二聚化剂调节的免疫受体复合物的制作方法

二聚化剂调节的免疫受体复合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2019年9月30日提交的美国临时申请第62/908,082号的权益，该申请以引用的方式整体并入本文。
3.关于序列表的声明
4.与本技术相关的序列表以文本格式提供，代替纸质副本，并且特此通过引用并入说明书中。含有序列表的文本文件的名称是blue_126_pc_st25。文本文件为44kb，创建于2020年9月22日，并在本说明书提交的同时，经由efs-web以电子方式提交。


背景技术：
技术领域
5.本公开涉及经改进的过继性细胞疗法。更具体地，本公开涉及经改进的化学调节的信号传导分子、细胞以及使用其的方法，所述方法用于调节在过继性免疫疗法期间的细胞信号起始和下游应答的空间和时间控制。
6.现有技术
7.全球癌症负担在1975年与2000年间翻倍。癌症是世界范围内导致发病率和死亡率的第二大主导原因，并且在2012年间有约1410万例新增病例和820万例癌症相关死亡。最常见的癌症是乳癌、肺和支气管癌、前列腺癌、结肠和直肠癌症、膀胱癌、皮肤黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma)、甲状腺癌、肾脏和肾盂癌、子宫内膜癌、白血病以及胰腺癌。预计在接下来的二十年里新增癌症病例的数量将增加至2200万例。
8.过继性细胞疗法正在成为一种用于递送复杂生物信号以治疗癌症的强大范例。与小分子和生物药物组合物相比，过继性细胞疗法由于其极大数量的感觉和应答程序以及日益明确的遗传控制机制而具有执行独特治疗任务的潜力。为了实现这种治疗价值，细胞需要装有用于感测和整合与局部生理环境相关的化学和/或生物学信息的机制。


技术实现要素：

9.本公开整体部分地涉及可以识别靶抗原以及募集和活化t细胞受体(tcr)信号传导复合物的二聚化剂调节的免疫受体复合物(daric)、编码它们的多核苷酸和多肽、它们的组合物以及制备和使用它们来治疗癌症的方法。
10.在各种实施方案中，一种非天然细胞包含：第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的第一结合结构域；fkbp多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；和第一共刺激结构域；所述第二多肽包含：与cd3ε、cd3δ或cd3γ结合的第二结合结构域；frb多聚化结构域多肽或其变体；和第二跨膜结构域；其中桥接因子促进多肽复合物在所述非天然细胞表面上的形成，并且所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域相关并且设置于它们之间。
11.在特定实施方案中，所述fkbp多聚化结构域多肽是fkbp12。
12.在特定实施方案中，所述frb多聚化结构域多肽是frb t2098l。
13.在一些实施方案中，桥接因子选自由以下组成的组：ap21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
14.在某些实施方案中，所述第一结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
15.在各种实施方案中，所述第一结合结构域包含选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
16.在另外的实施方案中，所述第一结合结构域包含scfv。
17.在特定实施方案中，所述第一结合结构域包含vhh抗体。
18.在另外的实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
19.在一些实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
20.在另外的实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
21.在各种实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd4跨膜结构域。
22.在某些实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、
t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
23.在其他实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：fyn、lck和zap70。
24.在特定实施方案中，所述第一共刺激结构域是lck多肽。
25.在另外的实施方案中，所述第一多肽包含所述第一结合结构域，所述第一结合结构域包含结合在癌细胞上表达的靶抗原的scfv或vhh、fkbp12多聚化结构域多肽、cd8α跨膜结构域；和lck多肽。
26.在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的抗体或其抗原结合片段。
27.在各种实施方案中，所述第二结合结构域包含选自由以下组成的组的结合cd3ε的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
28.在特定实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的scfv。
29.在另外的实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的vhh抗体。
30.在特定实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
31.在某些实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域。
32.在特定实施方案中，所述第二多肽还包含第二共刺激结构域。
33.在一些实施方案中，第二多肽的共刺激结构域选自由以下组成的组的共刺激分子：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
34.在另外的实施方案中，第二多肽的共刺激结构域是从ox40或tnfr2中分离的共刺激结构域。
35.在各种实施方案中，一种非天然细胞包含：多肽复合物，所述多肽复合物包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的第一结合结构域、fkbp12多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；和第一共刺激结构域；所述第二多肽包含：与cd3ε、cd3δ或cd3γ结合的第二结合结构域；frb多聚化结构域多肽或其变体；和第二跨膜结构域；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域相关并且设置于它们之间。
36.在另外的实施方案中，所述fkbp多聚化结构域多肽是fkbp12。
37.在特定实施方案中，所述frb多聚化结构域多肽是frb t2098l。
38.在其他实施方案中，所述桥接因子选自由以下组成的组：ap21967、西罗莫司、依维
莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
39.在各种实施方案中，所述第一结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
40.在某些实施方案中，所述第一结合结构域包含选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
41.在特定实施方案中，所述第一结合结构域包含scfv。
42.在另外的实施方案中，所述第一结合结构域包含vhh抗体。
43.在一些实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
44.在特定实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
45.在另外的实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
46.在另外的实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd4跨膜结构域。
47.在各种实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
48.在另外的实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：fyn、lck和zap70。
49.在一些实施方案中，所述第一共刺激结构域是lck多肽。
50.在某些实施方案中，所述第一多肽包含所述第一结合结构域，所述第一结合结构域包含结合在癌细胞上表达的靶抗原的scfv或vhh、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域；和lck多肽。
51.在其他实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的抗体或其抗原结合片段。
52.在特定实施方案中，所述第二结合结构域包含选自由以下组成的组的结合cd3ε的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
53.在另外的实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的scfv。
54.在特定实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的vhh抗体。
55.在某些实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
56.在特定实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域。
57.在一些实施方案中，所述第二多肽还包含第二共刺激结构域。
58.在另外的实施方案中，第二多肽的共刺激结构域选自由以下组成的组的共刺激分子：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
59.在各种实施方案中，第二多肽的共刺激结构域是从ox40或tnfr2中分离的共刺激结构域。
60.在另外的实施方案中，所述细胞是造血细胞。
61.在特定实施方案中，细胞是t细胞。
62.在其他实施方案中，所述细胞是cd3 、cd4 和/或cd8 细胞。
63.在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。
64.在某些实施方案中，细胞是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)或辅助t细胞。
65.在各种实施方案中，细胞是自然杀伤(nk)细胞或自然杀伤t(nkt)细胞。
66.在另外的实施方案中，细胞的来源是外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。
67.在另外的实施方案中，当所述第一多肽和所述第二多肽被表达时，所述frb多聚化结构域多肽和所述fkbp多聚化结构域多肽在细胞外定位。
68.在各种实施方案中，一种非天然细胞包含：第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包
含结合在癌细胞上表达的靶抗原的结合结构域；fkbp多聚化结构域多肽或其变体；跨膜结构域；和共刺激结构域；所述第二多肽包含：frb多聚化结构域多肽或其变体；接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽；其中桥接因子促进多肽复合物在所述非天然细胞表面上的形成，并且所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域相关并且设置于它们之间。
69.在特定实施方案中，所述fkbp多聚化结构域多肽是fkbp12。
70.在一些实施方案中，所述frb多聚化结构域多肽是frb t2098l。
71.在另外的实施方案中，桥接因子选自由以下组成的组：ap21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
72.在各种实施方案中，结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
73.在其他实施方案中，所述结合结构域包含选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
74.在另外的实施方案中，所述结合结构域包含scfv。
75.在特定实施方案中，所述结合结构域包含vhh抗体。
76.在某些实施方案中，所述结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
77.在各种实施方案中，所述结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
78.在另外的实施方案中，所述跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
79.在另外的实施方案中，所述跨膜结构域是cd4跨膜结构域。
80.在特定实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
81.在其他实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：fyn、lck和zap70。
82.在某些实施方案中，所述共刺激结构域是lck多肽。
83.在特定实施方案中，所述共刺激结构域是从ox40或tnfr2中分离的共刺激结构域。
84.在一些实施方案中，所述第一多肽包含所述结合结构域，所述结合结构域包含结合在癌细胞上表达的靶抗原的scfv或vhh、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域；和任选地lck多肽。
85.在各种实施方案中，一种融合多肽包含：第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的第一结合结构域；fkbp多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；和第一共刺激结构域；多肽裂解信号；所述第二多肽包含：与cd3ε、cd3δ或cd3γ结合的第二结合结构域；frb多聚化结构域多肽或其变体；和第二跨膜结构域。
86.在各种实施方案中，一种融合多肽从n-末端至c-末端包含：第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的第一结合结构域；fkbp多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；和第一共刺激结构域；多肽裂解信号；所述第二多肽包含：与cd3ε、cd3δ或cd3γ结合的第二结合结构域；frb多聚化结构域多肽或其变体；和第二跨膜结构域。
87.在另外的实施方案中，所述fkbp多聚化结构域多肽是fkbp12。
88.在一些实施方案中，所述frb多聚化结构域多肽是frb t2098l。
89.在另外的实施方案中，桥接因子选自由以下组成的组：ap21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
90.在各种实施方案中，所述第一结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
91.在另外的实施方案中，所述第一结合结构域包含选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
92.在特定实施方案中，所述第一结合结构域包含scfv。
93.在另外的实施方案中，所述第一结合结构域包含vhh抗体。
94.在某些实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、
cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
95.在各种实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
96.在另外的实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
97.在一些实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd4跨膜结构域。
98.在其他实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
99.在特定实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：fyn、lck和zap70。
100.在各种实施方案中，所述第一共刺激结构域是lck多肽。
101.在另外的实施方案中，所述第一多肽包含所述第一结合结构域，所述第一结合结构域包含结合在癌细胞上表达的靶抗原的scfv或vhh、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域；和lck多肽。
102.在另外的实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的抗体或其抗原结合片段。
103.在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含选自由以下组成的组的结合cd3ε的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体
(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
104.在其他实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的scfv。
105.在各种实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的vhh抗体。
106.在某些实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
107.在各种实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域。
108.在另外的实施方案中，所述第二多肽还包含第二共刺激结构域。
109.在特定实施方案中，第二多肽的共刺激结构域选自由以下组成的组的共刺激分子：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
110.在另外的实施方案中，所述第二多肽的所述共刺激结构域是从ox40或tnfr2中分离的共刺激结构域。
111.在一些实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。
112.在各种实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2a多肽。
113.在其他实施方案中，多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：口蹄疫病毒(fmdv)(f2a)肽、马a型鼻炎病毒(erav)(e2a)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(tav)(t2a)肽、猪捷申病毒-1(ptv-1)(p2a)肽、泰勒病毒2a肽以及脑心肌炎病毒2a肽。
114.在各种实施方案中，一种融合多肽包含：第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的结合结构域；fkbp多聚化结构域多肽或其变体；跨膜结构域；和共刺激结构域；多肽裂解信号；所述第二多肽包含：frb多聚化结构域多肽或其变体；接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽。
115.在各种实施方案中，一种融合多肽从n-末端至c-末端包含：第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的结合结构域；fkbp多聚化结构域多肽或其变体；跨膜结构域；和共刺激结构域；多肽裂解信号；所述第二多肽包含：frb多聚化结构域多肽或其变体；接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽。
116.在一些实施方案中，所述fkbp多聚化结构域多肽是fkbp12。
117.在一些实施方案中，所述frb多聚化结构域多肽是frb t2098l。
118.在另外的实施方案中，桥接因子选自由以下组成的组：ap21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
119.在各种实施方案中，结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
120.在另外的实施方案中，所述结合结构域包含选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
121.在特定实施方案中，所述结合结构域包含scfv。
122.在其他实施方案中，所述结合结构域包含vhh抗体。
123.在某些实施方案中，所述结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
124.在另外的实施方案中，所述结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
125.在一些实施方案中，所述跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
126.在另外的实施方案中，所述跨膜结构域是cd4跨膜结构域。
127.在各种实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
128.在特定实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：fyn、lck和zap70。
129.在特定实施方案中，所述第一共刺激结构域是lck多肽。
130.在另外的实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：ox40和tnfr2。
131.在某些实施方案中，所述第一多肽包含所述第一结合结构域，所述第一结合结构域包含结合在癌细胞上表达的靶抗原的scfv或vhh、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域；和lck多肽。
132.在各种实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解多肽。
133.在其他实施方案中，所述多肽裂解信号是病毒自裂解2a多肽。
134.在一些实施方案中，多肽裂解信号是选自由以下组成的组的病毒自裂解多肽：口蹄疫病毒(fmdv)(f2a)肽、马a型鼻炎病毒(erav)(e2a)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(tav)(t2a)肽、猪捷申病毒-1(ptv-1)(p2a)肽、泰勒病毒2a肽以及脑心肌炎病毒2a肽。
135.在各种实施方案中，一种多肽复合物包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的第一结合结构域、fkbp多聚化结构域多肽或其变体；第一跨膜结构域；和第一共刺激结构域；所述第二多肽包含：与cd3ε、cd3δ或cd3γ结合的第二结合结构域；frb多聚化结构域多肽或其变体；和第二跨膜结构域；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域相关并且设置于它们之间。
136.在各种实施方案中，所述fkbp多聚化结构域多肽是fkbp12。
137.在另外的实施方案中，所述frb多聚化结构域多肽是frb t2098l。
138.在另外的实施方案中，桥接因子选自由以下组成的组：ap21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
139.在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
140.在特定实施方案中，所述第一结合结构域包含选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
141.在另外的实施方案中，所述第一结合结构域包含scfv。
142.在某些实施方案中，所述第一结合结构域包含vhh抗体。
143.在各种实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、
ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
144.在其他实施方案中，所述第一结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
145.在特定实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
146.在一些实施方案中，所述第一跨膜结构域是cd4跨膜结构域。
147.在各种实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
148.在另外的实施方案中，所述第一共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：fyn、lck和zap70。
149.在一些实施方案中，所述第一共刺激结构域是lck多肽。
150.在一些实施方案中，所述第一多肽包含所述第一结合结构域，所述第一结合结构域包含结合在癌细胞上表达的靶抗原的scfv或vhh、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域；和lck多肽。
151.在各种实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的抗体或其抗原结合片段。
152.在另外的实施方案中，所述第二结合结构域包含选自由以下组成的组的结合cd3ε的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
153.在特定实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的scfv。
154.在某些实施方案中，所述第二结合结构域包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的vhh抗体。
155.在一些实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
156.在各种实施方案中，所述第二跨膜结构域是cd8α跨膜结构域。
157.在另外的实施方案中，所述第二多肽还包含第二共刺激结构域。
158.在其他实施方案中，第二多肽的共刺激结构域选自由以下组成的组的共刺激分子：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
159.在各种实施方案中，第二多肽的共刺激结构域是从ox40或tnfr2中分离的共刺激
结构域。
160.在另外的实施方案中，所述细胞是造血细胞。
161.在一些实施方案中，细胞是t细胞。
162.在另外的实施方案中，细胞是cd3 、cd4 和/或cd8 细胞。
163.在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。
164.在某些实施方案中，细胞是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)或辅助t细胞。
165.在特定实施方案中，细胞是自然杀伤(nk)细胞或自然杀伤t(nkt)细胞。
166.在一些实施方案中，细胞的来源是外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。
167.在另外的实施方案中，当所述第一多肽和所述第二多肽被表达时，所述frb多聚化结构域多肽和所述fkbp多聚化结构域多肽在细胞外定位。
168.在各种实施方案中，一种多肽复合物包含：第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含：结合在癌细胞上表达的靶抗原的结合结构域、fkbp多聚化结构域多肽或其变体；跨膜结构域；和共刺激结构域；所述第二多肽包含：frb多聚化结构域多肽或其变体；接头多肽；和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽；以及桥接因子，所述桥接因子与所述第一多肽和所述第二多肽的多聚化结构域相关并且设置于它们之间。
169.在另外的实施方案中，所述fkbp多聚化结构域多肽是fkbp12。
170.在另外的实施方案中，所述frb多聚化结构域多肽是frb t2098l。
171.在另外的实施方案中，桥接因子选自由以下组成的组：ap21967、西罗莫司、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
172.在某些实施方案中，结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
173.在各种实施方案中，所述结合结构域包含选自由以下组成的组的抗体或其抗原结合片段：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
174.在特定实施方案中，所述结合结构域包含scfv。
175.在另外的实施方案中，所述结合结构域包含vhh抗体。
176.在各种实施方案中，所述结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素
瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
177.在另外的实施方案中，所述结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
178.在一些实施方案中，所述跨膜结构域是cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。
179.在另外的实施方案中，所述跨膜结构域是cd4跨膜结构域。
180.在某些实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
181.在各种实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：fyn、lck和zap70。
182.在另外的实施方案中，所述共刺激结构域是lck多肽。
183.在一些实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激分子，所述共刺激分子选自由以下组成的组：ox40和tnfr2。
184.在各种实施方案中，所述多肽包含所述第一结合结构域，所述第一结合结构域包含结合在癌细胞上表达的靶抗原的scfv或vhh、fkbp多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域；和lck多肽。
185.在特定实施方案中，细胞是造血细胞。
186.在某些实施方案中，细胞是t细胞。
187.在另外的实施方案中，细胞是cd3 、cd4 和/或cd8 细胞。
188.在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞。
189.在另外的实施方案中，细胞是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)或辅助t细胞。
190.在各种实施方案中，细胞是自然杀伤(nk)细胞或自然杀伤t(nkt)细胞。
191.在特定实施方案中，细胞的来源为外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤。
192.在另外的实施方案中，当第一多肽和第二多肽被表达时，frb多聚化结构域和fkbp多聚化结构域在细胞外定位。
193.在各种实施方案中，一种多核苷酸编码本文所涵盖的第一多肽或第二多肽或融合多肽。
194.在一些实施方案中，所述多核苷酸是cdna。
195.在特定实施方案中，所述多核苷酸是rna。
196.在各种实施方案中，载体包含本文所涵盖的多核苷酸。
197.在其他实施方案中，所述载体是表达载体。
198.在某些实施方案中，载体是转座子。
199.在各种实施方案中，载体是piggybac转座子或sleeping beauty转座子。
200.在特定实施方案中，所述载体是病毒载体。
201.在其他实施方案中，载体是腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体或逆转录病毒载体。
202.在一些实施方案中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。
203.在另外的实施方案中，慢病毒载体选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒1(hiv-1)；人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、维斯纳-梅迪病毒(vmv)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；以及猿猴免疫缺陷病毒(siv)。
204.在各种实施方案中，一种组合物包含本文所涵盖的非天然细胞、融合多肽、多核苷酸或载体。
205.在各种实施方案中，一种药物组合物包含本文所涵盖的药学上可接受的载剂和非天然细胞、融合多肽、多核苷酸或载体。
206.在各种实施方案中，一种治疗有需要的受试者的方法包括向所述受试者施用有效量的本文所涵盖的组合物。
207.在各种实施方案中，一种治疗、预防癌症、传染病、自身免疫性疾病、炎性疾病和免疫缺陷或与其相关的病状或改善其至少一种症状的方法包括向所述受试者施用有效量的本文所涵盖的组合物。
208.在各种实施方案中，一种治疗实体癌的方法包括向受试者施用有效量的本文所涵盖的组合物。
209.在某些实施方案中，实体癌选自由以下组成的组：肺癌、鳞状细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、食道癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌或脑癌。
210.在一些实施方案中，实体癌是非小细胞肺癌、头部和颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、食管癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤或少突神经胶质瘤。
211.在各种实施方案中，一种治疗血液恶性肿瘤的方法包括向受试者施用有效量的本文所涵盖的组合物。
212.在某些实施方案中，血液恶性肿瘤是白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
213.在特定实施方案中，恶性血液病是急性骨髓性白血病(aml)。
附图说明
214.图1显示了代表性daric架构的草图。
215.图2显示了代表性daric架构的草图。
216.序列标识符简述
217.seq id no:1-5列出了代表性daric融合蛋白的氨基酸序列。
具体实施方案
218.a.概述
219.癌症是世界范围内死亡的主要原因之一。虽然过继细胞疗法已被用于成功治疗一些血液系统恶性肿瘤，但使用嵌合抗原受体(car)t细胞和表达针对肿瘤抗原的t细胞受体(tcr)的t细胞来治疗实体瘤仍然基本上无效。
220.经工程改造以表达car或tcr的t细胞的一个显著限制是缺乏对t细胞活性的空间和时间控制和/或t细胞信号传导通路的活化不足。缺乏对工程化t细胞活性的控制会引发一系列副作用，其中许多副作用开始时很微小，但会迅速恶化。特别严重的并发症是细胞因子释放综合征(crs)或“细胞因子风暴”，其中car t细胞诱导大量且可能致命的细胞因子释放。crs可能产生危险的高烧、极度疲劳、呼吸困难和血压急剧下降。crs还可能产生涉及神经系统的第二波副作用，包含神经毒性、震颤、头痛、混乱、失去平衡、说话困难、癫痫和幻觉。t细胞信号传导通路的活化不足可能导致无法根除癌症和/或导致无法治疗的癌症。本文所涵盖的组合物和方法为困扰过继性细胞疗法的这些和其它问题提供了解决方案。
221.本公开总体上涉及用于使用结合靶抗原并且可以募集和活化tcr信号传导复合物的二聚化剂调节的免疫受体复合物(daric)来调节过继性细胞疗法的空间和时间控制的改进的组合物和方法。不希望受到任何特定理论的束缚，本文所涵盖的daric组合物和方法提供了优于本领域中现有的car t细胞和tcr t细胞疗法的许多优点，包括但不限于对免疫效应细胞信号转导结合和信号传导活性以及活化基于tcr的信号通路而不需要mhc复合物识别的空间和时间控制。daric时间控制通过桥接因子介导的daric结合组分与daric信号传导组分之间的缔合来引发信号传导的daric机制。daric空间控制通过daric信号传导组分的结合结构域识别靶抗原来参与信号传导机制，而daric结合组分的结合结构域结合tcr复合物的成员。以此方式，当表达靶抗原的靶细胞和桥接因子都存在时，daric免疫效应细胞活化tcr信号传导。
222.在各种实施方案中，本公开涵盖了产生针对表达靶抗原但不对靶抗原进行mhc识别的癌症的基于tcr的抗癌反应的daric组分。
223.在特定实施方案中，daric包括这样的多肽(daric信号传导组分)：其包含结合在靶细胞上表达的靶抗原的结合结构域、多聚化结构域多肽或其变体、跨膜结构域和共刺激结构域；和这样的多肽(daric结合组分)：其包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的结合结构域、多聚化结构域多肽或其变体、跨膜结构域；和任选地共刺激结构域。在存在桥接因子的情况下，daric结合和信号传导组分通过桥接因子相互缔合，以形成具有功能活性的daric。
224.在特定实施方案中，daric包括这样的多肽(daric信号传导组分)，其包含结合在靶细胞上表达的靶抗原的结合结构域、多聚化结构域多肽或其变体、跨膜结构域和共刺激结构域；和这样的多肽(daric结合组分)，其包含多聚化结构域多肽或其变体、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽；和任选地共刺激结构域。在存在桥接因子的情况下，daric结合和信号传导组分通过桥接因子相互缔合，以形成具有功能活性的daric。
225.在优选实施方案中，daric结合组分和daric信号传导组分的多聚化结构域在细胞外定位。相比于细胞内定位，多聚化结构域的细胞外定位提供许多优点，包括但不限于结合结构域的更有效定位、对桥接因子调节的更高时间敏感性以及由于使用非免疫抑制剂量的特定桥接因子的能力而毒性较小。
226.本文涵盖了对daric、daric结合组分和daric信号传导组分进行编码的多核苷酸；daric结合组分、daric信号传导组分、daric蛋白复合物、daric融合蛋白；包括对daric、daric结合组分和daric信号传导组分进行编码和/或表达其的多核苷酸的细胞；以及使用其治疗免疫病症的方法。
227.用于重组(即，工程改造)dna、肽和寡核苷酸合成的技术、免疫分析、组织培养、转化(例如电穿孔、脂质体转染)、酶促反应、纯化以及相关技术和程序一般可以如本说明书通篇引用和论述的微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学及免疫学中的各种通用且更特定的参考文献中所描述来执行。参见，例如，sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,第3版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.；current protocols in molecular biology(john wiley and sons,2008年7月更新)；short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,greene pub.associates and wiley-interscience；glover,dna cloning:a practical approach,第i卷和第ii卷(irl press,oxford univ.press usa,1985)；current protocols in immunology(编辑:john e.coligan,ada m.kruisbeek,david h.margulies,ethan m.shevach,warren strober 2001john wiley&sons,ny,ny)；real-time pcr:current technology and applications,编辑：julie logan,kirstin edwards和nick saunders,2009,caister academic press,norfolk,uk；anand,techniques for the analysis of complex genomes,(academic press,new york,1992)；guthrie和fink,guide to yeast genetics and molecular biology(academic press,new york,1991)；oligonucleotide synthesis(n.gait编,1984)；nucleic acid the hybridization(b.hames&s.higgins编,1985)；transcription and translation(b.hames&s.higgins编,1984)；animal cell culture(r.freshney编,1986)；perbal,a practical guide to molecular cloning(1984)；next-generation genome sequencing(janitz,2008wiley-vch)；pcr protocols(methods in molecular biology)(park编，第3版,2010humana press)；immobilized cells and enzymes(irl press,1986)；the treatise,methods in enzymology(academic press,inc.,n.y.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller和m.p.calos编,1987,cold spring harbor laboratory)；harlow和lane,antibodies,(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1998)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer和walker编，academic press,london,1987)；handbook of experimental immunology,第i-iv卷(d.m.weir和cc blackwell编，1986)；roitt,essential immunology,第6版,(blackwell scientific publications,oxford,1988)；current protocols in immunology(q.e.coligan,a.m.kruisbeek,d.h.margulies,e.m.shevach和w.strober编，1991)；annual review of immunology；以及诸如advances in immunology的期刊中的专题论文。
228.b.定义
229.在更加详细地阐述本公开之前，提供本文要使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。
230.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文所描述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料来实践或测试特定实施方案，但本文中描述组合物、方法和材料的优选实施方案。出于本公开的目的，下文定义以下术语。
231.本文使用的冠词“一(a/an)”是指一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种)或一个(种)或多个(种))该冠词的语法对象。作为实例，“一个元件”意指一个元件或一个或多个元件。
232.替代选择(例如“或”)的使用应理解为意指替代选择中的一种、两种或其任何组合。
233.术语“和/或”应理解为意指替代选择中的一种或两种。
234.如本文所使用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度在大致参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度
±
15％、
±
10％、
±
9％、
±
8％、
±
7％、
±
6％、
±
5％、
±
4％、
±
3％、
±
2％或
±
1％的范围内。
235.在一个实施方案中，范围，例如1至5、约1至5或约1至约5是指所述范围所涵盖的每个数字值。例如，在一个非限制性且仅说明性实施方案中，范围“1至5”相当于表述1、2、3、4、5；或1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
236.如本文所使用，术语“基本上”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度是参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。在一个实施方案中，“基本上相同”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度产生的作用，例如生理作用与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同。
237.在本说明书通篇，除非上下文另外要求，否则“包含(comprise/comprises/comprising)”一词应理解为暗指包括所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或任何其它组步骤或要素。“由
……
组成”意图包括且限于短语“由
……
组成”之后的事物。因此，短语“由
……
组成”指示所列要素是必不可少或必需的，并且不能存在其他要素。“基本上由
……
组成”意图包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响关于所列要素的公开内容中所说明的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由
……
组成”指示所列要素是必不可少的或必需的，而且不存在实质上影响所列要素的活性或作用的其它要素。
238.本说明书通篇提到的“一个实施方案(one embodiment/an embodiment)”、“一个
特定实施方案”、“一个相关实施方案”、“某一实施方案”、“一个另外的实施方案”或“另一实施方案”或其组合意味着，结合所述实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇各处出现的前述短语未必都参考同一实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以通过任何适合方式组合于一个或多个实施方案中。还应理解，在一个实施方案中关于一个特征的正面叙述用作一个特定实施方案中排除所述特征的基础。
[0239]“抗原(ag)”是指可以在动物中刺激抗体产生或t细胞应答的化合物、组合物或物质，包含注射或吸收到动物内的组合物(如包含癌症特异性蛋白的组合物)。示例性抗原包括但不限于脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或核酸。抗原与具有特定体液或细胞免疫的产物反应，包含由如公开的抗原等异源抗原诱导的产物。
[0240]“靶抗原”或“所关注的靶抗原”是指在靶细胞的细胞表面上表达的分子，本文所涵盖的结合结构域被设计为结合所述分子。在特定实施方案中，靶抗原是在癌细胞的表面上表达的多肽的表位。
[0241]
如本文所用，术语“tcr复合物”是指由cd3与tcr结合形成的复合物。例如，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同源二聚体、tcrα链和tcrβ链组成。在一些实施方案中，tcr复合物可以由cd3γ链、cd3δ链、两条cd3ε链、cd3ζ链的同源二聚体、tcrγ链和tcrδ链组成。
[0242]
如本文所用，“tcr复合物的组分”是指tcr链(即，tcrα、tcrβ、tcrγ或tcrδ)、cd3链(即，cd3γ、cd3δ、cd3ε或cd3ζ)或由两条或更多条tcr链或cd3链形成的复合物(例如，tcrα和tcrβ的复合物、tcrγ和tcrδ的复合物、cd3ε和cd3δ的复合物、cd3γ和cd3ε的复合物、或者tcrα、tcrβ、cd3γ、cd3δ和两条cd3ε链的亚tcr复合物)。
[0243]
如本文所使用，术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“抗原结合结构域”、“细胞外结合结构域”、“细胞外抗原结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用并且为多肽提供与所关注的靶抗原特异性地结合的能力。结合结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。
[0244]
如本文所用，术语“特异性结合亲和力”或“特异性结合”或“特异性靶向”描述结合结构域与靶抗原结合的结合亲和力高于背景结合。如果结合结构域以例如大于或等于约105m-1的亲和力或ka(
即
，特定结合相互作用的平衡缔合常数，以1/m为单位)与抗原结合或缔合，则该结合结构域“特异性结合”至抗原。在某些实施方案中，结合结构域(或包含其的融合蛋白)以大于或等于约106m-1
、107m-1
、108m-1
、109m-1
、10
10
m-1
、10
11
m-1
、10
12
m-1
或10
13
m-1
的ka结合靶标。“高亲和力”结合结构域(或其单链融合蛋白)是指ka是至少107m-1
、至少108m-1
、至少109m-1
、至少10
10
m-1
、至少10
11
m-1
、至少10
12
m-1
、至少10
13
m-1
或更高的结合结构域。
[0245]
术语“选择性结合(selectively binds)”或“选择性结合(selectively bound)”或“选择性结合(selectively binding)”或“选择性靶向”描述在多个脱靶分子存在下，一个分子优先结合至靶分子(在靶结合(on-target binding))。
[0246]“抗体”是指属于包括至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫球蛋白可变区特异性地识别并结合靶标的表位，如脂质、碳水化合物、多糖、糖蛋白、肽或含有抗原决定簇的核酸，如通过免疫细胞识别的那些。
[0247]“表位”或“抗原决定簇”是指结合剂结合的抗原的区。
[0248]
抗体包含其抗原结合片段，如骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双-scfv、(scfv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab、骆驼vhh、纳米抗体)以及全长抗体的负责抗原结合的部分。所述术语还包括基因工程改造的形式如嵌合抗体(例如人源化鼠类抗体)、异偶联物抗体(如双特异性抗体)和其抗原结合片段。还参见pierce catalog and handbook,1994-1995(pierce chemical co.,rockford,il)；kuby,j.,immunology,第3版,w.h.freeman&co.,new york,1997。
[0249]“接头”或“接头多肽”是指为了分子的适当间隔和构象而添加的各个多肽结构域之间的多个氨基酸残基。在特定实施方案中，接头是可变区连接序列。“可变区连接序列”是氨基酸序列，所述氨基酸序列连接vh结构域和v
l
结构域并且提供与两个子结合结构域的相互作用兼容的间隔子功能，使得所得多肽对与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子保留特异性结合亲和力。在特定实施方案中，接头将一个或多个重链可变结构域或轻链可变结构域、铰链结构域、多聚化结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域分开。
[0250]
适于在本文所涵盖的特定实施方案中使用的接头的说明性实例包括但不限于以下氨基酸序列：ggg；dgggs(seq id no:6)；tgekp(seq id no:7)(参见例如,liu等人,pnas 5525-5530(1997))；ggrr(seq id no:8)(pomerantz等人1995,同上)；(ggggs)n，其中n＝1、2、3、4或5(seq id no:9)(kim等人,pnas 93,1156-1160(1996.)；egkssgsgseskvd(seq id no:10)(chaudhary等人,1990,proc.natl.acad.sci.u.s.a.87:1066-1070)；kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no:11)(bird等人,1988,science 242:423-426),ggrrgggs(seq id no:12)；lrqrdgerp(seq id no:13)；lrqkdgggserp(seq id no:14)；lrqkd(gggs)2erp(seq id no:15)。或者，可以使用能够对dna结合位点和肽本身建模的计算机程序(desjarlais&berg,pnas 90:2256-2260(1993),pnas 91:11099-11103(1994)或通过噬菌体展示方法合理地设计柔性接头。在一个实施方案中，接头包含以下氨基酸序列：gstsgsgkpgsgegstkg(seq id no:16)(cooper等人,blood,101(4):1637-1644(2003))。
[0251]“间隔子结构域”是指将两个结构域分开的多肽。在一个实施方案中，间隔子结构域使抗原结合结构域移动远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化(patel等人,gene therapy,1999；6:412-419)。在特定实施方案中，间隔子结构域将一个或多个重链可变结构域或轻链可变结构域、多聚化结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域分开。间隔子结构域可来源于天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔子结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如ch2和ch3。间隔子结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
[0252]“铰链结构域”是指在将抗原结合结构域定位成远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化中起作用的多肽。在特定实施方案中，多肽可以包括在结合结构域与多聚化结构域之间、在结合结构域与跨膜结构域(tm)之间或在多聚化结构域与跨膜结构域之间的一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的
氨基酸序列。
[0253]
如本文所使用，“多聚化结构域”或“多聚化结构域多肽”是指直接或经由桥连分子优先与另一个不同的多肽相互作用或缔合的多肽，例如，化学可诱导的二聚体，其中不同多聚化结构域的相互作用实质上有助于或高效地促进了多聚化(即，二聚体、三聚体或多分复合物的形成，所述二聚体、所述三聚体或所述多分复合物可以是同源二聚体、异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源多聚体、异多聚体)。多聚化结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。
[0254]
适于在本文所涵盖的特定实施方案中使用的多聚化结构域的说明性实例包含fk506结合蛋白(fkbp)多肽或其变体、fkbp-雷帕霉素结合(frb)多肽或其变体、钙调神经磷酸酶多肽或其变体、亲环蛋白多肽或其变体、细菌二氢叶酸还原酶(dhfr)多肽或其变体、pyr1样1(pyl1)多肽或其变体、脱落酸不敏感1(abi1)多肽或其变体、gib1多肽或其变体或gai多肽或其变体。
[0255]
如本文所使用，术语“fkbp-雷帕霉素结合多肽”是指frb多肽。在特定实施方案中，frb多肽是fkbp12-雷帕霉素结合多肽。适于在本文所涵盖的特定实施方案中使用的frb多肽通常含有至少约85个到约100个氨基酸残基。在某些实施方案中，参考genbank登录号l34075.1，frb多肽包含93个氨基酸序列ile-2021至lys-2113以及t2098l的突变。本文所涵盖的frb多肽通过桥接因子与fkbp多肽结合，由此形成三元复合物。
[0256]
如本文所使用，术语“fk506结合蛋白”是指fkbp多肽。在特定实施方案中，fkbp多肽是fkbp12多肽或包括f36v突变的fkbp12多肽。在某些实施方案中，fkbp结构域也可以被称为“雷帕霉素结合结构域”。有关各种fkbp种类的核苷酸序列、克隆和其它方面的信息是本领域已知的(参见，staendart等人,nature 346:671,1990(human fkbp12)；kay,biochem.j.314:361,1996)。本文所涵盖的fkbp多肽通过桥接因子与frb多肽结合，由此形成三元复合物。
[0257]“桥接因子”是指与两个或更多个多聚化结构域缔合并且置于两个或更多个多聚化结构域之间的分子。在特定实施方案中，多聚化结构域仅在桥接因子存在的情况下实质上有助于或高效地促进多肽复合物的形成。在特定实施方案中，多聚化结构域在不存在桥接因子的情况下不会有助于或不会高效地促进多肽复合物的形成。适于在本文所涵盖的特定实施方案中使用的桥接因子的说明性实例包括但不限于ap21967、雷帕霉素(西罗莫司)或雷帕霉素类似物、库马霉素或其衍生物、赤霉素或其衍生物、脱落酸(aba)或其衍生物、甲氨蝶呤或其衍生物、环孢菌素a或其衍生物、fkcsa或其衍生物、甲氧苄啶(tmp)-fkbp合成配体(slf)或其衍生物、或其任何组合。
[0258]
雷帕霉素类似物(rapalog)包括但不限于美国专利6,649,595号中公开的那些，所述rapalog结构以引用方式整体并入本文。在某些实施方案中，桥接因子是相较于雷帕霉素，具有明显较低的免疫抑制作用的雷帕霉素类似物。在优选实施方案中，雷帕霉素类似物是ap21967(也被称为c-16-(s)-7-甲基吲哚雷帕霉素，ic
50
＝10nm，经过化学修饰的非免疫抑制雷帕霉素类似物)。适于在本文所涵盖的特定实施方案中使用的其它说明性雷帕霉素类似物包括但不限于依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。
[0259]“显著降低的免疫抑制作用”是指是针对在临床上或在人类免疫抑制活性的适当
的体外(例如，抑制t细胞增殖)或体内替代物中测量的同一剂量观察或预期的免疫抑制作用的至少小于0.1倍到0.005倍。
[0260]“跨膜结构域”或“tm结构域”是将多肽与细胞的质膜锚定的结构域。tm结构域可以来源于天然、合成、半合成或重组来源。
[0261]
术语“效应子功能”或“效应细胞功能”是指免疫效应细胞的专门功能。效应子功能包括但不限于活化、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包含细胞毒性因子的释放，或通过与免疫效应细胞上表达的受体进行抗原结合引发的其它细胞应答。
[0262]“细胞内信号传导结构域”或“细胞内结构域”是指蛋白质的一部分，所述部分转导效应子功能信号并引导细胞执行专门功能。尽管通常可采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个结构域。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短部分代替整个结构域，只要其转导效应子功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域意指包含细胞内信号传导结构域的必需或足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
[0263]
众所周知，仅由tcr产生的信号不足以完全活化t细胞并且还需要二次或共刺激信号。因此，t细胞活化可以被认为是由两种不同类别的细胞内信号传导结构域介导：通过tcr(例如tcr/cd3复合物)起始抗原依赖性初级活化的初级信号传导结构域，以及以不依赖抗原的方式起作用以提供二次或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。
[0264]
如本文所使用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或fc受体之外的细胞表面分子，所述细胞表面分子提供在与抗原结合后使t淋巴细胞有效活化和起作用所需的第二信号。可以从其中分离共刺激结构域的这种共刺激分子的说明性实例包括但不限于：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、lck、t细胞受体相关的跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnf受体超家族成员14(tnfrs14；hvem)、tnf受体超家族成员18(tnfrs18；gitr)、tnf受体超家族成员25(tnfrs25；dr3)和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
[0265]
如本文所使用，术语“癌症”通常涉及异常细胞在没有控制的情况下分裂并且可能侵入附近组织的一类疾病或病状。
[0266]
如本文所使用，术语“恶性”是指一组肿瘤细胞显示出不受控制的生长(即，超出正常限度的分裂)、侵入(即，侵入和破坏相邻组织)和转移(即，经由淋巴或血液扩散到体内的其他位置)中的一种或多种的癌症。如本文所使用，术语“转移”是指癌症从身体的一个部位扩散到另一个部位。由已经扩散的细胞形成的肿瘤被称为“转移性肿瘤”或“转移”。转移性肿瘤含有与原始(原发性)肿瘤中的细胞相似的细胞。
[0267]
如本文所使用，术语“良性”或“非恶性”是指可以长得更大但不扩散到身体的其他部位的肿瘤。良性肿瘤是自限性的并且通常不会侵入或转移。
[0268]“癌细胞”是指癌性生长或组织的单个细胞。癌细胞包含实体癌和液体癌。“肿瘤”或“肿瘤细胞”通常是指由细胞的异常生长形成的肿胀或病变，所述肿胀或病变可以是良性
的、恶化前的(pre-malignant)或恶性的。大多数癌症形成肿瘤，但液体癌例如白血病不一定形成肿瘤。对于形成肿瘤的那些癌症，术语癌症(细胞)和肿瘤(细胞)可互换使用。个体中肿瘤的量是可以测量为肿瘤的数目、体积或重量的“肿瘤负荷”。
[0269]
术语“复发”是指经过一段时间的改善或缓解后诊断出癌症重现或重现体征和症状。
[0270]“缓解”也被称为“临床缓解”并且包含部分缓解和完全缓解两者。在部分缓解中，一些但并非所有癌症体征和症状已经消失。在完全缓解中，所有癌症体征和症状均已消失，尽管癌可能仍在体内。
[0271]“难治”是指癌症对用特定治疗剂进行的疗法具有抗性或无应答。癌症可以在治疗开始时是难治的(即，对初始暴露于治疗剂无应答)，或者由于在第一治疗期内或在随后的治疗期期间对治疗剂产生抗性而是难治的。
[0272]“抗原阴性”是指不表达抗原或表达可忽略量的不可检测的抗原的细胞。在一个实施方案中，抗原阴性细胞不结合被引导到抗原的受体。在一个实施方案中，抗原阴性细胞基本上不结合被引导到抗原的受体。
[0273]
如本文所使用，术语“个体”和“受试者”经常可互换使用并且是指展现出可以用本文中其它地方所涵盖的组合物和方法治疗的癌症或其它免疫病症的症状的任何动物。适合的受试者(例如，患者)包含实验用动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(如猫或狗)。包含非人灵长类和优选地人类患者。典型的受试者包含患有、已经被诊断为患有或有风险患有癌症或另一种免疫病状的人类患者。
[0274]
如本文所使用，术语“患者”是指已经被诊断为患有可以用本文中的其他地方所公开的组合物和方法治疗的癌症或另一种免疫病症的受试者。
[0275]
如本文所使用，“治疗(treatment或treating)”包含对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益的或期望的效果并且甚至可以包含正在治疗的疾病或病症的一个或多个可测量标志物的最低限度的减少。任选地，治疗可以涉及疾病或病状减少或者疾病或病状的进展延迟，例如延迟肿瘤生长。“治疗”不一定指示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。
[0276]
如本文所使用，“预防(prevent)”和诸如“预防(prevented/preventing)”等类似词语指示用于预防、抑制或减少疾病或病症发生或复发的可能性。预防还是指延迟疾病或病症的发作或复发或者延迟疾病或病症的症状的发生或复发。如本文所使用，“预防(prevention)”和类似词语还包括在疾病或病症发作或复发之前减少疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。
[0277]
如本文所使用，短语“减轻
……
的至少一种症状”是指减少正在治疗的受试者的疾病或病症的一种或多种症状。在特定实施方案中，被治疗的疾病或病状是癌症，其中所减轻的所述一种或多种症状包括但不限于虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部肿胀或疼痛(由于腹部器官肿大)、骨骼或关节疼痛、骨折、意外体重减轻、食欲不振、盗汗、持续性轻度发烧以及排尿减少(由于肾功能受损)。
[0278]“增强”或“促进”或者“增加”或“扩增”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文所涵盖的组合物能够产生、引发或引起更大的生理应答(即，下游效应)。可测量的生理应答可以包含t细胞扩增、活化、持续、细胞因子分泌的增加和/或癌细胞
杀伤能力的增加以及从本领域的理解和本文中的描述中显而易见的其它方面。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量并且可以包含是由媒介物或对照组合物产生的应答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含其间且在1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。
[0279]“减小”或“减弱”或“变少”或“减少”或“减轻”通常是指与由媒介物或对照分子/组合物引起的应答相比，本文所涵盖的组合物能够产生、引发或引起更少的应答(即，生理应答)。“减小的”或“减少的”量通常是“统计上显著”的量并且可以包含是由媒介物、对照组合物或特定细胞谱系中的应答产生的应答(参考应答)的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含其间且在1以上的所有整数和小数点，如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减小。
[0280]“维持(maintain或maintenance)”或“保持”或“无变化”或“无实质变化”或“无实质减小”通常是指与由媒介物、对照分子/组合物或特定细胞谱系中的应答引起的应答相比，本文所涵盖的组合物能够在细胞中产生、引发或引起基本上类似的或相当的生理应答(即，下游效应)。相当的反应是与参考反应并无显著不同或可测量不同的反应。
[0281]
在本公开通篇阐述了另外的定义。
[0282]
c.募集和活化t细胞受体复合物的daric
[0283]
在特定实施方案中，涵盖了一种或多种将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至表达靶抗原的癌细胞并且募集和活化tcr复合物的daric受体。如本文所用，术语“daric受体”是指一种或多种非天然存在的多肽，其在暴露于靶抗原和多聚化剂或桥接因子后促进免疫效应细胞中的免疫刺激信号的转导，例如，通过活化tcr复合物来刺激免疫效应细胞活性和功能。在优选的实施方案中，daric是多链嵌合受体，其包含结合靶抗原的daric信号传导组分和结合tcr复合物的成员的daric结合组分。
[0284]
在一个实施方案中，从同一细胞表达daric信号传导组分和daric结合组分。在另一个实施方案中，从不同细胞表达daric信号传导组分和daric结合组分。在特定实施方案中，从细胞表达daric信号传导组分，并且外源供应daric结合组分作为多肽。在一个实施方案中，将预先装载有桥接因子的daric结合组分外源供应给表达daric信号传导组分的细胞。
[0285]
1.daric信号传导组分
[0286]“daric信号传导组分”或“daric信号传导多肽”是指包含结合靶抗原的结合结构域、一个或多个多聚化结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的多肽。在特定实施方案中，daric信号传导组分包含结合靶抗原的结合结构域、多聚化结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。在特定实施方案中，daric信号传导组分包含结合靶抗原的结合结构域、第一多聚化结构域、第一跨膜结构域、第一共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。
[0287]
在特定实施方案中，daric信号传导组分包含结合靶抗原的结合结构域。靶抗原是在靶细胞上表达的抗原，所述靶细胞包括例如癌细胞。
[0288]
在特定实施方案中，daric信号传导组分包含结合结构域，所述结合结构域包含针对一种或多种靶抗原的抗体或其抗原结合片段。
[0289]
针对一种或多种适用于本文所涵盖的特定实施方案的靶抗原的抗原结合片段包括选自由以下组成的组的那些：骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab，骆驼vhh，纳米抗体)。
[0290]
在特别优选的实施方案中，结合结构域包含scfv。
[0291]
在特别优选的实施方案中，结合结构域包含vhh抗体。
[0292]
在特定实施方案中涵盖的daric信号传导分量包含结合靶抗原的结合结构域，所述靶抗原选自由以下组成的组：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
[0293]
在特别优选的实施方案中，结合结构域结合选自由以下组成的组的靶抗原：bcma、b7-h3(cd276)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd79a、cd79b、cd123、cll-1、egfr、egfrviii、muc16和prame。
[0294]
在特定实施方案中，daric信号传导组分包括一个或多个多聚化结构域。
[0295]
适用于本文所涵盖的特定daric信号传导组分的多聚化结构域的说明性实例包括但不限于fk506结合蛋白(fkbp)多肽或其变体、fkbp-雷帕霉素结合(frb)多肽或其变体、钙调磷酸酶多肽或其变体、亲环蛋白多肽或其变体、细菌二氢叶酸还原酶(dhfr)多肽或其变体、pyr1样1(pyl1)多肽或其变体和脱落酸不敏感1(abi1)多肽或其变体。
[0296]
在特定实施方案中，daric信号传导组分包括frb多肽。在优选实施方案中，daric信号传导组分包括包含t2098l突变的frb多肽或其变体。
[0297]
在特别优选的实施方案中，daric信号传导组分包括包含t2098l突变的frb多肽或其变体。
[0298]
在某些优选的实施方案中，daric信号传导组分包括fkbp12多肽或其变体。
[0299]
在特别优选的实施方案中，daric信号传导组分包括包含f36v突变的fkbp12多肽。
[0300]
在特定实施方案中，daric信号传导组分包括跨膜结构域。
[0301]
适于在本文所涵盖的特定daric信号传导组分中使用的跨膜结构域的说明性实例包括但不限于t细胞受体的α链、β链、γ链或δ链的跨膜区、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd71、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd 154、无羊膜蛋白(amn)和程序性细胞死亡1(pdcd1)。在一个优选的实施方案中，daric信号传导组分包含cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。在优选实施方案中，daric信号传导组分包括cd4跨膜结构域。
[0302]
在特定实施方案中，daric信号传导组分包含连接其中的一个或多个结构域的接头。在一些实施方案中，接头多肽设置在结合结构域的c-末端和跨膜结构域的n-末端之间。在各种实施方案中，短的寡肽或多肽接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别适合的接头。
[0303]
在特定实施方案中，接头多肽设置在跨膜结构域的c-末端和细胞内信号传导结构域的n-末端之间。在各种优选实施方案中，优选地长度在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间的短寡肽接头或多肽接头连接跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别适合的接头。
[0304]
本文特定实施方案中所涵盖的daric信号传导组分包括一个或多个细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，daric信号传导组分包括一个或多个共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序(itam)。
[0305]
适于在本文所涵盖的特定daric信号传导组分中使用的含itam初级信号传导结构域的说明性实例包括但不限于源自fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在优选的实施方案中，daric信号传导组分包含一个或多个共刺激信号传导结构域和任选地cd3ζ初级信号传导结构域。初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域可以按任何顺序与跨膜结构域的羧基端串联连接。
[0306]
适用于本文所涵盖的特定daric信号传导组分的共刺激结构域的说明性实例包括但不限于分离自以下共刺激分子的那些结构域：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、胱天蛋白酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、fyn、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、lck、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnfrs14、tnfrs18、tnrfs25和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
[0307]
在特定实施方案中，本文所涵盖的daric信号传导组分包含信号肽，例如分泌信号肽，并且不包含跨膜结构域。适于在特定daric信号传导组分中使用的信号肽的说明性实例包括但不限于igg1重链信号多肽、igκ轻链信号多肽、cd8α信号多肽或人gm-csf受体α信号多肽。在各种优选的实施方案中，daric信号传导组分包含igκ轻链信号多肽。
[0308]
在特定实施方案中，daric信号传导组分包含一个或多个选自由cd28、cd137、cd134、fyn、lck和zap70组成的组的共刺激信号传导结构域。在特定实施方案中，daric信号传导组分包含一个或多个选自由fyn、lck和zap70组成的组的共刺激信号传导结构域。在特
定实施方案中，daric信号传导组分包含一个或多个选自由fyn、lck和zap70组成的组的共刺激信号传导结构域以及cd3ζ初级信号传导结构域。
[0309]
在一个优选的实施方案中，daric信号传导组分包含结合结构域(所述结合结构域包括结合靶抗原的vhh或scfv)、fkbp12多聚化结构域、cd4跨膜结构域、任选地lck共刺激结构域和任选地cd3ζ初级信号传导结构域。
[0310]
2.daric结合组分
[0311]
在特定实施方案中，“daric结合组分”或“daric结合多肽”是指包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的结合结构域、一个或多个多聚化结构域、跨膜结构域和任选地共刺激结构域的多肽。在特定实施方案中，“daric结合组分”或“daric结合多肽”是指包含多聚化结构域多肽或其变体、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽；和任选地共刺激结构域的多肽。
[0312]
适用于特定daric结合组分的结合结构域的说明性实例包括但不限于结合至cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽的一个或多个表位的抗体或其抗原结合片段，包括例如结合cd3ε的okt3抗体。
[0313]
其他cd3抗体的说明性实例包括但不限于g19-4、bc3和64.1。
[0314]
适用于特定daric结合组分的抗体及其抗原结合片段的说明性实例包括但不限于骆驼ig、美洲驼ig、羊驼ig、ig nar、fab'片段、f(ab')2片段、双特异性fab二聚体(fab2)、三特异性fab三聚体(fab3)、fv、单链fv蛋白(“scfv”)、双scfv、(scfv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)和单结构域抗体(sdab、骆驼vhh、纳米抗体)。
[0315]
在特定实施方案中，适用于特定daric结合组分的抗体及其抗原结合片段包括但不限于鼠抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在特定实施方案中，抗体或其抗原结合片段源自单克隆抗体。
[0316]
在特定实施方案中，结合结构域包含一种或多种人源化骆驼vhh抗体，其结合至cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽的一个或多个表位。
[0317]
在特别优选的实施方案中，结合结构域是结合至cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽的一个或多个表位的人源化或人scfv。
[0318]
在特定实施方案中，daric结合组分包括一个或多个多聚化结构域。
[0319]
适用于本文所涵盖的特定daric结合组分的多聚化结构域的说明性实例包括但不限于fkbp多肽或其变体、frb多肽或其变体、钙调磷酸酶多肽或其变体、亲环蛋白多肽或其变体、dhfr多肽或其变体、pyl1多肽或其变体和abi1多肽或其变体。
[0320]
在特定实施方案中，daric结合组分包括frb多肽或其变体，并且daric信号传导组分包括fkbp多肽或其变体。在优选实施方案中，daric结合组分包括包含t2098l突变的frb多肽或其变体，并且daric信号传导组分包括fkbp12多肽或其变体。
[0321]
在特定实施方案中，daric结合组分包括fkbp多肽或其变体，并且daric信号传导组分包括frb多肽或其变体。在优选实施方案中，daric结合组分包括fkbp12多肽或其变体，并且daric信号传导组分包括包含t2098l突变的frb多肽或其变体。
[0322]
在特定实施方案中，daric结合组分包括跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域可以与daric信号传导组分中使用的跨膜结构域相同。在一个实施方案中，跨膜结构域可以不同于daric信号传导组分中使用的跨膜结构域。
[0323]
适于在本文所涵盖的特定daric结合组分中使用的跨膜结构域的说明性实例包括
但不限于t细胞受体的α链、β链、γ链或δ链的一个或多个跨膜区、cd3ε、cd3ζ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd 16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd71、cd80、cd86、cd 134、cd137、cd152、cd 154、无羊膜蛋白(amn)和程序性细胞死亡1(pdcd1)。在一个优选的实施方案中，daric结合组分包含cd8α跨膜结构域或cd4跨膜结构域。在一个优选的实施方案中，daric结合组分包含cd8α跨膜结构域。
[0324]
在各种优选的实施方案中，短的寡肽或多肽接头，优选地长度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸之间，连接daric结合组分中的一个或多个结构域。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别适合的接头。
[0325]
本文特定实施方案中所涵盖的daric结合组分不包含一个或多个细胞内信号传导结构域。
[0326]
在其它特定实施方案中，本文所涵盖的daric结合组分包括一个或多个细胞内信号传导结构域。在优选实施方案中，其中daric结合组分包括一个或多个细胞内信号传导结构域，那些结构域不同于同源daric信号传导组分中存在的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，daric结合组分包括共刺激信号传导结构域。
[0327]
适用于本文所涵盖的特定daric信号传导组分的共刺激结构域的说明性实例包括但不限于分离自以下共刺激分子的那些结构域：toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、半胱天冬酶募集结构域家族成员11(card11)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd94、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dnax-活化蛋白10(dap10)、用于活化t细胞家族成员1的接头(lat)、含sh2结构域的76kd白细胞蛋白(slp76)、t细胞受体相关的跨膜衔接子1(trat1)、tnfr2、tnf受体超家族成员14(tnfrs14；hvem)、tnf受体超家族成员18(tnfrs18；gitr)、tnf受体超家族成员25(tnfrs25；dr3)和t细胞受体相关的蛋白激酶70的ζ链(zap70)。
[0328]
在特定实施方案中，本文所涵盖的daric结合组分包括信号肽，例如分泌信号肽，并且不包含跨膜结构域。适于在特定daric结合组分中使用的信号肽的说明性实例包括但不限于igg1重链信号多肽、igκ轻链信号多肽、cd8α信号多肽或人gm-csf受体α信号多肽。在各种优选实施方案中，daric结合组分包括cd8α信号多肽。
[0329]
在特定实施方案中，daric结合组分包含结合至cd3ε、cd3δ或cd3γ的scfv或vhh、frb t2098l多聚化结构域和cd8α跨膜结构域和任选地共刺激结构域。
[0330]
在特定实施方案中，daric结合组分包含结合至cd3ε的scfv或vhh、frb t2098l多聚化结构域和cd8α跨膜结构域和任选地共刺激结构域。
[0331]
在特定实施方案中，daric结合组分包含结合至cd3δ的scfv或vhh、frb t2098l多聚化结构域和cd8α跨膜结构域和任选地共刺激结构域。
[0332]
在特定实施方案中，daric结合组分包含结合至cd3γ的scfv或vhh、frb t2098l多聚化结构域和cd8α跨膜结构域和任选地共刺激结构域。
[0333]
在特定实施方案中，daric结合组分包含frb t2098l多聚化结构域、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽。
[0334]
在特定实施方案中，daric结合组分包含frb t2098l多聚化结构域、接头多肽和cd3ε多肽。
[0335]
在特定实施方案中，daric结合组分包含frb t2098l多聚化结构域、接头多肽和
cd3δ多肽。
[0336]
在特定实施方案中，daric结合组分包含frb t2098l多聚化结构域、接头多肽和cd3γ多肽。
[0337]
3.桥接因子
[0338]
本文的特定实施方案中所涵盖的桥接因子介导或促进一种或多种daric信号传导组分与一种或多种daric结合组分通过各自组分中的多聚化结构域的缔合。桥接因子与多聚化结构域缔合并置于所述多聚化结构域之间，以促进daric信号传导组分与daric结合组分的缔合。在存在桥接因子的情况下，当daric结合多肽与靶细胞上的靶抗原结合时，daric结合组分和daric信号传导组分与tcr受体复合物相关并且引发针对靶细胞的免疫效应细胞活性。在不存在桥接因子的情况下，daric结合组分不与daric信号传导组分相关，不募集tcr复合物并且daric是无活性的。
[0339]
在特定实施方案中，daric信号传导组分和daric结合组分包括选自由以下组成的组的多聚化结构域的同源对：fkbp和fkbp12-雷帕霉素结合(frb)、fkbp和钙调磷酸酶、fkbp和亲环蛋白、fkbp和细菌二氢叶酸还原酶(dhfr)、钙调磷酸酶和亲环蛋白、和pyr1-样1(pyl1)和脱落酸不敏感1(abi1)。
[0340]
在某些实施方案中，daric信号传导和结合组分的多聚化结构域与选自由以下组成的组的桥接因子缔合：雷帕霉素或雷帕霉素类似物、库马霉素或其衍生物、赤霉素或其衍生物、脱落酸(aba)或其衍生物、甲氨蝶呤或其衍生物、环孢菌素a或其衍生物、fk506/环孢菌素a(fkcsa)或其衍生物、甲氧苄啶(tmp)-fk506结合蛋白(fkbp)合成配体(slf)或其衍生物。
[0341]
在特定实施方案中，daric信号传导组分和daric结合组分包括一个或多个frb和/或fkbp多聚化结构域或其变体。在某些实施方案中，daric信号传导组分包含fkbp12多聚化结构域或其变体，并且daric结合组分包含frb多聚化结构域或其变体。在特别优选的实施方案中，daric信号传导组分包含fkbp12或fkbp12 f36v多聚化结构域或其变体，并且daric结合组分包含frb t2098l多聚化结构域或其变体。
[0342]
适于在本文所涵盖的特定实施方案中使用的桥接因子的说明性实例包括但不限于ap1903、ap20187、ap21967(也称为c-16-(s)-7-甲基吲哚雷帕霉素)、依维莫司、诺氟莫司、吡美莫司、地磷莫司、他克莫司、替西罗莫司、乌米莫司和佐他莫司。在特定的优选实施方案中，桥接因子是ap21967。在某些优选的实施方案中，桥接因子是非免疫抑制剂量的西罗莫司(雷帕霉素)。
[0343]
d.工程改造的抗原受体
[0344]
在特定实施方案中，细胞被工程化或修饰以表达结合靶抗原并且募集tcr复合物和工程化抗原受体的daric。在特定实施方案中，核酸或载体编码融合多肽，所述融合多肽包含工程化受体和daric结合组分和/或daric信号传导组分，以及散布在受体和组分之间的一个或多个多肽裂解信号。在其它特定实施方案中，编码daric的多核苷酸或载体被引入包括工程改造的抗原受体的免疫效应细胞中。不希望受任何特定理论的束缚，预期在特定实施方案中，本领域已知的任何机制均可用于在相同的免疫效应细胞或细胞群中引入和共表达工程化抗原受体和daric，以实现免疫效应细胞反应的效率、效力和持久性。在特定实施方案中，工程化抗原受体的胞内信号传导结构域(例如，共刺激结构域)和daric信号传导
结构域和/或daric结合将彼此不同。
[0345]
在特定实施方案中，本文所涵盖的免疫效应细胞包括工程改造的抗原受体和daric的一种或多种组分。在特定实施方案中，工程改造的抗原受体是对t细胞进行工程改造受体(tcr)、嵌合抗原受体(car)或ζ因子。
[0346]
在特定实施方案中，本文所涵盖的免疫效应细胞包含工程化tcr和daric。在特别优选的实施方案中，本文所涵盖的免疫效应细胞包含由daric受体募集的工程化tcr。不希望受限于任何特定理论，在特定实施方案中设想的daric结合组分包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的结合结构域，因此，在存在桥接因子的情况下，daric受体通过结合cd3ε、cd3δ或cd3γ募集tcr复合物。不希望受限于任何特定理论，在特定实施方案中设想的daric结合组分包含通过接头多肽与cd3ε、cd3δ或cd3γ融合的多聚化结构域，因此，在存在桥接因子的情况下，daric信号传导组分通过结合至包含多聚化结构域的cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽募集tcr复合物。
[0347]
在一个实施方案中，通过引入对通过一个或多个多肽裂解信号分开的工程改造的tcr和daric的一种或多种组分进行编码的多核苷酸或载体来对t细胞进行工程改造。在一个实施方案中，通过引入对工程改造的tcr进行编码的多核苷酸或载体和对daric的一种或多种组分进行编码的多核苷酸或载体来对t细胞进行工程改造。在一个实施方案中，通过引入编码daric的一种或多种组分的多核苷酸或载体来进一步工程改造t细胞以表达工程化tcr。
[0348]
天然存在的t细胞受体包含两个亚基，即α链和β链亚基(αβtcr)，或γ链和δ链亚基(γδtcr)，其中每一个是通过每个t细胞基因组中的重组事件产生的独特蛋白质。可以关于其针对特定靶抗原的选择性筛选tcr文库。通过这种方式，可以选出对靶抗原具有高亲合力和反应性的天然tcr，克隆且随后引入t细胞群中用于过继性免疫疗法。在一个实施方案中，tcr是αβtcr。在一个实施方案中，tcr是γδtcr。
[0349]
在一个实施方案中，通过引入具有形成tcr的能力的tcr亚基来修饰t细胞，所述tcr赋予t细胞对表达靶抗原的肿瘤细胞的特异性。在特定实施方案中，相较于天然存在的亚基，所述亚基具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或修饰，只要所述亚基能够形成tcr并且使经过转染的t细胞能够将靶细胞归巢并参与免疫相关细胞因子信号传导。工程改造的tcr优选地还以高亲合力结合展示相关肿瘤相关肽的靶细胞，并且任选地介导对在体内呈现相关肽的靶细胞的高效杀灭作用。
[0350]
编码工程改造的tcr的核酸优选地是自其在t细胞的(天然存在的)染色体中的天然环境分离，并且可以被并入适合载体(如本文别处所描述)中。在特定实施方案中，所述核酸和包含所述核酸的载体都可以被转移至细胞，优选地t细胞中。接着，经过修饰的t细胞能够表达由一个或多个转导的核酸所编码的tcr的一条或多条链。在优选实施方案中，由于工程改造的tcr被引入通常不表达特定tcr的t细胞中，故所述工程改造的tcr是外源tcr。在特定实施方案中，工程改造的tcr的基本方面是其对主要组织相容性复合物(mhc)或类似免疫组分呈递的肿瘤抗原具有高亲合力。与工程改造的tcr相比之下，car被工程改造成以不依赖于mhc的方式结合靶抗原。
[0351]
tcr可以和与tcr的α链或β链或tcr的γ链或δ链的氨基末端部分或羧基末端部分连接的另外的多肽一起表达，只要连接的另外的多肽不干扰α链或β链形成功能性t细胞受
体以及mhc依赖性抗原识别的能力即可。
[0352]
特定实施方案中所涵盖的工程改造的tcr所识别的抗原包括但不限于癌症抗原，包括在血液癌和实体肿瘤上的抗原。示例性抗原包括但不限于：α叶酸受体(frα)、αvβ6整联蛋白、b细胞成熟抗原(bcma)、b7-h3(cd276)、b7-h6、碳酸酐酶ix(caix)、cd16、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd70、cd79a、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、癌胚抗原(cea)、c型凝集素样分子-1(cll-1)、cd2亚群1(cs-1)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(cspg4)、皮肤t细胞淋巴瘤相关抗原1(ctage1)、表皮生长因子受体(egfr)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、上皮糖蛋白2(egp2)、上皮糖蛋白40(egp40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、肝配蛋白a型受体2(epha2)、成纤维细胞激活蛋白(fap)、fc受体样5(fcrl5)、胎乙酰胆碱酯酶受体(achr)、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)、包括erbb2的egfr家族(her2)、il-10rα、il-13rα2、kappa、癌/睾丸抗原2(lage-1a)、lambda、lewis-y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、黑素瘤抗原基因(mage)-a1、mage-a3、mage-a4、mage-a6、magea10、t细胞识别的黑素瘤抗原1(melana或mart1)、间皮素(msln)、muc1、muc16、mhc i类链相关蛋白a(mica)、mhc i类链相关蛋白b(micb)、神经细胞粘附分子(ncam)、癌/睾丸抗原1(ny-eso-1)、多唾液酸；胎盘特异性1(plac1)、黑素瘤中优先表达的抗原(prame)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、滑膜肉瘤、x断裂点2(ssx2)、存活蛋白、肿瘤相关糖蛋白72(tag72)、肿瘤内皮标记1(tem1/cd248)、肿瘤内皮标记7相关(tem7r)、滋养层糖蛋白(tpbg)、ul16-结合蛋白(ulbp)1、ulbp2、ulbp3、ulbp4、ulbp5、ulbp6、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)和wilms肿瘤1(wt-1)。
[0353]
在特定实施方案中，本文所涵盖的免疫效应细胞包含car和daric。嵌合抗原受体(car)是将抗体针对靶抗原(例如肿瘤抗原)的特异性与t细胞受体活化细胞内结构域相组合以产生展现特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所使用，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或dna部分构成。
[0354]
在各种实施方案中，本文所涵盖的免疫效应细胞包含一条或多条ζ因子受体链和daric。ζ因子是嵌合跨膜免疫受体，其包含细胞外结构域、跨膜区和细胞内信号传导结构域，所述细胞外结构域包含可溶性受体配体连接至能够将细胞外结构域系栓至细胞表面的载体区域。ζ因子当在t淋巴细胞的表面上表达时，将t细胞活性引导至表达可溶性受体配体特异性针对的受体的细胞。ζ因子嵌合免疫受体重新引导t细胞的抗原特异性，并且用于治疗多种癌症，特别是通过人恶性疾病利用的自分泌/旁分泌细胞因子系统进行治疗。
[0355]
e.多肽
[0356]
本文设想了多种多肽，包括但不限于daric、daric结合组分、daric信号传导组分、工程化tcr、car、ζ因子、包含上述多肽及其片段的融合蛋白。在优选实施方案中，多肽包含seq id no:1-5中所示多肽的多核苷酸。除非作相反说明，否则“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义，即，定义为氨基酸序列。在一个实施方案中，“多肽”包括融合多肽和其它变体。多肽可使用多种众所周知的重组和/或合成技术中的任一种制备。多肽不限于特定长度，例如其可以包含全长蛋白质序列、全长蛋白质的片段、或融合蛋白，并且可以包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。在特定的优选实施方案中，从一种或多种人多肽制备、获得或
分离融合多肽、多肽、其片段和其它变体。
[0357]
如本文所使用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境中以及从与细胞的其它组分的缔合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，即所述肽或多肽分子未与体内物质显著缔合。在特定实施方案中，分离的多肽是合成多肽、半合成多肽或从重组来源获得或衍生的多肽。
[0358]
多肽包括“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。这种变体可以是天然存在的或可以通过合成生成，例如通过修饰上述多肽序列中的一个或多个。例如，在特定实施方案中，可以期望通过将一个或多个取代、缺失、添加和/或插入引入到多肽中来改进多肽的结合亲和力和/或其它生物性质。在特定实施方案中，多肽包含与本文所涵盖的参考序列中的任何一个有至少约65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％氨基酸一致性的多肽，通常其中变体维持参考序列的至少一种生物活性。在特定实施方案中，生物活性是结合亲和力。在特定实施方案中，生物活性是酶活性。
[0359]
在某些实施方案中，募集tcr复合物的daric包含多肽复合物，所述多肽复合物包含(i)第一多肽，例如，第一融合多肽，它具有第一多聚化结构域，和(ii)第二多肽，例如，第二融合多肽，它具有第二多聚化结构域。在特定实施方案中，多聚化结构域是相同的；在某些实施方案中，第一多聚化结构域不同于第二多聚化结构域。第一多聚化结构域和第二多聚化结构域在桥接因子存在的情况下基本上有助于或高效地促进多肽复合物的形成。在不存在第一多聚化结构域、第二多聚化结构域或桥接因子的情况下，如果第一融合多肽与第二融合多肽之间的缔合在统计上显著降低，则第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的一种或多种相互作用基本上有助于或高效地促进第一融合多肽和第二融合多肽的多聚化。在某些实施方案中，在存在桥接因子的情况下，当第一融合多肽和第二融合多肽共表达时，至少约60％，例如，至少约60％到约70％、至少约70％到约80％、至少约80％到约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％以及至少约90％到约92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的第一单链多肽和第二单链多肽彼此形成多聚体。
[0360]
多肽变体包含生物活性“多肽片段”。生物活性多肽片段的说明性实例包括结合结构域、细胞内信号传导结构域等。如本文所使用，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”是指保留至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％、或至少5％的天然存在的多肽活性的多肽片段。在某些实施方案中，多肽片段可包含至少5个至约1700个氨基酸长的氨基酸链。应了解，在某些实施方案中，片段是至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700个或更多个氨基酸长。
[0361]
在特定实施方案中，本文所述的多肽可包含一个或多个表示为“x”的氨基酸。“x”如果存在于氨基酸seq id no中，则指任何一个或多个氨基酸。在特定实施方案中，表示融
合蛋白的seq id no包括累积地代表任何氨基酸序列的连续x残基的序列。
[0362]
如上文所述，多肽可以通过不同方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法是本领域中一般已知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过dna中的突变制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域中众所周知的。参见，例如kunkel(1985,proc.natl.acad.sci.usa.82:488-492),kunkel等人,(1987,methods in enzymol,154:367-382)，美国专利第4,873,192号，watson,j.d.等人(molecular biology of the gene,fourth edition,benjamin/cummings,menlo park,calif.,1987)和其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可见于dayhoff等人,(1978)atlas of protein sequence and structure(natl.biomed.res.found.,washington,d.c.)的模型中。
[0363]
在某些实施方案中，多肽变体包括一个或多个保守取代。“保守性取代”是氨基酸被具有类似特性的另一个氨基酸取代，使得肽化学领域的技术人员能预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变的取代。修饰可以针对特定实施方案中所涵盖的多核苷酸和多肽的结构进行并且仍然获得了对具有期望特性的变体或衍生多肽进行编码的功能分子。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生等效或甚至改良的变体多肽时，本领域技术人员例如可以改变编码dna序列的一个或多个密码子，例如根据表1。
[0364]
表1-氨基酸密码子
[0365][0366]
可以使用本领域中公知的计算机程序如dnastar、dna strider、geneious、mac vector或vector nti软件找到关于确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指南。优选地，本文所公开的蛋白质变体的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即带类似电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守性氨基酸变化涉及侧链相关的一组氨基酸中的一个的取代。天然存在的氨基酸一般被分成四组：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，适合的氨基酸保守性取代是本领域技术人员已知的且一般可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域技术人员应认识到，一般说来，多肽非必需区中的单一氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见例如watson等人molecular biology of the gene,第4版,1987,the benjamin/cummings pub.co.,p.224)。
[0367]
在一个实施方案中，在期望表达两个或更多个多肽的情况下，如本文别处所公开的，对所述两个或多个多肽进行编码的多核苷酸序列可以通过ires序列分开。
[0368]
特定实施方案中所涵盖的多肽包括融合多肽。在特定实施方案中，提供了融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白是指具有至少二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多肽区段的多肽。在优选实施方案中，融合多肽包含一种或多种daric组分。在其他优选的实施方案中，融合多肽包含daric结合组分和daric信号传导组分。
[0369]
在特定实施方案中，两种或更多种daric组分和/或其他多肽可以表达为融合蛋白，所述融合蛋白包含本文其他地方公开的多肽之间的一条或多条自裂解肽序列。
[0370]
在特定实施方案中，融合多肽包含daric结合组分和一种或多种daric信号传导组分。
[0371]
融合多肽可以包括：一个或多个多肽结构域或片段，包括但不限于信号肽、细胞渗透性肽结构域(cpp)、结合结构域、信号传导结构域、表位标签(例如，麦芽糖结合蛋白(“mbp”)、谷胱甘肽s转移酶(gst)、his6、myc、flag、v5、vsv-g和ha)；多肽接头；以及多肽裂解信号。融合多肽典型地是c末端连接至n末端，不过它们还可以是c末端连接至c末端、n末端连接至n末端、或n末端连接至c末端。在特定实施方案中，融合蛋白的多肽可以遵循任何次序。融合多肽或融合蛋白还可以包括保守性修饰的变体、多态性变体、等位基因、突变体、子序列和种间同系物，只要保存融合多肽所希望的活性即可。融合多肽可以通过化学合成方法或通过二个部分之间的化学键联制造，或一般可以使用其它标准技术制备。构成融合多肽的连接的dna序列可操作地连接至如本文别处所公开的适合转录或翻译控制元件。
[0372]
融合多肽可以任选地包括可以用于连接多肽内的一个或多个多肽或结构域的一个或多个接头。肽接头序列可以用于将任何两种或更多种多肽组分隔开一定距离，该距离足以确保每一多肽折叠成其适当二级结构和三级结构，从而允许多肽结构域发挥其所希望的功能。此类肽接头序列是使用本领域中的标准技术并入融合多肽中。适合肽接头序列可以基于以下因素选择：(1)其能够呈现柔性延长构象；(2)其无法呈现能与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；以及(3)缺乏可能与多肽功能性表位反应的疏水性或带电残基。在特定实施方案中，优选的肽接头序列含有gly、asn和ser残基。其它接近中性的氨基酸，如thr和ala，也可以用于接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括maratea等人,gene 40:39-46,1985；murphy等人,proc.natl.acad.sci.美国83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号。当特定融合多肽区段含有可用于隔开功能性结构域并防止空间干扰的非必需n末端氨基酸区域时，不需要接头序列。在特定实施方案中，优选的接头通常是被合成为重组融合蛋白的一部分的柔性氨基酸子序列。接头多肽可以是在1个与200个氨基酸之间的长度、在1个与100个氨基酸之间的长度或在1个与50个氨基酸之间的长度，包括其间的所有整数值。
[0373]
示例性多肽裂解信号包括多肽裂解识别位点，如蛋白酶裂解位点、核酸酶裂解位点(例如罕见限制酶识别位点、自裂解核酶识别位点)和自裂解病毒寡肽(参见defelipe and ryan,2004.traffic,5(8)；616-26)。
[0374]
合适的蛋白酶切割位点和自切割肽是技术人员已知的(参见，例如ryan等人,1997.j.gener.virol.78,699-722；scymczak等人.(2004)nature biotech.5,589-594)。示
例性蛋白酶裂解位点包括但不限于马铃薯y病毒(potyvirus)nia蛋白酶(例如烟草蚀刻病毒蛋白酶)、马铃薯y病毒hc蛋白酶、马铃薯y病毒p1(p35)蛋白酶、大麦花叶病毒(byovirus)nia蛋白酶、大麦花叶病毒rna-2编码的蛋白酶、口疮病毒(aphthovirus)l蛋白酶、肠病毒2a蛋白酶、鼻病毒2a蛋白酶、细小核糖核酸3c蛋白酶、豇豆花叶病毒(comovirus)24k蛋白酶、线虫传多面体病毒(nepovirus)24k蛋白酶、水稻东格鲁球状病毒(rice tungro spherical virus，rtsv)3c样蛋白酶、欧防风黄点病毒(parsnip yellow fleck virus，pyvf)3c样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子xa以及肠激酶的裂解位点。在一个实施方案中，tev(烟草蚀刻病毒)蛋白酶裂解位点因其较高的裂解严格度而成为优选的，例如exxyxq(g/s)(seq id no:17)，例如enlyfqg(seq id no:18)和enlyfqs(seq id no:19)，其中x表示任何氨基酸(tev裂解发生于q与g或q与s之间)。
[0375]
在特定实施方案中，多肽裂解信号是病毒自裂解肽或核糖体跳跃序列。
[0376]
核糖体跳跃序列的说明性实例包括但不限于：2a或2a样位点、序列或结构域(donnelly等人，2001.j.gen.virol.82:1027-1041)。在特定实施方案中，病毒2a肽是口疮病毒2a肽、马铃薯y病毒2a肽或心病毒2a肽。
[0377]
在一个实施方案中，病毒2a肽选自由以下组成的组：口蹄疫病毒(fmdv)2a肽、马鼻炎a病毒(erav)2a肽、明脉扁刺蛾β四体(tav)2a肽、猪捷申病毒-1(ptv-1)2a肽、泰勒病毒(theilovirus)2a肽以及脑心肌炎病毒2a肽。
[0378]
2a位点的示例性实例提供于表2中。
[0379]
表2：
[0380]
[0381][0382]
在优选实施方案中，多肽或融合多肽包含一种或多种daric组分或daric。在优选的实施方案中，融合多肽包含一种或多种daric组分或被一种或多种自裂解多肽隔开的daric。
[0383]
在特定实施方案中，融合多肽包含daric结合组分和daric信号传导组分，所述daric结合组分包含结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的结合结构域、frb t2098l多聚化结构域、cd8α跨膜结构域和任选地共刺激结构域；病毒自裂解2a多肽；所述daric信号传导组分包含结合至靶抗原的抗体或其抗原结合片段、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域和任选地共刺激结构域。
[0384]
在特定实施方案中，融合多肽包含daric结合组分和daric信号传导组分，所述daric结合组分包含frb t2098l多聚化结构域、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽；病毒自裂解2a多肽；所述daric信号传导组分包含结合至靶抗原的抗体或其抗原结合片段、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域和任选地共刺激结构域。
[0385]
在特定实施方案中，融合多肽包含daric结合组分和daric信号传导组分，所述daric结合组分包含cd8α信号序列、结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的结合结构域、frb t2098l多聚化结构域、cd8α跨膜结构域；病毒自裂解2a多肽；所述daric信号传导组分包含ig kappa轻链信号序列、结合至靶抗原的抗体或其抗原结合片段、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域和任选地共刺激结构域，所述共刺激结构域选自由以下组成的组：fyn、lck、zap70、ox40和tnfr2。
[0386]
在特定实施方案中，融合多肽包含daric结合组分和daric信号传导组分，所述daric结合组分包含cd8α信号序列、frb t2098l多聚化结构域、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ多肽；病毒自裂解2a多肽；所述daric信号传导组分包含ig kappa轻链信号序列、结合至靶抗原的抗体或其抗原结合片段、fkbp12多聚化结构域多肽、cd4跨膜结构域和任选地共刺
激结构域，所述共刺激结构域选自由以下组成的组：fyn、lck、zap70、ox40和tnfr2。
[0387]
f.多核苷酸
[0388]
在特定实施方案中，提供了编码daric、一种或多种daric组分、工程化tcr、car、ζ因子、包含上述多肽及其片段的融合蛋白的多核苷酸。如本文所使用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)和dna/rna杂交体。多核苷酸可以是单链或双链的并且是重组、合成或分离的。多核苷酸包括但不限于：前信使rna(pre-mrna)、信使rna(mrna)、rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、核酶、基因组rna(grna)、正链rna(rna( ))负链rna(rna(-))、tracrrna、crrna、单向导rna(sgrna)、合成rna、合成mrna、基因组dna(gdna)、pcr扩增的dna、互补dna(cdna)、合成dna或重组dna。多核苷酸是指至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸长度，以及所有中间长度的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。容易理解的是，在此情形中，“中间长度”意指在引述值之间的任何长度，如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在特定实施方案中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％,76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0389]
如本文所使用，“分离的多核苷酸”是指已经从其两侧的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如，已经从通常与其相邻的序列移除的dna片段。在特定实施方案中，“分离的多核苷酸”还指互补dna(cdna)、重组dna或自然中不存在且已经通过人手制造的其他多核苷酸。在特定实施方案中，分离的多核苷酸是合成多核苷酸、半合成多核苷酸或从重组来源获得或衍生的多核苷酸。
[0390]
在各种实施方案中，多核苷酸包括编码本文所涵盖的多肽的mrna。在某些实施方案中，所述mrna包含帽、一个或多个核苷酸和聚腺苷酸尾。
[0391]
在特定实施方案中，对一种或多种daric组分进行编码的多核苷酸可被密码子优化。如本文所使用，术语“密码子优化的”是指取代编码多肽的多核苷酸中的密码子以便增加所述多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包括但不限于以下一个或多个：(i)两种或更多种生物体或基因之间密码子偏好的变化或合成地构造的偏好表；(ii)生物体、基因或基因集内密码子偏好程度的变化；(iii)包括环境在内的密码子的系统性变化；(iv)根据解码trna得到的密码子变化；(v)根据总体或三联体一个位置中的gc％得到的密码子变化；(vi)与参考序列，例如天然存在序列相似程度的变化；(vii)密码子频率截止值的变化；(viii)由dna序列转录的mrna的结构特性；(ix)有关作为设计密码子取代集合的基础的dna序列的功能的先验知识；(x)每个氨基酸的密码子集的系统性变化；和/或(xi)伪翻译起始位点的分离移除。
[0392]
如本文所使用，术语“核苷酸”是指与磷酸化糖的n-糖苷键联中的杂环含氮碱基。核苷酸应理解为包括天然碱基，以及多种本领域认可的经过修饰的碱基。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的1'位处。核苷酸一般包含碱基、糖和磷酸酯基。在核糖核酸(rna)中，糖是核糖，并且在脱氧核糖核酸(dna)中，糖是脱氧核糖，即，不含核糖中存在的羟基的糖。
[0393]
多核苷酸的说明性实例包括但不限于编码seq id no:1-5中所示多肽的多核苷酸。
[0394]
在各种示例性实施方案中，本文所涵盖的多核苷酸包括但不限于编码一种或多种daric组分、daric受体、工程化抗原受体、融合多肽的多核苷酸，以及包含本文所涵盖的多核苷酸的表达载体、病毒载体和转移质粒。
[0395]
如本文所使用，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列展示相当大的序列同一性的多核苷酸或在下文所定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖因至少一个核苷酸的添加、缺失、取代或修饰而有别于参考多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括一个或多个核苷酸被添加或缺失或修饰，或被置换成不同核苷酸的多核苷酸。就这一点而言，本领域中应充分理解，可以对参考多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代在内的某些改变，由此使改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生物功能或活性。
[0396]
如本文所使用，叙述“序列同一性”或例如包含“与
……
50％一致的序列”是指在核苷酸与核苷酸基础上或在氨基酸与氨基酸基础上，序列在比较窗内一致的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下方式计算：在比较窗内比较二个最佳地比对的序列，测定的一致核酸碱基(例如a、t、c、g、i)或一致氨基酸残基(例如ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys以及met)在两个序列中出现的位置的数目以得到相配位置的数目，用相配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即，窗大小)并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。包含与本文所描述的参考序列中的任何一个具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸和多肽。
[0397]
如本文所使用，术语“核酸盒”或“表达盒”是指载体内可以表达rna且随后表达多肽的基因序列。在一个实施方案中，核酸盒含有目的基因，例如目的多核苷酸。在另一个实施方案中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸序列以及目的基因，例如目的多核苷酸。载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核酸盒。核酸盒在载体内是按位置依序地取向，使得盒中的核酸可以被转录成rna，并且当需要时被翻译成蛋白质或多肽，经历被转化的细胞中的活性所需的适当翻译后修饰，并且通过靶向适当细胞内区室或分泌至细胞外区室中而易位至适当区室中以获得生物活性。优选地，所述盒的3'和5'端适合于迅速地插入载体中，例如其在每一端处具有限制性核酸内切酶位点。所述盒可以作为单一单元移出并插入质粒或病毒载体中。
[0398]
多核苷酸包括目的多核苷酸。如本文所使用，术语“目的多核苷酸”是指如本文所预期，编码多肽或融合多肽的多核苷酸或用作模板以转录抑制性多核苷酸的多核苷酸。
[0399]
如本文其他地方所公开的或如本领域已知的，无论编码序列本身的长度如何，本文所涵盖的多核苷酸可以与其他dna序列组合，如启动子和/或增强子、非转译区(utr)、信号序列、kozak序列、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(ires)、重组酶识别位点(例如，loxp位点、frt位点和att位点)、终止密码子、转录终止信号以及对自裂解多肽、表位标记进行编码的多核苷酸，使得所述多核苷酸的总长度可以显著变化。因此，涵盖可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，其总长度优选地受制备的容易
性和在预期的重组dna方案中的使用的限制。
[0400]
多核苷酸可以使用本领域中已知并且可用的多种公认技术中的任一种制备、操作、表达和/或递送。为了表达所希望的多肽，可将编码所述多肽的核苷酸序列插入适当载体中。
[0401]
载体的示例性实例包括但不限于质粒、自主复制序列和转座元件，例如sleeping beauty、piggybac。
[0402]
载体的另外的说明性实例包括但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1源性人工染色体(pac)、如λ噬菌体或m13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。
[0403]
可用作载体的病毒的示例性实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒以及乳多泡病毒(例如sv40)。
[0404]
表达载体的示例性实例包括但不限于用于在哺乳动物细胞中表达的pclneo载体(promega)；用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的plenti4/v5-dest
tm
、plenti6/v5-dest
tm
和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen)。在特定实施方案中，本文所公开的多肽的编码序列可连接至此类表达载体中以在哺乳动物细胞中表达所述多肽。
[0405]
在特定实施方案中，载体是游离型载体或维持在染色体外的载体。如本文所使用，术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体dna中且不会从分裂的宿主细胞中逐渐丧失的载体，这还意味着所述载体在染色体外或附加地复制。
[0406]
表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非转译区，包括复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(shine dalgarno序列或kozak序列)内含子、多腺苷酸化序列、5'和3'非转译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和转译。这些元件在其强度和特异性方面可能有所变化。取决于所利用的载体系统和宿主，可使用多种适合的转录与翻译元件，包括遍在型启动子和诱导型启动子。
[0407]
在特定实施方案中，多核苷酸包括载体，所述载体包括但不限于表达载体和病毒载体。载体可以包括一种或多种外源、内源或异源控制序列，如启动子和/或增强子。“内源控制序列”是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源控制序列”是通过基因操纵(即分子生物学技术)与被放置成与基因并置使得此基因的转录由所连接的增强子/启动子引导的序列。“异源控制序列”是与被基因操纵的细胞来自不同物种的外源序列。“合成”控制序列可以包括一种或多种内源和/或外源序列和/或在体外或计算机中所确定的为特定疗法提供最佳启动子和/或增强子活性的序列的元件。
[0408]
如本文所使用，术语“启动子”是指rna聚合酶结合的多核苷酸(dna或rna)的识别位点。rna聚合酶启动并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。在特定实施方案中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包括位于起始转录位点上游大约25个到30个碱基的at富含区和/或发现距离转录起始上游70个到80个碱基的另一个序列，即n可以是任何核苷酸的cncaat区。
[0409]
术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的朝向而起作用的dna的区段。增强子可以与启动子和/或其他增强子元件协同地或相加性地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子
和增强子两者的功能的序列的dna的区段。
[0410]
术语“可操作地连接”是指所描述的组分的关系允许其以其预定方式起作用的并接。在一个实施方案中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列，例如目的多核苷酸之间的功能性连接，其中所述表达控制序列引导对应于所述第二序列的核酸的转录。
[0411]
如本文所使用，术语“组成型表达控制序列”是指连续地或连续不断地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在各种各样的细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子或分别允许在受限种类的细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
[0412]
适合于在特定实施方案中使用的示例性普遍存在的表达控制序列包括但不限于：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)ltr启动子、rous肉瘤病毒(rsv)ltr、单纯疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子、h5、来自牛痘病毒的p7.5启动子和p11启动子、延伸因子1-α(ef1a)启动子、早期生长应答1(egr1)、铁蛋白h(ferh)、铁蛋白l(ferl)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)、真核翻译起始因子4a1(eif4a1)、热休克70kda蛋白5(hspa5)、热休克蛋白90kdaβ成员1(hsp90b1)、热休克蛋白70kda(hsp70)、β-驱动蛋白(β-kin)、人rosa 26基因座(irions等人,nature biotechnology 25,1477-1482(2007))、泛素c启动子(ubc)、磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子阴性对照区缺失并且dl587rev引物结合位点取代的(mnd)u3启动子(haas等人,journal of virology.2003；77(17):9439-9450)。
[0413]
在一个实施方案中，载体包括mndu3启动子。
[0414]
在一个实施方案中，载体包括包含人ef1a基因的第一内含子的ef1a启动子。
[0415]
在一个实施方案中，载体包括缺少人ef1a基因的第一内含子的ef1a启动子。
[0416]
在特定实施方案中，可能期望使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列来实现期望的多核苷酸序列的细胞类型特异性、谱系特异性或组织特异性表达(例如，仅在细胞类型、细胞谱系或组织的亚群中或在发育的特定阶段期间表达编码多肽的特定核酸)。
[0417]
在特定实施方案中，可能需要将多核苷酸表达为t细胞特异性启动子。
[0418]
如本文所使用，“条件表达”可以是指任何类型的条件表达，包括但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。此定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施方案提供了目的多核苷酸的条件表达，例如通过使细胞、组织、生物体等经受导致多核苷酸表达或导致由目的多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的治疗或病状来控制表达。
[0419]
诱导型启动子/系统的说明性实例包括但不限于：类固醇诱导型启动子如编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用对应的激素处理可诱导)、金属硫蛋白启动子(通过各种重金属处理可诱导)、mx-1启动子(通过干扰素可诱导)、“基因开关(geneswitch)”米非司酮可调节系统(sirin等人,2003,gene,323:67)、cumate诱导型基因开关(wo 2002/088346)、四环素依赖性调节系统等。诱导剂包括但不限于糖皮质激素、雌激
素、米非司酮(ru486)、金属、干扰素、小分子、cumate、四环素、多西环素及其变体。
[0420]
如本文所使用，“内部核糖体进入位点”或“ires”是指促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区)的如atg等起始密码子由此导致基因的非帽依赖性转译的元件。参见，例如，jackson等人，1990.trends biochem sci15(12):477-83)以及jackson and kaminski.1995.rna 1(10):985-1000。本领域的技术人员通常采用的ires的实例包括美国专利第6,692,736号中所描述的那些。本领域已知的“ires”的其他实例包括但不限于可从微小rna病毒获得的ires(jackson等人，1990)和可从病毒或细胞mrna来源获得的ires，例如免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)、血管内皮生长因子(vegf)(huez等人，1998.mol.cell.biol.18(11):6178-6190)、成纤维细胞生长因子2(fgf-2)和胰岛素样生长因子(igfii)、翻译起始因子eif4g和酵母转录因子tfiid和hap4、可从novagen商购的ephelomencycarditis病毒(emcv)(duke等人，1992.j.virol 66(3):1602-9)和vegf ires(huez等人，1998.mol cell biol 18(11):6178-90)。已经报道了小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、二顺反子病毒科(dicistroviridae)和黄病毒科(flaviviridae)物种的病毒基因组中以及hcv、弗里德鼠白血病病毒(friend murine leukemia virus，frmlv)和莫洛尼氏鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，momlv)中的ires。
[0421]
在一个实施方案中，本文所涵盖的多核苷酸中使用的ires是emcv ires。
[0422]
在特定实施方案中，多核苷酸是共有kozak序列。如本文所使用，术语“kozak序列”是指大大促进mrna与核糖体的小亚基的初始结合并增加转译的短核苷酸序列。共有kozak序列是(gcc)rccatgg(seq id no:42)，其中r是嘌呤(a或g)(kozak,1986.cell.44(2):283-92，和kozak,1987.nucleic acids res.15(20):8125-48)。
[0423]
引导异源核酸转录物的高效终止和聚腺苷酸化的元件将增加异源基因的表达。转录终止信号一般见于聚腺苷酸化信号的下游。在特定实施方案中，载体在编码待表达多肽的多核苷酸的3'端包含聚腺苷酸化序列。如本文所使用，术语“聚腺苷酸位点(polya site)”或“聚腺苷酸序列(polya sequence)”表示引导由rna聚合酶ii引起的初生rna转录物终止和聚腺苷酸化的dna序列。聚腺苷酸化序列可以通过在编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾来促进mrna稳定性，并因此促使翻译效率增加。裂解和聚腺苷酸化是由rna中的聚腺苷酸序列引导。哺乳动物pre-mrna的核心聚腺苷酸序列有两个识别元件侧接裂解-聚腺苷酸化位点上。通常，几乎不变的aauaaa六聚物位于富含u或gu残基的可变性较高的元件上游20-50个核苷酸处。初生转录物的裂解发生于这两个元件之间并偶合以将多达250个腺苷添加至5'裂解产物中。在特定实施方案中，核心聚腺苷酸序列是理想的聚腺苷酸序列(例如aataaa、attaaa、agtaaa)。在特定实施方案中，聚腺苷酸序列是sv40聚腺苷酸序列、牛生长激素聚腺苷酸序列(bghpa)、兔β-珠蛋白聚腺苷酸序列(rβgpa)、其变体、或本领域中已知的另一种适合的异源或内源性聚腺苷酸序列。在特定实施方案中，聚腺苷酸序列是合成的。
[0424]
在特定实施方案中，对一种或多种多肽或融合多肽进行编码的多核苷酸可以通过非病毒和病毒方法引入到免疫效应细胞中，例如t细胞。在特定实施方案中，一种或多种多核苷酸的递送可以通过相同的方法或通过不同的方法和/或通过相同的载体或通过不同的载体来提供。
[0425]
术语“载体”在本文中用以指能够转移或输送另一个核酸分子的核酸分子。被转移的核酸一般被连接至载体核酸分子，例如插入载体核酸分子中。载体可以包括引导在细胞
中自主复制的序列，或可以包括足以允许整合至宿主细胞dna中的序列。在特定实施方案中，使用了非病毒载体将本文所涵盖的一个或多个多核苷酸递送至t细胞中。
[0426]
非病毒载体的示例性实例包括但不限于质粒(例如dna质粒或rna质粒)、转座子、粘粒和细菌人工染色体。
[0427]
非病毒递送特定实施方案中所涵盖的多核苷酸的示例性方法包括但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪法、病毒粒子、脂质体、免疫脂质体、纳米粒子、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸dna、人工病毒粒子、deae-葡聚糖介导的转移、基因枪以及热休克。
[0428]
适用于特定实施方案中所涵盖的特定实施方案中使用的多核苷酸递送系统的说明性实例包括但不限于由amaxa biosystems、maxcyte,inc.、btx molecular delivery systems和copernicus therapeutics inc.提供的那些。脂质转染试剂是商业销售的(例如，transfectam
tm
和lipofectin
tm
)。已经在文献中描述了适合于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质。参见例如liu等人(2003)gene therapy.10:180
–
187；和balazs等人(2011)journal of drug delivery.2011:1-12。在特定实施方案中还涵盖了抗体靶向的、源自细菌的、基于无生命纳米细胞的递送。
[0429]
在特定实施方案中所涵盖的包含多核苷酸的病毒载体可以通过施用至个体患者体内递送，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施用，如下所述。可替代地，载体可以离体递送到细胞，如从个体患者移植的细胞(例如，动员的外周血、淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检等)或通用供体造血干细胞，然后将细胞再植入患者体内。
[0430]
在一个实施方案中，将包含本文所涵盖的多核苷酸的病毒载体直接施用至生物体以在体内转导细胞。可替代地，可以施用裸dna。通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径施用，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用这种核酸的合适的方法是本领域技术人员可获得的并且是公知的，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一条途径更直接且更有效的反应。
[0431]
适合于在特定实施方案中所涵盖的特定实施方案中使用的病毒载体系统的说明性实例包括但不限于腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒以及痘苗病毒载体。
[0432]
在各种实施方案中，通过用含有一种或多种多核苷酸的重组腺相关病毒(raav)转导细胞，将编码本文所涵盖的一种或多种daric组分和/或其它多肽的一种或多种多核苷酸引入免疫效应细胞，例如t细胞。
[0433]
aav是一种小型(约26nm)复制缺陷型、主要是附加型无包膜病毒。aav可以感染分裂和非分裂细胞，并且可以将其基因组并入到宿主细胞的基因组中。重组aav(raav)通常至少由转基因及其调节序列和5'和3'aav反向末端重复序列(itr)构成。itr序列的长度为约145bp。在特定实施方案中，raav包括从aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10分离的itr和衣壳序列。
[0434]
在一些实施方案中，使用嵌合raav，从一种aav血清型分离itr序列，并从不同的aav血清型分离衣壳序列。例如，具有源自aav2的itr序列和源自aav6的衣壳序列的raav被称为aav2/aav6。在特定实施方案中，raav载体可以包括来自aav2的itr以及来自aav1、
aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10中任一种的衣壳蛋白。在优选实施方案中，raav包括源自aav2的itr序列和源自aav6的衣壳序列。在优选实施方案中，raav包括源自aav2的itr序列和源自aav2的衣壳序列。
[0435]
在一些实施方案中，工程和选择方法可以应用于aav衣壳，以使其更有可能转导所关注细胞。
[0436]
已经公开了raav载体的构建、制备和其纯化，例如在美国专利第9,169,494号；第9,169,492号；第9,012,224号；第8,889,641号；第8,809,058号；以及第8,784,799号，上述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
[0437]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的逆转录病毒，例如慢病毒转导细胞，将编码本文所涵盖的一种或多种daric组分和/或其它多肽的一种或多种多核苷酸引入免疫效应细胞，例如t细胞。
[0438]
如本文所使用，术语“逆转录病毒”是指rna病毒，所述rna病毒将其基因组rna逆转录为线性双链dna拷贝并且随后将其基因组dna共价整合到宿主基因组中。适用于特定实施方案的示例性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mulv)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(momsv)、哈维鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv)、长臂猿白血病病毒(galv)、猫白血病病毒(flv)、泡沫病毒、弗里德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(mscv)和劳斯肉瘤病毒(rsv)以及慢病毒。
[0439]
如本文所使用，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包括但不限于：hiv(人免疫缺陷病毒；包含hiv 1型和hiv 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，vmv)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(caev)；马传染性贫血病毒(eiav)；猫免疫缺陷病毒(fiv)；牛免疫缺陷病毒(biv)；以及猿猴免疫缺陷病毒(siv)。在一个实施方案中，优选基于hiv的载体主链(即，hiv顺式作用序列元件)。
[0440]
在各种实施方案中，本文所涵盖的慢病毒载体包括一个或多个ltr，以及以下辅助元件中的一个或多个或全部：cppt/flap、psi(ψ)包装信号、输出元件、聚腺苷酸序列，并且可以任选地包括wpre或hpre、绝缘子元件、可选择标志物和细胞自杀基因，如本文其他地方所讨论的。
[0441]
在特定实施方案中，本文所涵盖的慢病毒载体可以是整合的或非整合的或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用，术语“整合缺陷型慢病毒”或“idlv”是指具有缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组的能力的整合酶的慢病毒。专利申请wo 2006/010834中已经描述了无整合能力的病毒载体，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
[0442]
适于降低整合酶活性的hiv-1pol基因中的示例性突变包括但不限于：h12n、h12c、h16c、h16v、s81 r、d41a、k42a、h51a、q53c、d55v、d64e、d64v、e69a、k71a、e85a、e87a、d116n、d1161、d116a、n120g、n1201、n120e、e152g、e152a、d35e、k156e、k156a、e157a、k159e、k159a、k160a、r166a、d167a、e170a、h171a、k173a、k186q、k186t、k188t、e198a、r199c、r199t、r199a、d202a、k211a、q214l、q216l、q221 l、w235f、w235e、k236s、k236a、k246a、g247w、d253a、r262a、r263a和k264h。
[0443]
术语“长末端重复序列(ltr)”是指位于逆转录病毒dna的末端处的碱基对的结构域，其在其天然序列环境中是直接重复序列并含有u3、r和u5区。
[0444]
如本文所使用，术语“flap元件”或“cppt/flap”指代序列包含逆转录病毒(例如，
hiv-1和hiv-2)的中心多嘌呤段和中心终止序列(cppt和cts)的核酸。合适的flap元件描述于美国专利第6,682,907号和zennou等人，2000,cell,101:173。
[0445]
如本文所用，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的psi[ψ]序列，其是病毒rna插入病毒衣壳或颗粒所需的，参见例如clever等人，1995.j.of virology,第69卷，第4期；第2101-2109页。
[0446]
术语“输出元件”是指调节rna转录物从细胞的细胞核向细胞质转运的顺式作用转录后调节元件。rna输出元件的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(hiv)rev应答元件(rre)(参见例如cullen等人,1991.j.virol.65:1053；以及cullen等人1991.cell 58:423)，和b型肝炎病毒转录后调节元件(hpre)。
[0447]
在特定实施方案中，通过将转录后调节元件、高效的多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号结合到载体中来增加异源序列在病毒载体中的表达。多种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质上的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre；zufferey等人,1999,j.virol.,73:2886)；存在于b型肝炎病毒(hpre)中的转录后调节元件(huang等人,mol.cell.biol.,5:3864)；等(liu等人,1995,genes dev.,9:1766)。
[0448]
由于修饰ltr，慢病毒载体优选地含有几种安全性增强。“自失活”(sin)载体是指复制缺陷型载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，其中被称为u3区的右(3')ltr增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。优选地通过在载体dna的3'ltr的u3区引入缺失(即，用于产生载体rna的dna)来实现自失活。因此，在逆转录期间，此缺失被转移到前病毒dna的5'ltr。在特定实施方案中，期望消除足够的u3序列以大大减少或完全消除ltr的转录活性，从而大大减少或消除转导细胞中全长载体rna的产生。在基于hiv的慢病毒载体的情况下，已经发现这种载体耐受显著的u3缺失，包含去除ltr tata盒(例如，从-418至-18的缺失)，而没有显著降低载体滴度。
[0449]
通过用异源启动子替代5'ltr的u3区来提供另外的安全性增强以驱动病毒颗粒产生期间病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包含例如病毒性猿猴病毒40(sv40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(cmv)(例如，立即早期)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(momlv)、劳斯肉瘤病毒(rsv)和单纯性疱疹病毒(hsv)(胸苷激酶)启动子。
[0450]
如本文所使用，术语“假型”或“假型包装”是指其病毒包膜蛋白已经被具有优选特性的另一病毒的病毒包膜蛋白取代的病毒。例如，hiv可以用水疱性口炎病毒g蛋白(vsv-g)包膜蛋白进行假型包装，这允许hiv感染更广泛的细胞，因为hiv包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向cd4

呈递细胞。
[0451]
在某些实施方案中，根据已知方法产生慢病毒载体。参见例如kutner等人,bmc biotechnol.2009；9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10；kutner等人nat.protoc.2009；4(4):495
–
505.doi:10.1038/nprot.2009.22。
[0452]
根据本文所涵盖的某些特定实施方案，大多数或所有病毒载体主链序列衍生自慢病毒，例如hiv-1。然而，应理解，可以使用或组合许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，并且可以容置慢病毒序列中的某些慢病毒序列的多种取代和改变而不损害转移载体执行本文所描述的功能的能力。此外，本领域已知多种慢病毒载体，参见naldini等人,(1996a、1996b和1998)；zufferey等人,(1997)；dull等人,1998,美国专利第6,013,516号、第5,994,136号，其中许多可以适于产生本文所涵盖的病毒载体或转移质粒。
[0453]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的腺病毒转导细胞，将编码本文所涵盖的一种或多种daric组分和/或其它多肽的一种或多种多核苷酸导入免疫效应细胞。
[0454]
基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率并且并不需要细胞分裂。使用这种载体，已经获得了高滴度和高表达水平。此载体可以在相对简单的系统中大量制备。将大多数腺病毒载体工程改造，使得转基因取代ad e1a、e1b和/或e3基因；随后，在以反式提供缺失的基因功能的人293细胞中繁殖复制缺陷型载体。ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包含如在肝、肾和肌肉中发现的非分裂的分化细胞。常规ad载体具有很大的承载能力。
[0455]
复制缺陷的当前腺病毒载体的产生和繁殖可以利用命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系通过ad5 dna片段从人胚胎肾细胞转化并组成性地表达e1蛋白(graham等人,1977)。由于e3区可从腺病毒基因组中分配出来(jones和shenk,1978)，所以目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下在e1、d3区或两个区中携带外源dna(graham和prevec,1991)。腺病毒载体已经用于真核基因表达(levrero等人,1991；gomez-foix等人,1992)和疫苗开发(grunhaus&horwitz,1992；graham&prevec,1992)。向不同的组织施用重组腺病毒方面的研究包含气管滴注(rosenfeld等人,1991；rosenfeld等人,1992)、肌肉注射(ragot等人,1993)、外周静脉注射(herz&gerard,1993)以及立体定向脑内接种(le gal la salle等人,1993)。在临床试验中使用ad载体的实例涉及用于伴随肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(sterman等人,hum.gene ther.7:1083-9(1998))中所述。
[0456]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的单纯疱疹病毒，例如hsv-1、hsv-2转导细胞，将编码本文所涵盖的一种或多种daric组分和/或其它多肽的一种或多种多核苷酸导入免疫效应细胞。
[0457]
成熟hsv病毒粒子由包膜的二十面体衣壳组成，其中病毒基因组由152kb的线性双链dna分子组成。在一个实施方案中，基于hsv的病毒载体缺乏一个或多个必需或非必需的hsv基因。在一个实施方案中，基于hsv的病毒载体为复制缺陷型。大多数复制缺陷型hsv载体含有缺失以去除一个或多个中早期、早期或晚期hsv基因从而防止复制。例如，hsv载体可能缺乏选自由以下组成的组的立即早期基因：icp4、icp22、icp27、icp47及其组合。hsv载体的优点是其进入可以导致长期dna表达的潜伏期的能力，以及其可以容纳高达25kb的外源dna插入物的大型病毒dna基因组。基于hsv的载体描述于例如美国专利第5,837,532号、第5,846,782号和第5,804,413号以及国际专利申请wo 91/02788、wo 96/04394、wo98/15637和wo 99/06583中，所述专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
[0458]
g.经过基因修饰的细胞
[0459]
在各种实施方案中，细胞被修饰以表达本文所涵盖的一种或多种daric、daric组分、工程化tcr、car、ζ因子和/或融合蛋白，用于治疗癌症。可以对细胞进行非基因修饰以表达本文所涵盖的多肽中的一种或多种多肽，或者在特定的优选实施方案中，可以对细胞进行基因修饰以表达本文所涵盖的多肽中的一种或多种多肽。如本文所使用，术语“基因工程改造”或“基因修饰”是指将额外的遗传物质以dna或rna的形式添加到细胞中的总遗传物质中。在特定实施方案中，术语“基因修饰细胞”、“修饰细胞”和“重新定向的细胞”可互换使用。
[0460]
在特定的实施方案中，本文所涵盖的一种或多种募集tcr复合物的daric组分被引入免疫效应细胞中并且在免疫效应细胞中表达以改善免疫效应细胞的功效。在特定实施方案中，一种或多种募集tcr复合物的daric组分被引入免疫效应细胞中并且在免疫效应细胞中表达，所述免疫效应细胞通过在细胞中共表达工程化抗原受体(例如，工程化tcr)而被重定向至靶细胞。
[0461]
在特定实施方案中，涵盖了双重靶向免疫效应细胞，其中靶细胞表达由daric识别的靶抗原和由tcr(例如，工程化tcr)识别的mhc-抗原复合物。
[0462]
在特定实施方案中，涵盖了双重靶向免疫效应细胞，其中靶细胞表达cd33、cd123、cll1、b7-h3、bcma、cd19、cd20、cd22、cd79a、cd79b、egfr、egfrviii，或由daric受体识别的nkg2d配体和由工程化抗原受体(例如，工程化tcr)识别的靶抗原。
[0463]“免疫效应细胞”是免疫系统的任何细胞，其具有一种或多种效应功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、adcc和/或cdc的诱导)。本文所涵盖的示例性免疫效应细胞是t淋巴细胞，包括但不限于细胞毒性t细胞(ctl；cd8

t细胞)、til和辅助t细胞(htl；cd4

t细胞，在一个特定实施方案中，细胞包括αβt细胞，在一个特定实施方案中，细胞包括γδt细胞，在一个实施方案中，免疫效应细胞包括自然杀伤(nk)细胞，在一个实施方案中，免疫效应细胞包括自然杀伤t(nkt)细胞，免疫效应细胞可以是自体的/自身的(“自我”)或非自体的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异种的)。
[0464]
如本文所使用，“自体”是指来自同一受试者的细胞。如本文所使用，“同种异体”是指来自同一物种的在基因上与比较细胞不同的细胞。如本文所使用，“同基因”是指来自不同受试者的在基因上与比较细胞相同的细胞。如本文所使用，“异种”是指来自与比较细胞不同的物种的细胞。在优选实施方案中，细胞是人自体免疫效应细胞。
[0465]
适用于引入本文所涵盖的一种或多种daric组分或daric的说明性免疫效应细胞包含t淋巴细胞。术语“t细胞”或“t淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包含胸腺细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、静息t淋巴细胞或活化t淋巴细胞。t细胞可以是t辅助(th)细胞，例如t辅助1(th1)或t辅助2(th2)细胞。t细胞可以是辅助t细胞(htl；cd4

t细胞)cd4

细胞、细胞毒性t细胞(ctl；cd8

t细胞)、cd4

cd8

t细胞、cd4-cd8-t细胞或任何其它的t细胞亚群。适用于特定实施方案中的其它示例性t细胞群包括原生t细胞和记忆t细胞。
[0466]
如本领域的技术人员所理解，其他细胞也可用作免疫效应细胞，其包含一种或多种daric组分或本文所涵盖的daric。在特定实施方案中，免疫效应细胞还包含nk细胞、nkt细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包含效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外诱导这种祖细胞分化成免疫效应细胞。因此，在特定实施方案中，免疫效应细胞包含免疫效应细胞的祖细胞，如源自脐带血、骨髓或动员的外周血的cd34 细胞群内含有的造血干细胞(hsc)，所述hsc在受试者中施用后分化为成熟免疫效应细胞，或可以在体外诱导所述hsc分化为成熟免疫效应细胞。
[0467]
如本文所使用，术语“cd34 细胞”是指在其细胞表面上表达cd34蛋白的细胞。如本文所使用，“cd34”是指通常充当细胞-细胞粘附因子并且参与t细胞进入淋巴结的细胞表面糖蛋白(例如，唾液黏蛋白)。cd34 细胞群含有造血干细胞(hsc)，其在施用给患者时分化并促成所有造血谱系，包含t细胞、nk细胞、nkt细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞。
[0468]
在特定实施方案中，提供了用于制备表达本文所涵盖的一种或多种daric组分的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得具有一种或多种核酸和/或载体或其组合的免疫效应细胞包括本文所涵盖的一种或多种daric组分。在一个实施方案中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达本文所涵盖的一种或多种daric组分和工程改造的抗原受体。在某些实施方案中，免疫效应细胞从个体分离并经基因修饰而无需在体外进一步操纵。然后，可以将这种细胞直接再次施用到个体。在另外的实施方案中，免疫效应细胞在基因修饰之前首先在体外被活化和刺激以增殖。在这方面，可以在基因修饰之前和/或之后培养免疫效应细胞。
[0469]
在特定实施方案中，在本文所述的免疫效应细胞的体外操纵或基因修饰之前，从受试者获得细胞来源。在特定实施方案中，经过修饰的免疫效应细胞包括t细胞。
[0470]
t细胞可以从多种来源获得，包括但不限于周边血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、肋膜积液、脾组织以及肿瘤。在某些实施方案中，可以使用技术人员已知的任何数目的技术如沉降(例如，ficoll
tm
分离)从采集自受试者的单位血液中获得t细胞。
[0471]
在其它实施方案中，使用分离的或纯化的t细胞群。在一些实施方案中，在pbmc的分离之后，可以在活化、扩增和/或基因修饰之前或之后将细胞毒性和辅助t淋巴细胞分类为原生、记忆和效应t细胞亚群。
[0472]
在一个实施方案中，分离的或纯化的t细胞群表达包括但不限于以下的标志物中的一个或多个：cd3

、cd4

、cd8

或其组合。
[0473]
在某些实施方案中，t细胞从个体分离，并且在进行修饰以表达一种或多种daric组分之前首先进行体外活化和刺激以增殖。
[0474]
为了实现足够治疗剂量的t细胞组合物，通常对t细胞进行一轮或多轮刺激、活化和/或扩增。在特定实施方案中，通常可以使用如例如以下美国专利中所述的方法使t细胞活化和扩增：第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；和第6,867,041号，上述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在特定实施方案中，在引入编码一种或多种daric组分的载体或多核苷酸，可选地与本文所涵盖的工程改造的抗原受体组合之前，使t细胞活化和扩增约6小时、约12小时、约18小时或约24小时。
[0475]
在一个实施方案中，t细胞在被修饰的同时被活化。
[0476]
在各种实施方案中，一种产生免疫效应细胞的方法包括活化包括t细胞的细胞群以及扩增所述t细胞群。t细胞活化可以通过以下方式实现：通过t细胞tcr/cd3复合物提供初级刺激信号以及通过辅助分子(例如，cd28)提供次级共刺激信号。
[0477]
可以通过使t细胞与适当的cd3结合剂(例如，cd3配体或抗cd3单克隆抗体)接触来刺激tcr/cd3复合物。cd3抗体的说明性实例包括但不限于：okt3、g19-4、bc3和64.1。
[0478]
除了通过tcr/cd3复合物提供的初级刺激信号外，t细胞应答的诱导还需要第二共刺激信号。在特定实施方案中，cd28结合剂可以用于提供共刺激信号。cd28结合剂的说明性实例包括但不限于：天然cd 28配体，例如，cd28的天然配体(例如，b7蛋白家族的成员，如
b7-1(cd80)和b7-2(cd86)；以及能够交联cd28分子的抗cd28单克隆抗体或其片段，例如，单克隆抗体9.3、b-t3、xr-cd28、kolt-2、15e8、248.23.2和ex5.3d10。
[0479]
在一个实施方案中，提供初级刺激信号的分子例如通过tcr/cd3复合物提供刺激的分子以及共刺激分子偶联到同一表面。
[0480]
在某些实施方案中，提供刺激和共刺激信号的结合剂定位于细胞的表面上。这可以通过以下方式实现：使用以适合于结合剂在细胞表面上的表达的形式对结合剂进行编码的核酸转染或转导细胞，或者可替代地将结合剂偶联到细胞表面。
[0481]
在另一个实施方案中，提供初级刺激信号的分子例如通过tcr/cd3复合物提供刺激的分子以及共刺激分子展现在抗原呈递细胞上。
[0482]
在一个实施方案中，提供初级刺激信号的分子例如通过tcr/cd3复合物提供刺激的分子以及共刺激分子提供于单独的表面上。
[0483]
在某个实施方案中，所述结合剂中提供刺激信号和共刺激信号的一种结合剂是可溶的(在溶液中提供)，而另一种或其他结合剂提供于一个或多个表面上。
[0484]
在特定实施方案中，提供刺激信号和共刺激信号的结合剂两者均以可溶形式(在溶液中提供)提供。
[0485]
在各种实施方案中，本文所涵盖的用于制备t细胞的方法包括使用抗cd3和抗cd28抗体活化t细胞。
[0486]
在一个实施方案中，扩增通过本文所涵盖的方法活化的t细胞进一步包括培养包括t细胞的细胞群若干小时(约3小时)到约7天到约28天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可以将t细胞组合物培养14天。在特定实施方案中，将t细胞培养约21天。在另一个实施方案中，将t细胞组合物培养约2至3天。还可以期望若干刺激/活化/扩增循环，使得t细胞的培养时间可以是60天或更长。
[0487]
在特定实施方案中，适合t细胞培养的条件包含适当的培养基(例如，最小必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo 15(lonza))和增殖和活力所必需的一个或多个因子，包括但不限于：血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、il-21、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或本领域的技术人员已知的适合于细胞生长的任何其他添加剂。
[0488]
细胞培养基的另外的说明性实例包括但不限于：rpmi 1640、clicks、aim-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo 15和x-vivo 20、optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，其无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使t细胞生长和扩增的量的一个或多个细胞因子。
[0489]
抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅在实验培养时包含，而在培养待注入受试者体内的细胞时不包含。靶细胞保持处于支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％的c02)。
[0490]
在特定实施方案中，在具有适当细胞因子如il-2、il-7和/或il-15等培养基中使pbmc或分离的t细胞与通常附接到珠粒或其他表面的刺激剂和共刺激剂如抗cd3和抗cd28抗体接触。
[0491]
在其他实施方案中，通过工程改造的k562、u937、721.221、t2和c1r细胞制备人工apc(aapc)以引导各种共刺激分子和细胞因子的稳定表达和分泌。在特定实施方案中，k32
或u32 aapc用于引导一个或多个基于抗体的刺激分子在aapc细胞表面上显示。t细胞群可以通过表达各种共刺激分子的aapc扩增，包括但不限于cd137l(4-1bbl)、cd134l(ox40l)和/或cd80或cd86。最后，aapc为扩增经过基因修饰的t细胞和维持cd8 t细胞上的cd28表达提供了高效平台。wo 03/057171和us2003/0147869中提供的aapc以全文引用的方式并入本文中。
[0492]
在一个特定实施方案中，将对一种或多种daric组分进行编码的多核苷酸引入到t细胞群中。在特定实施方案中，将对一种或多种daric组分进行编码的多核苷酸引入到表达工程改造的抗原受体的t细胞群中。可以通过显微注射、转染、脂质转染、热休克、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、deae-葡聚糖介导的转移等将多核苷酸引入到t细胞中。
[0493]
在优选实施方案中，通过病毒转导将多核苷酸引入到t细胞中。
[0494]
适合于将多核苷酸引入到免疫效应细胞或cd34

细胞中的病毒载体系统的说明性实例包括但不限于用于基因转移的腺相关病毒(aav)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒载体。
[0495]
在一个实施方案中，通过aav转导将多核苷酸引入到t细胞中。
[0496]
在一个实施方案中，通过逆转录病毒转导将多核苷酸引入到t细胞中。
[0497]
在一个实施方案中，通过慢病毒转导将多核苷酸引入到t细胞中。
[0498]
在一个实施方案中，通过腺病毒转导将多核苷酸引入到t细胞中。
[0499]
在一个实施方案中，通过单纯疱疹病毒转导将多核苷酸引入到t细胞中。
[0500]
在一个实施方案中，通过牛痘病毒转导将多核苷酸引入到t细胞中。
[0501]
h.组合物和配制物
[0502]
本文所涵盖的组合物可以包括一种或多种daric多肽、编码daric多肽的多核苷酸、包括其的载体、基因修饰的免疫效应细胞、桥接因子等。组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”是指单独地或与一种或多种其它治疗方式组合地施用于细胞或动物的在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中配制的组合物。还应理解，如果需要，组合物也可以与其他药剂组合施用，例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其他各种药学活性剂。对组合物中还可以包含的其它组分实际上不存在限制，条件是另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。
[0503]
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0504]
术语“药学上可接受的载剂”是指对桥接因子、多肽、多核苷酸、包括其的载体或经过基因修饰的免疫效应细胞施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药物载剂的说明性实例可以是无菌液体，如细胞培养基、水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。还可以使用生理盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液作为液体载体，特别是用于可注射溶液。在特定实施方案中，适合的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。除了任何常规培养基或药剂与活性成分不相容的情况之外，涵盖了其在药物组合物中的用途。补充性活性成分也可以并入到组合物中。
[0505]
在一个实施方案中，包括药学上可接受的载剂的组合物适于施用于受试者。在特
定实施方案中，包括载剂的组合物适于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。在特定实施方案中，包括药学上可接受的载剂的组合物适合于心室内、脊柱内或鞘内施用。药学上可接受的载剂包含无菌水溶液、细胞培养基或分散体。这些培养基和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。除了任何常规培养基或药剂与桥接因子、多肽、多核苷酸、包括其的载体或经过基因修饰的免疫效应细胞不相容的情况之外，涵盖其在药物组合物中的用途。
[0506]
在特定实施方案中，本文所涵盖的组合物包括经过基因修饰的t细胞和药学上可接受的载剂。本文所涵盖的包括基于细胞的组合物的组合物可以通过肠内或肠胃外施用方法单独地或与其它适合的化合物组合地施用以实现期望的治疗目的。
[0507]
在特定实施方案中，本文所涵盖的组合物包括桥接因子和药学上可接受的载剂。
[0508]
药学上可接受的载剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使其适于施用于正在治疗的人类受试者。药学上可接受的载剂应当保持或增加组合物的稳定性。药学上可接受的载剂可以是液体的或固体的并且在涵盖计划的施用方式的情况下被选择以在与组合物的其它组分组合时提供期望的体积、同一性等。例如，药学上可接受的载剂可以是但不限于结合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)、填充剂(例如，乳糖和其它糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)、崩解剂(例如，淀粉、羧基乙酸淀粉钠等)或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠等)。用于本文所涵盖的组合物的其它适合的药学上可接受的载剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
[0509]
此类载剂溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂。如本文所使用，术语“缓冲剂”是指化学成分中和酸或碱而不显著改变ph的溶液或液体。本文所涵盖的缓冲剂的实例包括但不限于杜尔贝克氏(dulbecco's)磷酸盐缓冲盐水(pbs)、林格氏(ringer's)溶液、5％葡萄糖水溶液(d5w)、正常(normal)/生理(physiologic)盐水(0.9％nacl)。
[0510]
药学上可接受的载剂可以存在的量足以使组合物的ph保持处于约7。可替代地，组合物的ph的范围为约6.8至约7.4，例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3和7.4。在仍另一个实施方案中，所述组合物的ph为约7.4。
[0511]
本文所涵盖的组合物可以包括无毒的药学上可接受的培养基。组合物可以是悬浮液。如本文所使用，术语“悬浮液”是指细胞未连接到固相支持物的非粘附性条件。例如，可以搅拌或搅动保持为悬浮液的细胞并且所述细胞未粘附到支持物，如培养皿。
[0512]
在特定实施方案中，本文所涵盖的组合物在悬浮液中配制，其中经过修饰的t细胞分散在静脉注射(iv)袋等中的可接受的液体培养基或溶液例如盐水或无血清培养基内。可接受的稀释剂包括但不限于水、plasmalyte、林格氏溶液、等渗氯化钠(盐水)溶液、无血清细胞培养基和适合于低温储存的培养基，例如培养基。
[0513]
在某些实施方案中，药学上可接受的载剂基本上不含人或动物来源的天然蛋白质，并且适合于储存包括经过修饰的t细胞群的组合物。药物组合物旨在施用到人类患者中并且因此基本上不含细胞培养组分，如牛血清白蛋白、马血清和胎牛血清。
[0514]
在一些实施方案中，所述组合物在药学上可接受的细胞培养基中配制。此类组合
物适于施用于人类受试者。在特定实施方案中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
[0515]
无血清培养基相比于含有血清的培养基具有若干优点，包含组合物得到简化且得到更好定义、污染物程度得到减小、可能的传染剂来源得到消除以及成本降低。在各种实施方案中，无血清培养基是无动物的并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。“无动物”培养基是指其中组分源自非动物来源的培养基。重组蛋白替代无动物培养基中的天然动物蛋白质，并且营养物从合成的、植物或微生物来源获得。相比之下，“无蛋白质”培养基被定义为基本上不含蛋白质。
[0516]
特定实施方案中使用的无血清培养基的说明性实例包括但不限于qbsf-60(quality biological,inc.)、stempro-34(life technologies)和x-vivo 10。
[0517]
在一个实施方案中，包括经过修饰的t细胞的组合物在plasmalyte中配制。
[0518]
在各种实施方案中，包括经过修饰的t细胞的组合物在冷冻保存培养基中配制。例如，可以使用具有低温保存药剂的低温保存培养基在解冻后保持高细胞存活率结果。特定实施方案中使用的低温保存培养基的说明性实例包括但不限于cryostor cs10、cryostor cs5和cryostor cs2。
[0519]
在一个实施方案中，所述组合物在包括50:50plasmalyte a:cryostor cs10的溶液中配制。
[0520]
在特定实施方案中，所述组合物基本上不含支原体、内毒素和微生物污染。关于内毒素，“基本上不含”是指每剂细胞的内毒素含量低于fda针对生物制剂允许的含量，其为每天5eu/kg体重的总内毒素，针对平均70kg的人而言为每总剂量细胞350eu。在特定实施方案中，本文所涵盖的组合物含有约0.5eu/ml到约5.0eu/ml、或约0.5eu/ml、1.0eu/ml、1.5eu/ml、2.0eu/ml、2.5eu/ml、3.0eu/ml、3.5eu/ml、4.0eu/ml、4.5eu/ml或5.0eu/ml。
[0521]
在特定实施方案中，对药学上可接受的载剂溶液的配制对本领域的技术人员来说是熟知的，这和开发用于将本文所描述的特定组合物用于各种治疗方案中的适合的给药和治疗方案一样，包含例如肠内和肠胃外，例如血管内、静脉内、动脉内、骨内、心室内、脑内、颅内、脊柱内、鞘内和髓内施用和配制。本领域技术人员应当理解，本文所涵盖的特定实施方案可以包括其它制剂，例如在药物领域中众所周知的那些，并且描述于例如remington:the science and practice of pharmacy,第i卷和第ii卷，第22版编著：loyd v.allen jr.philadelphia,pa:pharmaceutical press；2012中，上述美国专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
[0522]
在特定实施方案中，所述组合物包含一定量的表达本文所涵盖的一种或多种daric组分的免疫效应细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含一定量的表达工程改造的抗原受体的免疫效应细胞和本文所涵盖的一种或多种daric组分。如本文所使用，术语“量”是指包括本文所涵盖的一种或多种daric组分等的用于在存在桥接因子的情况下实现有益或期望的预防或治疗结果(包含临床结果)的“有效量”的细胞。
[0523]“预防有效量”是指包括本文所涵盖的一种或多种daric组分等的对于实现期望的预防结果有效的细胞的量。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期用于受试者的，所以预防有效量小于治疗有效量。
[0524]“治疗有效量”是指包括本文所涵盖的一种或多种daric组分的在存在桥接因子的
情况下对于“治疗”受试者(例如，患者)有效的细胞的量。当指示治疗量时，待施用的组合物、细胞、桥接因子等的精确量可以由内科医生涵盖年龄、体重、肿瘤大小、感染程度或转移程度以及患者(受试者)的病状的个体差异来确定。
[0525]
通常可以说，包括本文所述的免疫效应细胞的药物组合物可以以102至10
10
个细胞/kg体重，优选地105至106个细胞/kg体重(包含那些范围内的所有整数值)的剂量施用。细胞的数目将取决于组合物的期望最终用途，其中包含的细胞的类型也是如此。对于本文所提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以为500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所期望细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过105、106、107、108、109、10
10
、10
11
或10
12
个细胞的多次输注中。在一些实施方案中，特别是由于所有输注的细胞将被重新定向至特定靶抗原，所以可以施用106/千克(10
6-10
11
/患者)范围内的较低数量的细胞。
[0526]
如果需要，治疗还可以包含施用如本文所描述的有丝分裂原(例如，pha)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，ifn-γ、il-2、il-12、tnf-α、il-18和tnf-β、gm-csf、il-4、il-13、flt3-l、rantes、mip1α等)以增强免疫应答的诱导。
[0527]
通常，包括如本文所描述的活化和扩增的细胞的组合物可以用于治疗和预防免疫受损个体中出现的疾病。特别地，本文所涵盖的组合物用于治疗癌症。在特定实施方案中，免疫效应细胞可以单独施用，或作为药物组合物与载剂、稀释剂、赋形剂和/或与如il-2等其它组分或其它细胞因子或细胞群组合施用。
[0528]
在特定实施方案中，药物组合物包括与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的一定量的经过基因修饰的t细胞。
[0529]
在特定实施方案中，药物组合物包括一定量的与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合的桥接因子。
[0530]
在特定实施方案中，组合物包括有效量的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞包括本文所涵盖的单独或与桥接因子和/或一种或多种治疗剂组合的一种或多种daric组分，如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。所述组合物还可以与抗生素组合施用。本领域可接受这种治疗剂作为如本文所描述的如特定癌症等特定疾病状态的标准治疗。所涵盖的示例性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、nsaid、dmard、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其它活性剂和辅助剂。
[0531]
在一个特定实施方案中，将包含有效量的免疫效应细胞的组合物施用于受试者，所述免疫效应细胞包含本文所涵盖的一种或多种daric组分，并将包含有效量的桥接因子的组合物在细胞组合物之前、期间、与细胞组合物组合或之后施用于受试者，并且任选地重复施用于受试者。
[0532]
在某些实施方案中，包括免疫效应细胞的组合物可以与任何数目的化学治疗剂结合施用，所述免疫效应细胞包括本文所涵盖的一种或多种daric组分。
[0533]
多种其它治疗剂可以与本文所述的组合物结合使用。在一个实施方案中，将包括免疫效应细胞的组合物与抗炎剂一起施用，所述免疫效应细胞包括本文所涵盖的一种或多种daric组分。抗炎剂或药物包括但不限于类固醇和糖皮质激素(包含倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲
安奈德)、包含阿司匹林的非甾体类抗炎药(nsaids)、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗tnf药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。
[0534]
适合与包括本文所涵盖的一种或多种daric组分的经过修饰的t细胞进行组合治疗的治疗性抗体的说明性实例包含但不限于包括但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、杜利他单抗(duligotumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、度伐单抗(durvalumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(huluc63)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、因达单抗(indatuximab)、奥妥珠格图单抗(inotuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、罗沃单抗(lorvotuzumab)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、莫西姆单抗(moxetumomab)、纳武单抗(nivolumab)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(siltuximab)、四丙珠单抗(teprotumumab)和乌布妥昔单抗(ublituximab)。
[0535]
在某些实施方案中，本文所述的组合物与细胞因子结合施用。如本文所使用的“细胞因子”是指由一种细胞群释放的蛋白质的通用术语，所述蛋白质作为细胞间介体作用于另一种细胞。这种细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子以及传统的多肤激素。
[0536]
i.治疗方法
[0537]
经修饰以表达本文所涵盖的daric和/或工程化抗原受体的免疫效应细胞提供了改进的过继性免疫治疗方法，以用于预防、治疗和改善免疫病症(例如，癌症)或者预防、治疗或改善与其相关的至少一种症状。
[0538]
包含结合cd33、cd123、cll1、b7-h3、bmca、cd19、cd20、cd22、cd79a、cd79b、egfr、egfrviii或nkg2d配体的daric信号传导组分以及结合cd3ε、cd3δ或cd3γ的daric结合组分的免疫效应细胞提供了改进的过继免疫治疗方法，以用于预防、治疗和改善免疫病症(例如，癌症)或者预防、治疗或改善与其相关的至少一种症状。
[0539]
包含结合cd33、cd123、cll1、b7-h3、bmca、cd19、cd20、cd22、cd79a、cd79b、egfr、egfrviii或nkg2d配体的daric信号传导组分以及包含多聚化结构域、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ的daric结合组分的免疫效应细胞提供了改进的过继免疫治疗方法，以用于预防、治疗和改善免疫病症(例如，癌症)或者预防、治疗或改善与其相关的至少一种症状。
[0540]
在特定实施方案中，经修饰以表达daric的免疫效应细胞提供改进的过继性免疫疗法的方法以在降低中靶抗原、脱靶细胞毒性的风险(识别正常非靶细胞上的靶抗原)的同时微调针对表达靶抗原的靶细胞(例如，肿瘤细胞)的细胞毒性应答的安全性和功效。
[0541]
在特定实施方案中，预防、治疗或改善癌症的至少一种症状的方法包括向受试者施用有效量的经修饰的免疫效应细胞或t细胞，它们包含daric受体的一种或多种组分和工程化tcr、car，或者其他治疗性转基因，以将细胞重定向到靶细胞。通过转导可化学调节的免疫刺激信号，经过基因修饰的细胞是更有效且安全的细胞免疫疗法。
[0542]
在特定实施方案中，对一种或多种免疫效应细胞(例如，t细胞)进行修饰以表达daric结合组分和daric信号传导组分两者。在这种情况下，通过免疫效应细胞上表达的信号传导组分和靶细胞上表达的靶抗原的相互作用，将经修饰的细胞施用于有需要的受试者
并使其归巢到靶细胞。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用桥接因子。在存在桥接因子的情况下，在与靶抗原结合的daric信号传导组分、桥接因子和与tcr复合物结合的daric结合组分之间形成复合物。在复合物形成后，daric将免疫刺激信号转导至与tcr信号协同作用的免疫效应细胞，进而引发免疫效应细胞针对靶细胞的细胞毒性反应。
[0543]
在各种实施方案中，包含daric和/或工程化抗原受体的免疫效应细胞使用双重靶向策略微调针对靶细胞的细胞毒性反应的安全性和有效性，其中一个或多个靶细胞表达一个或多个由工程化抗原受体识别的靶抗原和daric。
[0544]
在特定实施方案中，一种或多种免疫效应细胞，例如，t细胞，被修饰以表达daric结合组分和daric信号传导组分以及工程化抗原受体，例如tcr。在这种情况下，通过结合第一靶抗原的daric信号传导组分和结合第二靶抗原的tcr的相互作用，将经修饰的细胞施用于有需要的受试者并使其归巢到靶细胞，其中一个或两个靶抗原在靶细胞或靶细胞群上表达。tcr与靶细胞上的靶抗原的相互作用可引发免疫效应细胞针对靶细胞的细胞毒性反应。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用桥接因子。在存在桥接因子的情况下，在结合第一靶抗原的daric信号传导组分、桥接因子和结合tcr复合物的daric结合组分之间形成复合物。在复合物形成后，daric将免疫刺激信号转导至与tcr信号协同作用的免疫效应细胞，进而引发或增强免疫效应细胞针对靶细胞的细胞毒性反应。
[0545]
在特定实施方案中，对一种或多种免疫效应细胞(例如，t细胞)进行修饰以表达daric结合组分和daric信号传导组分两者。在这种情况下，通过免疫效应细胞上表达的信号传导组分和靶细胞上表达的靶抗原的相互作用，将经修饰的细胞施用于有需要的受试者并使其归巢到靶细胞。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用桥接因子。在存在桥接因子的情况下，在与靶抗原结合的daric信号传导组分、桥接因子和包含多聚化结构域、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ的daric结合组分之间形成复合物。在复合物形成后，daric将免疫刺激信号转导至与tcr信号协同作用的免疫效应细胞，进而引发免疫效应细胞针对靶细胞的细胞毒性反应。
[0546]
在特定实施方案中，一种或多种免疫效应细胞，例如，t细胞，被修饰以表达daric结合组分和daric信号传导组分以及工程化抗原受体，例如tcr。在这种情况下，通过结合第一靶抗原的daric信号传导组分和结合第二靶抗原的tcr的相互作用，将经修饰的细胞施用于有需要的受试者并使其归巢到靶细胞，其中一个或两个靶抗原在靶细胞或靶细胞群上表达。tcr与靶细胞上的靶抗原的相互作用可引发免疫效应细胞针对靶细胞的细胞毒性反应。在已经向受试者施用经过修饰的细胞之前、与向受试者施用经过修饰的细胞几乎相同的时间或已经向受试者施用经过修饰的细胞之后，向受试者施用桥接因子。在存在桥接因子的情况下，在结合第一靶抗原的daric信号传导组分、桥接因子和包含多聚化结构域、接头多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ的daric结合组分之间形成复合物。在复合物形成后，daric将免疫刺激信号转导至与tcr信号协同作用的免疫效应细胞，进而引发或增强免疫效应细胞针对靶细胞的细胞毒性反应。
[0547]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗实体瘤或癌症。
[0548]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗实体瘤或癌症，包括但不限于：肾上腺癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/cns癌、乳腺癌、支气管肿瘤、心脏肿瘤、子宫颈癌、胆管癌、软骨肉瘤、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、原位导管癌(dcis)子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、输卵管癌、纤维组织肉瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞肿瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤、头颈癌、血管母细胞瘤、肝细胞癌、下咽癌、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺类癌、恶性间皮瘤、髓样癌、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、中线癌、口腔癌、粘膜肉瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、少突神经胶质瘤、口腔癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰岛细胞肿瘤、乳头状癌、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、小肠癌、胃癌、汗腺癌、滑膜瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌，尿道癌症、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管癌、外阴癌和wilms肿瘤。
[0549]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗实体瘤或癌症，包括但不限于非小细胞肺癌、头部和颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、食管癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤和少突神经胶质瘤。
[0550]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗实体瘤或癌症，包括但不限于非小细胞肺癌、转移性结直肠癌、成胶质细胞瘤、头颈癌、胰腺癌和乳腺癌。
[0551]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗成胶质细胞瘤。
[0552]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗液体癌或血液癌。
[0553]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗b细胞恶性肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
[0554]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗液体癌，包括但不限于白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤：急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、毛细胞白血病(hcl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)和慢性粒细胞白血病(cml)、慢性髓单核细胞白血病(cmml)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合
征(s
é
zary syndrome)、前体t淋巴母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨的孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤。
[0555]
在特定实施方案中，本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞用于治疗急性髓性白血病(aml)。
[0556]
在本文所涵盖的方法中使用的优选细胞包含自体/自身(“自我”)细胞、优选地造血细胞、更优选地t细胞以及更优选地免疫效应细胞。
[0557]
在特定实施方案中，一种方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的经修饰的免疫效应细胞，所述经修饰的免疫效应细胞表达一种或多种daric组分，和任选地工程化抗原受体或另一种daric结合组分，或包含它们的组合物，并且还向受试者施用桥接因子。在某些实施方案中，细胞用于治疗处于发展免疫病症的风险中的患者。因此，特定实施方案包括治疗或预防或改善免疫病症例如癌症的至少一种症状，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所涵盖的经过修饰的免疫效应细胞和桥接因子。
[0558]
施用经过修饰的免疫效应细胞、daric结合组分和/或桥接因子的数量和频率将由如患者的病状以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，即使适当的剂量和剂量时间表可以通过临床试验确定。
[0559]
在一个说明性实施方案中，提供给受试者的有效量的经过修饰的免疫效应细胞为至少2
×
106个细胞/kg、至少3
×
106个细胞/kg、至少4
×
106个细胞/kg、至少5
×
106个细胞/kg、至少6
×
106个细胞/kg、至少7
×
106个细胞/kg、至少8
×
106个细胞/kg、至少9
×
106个细胞/kg、或至少10
×
106个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含所有中间剂量的细胞。
[0560]
在另一个说明性实施方案中，提供给受试者的有效量的经过修饰的免疫效应细胞为约2
×
106个细胞/kg、约3
×
106个细胞/kg、约4
×
106个细胞/kg、约5
×
106个细胞/kg、约6
×
106个细胞/kg、约7
×
106个细胞/kg、约8
×
106个细胞/kg、约9
×
106个细胞/kg、或约10
×
106个细胞/kg或更多个细胞/kg，包含所有中间剂量的细胞。
[0561]
在另一个说明性实施方案中，提供给受试者的有效量的经过修饰的免疫效应细胞为约2
×
106个细胞/kg至约10
×
106个细胞/kg、约3
×
106个细胞/kg至约10
×
106个细胞/kg、约4
×
106个细胞/kg至约10
×
106个细胞/kg、约5
×
106个细胞/kg至约10
×
106个细胞/kg、2
×
106个细胞/kg至约6
×
106个细胞/kg、2
×
106个细胞/kg至约7
×
106个细胞/kg、2
×
106个细胞/kg至约8
×
106个细胞/kg、3
×
106个细胞/kg至约6
×
106个细胞/kg、3
×
106个细胞/kg至约7
×
106个细胞/kg、3
×
106个细胞/kg至约8
×
106个细胞/kg、4
×
106个细胞/kg至约6
×
106个细胞/kg、4
×
106个细胞/kg至约7
×
106个细胞/kg、4
×
106个细胞/kg至约8
×
106个细胞/kg、5
×
106个细胞/kg至约6
×
106个细胞/kg、5
×
106个细胞/kg至约7
×
106个细胞/kg、5
×
106个细胞/kg至约8
×
106个细胞/kg或6
×
106个细胞/kg至约8
×
106个细胞/kg，包含所有中间剂量的细胞。
[0562]
本领域普通技术人员将认识到，可能需要多次施用特定实施方案中所涵盖的组合物以实现期望的疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间的跨度内施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。经过修饰的免疫效应细胞、daric组分和桥接因子可以通过以下方式施用：在同一或不同组合物中；同时在一种或多种组合物中；或在不同的时间在多于一种
组合物中。经过修饰的免疫效应细胞、daric组分和桥接因子可以通过相同的施用途径或不同途径施用。
[0563]
在某些实施方案中，可能希望向受试者施用活化的t细胞，并且随后重新抽血(或进行单采血液成分术)、从中活化t细胞并且向患者重新输注这些活化的和扩增的t细胞。可以每隔几周进行多次此过程。在某些实施方案中，可以抽取10cc到400cc的血来活化t细胞。在某些实施方案中，抽取20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或400cc或更多量的血来活化t细胞。不受理论束缚，使用此多次抽血/多次重新输注方案可以用于选出某些t细胞群。
[0564]
在一个实施方案中，治疗诊断患有癌症的受试者的方法包括：从受试者中除去免疫效应细胞；通过将对一种或多种daric组分进行编码的一种或多种载体引入到细胞中来修饰免疫效应细胞并且产生经过修饰的免疫效应细胞群；以及向同一受试者施用经过修饰的免疫效应细胞群。在优选实施方案中，免疫效应细胞包括t细胞。
[0565]
在一个实施方案中，一种治疗被诊断患有癌症的受试者的方法包括：从受试者中除去免疫效应细胞；通过将编码一种或多种daric组分和任选地工程化抗原受体或另一种daric结合组分的一种或多种载体引入到细胞中来修饰免疫效应细胞并且产生经修饰的免疫效应细胞群；以及向同一受试者施用经修饰的免疫效应细胞群。在优选实施方案中，免疫效应细胞包括t细胞。
[0566]
用于施用特定实施方案中所涵盖的细胞组合物的方法包含任何有效导致重新引入经过离体修饰的免疫效应细胞或重新引入免疫效应细胞的经过修饰的祖细胞的方法，所述免疫效应细胞在引入受试者时分化为成熟免疫效应细胞。一种方法包括通过将编码一种或多种daric组分和任选地工程化抗原受体或另一种daric结合组分的一种或多种载体引入到细胞中并且使转导的细胞返回到受试者体内来离体修饰外周血t细胞。
[0567]
用于施用特定实施方案中所涵盖的细胞组合物的方法包含任何有效导致重新引入经过离体修饰的免疫效应细胞或重新引入免疫效应细胞的经过修饰的祖细胞的方法，所述免疫效应细胞在引入受试者时分化为成熟免疫效应细胞。一种方法包括通过将编码一种或多种daric组分和任选地工程化抗原受体或另一种daric结合组分的一种或多种载体引入到细胞中并且使转导的细胞返回到受试者体内来离体修饰外周血t细胞。
[0568]
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和授权专利都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同特定且个别地指示每一个别出版物、专利申请或授权专利以引用的方式并入一般。
[0569]
尽管已经出于清楚理解的目的，通过说明和实例相当详细地描述了前述实施方案，但根据本文所涵盖的传授内容，本领域的普通技术人员将易于了解，可以在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下对其作出某些改变和修改。提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。本领域技术人员将容易认识到可以在特定实施方案中被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。
[0570]
实施例
[0571]
实施例1
[0572]
药物可调节的daric t细胞对肿瘤细胞的反应
[0573]
daric慢病毒质粒含有mndu3启动子，该启动子可操作地连接到编码cd8α源性信号
肽、抗cd3抗体、frb结构域变体(t82l)、cd8α源性跨膜结构域的多核苷酸；p2a序列；并且设计、构建和验证了igκ源性信号肽、抗cd19 scfv、fkbp12结构域和cd4源性跨膜和截短的细胞内结构域。图1.
[0574]
daric慢病毒质粒含有mndu3启动子，该启动子可操作地连接到编码cd8α源性信号肽、frb结构域变体(t82l)、线性多肽和cd3ε、cd3δ或cd3γ的多核苷酸；p2a序列；并且设计、构建和验证了igκ源性信号肽、抗cd19 scfv、fkbp12结构域和cd4源性跨膜和截短的细胞内结构域。图2.
[0575]
通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而是应被解释为包含所有可能的实施方案连同这些权利要求所要求的等效物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开限制。