量的标准多重pcr或扩增非常大数量短片段的高度多重pcr方法，将pcr导向所关心的靶标区(mertes等人,2011,briefings in functional genomics,10,6,374-386)。
5.最近，将crispr/cas技术用于靶向富集目的，具体地为了从测序文库中去除不需要的序列。
6.crispr/cas技术是基于crispr/cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列/cas)细菌免疫系统的重新调整用途的(repurposing)新的并且非常通用的基因组编辑和表观基因组编辑工具(cong等人,2013,science,339,819-824)。当与被称为单链向导rna(sgrna)的短rna寡核苷酸复合时，cas核酸酶可以在特异性sgrna互补位置引起双链断裂(dsb)。
7.crispr/cas系统还被重新用作可编程的限制性内切酶以非常精确和定制的方式指导切割(lee等人,2015,nucleic acids res.,43,1
–
9)。
8.因此，已开发出使用crispr/cas的方法，该方法在称为通过杂交耗尽丰富序列(dash)的过程中选择性耗尽过剩序列。dash用于通过指导靶标的靶向切割并阻止靶标的进
一步扩增和测序去除靶标，如从mrna-seq中去除核糖体rna(rrna)和从癌症样品中去除野生型kras背景序列(gu等人,2016.genome biol.,17,41)。根据gu等人，在转座子介导的片段化之后但在随后的扩增步骤(这取决于片段两端是否存在衔接子序列)之前使用dash能够防止靶标序列(线粒体rrna)的扩增，从而确保它们不出现在最终测序文库中。
9.然而，这种富集方法适合于仅从测序文库中去除特定物质，而所有其他序列仍保留在文库中。因此，需要一种通用的个性化转录组-基富集和分析方法，其使得能够有效降低测序文库的复杂性，并由此涉及降低的测序深度和易管理的要处理的数据量并由此使得能够(例如)在监测方法中反复实施。


技术实现要素：

10.本发明解决了这种需要并且提供了获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法，所述方法包括：(i)从获自受试者的样品纯化mrna分子的群体；(ii)从步骤(i)的mrna分子制备cdna；(iii)从步骤(ii)中获得的cdna扩增一条或多条靶标序列以获得dna分子的池；(iv)使所扩增的dna分子片段化，优选地片段化至20至30bp的尺寸；(v)将步骤(iv)的片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签以获得标签化捕手寡核苷酸的池；(vi)提供用于制备用于sgrna引导的核酸结合蛋白的合成单链向导rna(sgrna)的池的起始寡核苷酸的池，其中所述起始寡核苷酸包括启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和结合节段，其与用于与所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补；(vii)使所述起始寡核苷酸的池与所述标签化的捕手寡核苷酸杂交；(viii)通过将所述标签结合至同源相互作用子(优选地位于磁珠或适合的表面上)，从所述起始寡核苷酸的池除去起始寡核苷酸和标签化的捕手寡核苷酸的复合物，借此获得减少的起始寡核苷酸的池；(ix)用步骤(viii)中所获得的所述减少的起始寡核苷酸的池制备sgrna的池；(x)使用步骤(ix)中获得的sgrna的池，通过用于sgrna引导的核酸结合蛋白切割获自测试样品的多核苷酸的混合物；和(xi)从步骤(x)中获得的所述多核苷酸的混合物尺寸选择一条或多条未切的靶标多核苷酸。通过提供能够结合至所述序列的sgrna池，所述方法有利地允许除去相对于个性化的靶标多核苷酸靶标不相关的全部序列，即患者转录组的基因或基因组(panel of genes)。由此，极大降低了所产生的个性化测序文库的复杂性，并且对该文库执行测序操作，具体地下一代测序(ngs)包括低得多的测序深度，这显著降低了测序成本以及后续数据管理和数据处理的成本。
11.在另一个方面，本发明涉及获得用于sgrna引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的方法，所述方法包括：(i)从获自受试者的样品纯化mrna分子的群体；(ii)从步骤(i)的mrna分子制备cdna；(iii)从步骤(ii)中获得的cdna扩增一条或多条靶标序列以获得dna分子的池；(iv)使所扩增的dna分子片段化，优选地片段化至20至30bp的尺寸；(v)将步骤(iv)的片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签以获得标签化捕手寡核苷酸的池；(vi)提供用于制备用于sgrna引导的核酸结合蛋白的合成单链向导rna(sgrna)的池的起始寡核苷酸的池，其中所述起始寡核苷酸包括启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和结合节段，其与用于与所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补；(vii)使所述起始寡核苷酸的池与所述标签化的捕手寡核苷酸杂交；(viii)通过将所述标签结合至同源相互作用子
(优选地位于磁珠或适合的表面上)，从所述起始寡核苷酸的池除去起始寡核苷酸和标签化的捕手寡核苷酸的复合物，借此获得减少的起始寡核苷酸的池；和(ix)用步骤(viii)中所获得的所述减少的起始寡核苷酸的池制备sgrna的池。
12.在本发明优选的实施方式中，作为聚合酶链反应(pcr)实施扩增(iii)。
13.在特别优选的实施方式中，能够结合至同源相互作用子的标签是生物素并且其中所述同源相互作用子是抗生蛋白链菌素。
14.在其他实施方式中，将所述片段连接至生物素标签的步骤包括用激活的生物素加尾、与生物素的连接反应或者通过点击化学连接至生物素。
15.在另一个实施方式中，所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白是dna结合cas蛋白，优选地cas9蛋白或其衍生物。
16.在本发明的其他实施方式中，所述随机节段包括约10至30个随机核苷酸，优选地，所述随机节段包括约20个随机核苷酸。
17.在本发明的另一个实施方式中，重复如以上所提及的步骤(vii)至(viii)1、2、3、4、5次或更多次。
18.在本发明的另一个实施方式中，所述一个或多个靶标多核苷酸或靶标序列代表基因、基因的一个或多个外显子和/或其开放阅读框或子部分；或者不同基因的组、不同基因的一个或多个外显子的组和/或其开放阅读框或子部分的组，或任何之前所提及的要素的任何组合。
19.在本发明的另一个优选实施方式中，如以上所描述的获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的所述方法还包括作为步骤(xii)的对所述尺寸选择的未切割的靶标多核苷酸测序的步骤。
20.在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含通过获得如以上所描述的用于sgrna引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的方法可获得的sgrna的池，和用于sgrna引导的核酸结合蛋白。优选地，所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白是cas9蛋白或其衍生物。
21.在另一个方面，本发明涉及在基于cas9的核酸内切酶测定中通过获得如以上所描述的用于sgrna引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的方法可获得的sgrna的池用于从多核苷酸的混合物除去靶标不相关的多核苷酸的应用。
22.在另一个方面，本发明涉及监测疾病状况的方法，其包括以预定时间间隔实施如以上所描述的获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法。优选地，根据所述疾病的治疗要求实施所述方法。
23.应理解不仅可以在所指明的各个组合中使用上述特征和以下将解释的那些特征，而且还可以在不背离本发明的范围的情况下，在其他组合中或单独使用。
附图说明
24.图1显示了用于获得根据本发明的实施方式的个性化的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的步骤的示意图。
25.图2显示了用于制备根据本发明的实施方式所使用的靶向不相关的sgrna的步骤。
具体实施方式
26.尽管将相对于具体实施方式描述本发明，但是这种描述不应视为限制含义。
27.在详细描述本发明的示例性实施方式之前，提供了对于本发明的理解重要的定义。
28.除非上下文明确规定，否则如在本说明书和在所附权利要求中所使用的，单数形式的“一个”还包括各自的复数形式。
29.在本发明的背景中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解仍能确保所讨论的特征的技术效果的准确度间隔。该术语通常表示与所指明的数值
±
20％，优选地
±
15％，更优选地
±
10％，并且甚至更优选地
±
5％的偏离。
30.应理解术语“包含”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由...组成”或者“基本上由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方式。如果在下文中将组定义为包含至少某些实施方式，则这表示还涵盖了优选地仅由这些实施方式组成的组。
31.此外，描述或权利要求中的术语“(i)”、“(ii)”、“(iii)”，或者“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”，或者“第一”、“第二”、“第三”等用于区分类似的要素并且不必需用于描述顺序或时间次序。
32.应理解在适当情况下，所使用的术语是可互换的，并且本文所述的本发明的实施方式能够以不同于本文中所述或所示的其他顺序操作。除非另外说明，否则在术语涉及方法、程序或使用步骤的情况下，步骤之间没有时间或时间间隔连贯性，即可以同时进行所述步骤或者在这些步骤之间可以存在数秒、数分钟、数小时、数天、数周等的时间间隔。
33.应理解本发明不局限于本文所述的具体方法、规程等，因为这些是可以变化的。还应理解本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并且不意欲限制将仅由所附权利要求限制的本发明的范围。
34.附图将被认为是示意图，并且附图所示的要素不必需按比例显示。然而，显示了多种要素，从而它们的功能和一般目的将对于本领域技术人员变得显而易见。
35.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。
36.如上所述，本发明在一个方面涉及获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法，所述方法包括：(i)从获自受试者的样品纯化mrna分子的群体；(ii)从步骤(i)的mrna分子制备cdna；(iii)从步骤(ii)中获得的cdna扩增一条或多条靶标序列以获得dna分子的池；(iv)使所扩增的dna分子片段化，优选地片段化至20至30bp的尺寸；(v)将步骤(iv)的片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签以获得标签化捕手寡核苷酸的池；(vi)提供用于制备用于sgrna引导的核酸结合蛋白的合成单链向导rna(sgrna)的池的起始寡核苷酸的池，其中所述起始寡核苷酸包括启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和结合节段，其与用于与所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补；(vii)使所述起始寡核苷酸的池与所述标签化的捕手寡核苷酸杂交；(viii)通过将所述标签结合至同源相互作用子(优选地位于磁珠或适合的表面上)，从所述起始寡核苷酸的池除去起始寡核苷酸和标签化的捕手寡核苷酸的复合物，借此获得减少的起始寡核苷酸的池；(ix)用步骤(viii)中所获得的所述减少的起始寡核苷酸的池制备sgrna的池；(x)使用步骤(ix)中获得的sgrna的池，通过用于sgrna引导的核酸结合蛋白切割获自测试
样品的多核苷酸的混合物；和(xi)从步骤(x)中获得的所述多核苷酸的混合物尺寸选择一条或多条未切的靶标多核苷酸。
37.如本文所使用的术语“靶标多核苷酸”涉及任何目标核酸分子，其适用于分子分析。优选地，所述靶标多核苷酸是dna或cdna分子。在典型的实施方式中，所述靶标多核苷酸来源于受试者的测试样品，或者在具体的实施方式中，来源于一组受试者。如本文所使用的术语“靶标序列”涉及来源于受试者，或者在具体的实施方式中，一组受试者的转录组的核酸。因此，可以作为mrna，或者优选地，作为cdna分子提供靶标序列。在本发明的具体的实施方式中，所述靶标多核苷酸或所述靶标序列代表基因、基因的一个或多个外显子和/或其开放阅读框或子部分。在其他实施方式中，所述靶标多核苷酸或所述靶标序列还可以是不同基因的组、不同基因的一个或多个外显子的组和/或其开放阅读框或子部分的组。还优选之前所提及的要素的组合。通常通过来源于受试者转录组的靶标序列的含量和序列来反映所述靶标多核苷酸的形式和含量，反过来，通过如本发明的方法中使用的捕手寡核苷酸的序列和形式来反映所述靶标序列。
38.在本发明的方法的第一步中，从获自受试者的样品纯化mrna分子的群体。
39.如本文所使用的术语“样品”或“测试样品”涉及通过本领域技术人员已知的适合方法从受试者获得的任何生物材料。应优选地以临床可接受的方式，更优选地以保存核酸，具体地rna，更优选地mrna分子的方式采集在本发明的背景中所使用的样品。所述生物样品可以包括身体组织和/或液体，如血液，或血液组分，如血清或血浆、汗液、痰液或唾液、精液和尿液以及排泄物或粪便样品。此外，所述生物样品可以含有来源于细胞群体的细胞提取物，所述细胞群体包括上皮细胞，优选地肿瘤上皮细胞或者来源于怀疑为肿瘤的组织的上皮细胞。癌性组织或包含癌细胞的样品是特别优选的。其他疾病-相关组织样品或其他生物样品也是优选的。液体活组织检查样品是特别优选的。作为另外一种选择，所述生物样品可以来源于动物来源。在某些实施方式中，细胞可以用作多核苷酸的原始来源。在某些实施方式中，可以将样品，具体地，初始处理之后的样品混合。本发明优选地设想了非混合的样品的使用。在本发明的具体实施方式中，还可以对生物样品的含量进行具体的预富集步骤。例如，样品可以与对于某些细胞类型的细胞膜或细胞器特异的配体所官能化的(例如)磁性颗粒接触。随后，通过磁性颗粒浓缩的材料可以用于制备多核苷酸。在本发明的其他实施方式中，可以获得和/或使用活组织检查或切除样品。这些样品可以包含细胞或细胞裂解液。此外，可以通过流体或液体样品，例如，血液、尿液、汗液等的过滤法来富集细胞，例如，肿瘤细胞。这些过滤处理还可以与基于如上文所述的配体特异性相互作用的预富集步骤结合。
40.如本文所使用的术语“纯化”涉及核酸的制备和净化，优选地，以防止核酸，如dna或rna降解的方式制备和净化。如本文所使用的术语“纯化”涉及核酸的制备和净化，优选地，以防止核酸，如dna或rna降解的方式制备和净化。在其他步骤中，如有必要，可以从身体组织和体液中净化细胞，然后进一步处理以获得多核苷酸。可以根据技术人员已知的任何适合的方法进行纯化。这些方法可以包括核酸提取和清洗规程的使用、基于柱的纯化规程的使用，或优选地，基于磁珠的规程的使用。所述规程可以从预处理样品或粗样品开始。在优选的实施方式中，纯化适合于rna，具体地mrna的制备。作为另外一种选择，纯化可以适合于dna的制备。
41.因此，如本文所使用的“获自测试样品的多核苷酸”通常是已从测试样品制备的多
dna聚合酶的环介导等温扩增、使用phi29 dna聚合酶的等温扩增、重组酶-聚合酶扩增和蜗牛酶依赖性等温扩增。
49.通常对如本文所定义的一个或多个靶标序列，例如，特异性基因或基因的组等，优选地，如本文所定义的基因或其部分或基因的组，或者包含一条或多条这些靶标序列的那些进行根据本发明的扩增。因此，可以通过序列特异的寡核苷酸，例如，与所述靶标序列的区域或节段互补的序列特异的寡核苷酸进行靶标序列的扩增。扩增获得了双链dna分子的池。可以通过pcr方法的参数，例如，pcr循环数、寡核苷酸退火的杂交温度、缓冲液组成、寡核苷酸的长度、pcr期间的温度谱和变化等，来调整所获得分子的数目和池的复杂性。
50.在本发明的其他具体实施方式中，可以对所扩增的靶标cdna分子进行分离，例如，根据长度、序列、与基因的联系、基因的组、基因家族等。可以以如本文所描述的池的方式或者以分离的方式使用所扩增的cdna分子。
51.在根据本发明的获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法的后续步骤中，使所扩增的dna分子片段化。可以根据技术人员已知的任何适合的方法进行片段化。例如，可以通过限制性消化或者任何适合的剪切规程，例如，自适应聚焦声学剪切(afa)或covaris剪切、雾化力的使用、超声处理、点汇剪切或使用法式压剪程序来实现片段化。优选地使用声学剪切，具体地covaris剪切。还优选地，所得多核苷酸的尺寸与预定范围类似或在预定范围内。所得片段的范围可以在约20至100bp之间，更优选地在约20至50bp之间。在特别优选的实施方式中，片段化的dna分子的所得尺寸在约20至30bp之间。
52.可以作为钝端或粘性末端片段获得片段化的dna分子。应提供具有粘性末端的片段，它们需要经历钝化反应以准备后续与标签连接的步骤。钝化活动可以(例如)是末端修复步骤。可以通过使用任何适合的末端修复酶活性，例如，dna聚合酶i，优选地其klenow片段、t4 dna聚合酶或t4多核苷酸激酶进行末端修复步骤。优选地，使用t4 dna聚合酶、t4 pnk和klenow在20℃进行末端修复。
53.在后续步骤中，如以上所提及的，将步骤(iv)的片段，优选地如有必要通过末端修复进一步修饰的片段连接至能够结合至同源相互作用子的标签。该步骤获得了标签化的捕手寡核苷酸的池。如本文所使用的术语“标签”涉及能够结合至同源相互作用子并借此从分子的液体溶液或混合物中挑出的分子。适合的标签和相互作用子的实例为生物素标签，例如，通过以上所描述的步骤所获得的dna片段，从而获得“捕手寡核苷酸”，和在(例如)反应容器或磁珠等上的适合表面上所提供的抗生蛋白链菌素相互作用子。还设想了如技术人员已知的生物素和抗生蛋白链菌素的衍生物。其他实例包括：与通过以上所描述的步骤所获得的dna片段结合的磁珠，和吸引所述磁珠的磁力分离器，例如，在表面附接的磁珠。还设想了其中通过以上所描述的步骤所获得的dna片段固定在表面或固相上的实施方式。这种固定化可以(例如)处于柱的形式。所述固相可以具有任何适合的形式或结构，例如，由琼脂糖组成。这使得能够使潜在杂交分子通过或移动通过所述表面或固相或者在所述表面或固相上通过或移动，并借此将它们结合至捕手寡核苷酸并因此从池除去它们。在某些实施方式中，可以将这种活动重复一次或几次。因此，相互作用子-标签结合可以有利地用于将所述捕手寡核苷酸与任何所结合或联接的包含互补靶标序列的结合伴侣一起从液体溶液的混合物中挑出。
54.通常，所述捕手寡核苷酸因此对应于多核苷酸的一部分，其应富集或应包含在靶
标多核苷酸的富集的个性化群体中。例如，所述捕手寡核苷酸与如本文所定义的靶标多核苷酸或包含靶标序列的多核苷酸互补，例如，覆盖基因、基因的一个或多个外显子和/或其开放阅读框或子部分，或者在其他实施方式中，覆盖不同基因的组、不同基因的一个或多个外显子的组和/或其开放阅读框或子部分的组，以及之前所提及的要素的组合。优选地，通过捕手寡核苷酸的组覆盖基因等的组。通过使用受试者样品来源的rna分子实现了所述基因或基因的组等的特异性、受试者-依赖性以及因此的个性化。
55.如本文所使用的术语“连接的”表示将dna片段与如以上所描述的标签联接的任何适合的步骤。在双链扩增的cdna片段的两条链进行标签的连接。优选地，可以在每条链的3'末端进行连接。这种连接程序可以(例如)包括用激活的标签，例如，生物素加尾。优选地，实施钝化cdna片段的a加尾，其中在优选的实施方式中，a加尾步骤包括生物素基-datp的使用。可以通过任何适合的a加尾酶活动，如taq聚合酶或klenow片段实施a加尾活动。优选地，使用taq dna聚合酶在65℃进行a加尾。更多详细信息可以来源于适合的文献来源，如nucleic acids research,2010,38,13,e137。
56.作为另外一种选择，连接反应可以基于与标签，例如，生物素的连接反应，或者通过点击化学与标签，例如，生物素的连接。
57.所述连接可以是化学或酶促连接。优选酶促连接。化学连接通常需要缩合剂的存在。本发明所设想的化学连接的实例利用了亲电子磷酸硫酯基团。其他实例包括使用溴化氰作为缩合剂。可以使用技术人员已知的任何适合的酶促连接酶进行酶促连接。适合的连接酶的实例包括t4 dna连接酶、大肠杆菌(e.coli)dna连接酶、t3 dna连接酶和t7 dna连接酶。作为另外一种选择，可以使用连接酶，如taq dna连接酶、tma dna连接酶、9
°
n dna连接酶、t4聚合酶1、t4聚合酶2或者热稳定性5'app dna/rna连接酶。
58.可以通过点击化学进行标签与cdna片段的连接。术语“点击化学”表示叠氮化物和炔烃之间获得共价1,5-二取代的1,2,3-三唑产物的反应并且其本质上基于cu催化。通常，可以作为cu-tbta络合物引入催化剂。优选地，通过将炔基残基引入dna分子来实施cdna片段和标签，例如，生物素之间的连接。这通常使用炔基三磷酸通过终止反应或切口平移反应来实施。作为另外一种选择，还可以在pcr期间引入炔基。该反应获得了炔烃-修饰的dna，其可以与同源叠氮化物激活的酯，优选地叠氮化物激活的标签，更优选地叠氮化物激活的生物素反应。
59.随后，作为单链分子提供所述标签化的捕手寡核苷酸。因此，在两条链包含标签的所述双链分子解链以获得单链。在具体的实施方式中，通过添加适合的缓冲剂或者使用适合的反应参数来维持或改善所述捕手寡核苷酸的单链性质。
60.在根据本发明获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法的其他步骤中，提供了用于制备用于sgrna引导的核酸结合蛋白的合成单链向导rna(sgrna)的起始寡核苷酸的池。
61.通常，所述方法的相应部分基于crispr/cas系统的使用。如本文所使用的术语“crispr/cas系统”涉及特异性切割和修饰核酸的生物化学方法，也称为基因组编辑。例如，一般可以通过crispr/cas系统插入、除去或关闭基因组中的基因，还可以改变基因或核酸分子中的核苷酸。crispr/cas系统的概念和活动步骤的效果与rna干扰具有多种相似性，因为约18至20个核苷酸的短rna片段介导了细菌防御机制中对靶标的结合。在crsipr/cas系
统中，通常rna引导的核酸结合蛋白，如cas蛋白作为核糖核蛋白结合某些rna序列。例如，cas核酸内切酶(例如，cas9、cas5、csn1或csx12或其衍生物)可以结合至称为crrna重复的某些rna序列并切割紧邻这些序列的dna。不希望受理论束缚，据信crrna重复序列形成了rna二级结构，并随后通过改变其蛋白折叠的核酸结合蛋白(例如，cas)结合，从而使得靶标dna能够与rna结合。此外，pam基序，即前间区序列邻近基序在靶标dna中的存在对于激活核酸结合蛋白(例如，cas)是必须的。dna通常切割pam基序之前的3个核苷酸。crrna重复序列之后通常是结合至靶标dna的序列，即crrna间隔区；通常将两条序列，即crrna重复基序和靶标结合节段标记为“crrna”。crrna的这种第二部分(靶标结合节段)是具有可变衔接子功能的crrna-间隔序列。它与靶标dna互补并且结合至所述靶标dna。还需要其他rna，tracrrna或反式作用crispr rna。tracrrna与crrna部分互补，从而它们彼此结合。tracrrna通常结合至前体crrna，形成rna双螺旋并且通过rna酶iii转化为活性形式。这些性质使得能够结合至dna并通过结合位点附近的核酸结合蛋白(例如，cas)的核酸内切酶功能切割。
62.如本文所使用的术语“起始寡核苷酸”是指短核酸分子或核酸寡聚物。其长度可以根据具体应用、靶向方法、所涉及的生物的遗传背景等而改变。通常，起始寡核苷酸的长度在约40至250个核苷酸之间，例如，40、45、50、55、60、65、100、150、200或250个核苷酸或所提及的值之间的任何值。优优地，所述寡核苷酸的长度为55个核苷酸。优选地，所述起始寡核苷酸是单链dna分子。在具体替代实施方式中，作为起始寡核苷酸还设想了rna、pna、cna、hna、lna或ana分子或其混合物。如本文所使用的术语“pna”是指肽核酸，即类似于dna或rna的人工合成聚合物。pna主链通常由通过肽键连接的重复n-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成。多种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至主链。如本文所使用的术语“cna”是指环戊烷核酸，即包含(例如)2'-脱氧卡巴鸟嘌呤核苷的核酸分子。术语“hna”是指己糖醇核酸，即由标准核碱基和磷酸化的1,5-脱水己糖醇骨架构建的dna类似物。如本文所使用的术语“lna”是指锁核酸。通常，锁核酸是经修饰的，因此是不可接近的rna核苷酸。lna核苷酸的核糖部分可以用连接2'和4'碳的另外的桥进行修饰。这样的桥将核糖锁定在3'-内切结构构象中。锁定的核糖构象增强了碱基堆叠和骨架预组织。假定这增加了热稳定性，即寡核苷酸的解链温度。如本文所使用的术语“ana”是指阿糖酸核酸或其衍生物。在本发明的背景中，优选的ana衍生物是2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿糖核苷(2'f-ana)。
63.所述寡核苷酸通常提供于液体，例如，水溶液中。所述溶液可以包含适合的缓冲液或由其组成，所述缓冲液如杂交缓冲液，例如，其包含ssc、nacl、磷酸钠、sds、te和/或mgcl2。
64.如本文所使用的“用于制备合成单链向导rna(sgrna)的起始寡核苷酸的池”是指提供制备合成单链向导rna(sgrna)的池所必需的特征的寡核苷酸的组。在本上下文中，如本文所使用的术语“合成单链向导rna(sgrna)”或“单链向导rna(sgrna)”是指如以上所描述的crispr/cas系统的crrna和tracrrna序列的人工或合成组合。通常，所述sgrna包含可以用于将dna结合蛋白向结合位点引导的序列节段。如jinek等人,2012,science,337,816-821中所述，crrna和tracrrna可以组合成功能性物质(sgrna)，这满足了如以上所提及的两种活性(crrna和tracrrna)。例如，crrna-sp2的核苷酸1-42、crrna-sp2的核苷酸1-36或crrna-sp2的核苷酸1-32可以与tracrrna的核苷酸4-89组合。用于获得sgrna的其他选择可
以来源于nowak等人,2016,nucleic acids research,44,20,9555
–
9564。例如，可以提供包含不同形式的上部茎结构的sgrna，或者其中间隔序列从标准的20个核苷酸差异截短至14或15个核苷酸的sgrna。进一步设想的变体包括从下部茎中去除推定的rnap iii终止子序列的那些变体。还设想了其中上部茎被延伸以增加sgrna稳定性并且增加其与用于sgrna引导的核酸结合蛋白，例如，cas蛋白的组装的变体。根据本发明的其他实施方式，根据用于sgrna引导的核酸结合蛋白，例如，cas蛋白的形式或特性，sgrna的序列和形式可以是不同的。因此，基于所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白的来源，可以使用序列元件的不同组合。本发明还设想了在这种背景下的任何未来发展，并且包括超出可来源于jinke等人,2012或nowak等人,2016的信息的sgrna-核酸结合蛋白相互作用的任何修改或改善。在具体的实施方式中，要使用的sgrna可以具有seq id no：1至3中的任一项所示的序列。特别优选地使用酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)sgrna，例如，如在可商够试剂盒中所使用的，如new england biolabs inc.提供的engen sgrna合成试剂盒。还设想了来自其他可商够供应商的类似sgrna形式，或单独制备的sgrna。如果与来自酿脓链球菌(s.pyogenes)的同源核酸结合蛋白一起使用，则此类sgrna可以来源于seq id no：1所示的序列。作为另外一种选择，如果与来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的同源核酸结合蛋白一起使用，则此类sgrna可以来源于seq id no：2所示的序列。在其他替代选择中，如果与来自嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)的同源的核酸结合蛋白一起使用，则所述sgrna可以来源于seq id no：3所示的序列。
65.通常，制备合成单链向导rna(sgrna)所需的特征包括如本文以上所述的产生适合用于crispr/cas系统的sgrna分子所必需的所有要素。因此，这些特征包括启动子节段的存在；作为或包含如本文所描述的捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段的存在，其用作具有匹配序列的潜在结合或杂交相互作用子的互补序列；和与支架序列的至少一部分互补的结合元件的存在，其用于与用于sgrna引导的核酸结合蛋白相互作用。可以以任何适合的顺序提供所提及的特征。优选地，所述顺序为从5'至3'：(i)启动子节段，(ii)随机节段和(iii)用于支架序列的结合元件。所述寡核苷酸组的成员根据随机节段的序列而不同。
66.如本文所使用的，“启动子节段”是指能够启动rna转录的任何合适的启动子结构。优选地，启动子是在体外条件下起作用的启动子。在其他实施方式中，所述启动子可以是组成型启动子或可调控启动子。合适的启动子的实例是t7 rna聚合酶启动子。在替代实施方式中，启动子可以是u6 rna聚合酶iii启动子、iii型rna聚合酶iii启动子h1或巨细胞病毒启动子(cmv)，优选地，最小cmv启动子。所述启动子节段可以伴随有或另外包含其他元件，如间隔元件、引导元件等。例如，在启动子的间隔序列的上游，所述节段可以优选地包含1或2个鸟嘌呤残基。启动子节段的其他详细信息可以来源于适合的文献来源，如milligan等人,1987,nucleic acids research,15,21,8783-8798或nowak等人,2016,nucleic acids research,44,20,9555
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9564。
67.如本文所使用的“随机节段”是指包含随机碱基序列的核酸延伸，其通常在所覆盖的延伸中覆盖了所有序列可能性，包括单核苷酸延伸，如多聚t、多聚a、多聚g、多聚c。在某些实施方式中，大多数或一定量的可能的核苷酸组合或序列可以由随机节段来表示，例如，99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或以下或者上述值之间的任何值。在优选的实施方式中，所述随机节段包含约10至30个随机核苷酸，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。特别优选地，所述随机节段包含约20个核苷酸。
68.起始寡核苷酸的“池”可以具有任何适合的大小。通常，池的大小取决于随机节段的长度，因此更长的序列意味着更大的寡核苷酸池，且更长的节段比更短的节段需要更多不同的寡核苷酸来覆盖所有可能的序列变化。因此，寡核苷酸的池可以包含具有随机碱基序列的节段，即没有预先确定的序列，因此在所述节段中包含了所有可能的核苷酸组合或序列。
69.在具体的实施方式中，某些随机节段可以出现过度，而其他可能出现不足。可以有意控制这种表达过度或出现不足，例如，根据需要、样品中已知或预期的序列组成或在样品制备期间使用的分离或消除技术的添加，例如，长度排阻等。例如，可以有利地为测试样品中更频繁存在的核酸物质(如rdna序列、重复序列等)提供更高的序列出现。
70.在其他实施方式中，寡核苷酸的池可以包含单一特定核苷酸组合或序列的一次或几次出现。例如，如上定义的随机节段中每种可能的核苷酸组合或序列可以在寡核苷酸的池中出现1次、2次、3次、4次、5次、10次、50次、100次、1000次或更频繁。
71.术语“用于与用于sgrna引导的核酸结合蛋白相互作用的与支架序列的至少一部分互补的结合元件”是指核酸节段，其包含与含有如在sgrna中所组合的crrna和tracrrna功能，优选地如上文所描述的，包含crrna重复基序和rna双螺旋形成元件的寡核苷酸互补的序列。如本文所使用的术语“支架序列”是指通常对于与如上定义的用于sgrna引导的核酸结合蛋白，例如，cas蛋白的结合和相互作用所需要的所述结构基序。通过在单独的寡核苷酸中提供所述支架功能，在起始寡核苷酸的池(优选地，根据本发明的减少的起始寡核苷酸的池)与所述支架序列之间的杂交步骤以及随后的dna延伸，导致在一个实体中产生了包含启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和所述sgrna支架功能的双链模板分子。图2示意性地显示了获得在一个实体中包含启动子节段、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段和所述sgrna支架功能的所述双链模板分子的方法，以及基于所述模板分子产生sgrna分子的后续步骤。
72.如本文所使用的术语“互补的”是指在相对核酸链中存在相匹配的基底对。例如，对于有义链中的核苷酸或碱基a，互补或反义链通过核苷酸或碱基t结合，或者反之亦然；同样地，对于有义链中的核苷酸或碱基g，互补或反义链通过核苷酸或碱基c结合，或者反之亦然。在本发明的某些实施方式中，可以通过有义链和/或反义链内单个或多个非互补碱基或核苷酸延伸的存在的可能性来改变这种全部或完全互补性方案。因此，在一对有义链和反义链的概念内，两条链可以完全互补或者可以仅部分互补，例如，在两条链的所有核苷酸之间或者在如本文所定义的特定节段中的所有核苷酸之间显示出约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的互补性。非互补碱基可以包括核苷酸a、t、g、c之一，即显示出a和g之间或者t和c之间的错配，或者可以包括任何修饰的核苷碱基，其包括(例如)如wipo标准st.25中所述的修饰的碱基。此外，本发明还设想了不同核酸分子之间的互补性，例如，dna链与rna链之间、dna链与pna链之间、dna链与cna链之间等。优选地，如本文所定义的链或节段之间的互补性为完全的或100％互补性。
73.如本文所使用的术语“与支架序列的至少一部分互补的”是指结合节段与包含所述支架序列的所述寡核苷酸具有互补重叠。所述重叠可以是(例如)5、7、10、12、15、18、20、
22、25、28或30个核苷酸的重叠，或者上述值之间的任何值的重叠。还设想了更长的重叠。优选在5至20个核苷酸的范围内的短重叠。所述重叠的长度可以根据杂交效率进一步调整。所述重叠通常在起始寡核苷酸的3'末端和包含支架序列的寡核苷酸的5'末端。在所述重叠内，互补碱基之间的匹配或互补性优选地为100％。在替代实施方式中，所述匹配小于100％，例如，99％、95％、90％、85％或小于85％。
74.如随机节段的背景中所使用的术语“潜在互补序列”是指随机节段的序列，以基于尺寸、核苷酸组合等的特定可能性，其可以与如本文以上所定义的一个或多个捕手寡核苷酸互补，其来源于受试者的cdna/mrna分子。因此，所述随机节段可以包含与所述捕手寡核苷酸互补的序列和与所述捕手寡核苷酸不互补的序列。本发明的主旨在于识别或获得用于制备合成单链向导rna(sgrna)的那些起始寡核苷酸，所述起始寡核苷酸的确与个性化捕手寡核苷酸互补，从而使得能够从起始寡核苷酸的池中可调节地除去这些序列。
75.在捕手寡核苷酸和起始寡核苷酸之间的至少部分互补性的情况下，优选地在所述捕手寡核苷酸和如本文所定义的起始寡核苷酸中所提供的潜在互补序列的至少一部分之间进行杂交。这些分子之间的结合能够从起始寡核苷酸的池中有效除去包含所述互补序列的起始寡核苷酸。
76.优选地，所述捕手寡核苷酸包含约20至30个核苷酸，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或者30个核苷酸。所述捕手寡核苷酸还可以包含其他元件，如间隔元件、条型码序列等。可以在与如以上所描述的标签连接之前或之后将这些元件添加至所述捕手寡核苷酸。
77.在后续步骤中，使所述起始寡核苷酸的池和所述捕手寡核苷酸杂交。所述杂交通常在液体溶液，例如，包含如上定义的适合的缓冲液的水溶液中进行。可以根据技术人员已知的任何适合的温度、离子浓度和/或ph参数进行杂交。例如，可以在溶液中在起始寡核苷酸中的大部分，优选地所有互补碱基与捕手寡核苷酸发生互补碱基配对的温度和/或ph和/或离子浓度下进行杂交。例如，可以通过将温度设置在仅允许完全，即100％互补结合的值来避免非特异性结合或杂交反应。在替代实施方式中，可以将温度设置为允许约99％、98％、95％、90％、85％或80％的互补碱基互补结合的值。
78.在根据本发明获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法的其他步骤中，从起始寡核苷酸的池除去起始寡核苷酸和捕手寡核苷酸的复合物。优选地，通过将所述标签结合至同源相互作用子(其优选地位于磁珠或适合的表面上)来起始除去。例如，通过引入包含抗生蛋白链菌素分子的磁珠，可以使生物素标签结合至所述标签。此外，杂交的起始寡核苷酸，即包含匹配捕手寡核苷酸序列的序列的那些寡核苷酸也间接结合至所述磁珠。随后，可以从溶液除去具有所结合的核酸的磁珠。例如，所述磁珠可以是可以通过磁力除去的磁珠。还设想了不同的除去选择，如离心或过滤。作为另外一种选择，可以通过磁珠-磁力相互作用实施除去。在这种情况下，将捕手寡核苷酸连接至磁珠。在与匹配的起始寡核苷酸杂交后，施加磁力并且可以将捕手寡核苷酸和起始寡核苷酸之间的复合物从溶液移除至(例如)磁性区。
79.在进行了上述步骤之后，减少了所述起始寡核苷酸的池，即与捕手寡核苷酸的序列互补的起始寡核苷酸不再存在于所述池中或它们的存在减少。如本文所使用的术语“减少的存在”是指与捕手寡核苷酸的序列互补的起始寡核苷酸的数目减少了5倍、10倍、20倍、
30倍、40倍、50倍、100倍。
80.在具体实施方式中，先前的步骤(vii)和(viii)，即使起始寡核苷酸的池与所述标签化的捕手寡核苷酸杂交的步骤以及如上定义的去除起始寡核苷酸和标签化的捕手寡核苷酸的复合物的步骤可以重复一次或几次。例如，这些步骤可以重复1、2、3、4、5或更多次。在某些实施方式中，所述重复可以与减少的起始寡核苷酸的池的扩增步骤(例如通过pcr)相关。因此，每个起始寡核苷酸上可以存在适合的引物结合位点，并用于扩增。可以优选地使用pfu dna聚合酶或者具有高保真度的其他热稳定dna聚合酶和相应系统进行扩增。每次重复可以结合清洗步骤和/或质量控制步骤。例如，可以通过实时pcr确定减少的池中特定元件的存在。在具体的实施方式中，使用新的捕手寡核苷酸或者新的捕手寡核苷酸的组进行每次重复。在其他实施方式中，使用不同的捕手寡核苷酸或者捕手寡核苷酸的不同的组，例如，使用如本文以上所述的cdna分子的一个或多个部分进行每次重复。例如，差异可以是整个靶标序列的不同部分，例如，基因或基因组序列的相邻序列部分(如果所述基因被数个相邻或连续或部分重叠的捕手寡核苷酸所覆盖)。
81.在其他步骤中，产生了在步骤(viii)中所获得的具有所述减少的起始寡核苷酸的池的sgrna的池。通常，可以如图2所示实施该步骤。通常，将包含如在sgrna中所组合的crrna和tracrrna功能，优选地，如本文以上所述，包含crrna重复基序和rna双螺旋形成元件的单链寡核苷酸，优选地，dna分子通过如本文以上所定义的所存在的结合元件杂交至在步骤(viii)中所获得的起始寡核苷酸，所述结合元件存在于所述起始寡核苷酸中。随后，可以通过dna延伸反应填充杂交复合物的单链部分。该反应优选地用dna聚合酶，例如，t4 dna聚合酶或klenow酶进行。
82.在某些实施方式中，可以(例如)通过pcr，将所得的在一个实体中包含启动子节段、作为与结合至捕手寡核苷酸无关(即与捕手寡核苷酸序列不显示出互补性)的随机节段以及所述sgrna支架功能的双链模板分子进行扩增。随后，可以通过如本文以上所定义的启动子节段将模板转录成rna分子，从而产生可以用于crispr/cas活动的sgrna。
83.在具体的实施方式中，根据商品化规程并且基于商品化试剂盒(例如，由new england biolabs提供的商品化试剂盒，如engen sgrna合成试剂盒)获得了sgrna的池。还设想了来自其他商品化供应商的类似的sgrna形式。
84.因此，在另一个方面，本发明涉及获得用于sgrna引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的方法。该方法本质上包括如本文所定义的步骤(i)至(ix)。在替代方面，本发明设想了对于减少的起始寡核苷酸的池的提供，其本质上包括了如本文以上所定义的步骤(i)至(iv)。
85.在某些实施方式中，可以存储、修饰和/或纯化步骤(ix)中所获得的sgrna，以允许适当的进一步使用。例如，可以去除可能存在的5'三磷酸残基，例如，通过使用碱性磷酸酶去除。可以根据技术人员已知的任何适合的规程进行sgrna的纯化，例如，使用离心柱去除蛋白质、盐和核苷酸。在某些实施方式中，还设想了在进一步使用之前对sgrna进行质量检查，例如，通过在260nm下的uv光吸光度。
86.在根据本发明的获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法的其他步骤中，使用如上定义的在步骤(ix)中获得的sgrna的池，通过用于sgrna引导的核酸结合蛋白切割从如本文所定义的测试样品所获得的多核苷酸的混合物。
87.如本文所使用的术语“多核苷酸的混合物”是指来源于如以上所提及的样品的核酸。根据本发明的方法的这一步骤所使用的多核苷酸优选地为dna分子或cdna分子。所述dna分子可以是基因组dna或其衍生物。还设想了dna文库的使用。
88.在优选的实施方式中，获自测试样品，特别是获自液体活组织检查样品的多核苷酸的混合物包含称为无循环细胞dna(ccfdna)的基因组dna和/或cdna分子片段。这些dna物质的尺寸通常在70-300个碱基对之间。ccfdna通常包含释放至血浆中的降解的dna片段。ccfdna可以用于描述血流中自由循环的dna的多种形式，包括循环肿瘤dna(ctdna)和无细胞胎儿dna(cffdna)。在癌症中，特别是在晚期疾病中观察到cfdna水平升高。有证据表明随着年龄的增长，cfdna在循环中变得越来越频繁。已表明ccfdna是除癌症和胎儿医学外的大量疾病的有用生物标志物。这包括(但不限于)创伤、败血病、无菌性炎症、心肌梗塞、中风、移植、糖尿病和镰刀形红细胞病。ccfdna大部分是dna的双链胞外分子。
89.在优选的实施方式中，获自测试样品的多核苷酸的混合物包含任选地将其尺寸调节至预定值的基因组dna和/或cdna分子。例如，多核苷酸的混合物可以包含如上定义的剪切或片段化的基因组dna或cdna分子。在任选的实施方式中，可以将所获得的多核苷酸的尺寸调节至预定范围。示例性范围为约2kb至2.5kb、2.5kb至3kb或者3kb至3.5kb等、5kb至6kb、10kb至12kb等。多核苷酸的尺寸以及任何任选的调节可以基于如本文所提及的靶标序列的长度。
90.根据如以上所描述的crsipr/cas法，使用步骤(ix)中所获得的sgrna的池，实施通过用于sgrna引导的核酸结合蛋白，例如，核酸酶，如cas的切割。通常，将如上定义的多核苷酸的混合物加入至包含处于适合的浓度的如以上所提及的sgrna、适合的反应缓冲液和处于适合的浓度的用于sgrna引导的核酸结合蛋白的反应溶液中。可以在适合的温度下培育所述反应。随后，在某些实施方式中，可以通过添加蛋白酶，例如，蛋白酶k，或者优选地，通过实施热变性步骤，例如，在65℃实施来终止所述反应。
91.在具体的实施方式中，还可以根据商品化规程并且基于商品化试剂盒(如，例如，由new england biolabs提供的商品化试剂盒，如engen cas9nls、酿脓链球菌(s.pyogenes)体外消化试剂盒)来进行所述切割。还设想了来自其他商品化供应商的类似的消化规程。
92.在本发明的获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法的最后一步中，进行尺寸选择，这使得能够从步骤(x)中获得的切割的多核苷酸中分离出未切割的靶标多核苷酸。通常，由于使用随机靶标序列用于sgrna制备，因此用crsipr/cas系统切割包含匹配的随机序列的多核苷酸分子。包含靶标序列(其未被sgrna的池中的sgrna识别，因为已通过与如以上所描述的捕手寡核苷酸杂交除去了这些分子)，即根据本发明的靶标多核苷酸的多核苷酸分子将不会被切割且因此具有较大的尺寸。可以通过任何适合的方法进行尺寸选择。例如，可以使用基于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶的方法或基于磁珠的方法。在优选的替代实施方式中，磁珠可以用于除去短片段。
93.随后，可以将所获得的靶标多核苷酸纯化、存储和/或用于另外或随后的活动。
94.在本发明的具体实施方式中，使用所述多核苷酸进行的一种其他活动是对所述获得的靶标多核苷酸进行测序。如本文所使用的术语“测序”涉及技术人员已知的任何适合的测序方法。优选地，可以使用下一代序列(ngs)或第二代测序技术，其通常是以高度并行方
式进行的大规模平行测序方法。例如，可以在如roche 454、gs flx titanium、illumina、life technologies ion proton、oxford nanopore technologies、solexa、solid或helicos biosciences heliscope systems的平台上根据平行测序方法进行测序。在某些实施方式中，测序还可以包括多核苷酸的另外制备、测序以及后续成像和初始数据分析步骤。
95.例如，制备步骤可以包括将多核苷酸随机断裂成较小的尺寸，并产生测序模板，如片段模板。可以将空间分离的模板(例如)附接或固定在固体表面上，从而允许同时进行测序反应。在典型的实例中，产生了核酸片段的文库，并将含有通用引物位点的衔接子连接至片段的末端。随后，将片段变性成单链并被磁珠捕获。扩增后，大量模板可以附接或固定在聚丙烯酰胺凝胶中，或化学交联至氨基涂覆的玻璃表面上，或沉积在各个滴定板上。作为另外一种选择，可以使用固相扩增。在这种方法中，通常将正向和反向引物附接至固体载体上。扩增片段的表面密度由引物与载体上的模板的比所定义。该方法可以产生数百万个空间分离的模板簇，这些模板簇可以与通用测序引物杂交以用于大规模平行测序反应。其他适合的选择包括多重置换扩增方法。适合的测序方法包括(但不限于)illumina的循环可逆终止(crt)或合成测序(sbs)、连接测序(sbl)、单分子加成(焦磷酸测序)或实时测序。使用crt方法的示例平台是illumina/solexa和helicoscope。示例性的sbl平台包括life/apg/solid载体寡核苷酸连接检测。示例性的焦磷酸测序平台为roche/454。示例性的实时测序平台包括pacific biosciences平台和life/visi-gen平台。获得大规模平行核酸序列数据的其他测序方法包括纳米孔测序、杂交测序、基于纳米晶体管阵列的测序、基于扫描隧道显微镜(stm)的测序或基于纳米线-分子传感器的测序。关于测序方法的更多详细信息是技术人员已知的，或者可以来源于适合的文献来源，如goodwin等人,2016,nature reviews genetics,17,333-351，van dijk等人,2014,trends in genetics,9,418-426或者feng等人,2015,genomics proteomics bioinformatics,13,4-16。
96.在另一个方面，本发明涉及通过如本文以上所定义的获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法可获得的靶标多核苷酸。因此，所述靶标多核苷酸可以存在于(例如)处于可尺寸分离状态的具有非靶标多核苷酸的混合物中。因此，通过如本文所描述的将靶标多核苷酸与非靶标多核苷酸分离，可以获得靶标多核苷酸的纯化部分。类似地，所述靶标多核苷酸可以以分离的形式存在于凝胶中，如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，并因此可以使用技术人员已知的适合方法从中提取。可以根据任何适合的方法纯化、储存或修饰所获得的靶标多核苷酸。可以在任何适合的缓冲液或液体中提供所述靶标多核苷酸，或者可以以干燥或冻干形式提供它。
97.在另一个方面，本发明涉及根据本发明方法获得的用于sgrna引导的核酸结合蛋白，例如，cas9的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池。因此，可以作为rna分子提供所述池。优选地，纯化和/或净化所述rna。可以在任何适合的缓冲液或液体中提供，或者可以以干燥或冻干形式提供它。在替代实施方式中，根据本发明作为减少的起始寡核苷酸的池提供所述sgrna的池。在另一个实例中，可以作为如以上所描述的起始寡核苷酸和含有支架序列的寡核苷酸的混合物提供它。
98.在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含通过获得用于sgrna引导的核酸结合蛋白的个性化的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的方法可获得的sgrna的池和用
于sgrna引导的核酸结合蛋白。所述试剂盒优选地用于富集靶标多核苷酸的个性化群体。如本文以上所定义的方法的特征还适用于本发明所述的试剂盒。所述试剂盒可以(例如)包含如本发明所述方法的一个或多个步骤中所定义的试剂和组分。例如，所述试剂盒可以包含用于通过用于sgrna引导的核酸结合蛋白切割获自测试样品的多核苷酸的混合物的试剂或组分。在不同的实施方式中，所述试剂盒可以包含或者可以另外包含用于实施尺寸选自的试剂或组分。一般地，所述试剂盒可以包含适合的缓冲溶液、标记物或清洗液等。此外，所述试剂盒可以包含一定量的已知的核酸分子或蛋白，其可以用于所述试剂盒的校准或者用作内部对照。相应成分对于技术人员将是已知的。
99.另外，所述试剂盒可以包含说明书活页和/或可以提供有关其使用等的信息。
100.还设想了实施上述方法步骤的设备。所述设备可以(例如)由不同模块组成，其可以实施本发明所述方法的一个或多个步骤。这些模块可以以任何适合的方式组合，例如，它们可以存在于单一位置或者是分离的。还设想了所述方法在不同时间点和/或不同位置的实施。在如本文所定义的所述方法的一些步骤之后，可以是休息或暂停，其中适当储存所述试剂或产物等，例如，在冰箱或冷却装置中储存。在如本文所定义的设备的特定模块中实施这些步骤的情况下，所述模块可以用作储存车辆。所述模块还可以用于将反应产物或试剂运输至不同的位置，例如，不同的实验室等。
101.在另一个方面，本发明涉及在用于sgrna引导的核酸结合蛋白-基测定中通过获得用于sgrna引导的核酸结合蛋白的靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的方法可获得的sgrna的池用于从多核苷酸的混合物除去靶标不相关的多核苷酸的应用。所述测定可以包括通过用于sgrna引导的核酸结合蛋白切割获自测试样品的多核苷酸混合物的步骤，其中向将通过根据本发明的方法所获得的sgrna切割的序列引导所述核酸结合蛋白引导。如本文以上所定义的方法的特征还适用于如以上所提及的应用或测定。
102.在上述方法、试剂盒或应用的优选实施方式中，所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白是dna结合cas蛋白。这些dna结合cas蛋白的实例为cas2、cas3、cas5、csn1或csx12或cas9。还设想了其衍生物或突变体。在特别优选的实施方式中，所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白来源于cas9蛋白家族或其衍生物。更优选地，所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白是cas9或其衍生物。优选地，所述衍生物为具有核酸酶活性的功能衍生物。本发明还设想了来源于不同细菌来源的cas9的使用。例如，cas9蛋白可以来源于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)或者嗜热链球菌(streptococcus thermophiles)。优选地，所述cas9为酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)cas9蛋白。有关cas蛋白的形式和使用的其他详细信息可以来源于适合的文献来源，如jiang and doudna,2017,annu.rev.biophys.,46,505-529，makarova等人,2011,biology direct,6,38或者wang等人,2016,annu.rev.biochem.,85,22.1-22.38。
103.在另一个方面，本发明涉及监测疾病状况的方法，其包括以预定时间间隔实施获得靶标多核苷酸的富集的个性化群体的方法。因此，所述方法的目标在于提供用于制备靶标不相关的sgrna的患者的个性化cdna分子，并因此提供以特定间隔对一种或多种未切割的靶标多核苷酸的选择。随后，根据它们的序列和/或长度等分析靶标多核苷酸，并且可以(例如)相对于它们的序列、长度或其他参数将它们与先前获得的靶标多核苷酸或者与参考多核苷酸相比较。相应cdna以及最终靶标多核苷酸的重复提供使得能够追踪靶标多核苷
酸，例如，基因或基因的组的分子变化。这些分子变化可以表示疾病的发病或存在或者疾病的不存在或治愈，或者可以具有任何其他适合的诊断价值。所述分子变化还可以使得能够(例如)通过限定治疗长度、选择适合药剂、限定潜在的共疗法等来采取治疗方法。
104.在优选的实施方式中，可以相对于受试者mrna分子的群体用于制备靶标多核苷酸的富集的个性化群体之间的间隔根据任何适合的考虑进行监测。例如，可以实施任何适合的间隔，例如，在数小时至数年之间。优选地，可以根据治疗策略要求定义间隔。例如，如果要治疗的疾病是需要疗法每月或每两个月再调整的疾病，则可以因此设置间隔。因此可以根据监测方法结果来划分受试者。
105.如本文所使用的术语“划分受试者”表示通过治疗本身以外的因素来对受试者分类。在本发明的情况下，这种因素可以是如本文以上所定义的分子变化。划分可以(例如)帮助控制混杂变量，或者辅助在变量之间进行检测和解释。通常，可以在某些间隔之后相对于其分子变化来分析患者。在遇到或怀疑特定分子状况的情况下，可以使用特定疗法形式或具体调整的疗法形式。
106.如本文所使用的术语疾病可以是适合于分子分析的任何疾病。优选地，所述疾病是癌症。
107.在具体的实施方式中，所述癌症可以是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、肺癌、胰癌、膀胱癌、子宫癌、肾癌、脑癌、胃癌、结肠癌、黑素瘤或纤维肉瘤、成胶质细胞瘤或血液学白血病或淋巴瘤，例如，脊髓或淋巴性淋巴瘤。
108.现转向图1，提供了根据本发明的实施方式用于获得靶标不相关的合成单链向导rna(sgrna)的池的步骤的示意图。在第一步中，将受试者的样品1纯化2。该步骤获得了mrna 3，将其逆转录4，从而导致产生了mrna的cdna拷贝5。通过聚合酶链反应7，将所述cdna进一步扩增6。扩增获得了pcr产物8，将其片段化9，从而导致产生了短片段10，所述短片段10特别地包含粘性末端。随后，将短片段10钝化11以获得钝化片段12。将钝化片段12连接14至标签13，优选地生物素。这获得了标签化的捕手寡核苷酸的池15。此外，提供了起始寡核苷酸的池16，其包含启动子节段17、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段18和结合节段19，其与用于与所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补。将起始寡核苷酸的池16与来源于标签化的捕手寡核苷酸的池15的单链捕手寡核苷酸20杂交，其中所述捕手寡核苷酸包含标签13和与随机节段18互补的节段21。随后，从溶液或反应混合物除去23起始寡核苷酸16和捕手寡核苷酸20的复合物。在所述溶液或反应混合物内，保留减少的起始寡核苷酸的池24。
109.图2显示了用于制备根据本发明的实施方式所使用的靶标不相关的sgrna 107的步骤的示意图。所述方法从起始寡核苷酸的池16开始，其包含启动子节段17、作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段18和结合节段19，其与用于与所述用于sgrna引导的核酸结合蛋白相互作用的支架序列的至少一部分互补，其与支架寡核苷酸100杂交102。在单管101中发生后续反应步骤109。在杂交后，在dna延伸反应103中填充单链区域，从而提供双链dna分子104。在下一步中，通过启动子活性105起始转录106所述dsdna分子。这获得了sgrna分子107，其包含对根据本发明的靶标多核苷酸不特异的序列18和sgrna支架节段108。
110.出于说明性目的提供了附图。因此，应理解附图不应视为限制性的。本领域技术人员将明显能够设想对本文所述原理的进一步改变。
111.附图标记列表
[0112]1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
受试者的样品
[0113]2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
样品的纯化
[0114]3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
mrna
[0115]4ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
逆转录
[0116]5ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
cdna
[0117]6ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
扩增
[0118]7ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚合酶链反应(pcr)
[0119]8ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
pcr产物
[0120]9ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
片段化
[0121]
10
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
短片段
[0122]
11
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
钝化
[0123]
12
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
钝化片段
[0124]
13
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
标签
[0125]
14
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
连接至标签
[0126]
15
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
标签化的捕手寡核苷酸的池
[0127]
16
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
起始寡核苷酸的池
[0128]
17
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
启动子节段
[0129]
18
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
作为捕手寡核苷酸的潜在互补序列的随机节段
[0130]
19
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
结合节段
[0131]
20
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
单链捕手寡核苷酸
[0132]
21
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
与随机节段互补的节段
[0133]
22
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
杂交反应
[0134]
23
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
从溶液除去复合物
[0135]
24
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
以减少的起始寡核苷酸的池继续
[0136]
100
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
支架寡核苷酸
[0137]
101
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
单管反应
[0138]
102
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
与支架寡核苷酸的杂交反应
[0139]
103
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
dna延伸反应
[0140]
104
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
双链dna分子
[0141]
105
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
启动子活性
[0142]
106
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
转录反应
[0143]
107
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
靶标不相关的sgrna分子
[0144]
108
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
sgrna支架节段
[0145]
109
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
单管中的反应步骤