转化植物及其制造和使用方法与流程

转化植物及其制造和使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年8月27日提交的美国临时申请号62/892,219的权益，其内容通过引用由此并入。


背景技术：

3.由梭杆菌感染引起的反刍动物感染严重影响动物生产和性能，而白细胞毒素a(ltka)蛋白被认为是肉牛和奶牛肝脓肿和腐蹄病发展的主要毒力因子(narayanan等人，2001)。在畜牧业中，治疗和预防这种和其它感染的方法仍然是一项代价高昂的挑战。


技术实现要素：

4.本公开尤其提供了转化植物的方法和包含转化植物或其一部分(例如，本公开中涵盖的植物产生的抗原蛋白或其片段)的组合物。在本公开的一个方面，转化植物的方法包括提供核酸材料和用核酸材料转化植物细胞中的叶绿体。在一些实施例中，核酸材料包含第一靶向序列和第二靶向序列、启动子序列和外源核酸序列。在一些实施例中，核酸材料还包含一个或多个附加组分，例如选择序列和/或增强子序列。
5.在本公开的一个方面，转化植物的方法包括提供核酸材料和载体，和用核酸材料转化植物细胞中的叶绿体。在一些实施例中，转化植物的方法进一步包括表达外源核酸序列，其中所述表达至少部分地发生在叶绿体中。在一些实施例中，外源核酸序列在植物细胞的叶绿体中瞬时表达。在一些实施例中，外源核酸序列整合在植物细胞的叶绿体基因组中。在一些实施例中，外源核酸序列稳定地整合在植物细胞的叶绿体基因组中。
6.在一些实施例中，转化植物是或包括转导。在一些实施例中，在已经用核酸材料转化植物细胞之后，去除一部分核酸材料。例如，被去除的所述部分核酸材料可以是选择标志物。一部分核酸材料的去除可以通过同源重组和/或位点特异性重组，例如cre-lox重组。
7.根据各个实施例，核酸材料可以缀合到如纳米颗粒等载体，并且转化叶绿体可以包括使植物细胞与缀合到核酸材料的纳米颗粒接触。在一些实施例中，载体是纳米颗粒。纳米颗粒可以是或包含例如纳米管。在一些实施例中，纳米管包含单壁纳米管。在一些实施例中，纳米管是碳纳米管。
8.如本公开中所述，考虑了待用核酸材料转化的多个植物。在一些实施例中，植物是粟或高粱。在包括用如本文所述的核酸材料转化的植物的一些实施例中，所述植物能够在植物的叶绿体中至少部分地表达外源核酸序列。
9.本公开的另一方面包括一种试剂盒，所述试剂盒包含核酸材料，所述核酸材料包含第一靶向序列和第二靶向序列、启动子序列、选择序列；和至少一个外源核酸序列；和纳米颗粒载体。在一些实施例中，纳米颗粒载体可以是任何已知的纳米颗粒、纳米颗粒组合物或纳米管(例如，如本文其它地方所述)。
10.如本公开中所述，在一些实施例中，外源核酸材料是或包含rna寡核苷酸、dna寡核苷酸、质粒及其任何组合。在一些实施例中，外源核酸可以包含两个或更多个外源核酸序
列。
11.在一些实施例中，核酸材料包含第一靶向序列和第二靶向序列、启动子序列和外源核酸序列。根据各个实施例，启动子序列选自ppsba、prrn、prna、psaa、prbcl、camv35s、rbcs及其任何组合。在一些实施例中，第一和第二靶向序列各自具有分别与seq id no:15和seq id no:16具有至少80％同一性的序列。
12.根据各个实施例，第一靶向序列和第二靶向序列中的至少一者涉及位于染色体坐标之间的序列，所述染色体坐标选自trni-trna、trnm-trng、rrn16-rps12/7、tsca-psac、trnv-trna、rbcl-accd、rp132-trnl、3'rps12/7-trnv、peta-psbj、trn16/v-16srrna、trnfm-trng、atpb-rbcl、trn-trnr、ycf3-trns、rps7-ndhb、trny-gua-trnd-guc、trng-ucc-trnm-cau、trnt-trnl及其任何组合。在一些实施例中，第一靶向序列和第二靶向序列涉及位于trng-ucc-trnm-cau之间的序列。在一些实施例中，第一靶向序列和第二靶向序列涉及位于trny-gua-trnd-guc之间的序列。在一些实施例中，第一靶向序列和第二靶向序列涉及位于trnt-trnl之间的序列。在一些实施例中，第一靶向序列和第二靶向序列各自具有分别与seq id no:1(高粱叶绿体基因组的碱基14048-14793)和seq id no:8或23具有至少80％同一性的序列。
13.根据各个实施例，外源核酸序列可以包含对于如本文所述转化的植物细胞非天然的任何核酸。在一些实施例中，外源核酸序列编码包含与根据genbank:dq672338的白细胞毒素a(ltka)蛋白具有至少80％同一性的序列或其片段或变体的肽。在一些实施例中，外源核酸序列包含编码选自由pl1、pl2、pl3、pl4、pl5组成的群组的ltka的至少一个区域的序列或其片段或变体。
14.在一些实施例中，核酸材料还可以包含一个或多个附加组分，例如选择序列、增强子序列和/或终止序列。在一些实施例中，选择序列可以包含至少一个抗生素选择序列。抗生素选择序列的实例包含但不限于编码壮观霉素耐药基因、链霉素耐药基因、卡那霉素耐药基因、庆大霉素耐药基因、新霉素耐药基因、β内酰胺耐药基因及其任何组合的核酸序列。
15.在一些实施例中，选择序列可以包含编码以下的核酸序列：his标签、gus uida lacz、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白及其任何组合。实例包含但不限于黄色荧光蛋白(yfp，genbank:gq221700.1)、红色荧光蛋白(dsred，genbank:ky426960.1)或青色荧光蛋白(cfp，genbank:hq993060.1)。
16.在一些实施例中，核酸材料中包含的增强子序列选自编码以下的一个或多个序列：ggagg、rrn 5'utr、t7gene10 5'utr、lrbcl 5'utr、latpb 5'utr、烟草花叶病毒ω'5'utr(genbank:km507060.1)、lcry9aa2 5'utr、atpi 5'utr、psba5'utr、cry2a、rrnb、rps16、petd、psba、paba及其任何组合。
17.在一些实施例中，终止序列包含编码rps16(genbank:mf580999.1)的序列或其一部分或片段。
18.在一些实施例中，本公开提供了向非人类动物施用包含抗原的改造植物的方法，所述方法包括向非人类动物施用包含改造植物的免疫原性组合物。在一些实施例中，施用改造植物可以包括向非人类动物饲喂所述改造植物。在一些实施例中，非人类动物选自牛、山羊和鸡。
19.在一些实施例中，向非人类动物饲喂包含改造植物的免疫原性组合物一长段时
间。在一些实施例中，向非人类动物饲喂免疫原性组合物超过1、2、3、4、5、6或7天的时间(例如，连续多天)。在一些实施例中，向非人类动物饲喂免疫原性组合物超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周的时间(例如，连续多周)。在一些实施例中，每天向非人类动物饲喂免疫原性组合物。在一些实施例中，每周向非人类动物饲喂免疫原性组合物。
20.本公开的另一方面包括一种治疗非人类动物中的梭杆菌感染的一种或多种症状的方法。在一些实施例中，所述方法包括施用免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含植物，所述植物包含外源核酸序列，其中至少一个外源核酸序列至少部分地在植物的叶绿体中表达。在一些实施例中，所述外源核酸序列编码包含与根据genbank ref:dq672338的白细胞毒素a(ltka)蛋白具有至少80％同一性的序列或其片段或变体的肽。
21.在一些实施例中，梭杆菌感染的一种或多种症状包括腐蹄病和/或肝脓肿。在一些实施例中，所述免疫原性组合物包含的与ltka蛋白具有至少80％同一性的肽的量为所述免疫原性组合物中的总可溶性蛋白的至少约0.5％。
22.在一些实施例中，在施用28天之后，与对照相比，非人类动物未表现出显著的疾病进展或表现出较慢的疾病进展。在一些实施例中，与对照相比，非人类动物表现出梭杆菌感染的症状的延迟发作或症状的严重程度降低。在一些实施例中，所述症状是腐蹄病，其中所述症状的特征在于受感染动物的趾间皮肤的疼痛性炎症、跛行、食欲不振、体重减轻和死亡中的一者或多者。
23.在一些实施例中，所述施用是或包括饲喂。在一些实施例中，非人类动物选自牛、山羊和鸡。
24.在一些实施例中，向非人类动物饲喂免疫原性组合物一长段时间。在一些实施例中，向非人类动物饲喂免疫原性组合物超过1、2、3、4、5、6、7天的时间(例如，连续多天)。在一些实施例中，向非人类动物饲喂免疫原性组合物超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周的时间(例如，连续多周)。在一些实施例中，每天向非人类动物饲喂免疫原性组合物。在一些实施例中，每周向非人类动物饲喂免疫原性组合物。在一些实施例中，连续地向非人类动物饲喂免疫原性组合物。
25.在一些实施例中，所述植物是粟或高粱。在一些实施例中，所述外源核酸序列包含编码选自由pl1、pl2、pl3、pl4、pl5组成的群组的ltka的至少一个区域的序列或其片段或变体。
26.本文中对出版物、专利或专利申请的任何引用通过引用整体并入。在存在或不存在约/大约的情况下，本技术中所用的任何数值都旨在涵盖相关领域中普通技术人员所了解的任何正常波动。
27.本发明的其它特征、目的和优点在以下具体实施方式中显而易见。然而，应理解，尽管指示本发明的实施例，但具体实施方式仅作为说明而非限制给出。根据具体实施方式，本发明范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
28.下面描述的图式共同构成了附图，其仅用于说明目的，而不是用于限制。
29.图1示出了用于转化到高粱叶绿体基因组中的示例性dna构建体。
30.图2示出了用于转化到高粱叶绿体基因组中的示例性dna构建体。
31.图3示出了用于转化到高粱叶绿体基因组中的示例性dna构建体。
32.图4示出了用于转化到粟叶绿体基因组中的示例性dna构建体。
33.图5示出了使用相应高粱和粟侧翼引物从质粒模板扩增的pcr产物的凝胶图像。质粒pcr产物按照技术复制加载。泳道1：1.5kb序列梯。泳道2和3：用粟侧翼引物扩增的粟pl1 pl4质粒；预期大小为5385个碱基。泳道4和5：用高粱侧翼引物扩增的高粱pl1质粒；预期大小为4022个碱基。泳道6和7：用高粱侧翼引物扩增的高粱pl4质粒；预期大小为4607个碱基。泳道8和9：用高粱侧翼引物扩增的高粱pl1 pl4质粒；预期大小为5069个碱基。
34.图6示出了接种pl1构建体两天后来自五株高粱植物的sybr pcr检测数据。接种两天后从高粱植物提取dna。用pl1特异性寡核苷酸和无模板对照(ntc)进行扩增。
35.图7示出了接种pl4构建体两天后来自五株高粱植物的sybr pcr检测数据。接种两天后从高粱植物提取dna。用pl4特异性寡核苷酸和ntc进行扩增。
36.图8示出了接种pl1 pl4构建体两天后来自五株高粱植物的sybr pcr检测数据。接种两天后从高粱植物提取dna。图(a)示出：指示了用pl1特异性寡核苷酸和ntc nrt进行扩增。图(b)示出：指示了用pl4特异性寡核苷酸和ntc的扩增。
37.图9示出了来自由本研究中的粟(图a)和高粱(图b)植物生成的cdna的pp2a参考基因的逆转录酶sybr pcr。指示了pp2a(高粱/粟丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶)以及ntc和无逆转录酶(nrt；即rna)。
38.图10示出了高粱中的表达(即转基因构建体的重组的证据)。图(a)来自由本研究中所有高粱植物生成的cdna的pl1和pl4的逆转录酶sybr pcr。指示了ntc。图(b)由pcr引物生成的扩增子的琼脂糖凝胶染色，所述引物位于构建体的左侧之外(即在天然叶绿体基因组上)且插入序列(即坏死梭杆菌pl1；左凝胶)之内以及构建体的右侧之外且插入序列(右凝胶)之内，其中总dna由pl1 pl4接种高粱制备。左凝胶泳道1：高质量序列梯；泳道2：pcr扩增子；泳道3：1kb序列梯。右凝胶泳道1：pcr扩增子；泳道2：1kb序列梯。凝胶下方的示意图示出了负责相应左和右凝胶扩增子的靶向位置。细绿圈表示圆形高粱叶绿体基因组；粗绿线表示构建体侧翼区，其与叶绿体dna无法区分；蓝箭头表示相对引物位置；黑线表示相对扩增靶标；粗黄线是包含坏死梭杆菌pl1、pl4的转基因材料以及相关联的遗传表达机制和参考基因。
39.图11示出了图6中的pl4 pcr产物序列(pl4_rtpcrprod)和预期pl4编码dna区域的序列(pl4_dnaseq)的clustalw比对。从比对中去除了引物序列。
40.图12示出了由pcr引物生成的扩增子的琼脂糖凝胶染色，所述引物位于构建体的左侧之外且插入序列之内。左泳道：1kb序列梯，右泳道：pcr扩增子。凝胶下方的示意图示出了负责凝胶扩增子的靶向位置。细绿圈表示圆形高粱叶绿体基因组；粗绿线表示构建体侧翼区，其与叶绿体dna无法区分；蓝箭头表示相对引物位置；黑线表示扩增靶标。
41.图13示出了转基因构建体在高粱中的表达。逆转录酶定量taqman pcr(rt-qpcr)来源于接种两天后从高粱植物采集的mrna。指示了参考基因pp2a、梭杆菌白细胞毒素的免疫原性亚基(pl4)和无逆转录酶(即rna)对照。
42.图14示出了转基因构建体和粟叶绿体基因组的同源重组的证据。由pcr引物生成的扩增子的琼脂糖凝胶染色，所述引物位于粟构建体的左侧之外(即在天然叶绿体基因组上)和插入序列(即坏死梭杆菌pl1)之内，其中总dna由pl1 pl4接种粟制备。左泳道：pcr扩
增子；右车道：1kb序列梯。所述示意图示出了负责相应左和右凝胶扩增子的靶向位置。细蓝环表示圆形粟叶绿体基因组；粗蓝线表示构建体侧翼区，其与叶绿体dna无法区分；蓝箭头表示相对引物位置；黑线表示相对扩增靶标；粗黄线是包含坏死梭杆菌pl1、pl4的转基因材料以及相关联的遗传表达机制和参考基因。
43.图15示出了转基因构建体(pl1和pl4)在粟中的表达。逆转录酶定量pcr(rt-qpcrs)来源于从接种粟植物采集的mrna。指示了无逆转录酶(即rna)对照(nrt)和无模板对照(ntc)。
44.图16示出了接种pl1、pl4和pl1 pl4构建体三个月后来自20株高粱植物的pcr。使用pl1和pl4特异性测定的扩增来检测其相应构建体的存在，以及使用pp2a的扩增来检测高粱基因组的存在。还示出了无模板对照(ntc)。
45.图17示出了图12中的pl1 pcr产物序列(上)和预期pl1编码dna区域的序列(下)的clustalw比对。从比对中去除了引物序列。
46.图18示出了图12中的pl4 pcr产物序列(上)和预期pl4编码dna区域的序列(下)的clustalw比对。从比对中去除了引物序列。
47.定义
48.在本技术中，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一个”可以被理解为意指“至少一个”；(ii)术语“或”可以被理解为意指“和/或”；(iii)术语“包括”和“包含”可以被理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论是单独呈现还是与一个或多个附加组分或步骤一起呈现；(iv)术语“约”和“大约”可以被理解为允许标准偏差，如本领域普通技术人员所理解；(v)在提供范围的情况下，包含端点。
49.约：术语“约”或“大约”，当在本文中关于值使用时，是指在上下文中与参考值相似的值。一般来说，熟悉上下文的本领域的技术人员将了解在所述上下文中由“约”所涵盖的相关偏差度。例如，在一些实施例中，术语“约”可以涵盖参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小比例内的值范围。
50.施用：如本文使用，术语“施用”通常是指向受试者或系统(例如，非人类动物)施用组合物。本领域普通技术人员将知晓在适当情况下可以用于向例如人类或非人类受试者给药的施用途径。例如，如果在一些实施例中，施用可以是眼部施用、口服施用、肠胃外施用、局部施用等。在一些特定实施例中，施用可以包括向非人类动物饲喂组合物。在一些特定实施例中，施用可以是支气管施用(例如，通过支气管滴注)、颊部施用、皮肤施用(其可以是或包括例如向真皮局部施用、皮内施用、皮间施用、透皮施用等中的一者或多者)、肠内施用、动脉内施用、皮内施用、胃内施用、髓内施用、肌肉内施用、鼻内施用、腹膜内施用、鞘内施用、静脉内施用、心室内施用、特定器官内施用(例如，肝内施用)、粘膜施用、鼻腔施用、口服施用、直肠施用、皮下施用、舌下施用、局部施用、气管施用(例如，通过气管内滴注)、阴道施用、玻璃体施用等。在一些实施例中，施用可以涉及间歇性(例如，在时间上间隔开的多个剂量)和/或周期性(例如，以共同的一段时间间隔开的个体剂量)给药。在一些实施例中，施用可以涉及至少选定的一段时间内的连续给药(例如，灌注)。在一些特定实施例中，可以以间歇性(例如，在时间上间隔开的多个剂量)和/或周期性(例如，以共同的一段时间间隔开的单个剂量)给药的给药方案向动物饲喂组合物。在一些特定实施例中，可以在一段时间内连
续地向动物饲喂组合物。
51.试剂：一般来说，如本文使用的术语“试剂”可以用于指化合物或任何化学类别的实体，包括例如多肽、核酸、糖、脂质、小分子、金属或其组合或复合物。在适当的情况下，如本领域的普通技术人员从上下文中可以清楚地看出，所述术语可以用于指这样的实体，其是或包含细胞或生物体，或其级分、提取物或组分。在一些情况下，同样从上下文中可以清楚地看出，所述术语可以用于指一种或多种人造实体，因为它是由人工设计、工程改造和/或产生的和/或在自然界中找不到的。在一些实施例中，可以以分离形式或纯形式使用试剂；在一些实施例中，可以以粗制形式使用试剂。在一些实施例中，潜在试剂可以作为集合或库提供，例如可以经过筛选以标识或表征其中的活性剂。在一些情况下，术语“试剂”可以是指化合物或实体，其是或包含聚合物；在一些情况下，所述术语可以是指包含一个或多个聚合部分的化合物或实体。在一些实施例中，所述术语可以是指缺少或基本上不含任何聚合部分的化合物或实体。
52.改善：如本文使用，其是指受试者的状态的预防、减轻或缓和，或状态的改良。改善包括但不要求疾病、病症或病状(例如，传染病)的完全恢复或完全预防。
53.动物：如本文使用，其是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指任何性别和处于任何发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、鸡、山羊、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可以是转基因动物、基因工程改造动物和/或克隆。
54.抗原：如本文使用，术语“抗原”是指引发免疫反应的试剂；和/或(ii)结合到t细胞受体(例如，当由mhc分子呈递时)或结合到抗体的试剂。在一些实施例中，抗原引发体液反应(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；在一些实施例中，抗原引发细胞反应(例如，涉及其受体与抗原特异性相互作用的t细胞)。在一些实施例中，抗原结合到抗体并且可以诱导或不诱导生物体中的特定生理反应。一般来说，抗原可以是或包含任何化学实体，诸如例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施例中，除生物聚合物以外[例如，除核酸或氨基酸聚合物以外])等。在一些实施例中，抗原是或包含多肽。在一些实施例中，抗原是或包含聚糖。本领域的普通技术人员将了解，通常，抗原可以以分离形式或纯形式提供，或者可替代地，可以以粗制形式提供(例如，与其它材料一起，例如在如细胞提取物或含有抗原的来源的其它相对粗制剂的提取物中)。在一些实施例中，根据本发明使用的抗原以粗制形式提供。在一些实施例中，抗原是重组抗原。
[0055]
相关联：如所述术语在本文中使用，如果一个事件或实体的存在、水平、程度、类型和/或形式与另一事件或实体的存在、水平、程度、类型和/或形式相关，则两个事件或实体彼此“相关联”，。例如，如果特定实体(例如，多肽、遗传标签(genetic signature)、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与特定疾病、病症或病状的发病率和/或对特定疾病、病症或病状的易感性相关(例如，在相关群体内)，则认为所述特定实体与所述疾病、病症或病状相关联。在一些实施例中，如果两个或更多个实体直接或间接相互作用，使得其彼此具有和/或保持物理接近性，则其彼此物理“相关联”。在一些实施例中，彼此物理相关联的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施例中，彼此物理相关联的两个或更多个实体彼此
不共价连接而是非共价相关联，例如借助氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合。
[0056]
品种：如本文使用，术语“品种”是指具有共同祖先和/或共享其它品种的动物不共享的某些可区分性状的一组动物(例如，牛)。本领域的技术人员熟悉品种标准和/或特征。在多个实施例中，特定品种是通过使一个或多个特定标识亲本彼此交配而产生和/或维持的。
[0057]
载体：如本文使用，“载体”或在一些情况下“纳米颗粒载体”是指与组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。在一些示例性实施例中，载体可以包含无菌液体，诸如例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，诸如例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些实施例中，载体是或包含一个或多个固体组分。在一些实施例中，载体可以包含纳米颗粒。在一些特定实施例中，载体可以包含纳米管，例如碳纳米管、单壁纳米管、壳聚糖包裹纳米管或其任何组合。
[0058]
叶绿体：一种含有叶绿素并能进行光合作用的质体。叶绿体含有植物细胞质体基因组的多个拷贝。
[0059]
染色体：如本文使用，术语“染色体”是指dna分子，任选地与相关联蛋白质和/或其它实体一起，例如在真核细胞的细胞核中发现。通常，染色体携带允许其传递遗传信息的基因和功能(例如，复制起点等)。
[0060]
可比较的：如本文使用，术语“可比较的”是指两个或更多个试剂、实体、情况、条件集合等，它们可能彼此不相同，但是足够相似以允许它们之间能够进行比较，使得本领域的技术人员将了解，可以基于所观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施例中，通过多个基本上一致的特征和一个或少量变化特征来表征可比较的条件、情形、个体或群组的集合。本领域的普通技术人员将理解，在上下文中，在待视为可比较的两个或更多个此类试剂、实体、情况、条件集合的任何给定情形中需要何种程度的一致性。例如，本领域的普通技术人员将了解，情形、个体或群体的集合当被表征为足够数量和类型的基本上一致的特征以确保合理的结论时是彼此可比较的，其中在情形、个体或群体的不同集合下或使用情形、个体或群体的不同集合获得的结果或观察到的现象的差异是由变化的那些特征的变化引起的或指示变化的那些特征的变化。
[0061]
组合物：本领域的普通技术人员将了解，术语“组合物”可以用于指包含一个或多个指定组分的离散物理实体。一般来说，除非另有说明，否则组合物可以是任何形式——例如气体、凝胶、液体、固体等。在一些实施例中，组合物可以用于指已经转化以表达外源蛋白的植物。在一些实施例中，组合物可以包含核酸材料。在一些特定实施例中，组合物可以包含缀合到载体的核酸。
[0062]
包含：本文中被描述为“包含”一个或多个指定的元件或步骤的组合物或方法是开放式的，意指指定的元件或步骤是必需的，但是可以在组合物或方法的范围内加入其它元件或步骤。为了避免冗长，还应理解，被描述为“包含”(或其“包含”)一个或多个指定的元件或步骤的任何组合物或方法也描述了“基本上由”前述指定的元件或步骤“组成”(或其“基本上由”前述指定的元件或步骤“组成”)的相对应的更有限的组合物或方法，意指所述组合物或方法包括指定的基本元件或步骤，并且还可以包括不会实质上影响组合物或方法的基本和新颖特征的附加元件或步骤。还应理解，在本文中被描述为“包含”一个或多个指定的
元件或步骤或“基本上由”一个或多个指定的元件或步骤“组成”的任何组合物或方法也描述了相对应的更有限的且封闭式的组合物或方法，其“由”指定的元件或步骤“组成”(或“由”指定的元件或步骤“组成”)，不包含任何其它未指定的元件或步骤。在本文中所公开的任何组合物或方法中，可以用任何指定的基本元件或步骤的已知或所公开的等同物取代所述元件或步骤。
[0063]
对应于：如本文使用，术语“对应于”可以用于通过与适当的参考化合物或组合物的比较来指定结构元件在化合物或组合物中的位置/标识。例如，在一些实施例中，聚合物中的单体残基(例如，多肽中的氨基酸残基或多核苷酸中的核酸残基)可以被标识为“对应于”适当的参考聚合物中的残基。例如，普通技术人员将了解，为简单起见，多肽中的残基通常使用基于参考相关多肽的规范编号系统来指定，使得例如“对应于”位置190处的残基的氨基酸实际上不必是特定氨基酸链中的第190位氨基酸，而是对应于参考多肽中的190处发现的残基；本领域的普通技术人员容易了解如何标识“相对应的”氨基酸。例如，本领域的技术人员将知晓各种序列比对策略，包括软件程序，诸如例如blast、cs-blast、cusasw 、diamond、fasta、ggsearch/glsearch、genoogle、hmmer、hhpred/hhsearch、idf、infernal、klast、usearch、parasail、psi-blast、psi-search、scalablast、sequilab、sam、ssearch、swaphi、swaphi-ls、swimm或swipe，其可以例如用于标识根据本公开的多肽和/或核酸中的“相对应的”残基。
[0064]
给药方案：本领域的技术人员将了解，术语“给药方案”可以用于指通常间隔一段时间向受试者单独施用的一组单位剂量(通常多于一个)。在一些实施例中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可能涉及一个或多个剂量。在一些实施例中，给药方案包括多个剂量，其中每个剂量在时间上与其它剂量间隔开。在一些实施例中，个体剂量以相同长度的时间段彼此间隔开；在一些实施例中，给药方案包括多个剂量和至少两个不同的时间段间隔开的个体剂量。在一些实施例中，给药方案内的所有剂量都具有相同的单位剂量量。在一些实施例中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施例中，给药方案包括呈第一剂量量的第一剂量，接着是呈不同于第一剂量量的第二剂量量的一个或多个附加剂量。在一些实施例中，给药方案包括呈第一剂量量的第一剂量，接着是呈与第一剂量量相同的第二剂量量的一个或多个附加剂量。在一些实施例中，当在相关群体内施用时，给药方案与期望的或有益的结果相关(即治疗性给药方案)。
[0065]
工程改造：一般来说，术语“工程改造”是指已经被人为操纵的方面。例如，当在自然界中没有以所述顺序连接在一起的两个或更多个序列被人为操纵以在工程改造多核苷酸中直接彼此连接时，多核苷酸被认为是“工程改造的”。例如，在本发明的一些实施例中，工程改造多核苷酸包含在自然界中发现与第一编码序列操作性相关联，但不与第二编码序列操作性相关联的调节序列，所述调节序列经人为连接使得其与第二编码序列操作性相关联。类似地，如果细胞或生物体经操纵使得其遗传信息改变(例如，引入先前不存在的新遗传材料，例如通过转化、交配、体细胞杂交、转染、转导或其它机制，或改变或去除先前存在的遗传材料，例如通过取代或缺失突变，或通过交配方案)，则其被认为是“工程改造的”。如通常的实践并为本领域的技术人员所理解，即使实际的操纵是在现有实体上进行的，工程改造多核苷酸或细胞的子代通常仍被称为是“工程改造的”。
[0066]
赋形剂：如本文使用，其是指可以包含在药物组合物中的非治疗剂，例如以提供或
促进期望的稠度或稳定作用。在一些实施例中，适合的药物赋形剂可以包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻谷、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
[0067]
表达：如本文使用，核酸序列的“表达”是指以下一种或多种事件：(1)从dna序列产生rna模板(例如，通过转录)；(2)rna转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端形成)；(3)rna翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
[0068]
功能性：如本文使用，“功能性”生物分子是呈表现出其特征性性质和/或活性的形式的生物分子。
[0069]
片段：如本文中所描述的材料或实体的“片段”具有一种结构，其包括整体的离散部分，但不具有在整体中发现一或多个部分。在一些实施例中，片段由这种离散部分组成。在一些实施例中，片段由在整体中发现的特征结构元件或部分组成或包含在整体中发现的特征结构元件或部分。在一些实施例中，聚合物片段包含在整个聚合物中发现的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或更多个单体单元(例如，残基)或由其组成。在一些实施例中，聚合物片段包含在整个聚合物中发现的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大比例的单体单元(例如，残基)或由其组成。在一些实施例中，整个材料或实体可以被称为片段的“亲本”。
[0070]
基因：如本文使用，术语“基因”是指染色体中编码产物(例如，rna产物和/或多肽产物)的dna序列。在一些实施例中，基因包含编码序列(即编码特定产物的序列)；在一些实施例中，基因包含非编码序列。在一些特定实施例中，基因可以包含编码(例如，外显子)和非编码(例如，内含子)序列。在一些实施例中，基因可以包含一个或多个调节元件，例如，其可以控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，细胞类型特异性表达、诱导型表达等)。
[0071]
基因组：如本文使用，术语“基因组”是指由生物体个体或细胞个体携带的总遗传信息，由其染色体的完整dna序列表示。
[0072]
异源：如本文使用，关于序列的“异源”意指源自外来物种的序列，或者，如果来自相同物种，则意指通过有意的人为干预在组成和/或基因组位点上从其天然形式显著修饰的序列。
[0073]
同源性：如本文使用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果多个聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性，则它们被认为彼此“同源”。在一些实施例中，如果多个聚合分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似性，则它们被认为是彼此“同源的”。
[0074]
宿主：术语“宿主”在本文中用于指其中存在感兴趣的多肽的系统(例如，细胞、生物体等)。在一些实施例中，宿主是易被特定传染剂感染的系统。在一些实施例中，宿主是表
达特定的感兴趣的多肽的系统。在一些实施例中，宿主系统是植物。
[0075]
宿主细胞：如本文使用，其是指已引入外源核酸，例如dna或rna(重组或其它)的细胞。技术人员在阅读本公开后将理解，此类术语不仅是指特定受试者细胞，而且是指此类细胞的子代。因为某些修饰可以由于突变或环境影响而在后代中发生，此类子代可能在事实上与亲本细胞不同，但是仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施例中，宿主细胞包括选自适合于表达外源核酸(例如，重组核酸序列)的任何生命界的原核和真核细胞。在一些实施例中，宿主细胞是植物细胞。
[0076]
同一性：如本文使用，术语“同一性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如，dna分子和/或rna分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果多个聚合物分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性，则它们被认为是彼此“基本上同一的”。两个核酸或多肽序列之间的同一性百分比的计算可以例如通过出于最佳比较目的而比对两个序列来进行(例如，可以将空位引入第一和第二核酸序列中的一者或两者中以便最佳比对且出于比较目的可以舍弃非同一性序列)。在某些实施例中，处于比较目的而比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后，比较相对应位置处的核苷酸。当第一序列中的位置与第二序列中的相对应位置被相同残基(例如，核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在那个位置具有同一性。考虑到两个序列的最佳比对需要引入的空位的数量和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分比会随所述序列共享的同一性位置的数量而变化。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法实现。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用myers和miller的算法(《计算机应用生物科学(cabios)》，1989,4:11-17)确定，所述算法已并入align程序(版本2.0)。在一些示例性实施例中，使用align程序进行的核酸序列比较使用pam120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。可替代地，可以使用gcg软件包中的gap程序使用nwsgapdna.cmp矩阵确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。
[0077]“改良”、“增加”、“抑制”或“减少”：如本文使用，术语“改良”、“增加”、“抑制”、“减少”或其语法等同物指示相对于基线或其它参考测量的值。在一些实施例中，适当的参考测量可以是或包括在不存在特定试剂或治疗(例如，之前和/或之后)的其它可比较条件下或在存在适当的可比较参考试剂的情况下的特定系统(例如，单个个体)中的测量。在一些实施例中，适当的参考测量可以是或包括已知或预期在存在相关试剂或治疗的情况下以特定方式反应的可比较系统中的测量。
[0078]
引入：在将核酸片段(例如，重组dna构建体)插入到细胞中的上下文中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括对将核酸片段并入真核或原核细胞的提及，其中核酸片段可以并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体dna)，转化为自主复制子，或瞬时表达(例如，转染mrna)。
[0079]
体外：如本文使用，术语“体外”是指在人工环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内。
[0080]
体内：如本文使用，其是指在多细胞生物体内发生的事件，例如人类和非人类动物。在基于细胞的系统的上下文下，所述术语可以用于指代在活细胞(与例如体外系统相
反)内发生的事件。
[0081]
纳米颗粒：如本文使用，术语“纳米颗粒”是指直径小于1000纳米(nm)的颗粒。在一些实施例中，如由美国国家科学基金会(national science foundation)定义，纳米颗粒具有小于300nm的直径。在一些实施例中，如由美国国家卫生研究院(national institutes of health)定义，纳米颗粒具有小于100nm的直径。在一些实施例中，纳米颗粒为胶束，因为其包含通过胶束膜与本体溶液分离的闭合区室，所述胶束膜通常包含包围且围封空间或区室(例如，以界定内腔)的两亲实体。在一些实施例中，胶束膜包含至少一种聚合物，诸如例如生物相容性和/或生物可降解聚合物。在一些实施例中，纳米颗粒可以是纳米管。
[0082]
纳米颗粒组合物：如本文使用，术语“纳米颗粒组合物”是指含有至少一种纳米颗粒和至少一种附加试剂或成分的组合物。在一些实施例中，纳米颗粒组合物含有如本文所述的纳米颗粒的基本上均一集合。在一些实施例中，纳米颗粒组合物含有缀合到另一试剂(例如，药物、试剂、核酸材料)的纳米颗粒。
[0083]
纳米颗粒膜：如本文使用，术语“纳米颗粒膜”是指纳米颗粒外表面与周围环境之间的边界或界面。在一些实施例中，纳米颗粒膜是具有外表面和边界内腔的聚合物膜。
[0084]
核酸：如本文使用，在其最广泛的意义上，其是指被并入或可以被并入寡核苷酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可以经由磷酸二酯键并入寡核苷酸链的化合物和/或物质。如从上下文中可以清楚地看出，在一些实施例中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施例中，“核酸”是指包含个体核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”是或包含rna；在一些实施例中，“核酸”是或包含dna。在一些实施例中，核酸是或包含一个或多个天然核酸残基，或由其组成。在一些实施例中，核酸是或包含一个或多个核酸类似物，或由其组成。在一些实施例中，核酸类似物与核酸的不同之处在于其不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施例中，核酸是或包含一个或多个“肽核酸”，或由其组成，所述肽核酸在本领域中是已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本发明的范围内。可替代地或另外地，在一些实施例中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-n-亚磷酰胺键而不是磷酸二酯键。在一些实施例中，核酸是或包含一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，或由其组成。在一些实施例中，核酸是或包含一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷，c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、甲基化碱基、嵌入碱基及其组合)或由其组成。在一些实施例中，与天然核酸中的那些相比，核酸包含一个或多个修饰糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施例中，核酸具有编码如rna或蛋白质等功能性基因产物的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，通过以下中的一者或多者制备核酸：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合进行酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中繁殖和化学合成。在一些实施例中，核酸的长度是至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、20个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、
375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或更多个残基。在一些实施例中，核酸部分或全部是单链的；在一些实施例中，核酸部分或全部是双链的。在一些实施例中，核酸具有包含对多肽进行编码的至少一个元件的核苷酸序列，或者是对多肽进行编码的序列的互补序列。在一些实施例中，核酸具有酶活性。
[0085]
核酸材料：如本文使用，“核酸材料”在其最广泛的意义上是指仅包含一个或多个核酸物质或包含所述核酸物质与另一组分或试剂的组合的任何组合物。在一些实施例中，核酸材料可以仅包含一个或多个外源核酸序列或包含所述外源核酸序列与一个或多个内源核酸序列的组合。在一些实施例中，核酸材料可以是dna构建体。
[0086]
口服：如本文使用，短语“口服施用(oral administration/administered orally)”具有其在本领域中所理解的含义，是指经口施用化合物或组合物。在一些实施例中，口服施用可以指饲喂非人类受试者。
[0087]
可操作连接：如本文使用，其是指并列，其中所描述的组分处于允许它们以它们预期的方式起作用的关系。与功能性元件“可操作连接的”控制元件以某一方式相关联，使得在与控制元件相容的条件下实现功能性元件的表达和/或活性。在一些实施例中，“可操作连接的”控制元件与感兴趣的编码元件邻接(例如，共价连接)；在一些实施例中，控制元件以反式或以其它方式作用于感兴趣的功能性元件。在两个或更多个核酸片段的上下文中，“可操作连接”可以指例如两个或更多个dna片段在dna构建体中的关联，使得一个片段，例如蛋白质编码dna，的功能受另一片段，例如启动子，控制。
[0088]
药物组合物：如本文使用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体一起调配的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量量存在，当施用于受试者时，所述治疗方案表现出实现预定治疗效果的统计学显著概率。在一些实施例中，活性剂可以是转化植物(例如，转基因植物)。在一些实施例中，药物组合物可以被特别调配成用于以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些：口服施用，例如浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂，例如靶向颊部、舌下和全身吸收的那些、丸剂、粉剂、颗粒剂、应用于舌头的糊剂；肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，例如无菌溶液或悬浮液或缓释调配物；局部应用，例如霜剂、软膏或控释贴剂或应用于皮肤、肺部或口腔的喷雾剂；阴道内或直肠内施用，例如子宫托、霜剂或泡沫；舌下施用；眼部施用；透皮施用；或鼻腔施用、肺部施用和向其它粘膜表面施用。
[0089]
药学上可接受的：如本文使用，短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触使用，而不会产生过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，并与合理的效益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0090]
药学上可接受的载体：如本文使用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，涉及将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或转运到另一器官或身体的一部分。在与调配物的其它成分相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝
麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；ph缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；和药物调配物中采用的其它无毒相容物质。
[0091]
表型：如本文使用，术语“表型”是指性状，或是指由细胞或生物体表现出的一类或一组性状。在一些实施例中，特定表型可能与特定等位基因或基因型相关。在一些实施例中，表型可以是离散的；在一些实施例中，表型可以是连续的。
[0092]
植物：包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞及其子代的提及。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉以及小孢子的细胞。本公开的植物可以包括但不限于粮食作物、经济作物、蔬菜作物、水果、花卉、草、树木、工业原料作物、饲料作物或药用作物。粮食作物可以包括水稻、玉米、大豆、菜豆、山药、马铃薯、无壳大麦、蚕豆、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦、高粱和黑小麦等。经济作物包括但不限于油茶、油菜、油菜籽、亚麻、亚麻荠(camelina sativa)、花生、油麻(linum usitatissimum)、大麻(cannabis sativa)、向日葵、烟草、棉花、甜菜、甘蔗等。蔬菜作物可以包括但不限于萝卜、大白菜、番茄、黄瓜、辣椒、胡萝卜等。水果可以包括但不限于梨、苹果、核桃、樱桃、草莓、枣或桃；所述花卉包括观赏花卉，例如兰花、菊花、康乃馨、玫瑰、绿植等。草和树木包括但不限于杨树、橡胶树、红豆杉以及城市绿化用草木或沙漠中及干旱等恶劣条件中存活的草木。工业原料作物包括橡胶草、银胶菊、麻风树等。饲料作物包括但不限于牲畜的饲料，例如粟、高粱、燕麦、小麦、苜蓿、大麦、浮萍、三叶草、草、玉米、干草、稻草、青贮饲料、发芽谷物、豆类(例如，豆芽、新鲜麦芽或废麦芽)等；药用作物包括但不限于人参、当归和灵芝。
[0093]
质体：在植物、藻类的细胞和其它真核细胞中发现的一种膜结合细胞器，其通常携带一种或多种叶绿素或其它色素、脂肪、蛋白质、淀粉或其它化合物。
[0094]
质体基因组：如本文使用，“质体基因组”是指质体的基因组。每个叶绿体含有质体基因组的多个拷贝。
[0095]
子代：包括植物或其它活生物体的任何后代。
[0096]
多肽：如本文使用，其是指氨基酸的任何聚合链。在一些实施例中，多肽具有自然界中存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有自然界中不存在的氨基酸序列。在一些实施例中，多肽具有被工程改造的氨基酸序列，因为它是人工设计和/或产生的。在一些实施例中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者或由天然氨基酸、非天然氨基酸或两者组成。在一些实施例中，多肽可以仅包含天然氨基酸或仅包含非天然氨基酸，或者仅由天然氨基酸组成或仅由非天然氨基酸组成。在一些实施例中，多肽可以包含d-氨基酸、l-氨基酸或两者。在一些实施例中，多肽可以仅包含d-氨基酸。在一些实施例中，多肽可以仅包含l-氨基酸。在一些实施例中，多肽可以包含一个或多个侧基或其它修饰，其例如在多肽的n末端处、多肽的c末端处或其任何组合修饰或附接到一个或多个氨基酸侧链。在一些实施例中，此类侧基或修饰可以选自由以下组成的群组：乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等，包括其组合。在一些实施例中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施例中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施例中，多肽是直链的。在一些实施例中，多肽可以是或包含钉合多肽。在一些实施例中，术语“多肽”可以附加到参
考多肽、活性或结构的名称；在这种情况下，它在本文中用于指共享相关活性或结构的多肽，因此可以被认为是相同类别或家族的多肽的成员。对于每个此类别，本说明书提供，和/或本领域的技术人员将知晓，所述类别中的示例性多肽，其氨基酸序列和/或功能是已知的；在一些实施例中，此类示例性多肽是所述多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施例中，多肽类别或家族的成员表现出显著的与所述类别的参考多肽的序列同源性或同一性，与所述类别的参考多肽共享共同的序列基序(例如，特征序列元件)，和/或与所述类别的参考多肽共享共同的活性(在一些实施例中，处于可比较的水平或在指定范围内)；在一些实施例中，表现出显著的与所述类别内的所有多肽的序列同源性或同一性，与所述类别内的所有多肽共享共同的序列基序和/或共享共同的活性)。例如，在一些实施例中，成员多肽表现出的与参考多肽的序列同源性或同一性的总体程度为至少约30-40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大比例，和/或所述成员多肽包含至少一个区域(例如，在一些实施例中可能是或包含特征序列元件的保守区域)，所述区域表现出非常高的序列同一性，通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％。此保守区域通常涵盖至少3-4个，通常至多20个或更多个氨基酸；在一些实施例中，保守区域涵盖至少一段至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个连续氨基酸。在一些实施例中，相关多肽可以包含亲本多肽的片段或由其组成。在一些实施例中，可用的多肽可以包含多个片段或由其组成，其中每一个片段以不同于感兴趣的多肽中所存在的彼此相对空间排列存在于同一个亲本多肽中(例如，在亲本中直接连接的片段在感兴趣的多肽中可以在空间上分离或反之亦然，和/或片段可以在感兴趣的多肽中以不同于亲本中的顺序存在)，使得感兴趣的多肽是其亲本多肽的衍生物。
[0097]
预防：如本文使用，当结合疾病、病症和/或病状的出现使用时，其是指降低罹患疾病、病症和/或病状的风险和/或延迟疾病、病症或病状的一种或多种特征或症状的发作。当疾病、病症或病状的发作已被延迟预定的时间段时，可以认为预防完成。
[0098]
启动子：如本文使用，“启动子”是指用于启动转录的dna调节元件。植物启动子是能够在植物细胞中发起转录的启动子，无论其来源是否为植物细胞，例如众所周知，农杆菌启动子在植物细胞中起作用。因此，植物启动子包含从植物、植物病毒和如农杆菌和慢生根瘤菌等细菌获得的启动子dna。处于发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织，例如叶、根或种子中发起转录的启动子。此类启动子被称为“组织优选的”。仅在某些组织中发起转录的启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动一个或多个器官中的某些细胞类型，例如根或叶中的血管细胞中的表达。“诱导型”或“阻遏型”启动子是处于环境控制之下的启动子。可能影响诱导型启动子进行的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或某些化学物质或光的存在。组织特异性、组织优选、细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数条件下有活性的启动子。可用于本发明的启动子没有特别限制。本领域的技术人员可以根据自己的知识选择合适的启动子。
[0099]
蛋白质：如本文使用，术语“蛋白质”是指多肽(即一串通过肽键彼此连接的至少两个氨基酸)。蛋白质可以包含除氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以以其它方式加工或修饰。本领域的普通技术人员将了解，“蛋白质”可以是如由细胞产
生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可以是其特征部分。普通技术人员将了解，蛋白质有时可以包含多于一个多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它手段相关联。多肽可以含有l-氨基酸、d-氨基酸或两者，并且可以含有本领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。可用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施例中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于约20个氨基酸或小于约10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。
[0100]
纯：如本文使用，如果试剂或实体基本上不含其它组分，则它是“纯的”。例如，含有超过约90％的特定试剂或实体的制剂通常被认为是纯制剂。在一些实施例中，试剂或实体是至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％纯。
[0101]
重组：如本文使用，其旨在指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、产生、创造和/或分离的多肽，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；从重组的组合人多肽文库中分离出的多肽；从动物(例如，小鼠、兔、绵羊、鱼等)中分离出的多肽，所述动物是转基因的或已被操纵以表达一个或多个基因或编码所述多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域和/或指引所述多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域的表达的基因组分；和/或通过任何其它手段制备、表达、创造或分离的多肽，所述其它手段涉及将选定的核酸序列元件彼此剪接或连结，化学合成选定的序列元件，和/或以其它方式生成编码所述多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域和/或指引所述多肽或其一个或多个组分、部分、元件或结构域的表达的核酸。在一些实施例中，此类选定的序列元件中的一者或多者发现于自然界中。在一些实施例中，此类选定的序列元件中的一者或多者通过计算机模拟设计。在一些实施例中，一个或多个此类选定的序列元件来自已知序列元件的诱变(例如，体内或体外)，例如来自天然或合成来源，诸如例如在感兴趣的来源生物体(例如，人类、小鼠等)的种系中。
[0102]
参考：如本文使用，其描述了相对于其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施例中，将感兴趣的试剂、动物、个体、群体、样本、序列或值与参考或对照试剂、动物、个体、群体、样本、序列或值进行比较。在一些实施例中，与感兴趣的测试或确定基本上同时测试和/或确定参考或对照。在一些实施例中，参考或对照是任选地体现在有形介质中的历史参考或对照。通常，如本领域的技术人员将理解，在与评估中的条件或环境相当的条件或环境下确定或表征参考或对照。本领域的技术人员将了解何时存在足够的相似性来证明对特定的可能参考或对照的依赖和/或比较。
[0103]
反应：如本文使用，对治疗的反应可以指由治疗引起或与治疗相关的受试者的病状中的任何有利改变。此类改变可以包括病状的稳定(例如，预防在未进行治疗时会发生的恶化)、病状的症状的改善和/或病状的治愈前景的改良等。用于评估反应的技术包括但不限于临床检验、正电子发射断层扫描、胸腔x射线ct扫描、mri、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、从受试者获得的样本中的肿瘤标记物的存在或水平、细胞学和/或组织学。可以以任何适合的方式选择确切的反应准则，前提条件是当比较肿瘤和/或患者的群组时，待比较的群组是基于用于确定反应率的相同或相当准则来评估的。本领域的普通技术人员将能够选择适当的准则。
[0104]
风险：如将从上下文中理解，疾病、病症和/或病状的“风险”是指特定个体将罹患疾病、病症和/或病状的可能性。在一些实施例中，风险被表示为百分比。在一些实施例中，风险为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90，至多为100％。在一些实施例中，风险表示为相对于与参考样本或参考样本组相关联的风险的风险。在一些实施例中，参考样本或参考样本组具有已知的疾病、病症、病状和/或事件的风险。在一些实施例中，参考样本或参考样本组来自与特定个体相当的个体。在一些实施例中，相对风险为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
[0105]
样本：如本文使用，术语“样本”通常是指获自或来源于感兴趣的来源的材料的等分试样，如本文所述。在一些实施例中，感兴趣的来源是生物或环境来源。在一些实施例中，感兴趣的来源可以是或包括细胞或生物体，例如微生物、植物或动物(例如，人)。在一些实施例中，感兴趣的来源是或包括生物组织或流体。在一些实施例中，生物组织或流体可以是或包括羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊液、耵聍、乳糜、食糜、精液、内淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、胸膜液、脓、水状分泌物、唾液、皮脂、精子、血清、包皮垢、痰、滑膜液、汗液、眼泪、尿液、阴道分泌物、玻璃状液、呕吐物和/或其组合或组分。在一些实施例中，生物流体可以是或包括细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间质液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施例中，生物流体可以是或包括植物渗出液。在一些实施例中，生物组织或样本可以通过例如抽吸、活检(例如，细针或组织活检)、拭子(例如，口腔、鼻腔、皮肤或阴道拭子)、刮擦、手术、洗涤或灌洗(例如，支气管肺泡、导管、鼻、眼、口腔、子宫、阴道或其它洗涤或灌洗)来获得。在一些实施例中，生物样本是或包括从个体获得的细胞。在一些实施例中，样本是通过任何适当的方式直接从感兴趣的来源获得的“原始样本”。在一些实施例中，如从上下文中可以清楚地看出，术语“样本”是指通过处理原始样本(例如，通过去除其一个或多个组分和/或通过向其加入一个或多个试剂)而获得的制剂。例如，使用半渗透膜进行过滤。此“经处理的样本”可以包括例如从样本提取的核酸或蛋白质，或通过使原始样本经受一种或多种技术，例如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等，而获得的核酸或蛋白质。
[0106]
小分子：如本文使用，术语“小分子”意指低分子量有机和/或无机化合物。一般来说，“小分子”是大小小于约5千道尔顿(kd)的分子。在一些实施例中，小分子小于约4kd、3kd、约2kd或约1kd。在一些实施例中，小分子小于约800道尔顿(d)、约600d、约500d、约400d、约300d、约200d或约100d。在一些实施例中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、小于约800g/mol或小于约500g/mol。在一些实施例中，小分子不是聚合物。在一些实施例中，小分子不包含聚合部分。在一些实施例中，小分子不是蛋白质或多肽和/或不包含蛋白质或多肽(例如，不是寡肽或肽)。在一些实施例中，小分子不是多核苷酸和/或不包含多核苷酸(例如，不是寡核苷酸)。在一些实施例中，小分子不是多糖和/或不包含多糖；例如，在一些实施例中，小分子不是糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂等。在一些实施例中，小分子不是脂质。在一些实施例中，小分子是调节剂(例如，是抑制剂或活化剂)。在一些实施例中，小分子具有生物活性。在一些实施例中，小分子是可检测的(例如，包含至少一个可检测部分)。在一些实施例中，小分子是治疗剂。阅读本公开后，本领域的普通技术人员应了解，本文中所述的某些小分子化合物可以以多种形式中的任一种提供和/或利用，诸如例如晶体形式、盐形式、受保护形式、前药形式、酯形式、异构形式(例如，光学和/或结构异构
体)、同位素形式等。本领域的技术人员将了解，某些小分子化合物具有可以以一种或多种立体异构形式存在的结构。在一些实施例中，此类小分子可以根据本公开以单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式利用，或者可以是立体异构体的混合物的形式；在一些实施例中，此类小分子可以根据本公开以外消旋混合物的形式利用。本领域的技术人员将了解，某些小分子化合物具有可以以一种或多种互变异构形式存在的结构。在一些实施例中，此类小分子可以根据本公开以单独的互变异构体的形式或以在互变异构体形式之间相互转化的形式利用。本领域的技术人员将了解，某些小分子化合物具有允许同位素取代(例如，2h或3h取代h；
11
c、
13
c或
14
c取代12c；
13
n或
15
n取代14n；
17
o或
18
o取代16o；
36
cl取代xxc；
18
f取代xxf；131i取代xxxi；等)的结构。在一些实施例中，此类小分子可以根据本公开以一种或多种同位素修饰的形式或其混合物利用。在一些实施例中，对特定小分子化合物的提及可能涉及所述化合物的特定形式。在一些实施例中，特定小分子化合物可以以盐形式(例如，以酸加成或碱加成盐形式，这取决于化合物)提供和/或利用；在一些此类实施例中，盐形式可以是药学上可接受的盐形式。在一些实施例中，当小分子化合物是自然界中存在或发现的小分子化合物时，所述化合物可以根据本公开以与其在自然界中存在或发现的形式不同的形式提供和/或利用。本领域的普通技术人员将了解，在一些实施例中，含有绝对量或相对量的特定小分子化合物或其特定形式的所述化合物的制剂与存在于参考制剂或来源中的化合物不同，所述绝对量或相对量与存在于感兴趣的参考制剂中(例如，来自如生物或环境来源等感兴趣的来源的原始样本中)的化合物或形式的绝对量或相对量(相对于制剂的另一组分，包括例如所述化合物的另一形式)不同。因此，在一些实施例中，例如，小分子化合物的单一立体异构体的制剂可以被认为是与化合物的外消旋混合物不同的化合物形式；小分子化合物的特定盐可以被认为是与所述化合物的另一盐形式不同的形式；仅包含含有双键的一种构象异构体((z)或(e))的化合物形式的制剂可以被认为是与含有双键的另一构象异构体((e)或(z))的化合物形式不同的化合物形式；一个或多个原子是不同于参考制剂中存在的同位素的制剂可以被认为是不同的形式；等等。
[0107]
稳定：术语“稳定”当应用于本文中的组合物时，意指组合物在一组指定条件下在一段时间内维持其物理结构和/或活性的一个或多个方面。在一些实施例中，所述时间段是至少约一小时；在一些实施例中，所述时间段是约5小时、约10小时、约一(1)天、约一(1)周、约两(2)周、约一(1)个月、约两(2)个月、约三(3)个月、约四(4)个月、约五(5)个月、约六(6)个月、约八(8)个月、约十(10)个月、约十二(12)个月、约二十四(24)个月、约三十六(36)个月或更长时间。在一些实施例中，所述时间段在约一(1)天到约二十四(24)个月、约两(2)周到约十二(12)个月、约两(2)个月到约五(5)个月等范围内。在一些实施例中，指定条件是环境条件(例如，在室温和环境压力下)。在一些实施例中，指定条件是生理条件(例如，在体内或在约37℃下，例如在血清或磷酸盐缓冲盐水中)。在一些实施例中，指定条件是在冷藏下(例如，处于或低于约4℃、-20℃或-70℃)。在一些实施例中，指定条件是在暗处。
[0108]
受试者：如本文使用，术语“受试者”或“测试受试者”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的而根据本公开向其施用所提供的化合物或组合物的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、鸡、山羊、牛、牛、非人类灵长类动物和人类；昆虫；蠕虫等)和植物。在一些实施例中，非人类动物可以是单胃动物，例如猪、家禽或马。在一些实施例中，非人类动物可以是反刍动物，例如牛、绵羊和/或山羊。在一些实施
peripherally)”具有其在本领域所理解的含义，是指施用化合物或组合物，使得其进入接受者的系统。
[0115]
治疗剂：如本文使用，短语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗作用和/或引发期望的生物学和/或药理学作用的试剂。在一些实施例中，治疗剂是可以用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发病率的任何物质。
[0116]
治疗有效量：如本文使用，术语“治疗有效量”意指当作为治疗方案的一部分施用时引发期望的生物反应的物质(例如，治疗剂、组合物和/或调配物)的量。在一些实施例中，物质的治疗有效量是当向罹患或易患疾病、病症和/或病状的受试者施用时足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或病状和/或延迟其发作的量。如本领域的普通技术人员将了解，物质的有效量可以取决于如期望生物端点、待递送的物质、靶细胞或组织等因素而有所不同。例如，用于治疗疾病、病症和/或病状的调配物中的化合物的有效量是减轻、改善、缓解、抑制、预防所述疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发病率的量。在一些实施例中，治疗有效量以单个剂量施用；在一些实施例中，需要多个单位剂量来递送治疗有效量。
[0117]
转化：如本文使用，其是指将外源dna引入宿主细胞的任何过程。转化可以在天然或人工条件下使用本领域众所周知的多种方法进行。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法。在一些实施例中，特定的转化方法基于所转化的宿主细胞来选择，并且其可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、交配、脂转染或使用化学和/或纳米颗粒或微粒助剂。在一些实施例中，“转化”细胞被稳定转化，因为插入的dna能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分(例如，在细胞核或叶绿体中)复制。在一些实施例中，转化细胞在有限时间内瞬时表达所引入的核酸。
[0118]
转基因植物：如本文使用，“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选地，异源多核苷酸稳定整合在基因组内，使得多核苷酸传递给连续世代。异源多核苷酸可以仅整合到基因组中或作为重组dna构建体的一部分进行整合。
[0119]
性状：如本文使用，术语“性状”是指个体的可检测属性。通常，特定性状的表达可能完全或部分受个体的遗传构成的影响。在一些实施例中，性状是特定个体、品系、品种或杂交品种的特征，例如可以依赖其(单独地或作为集合的一部分)来将所述个体、品系、品种或杂交品种与其它个体、品系、品种或杂交品种区分开来。
[0120]
治疗：如本文使用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指用以部分地或完全地减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发病率的任何方法。可以向没有表现出疾病、病症和/或病状的迹象的受试者施用治疗。在一些实施例中，可以向仅表现出所述疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者施用治疗，例如出于降低罹患与所述疾病、病症和/或病状相关联的病理的风险的目的。
[0121]
疫苗接种或疫苗：如本文使用，术语“疫苗接种”是指旨在例如对引起疾病的试剂生成免疫反应的组合物的施用。出于本发明的目的，疫苗接种可以在暴露于引起疾病的试剂之前、期间和/或之后施用，并且在某些实施例中，疫苗接种可以在暴露于所述试剂之前、期间和/或之后立即施用。在一些实施例中，疫苗接种包括间隔适当时间的接种疫苗组合物
的多次施用。如本文使用，术语“疫苗”是指旨在生成免疫反应的任何组合物。在一些实施例中，疫苗包含经工程改造以表达抗原的转基因生物。
[0122]
变体：如本文在分子，例如核酸、蛋白质或小分子的上下文中使用，术语“变体”是指表现出显著的与参考分子的结构一致性但在结构上不同于参考分子的分子，例如相较于参考实体，存在或不存在一个或多个化学部分或处于一个或多个化学部分的水平。在一些实施例中，变体在功能上也与其参考分子不同。一般来说，特定分子是否被恰当地视为参考分子的“变体”基于其与参考分子的结构一致性程度。如本领域的技术人员将了解，任何生物或化学参考分子都具有某些特征结构元件。根据定义，变体是共享一个或多个此类特征结构元件但在至少一个方面与参考分子不同的独特分子。仅举几个实例，多肽可以具有包含多个氨基酸的特征序列元件，所述氨基酸在线性或三维空间中相对于彼此具有指定位置和/或有助于特定结构基序和/或生物学功能；核酸可以具有包含多个核苷酸残基的特征序列元件，所述核苷酸残基在线性或三维空间中相对于彼此具有指定位置。在一些实施例中，变体多肽或核酸可以由于氨基酸或核苷酸序列的一种或多种差异和/或化学部分(例如，碳水化合物、脂质、磷酸根基团)的一种或多种差异而不同于参考多肽或核酸，所述化学部分是多肽或核酸的共价组分(例如，与附接到多肽或核酸主链)。在一些实施例中，变体多肽或核酸表现出与参考多肽或核酸的总体序列同一性为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。在一些实施例中，变体多肽或核酸不与参考多肽或核酸共享至少一个特征序列元件。在一些实施例中，参考多肽或核酸具有一种或多种生物活性。在一些实施例中，变体多肽或核酸共享参考多肽或核酸的一种或多种生物活性。在一些实施例中，变体多肽或核酸缺乏参考多肽或核酸的一种或多种生物活性。在一些实施例中，与参考多肽或核酸相比，变体多肽或核酸表现出降低的一种或多种生物活性的水平。在一些实施例中，如果感兴趣的多肽或核酸具有与参考多肽或核酸具有同一性但在特定位置具有少量序列改变的氨基酸或核苷酸序列，则它被认为是所述参考的“变体”。通常，与参考相比，变体中的少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％或约2％的残基被取代、插入或缺失。在一些实施例中，与参考相比，变体多肽或核酸包含约10个、约9个、约8个、约7个、约6个、约5个、约4个、约3个、约2个或约1个经取代的残基。通常，与参考相比，变体多肽或核酸包含非常少量的(例如，少于约5个、约4个、约3个、约2个或约1个)经取代、经插入或经缺失的功能性残基(即参与特定生物活性的残基)。在一些实施例中，与参考相比，变体多肽或核酸包含不多于约5个、约4个、约3个、约2个或约1个添加或缺失，并且在一些实施例中，不包含添加或缺失。在一些实施例中，与参考相比，变体多肽或核酸包含少于约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个添加或缺失，通常少于约5个、约4个、约3个或约2个添加或缺失。在一些实施例中，参考多肽或核酸是在自然界中发现的。在一些实施例中，参考多肽或核酸是人多肽或核酸。
[0123]
载体：如本文使用，“载体”是指一种核酸分子，其能够转运其所连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”，它是指附加的dna区段可以连结到其中的环状双链dna环。另一类型的载体是病毒载体，其中附加的dna区段可以连结到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时可以被整合到宿主细胞
的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指引与其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
[0124]
野生型：如本文使用，术语“野生型”具有其在本领域中所理解的含义，意指“正常”(与突变、患病、改变等形成对比)状态或环境下具有在自然界中发现的结构和/或活性的实体。本领域的普通技术人员将了解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式存在(例如，等位基因)。
具体实施方式
[0125]
本说明书尤其涵盖免疫原性组合物，例如包含修饰植物或其一部分的植物基疫苗组合物，以及向如反刍牲畜等动物施用所述组合物的方法。还公开了改造植物以表达外源核酸序列，例如编码感兴趣的抗原的方法。在一些实施例中，将一个或多个外源核酸序列引入宿主植物细胞的方法包括例如经由转化。在一些实施例中，植物细胞的转化包括将外源核酸序列转化到宿主植物细胞的质体基因组(例如，叶绿体基因组)中。在一些实施例中，将外源核酸序列传递给子代。本文描述了使用某些植物宿主物种(例如，高粱和粟)生产植物基疫苗的方法及其施用方法。
[0126]
在牛饲养场操作中，大环内酯类抗生素被广泛用于控制坏死梭杆菌的负面影响，其中泰乐菌素最为有效(brown等人，1973；brown等人，1975；tadepalli等人，2009)。然而，由于这类抗生素也被用作人类治疗药物来控制由细菌感染和炎症引起的各种小病，牛肉行业正在寻求替代治疗方案。
[0127]
对坏死梭杆菌疫苗fusogard的研究表明，在背景饲喂牛中，某种程度地预防了腐蹄病并降低了肝脓肿的可能性，但高谷物饮食似乎无法发挥保护作用(checkley等人，2005)。sun等人(2009)为提高疫苗效力所做的努力实现了对命名为pl1和pl4的ltka的两个高度免疫保护亚区的标识。尽管取得了这些进展，但皮下注射的繁琐和费力的性质(例如，需要训练有素的医疗人员，涉及大量动物时还需面临后勤挑战)限制了疫苗接种的实际数量，因此也限制了这种治疗的有效性。此外，其它挑战与传统疫苗相关联，包括成本、疫苗在储存期间的稳定性，以及对强化加工和储存的需求。这些因素使得使用常规疫苗和为饲养场中的大量牲畜接种疫苗的施用方法变得特别具有挑战性。
[0128]
使用如本文所述的植物基疫苗的简便性和相对安全性可以使此类作物的生产对于控制或在一些情况下预防疾病具有吸引力。可食用疫苗为免疫提供了另一途径，特别是在侵袭部位是胃肠道粘膜表面的疾病中。植物基可食用疫苗已被证明可刺激粘膜和全身体液反应，并且它们被细胞壁的生物包封防止了在胃中过早消化(lakshmi等人，2013)。此外，它们可以通过简单的牧场/饲槽饲喂来施用，总体而言是一种低成本的选择(kwon和daniell，2015)。
[0129]
转基因植物进行所有相关的翻译后过程(折叠、糖基化等)，以实现免疫原性抗原的适当三维组装。对使用转基因作物来进行动物的口服免疫的研究取得了一些有限的成功，包括用表达肠病毒蛋白的转基因番茄饲喂的小鼠的免疫(chen等人，2006)，在用表达狂犬病病毒糖蛋白的玉米饲喂的绵羊中诱导免疫保护反应(loza-rubio等人，2012)，以及用转基因莴苣产生的肝吸虫抗原饲喂的反刍动物(牛和羊)的口服疫苗接种(wesolowska等人，2018)。
[0130]
在兽医研究中使用植物基可食用疫苗也取得了一些成功(综述参见jacob等人，2013；和takeyama等人，2015)，并且loza-rubio等人(2012)报道了首个针对反刍动物有效的植物基口服疫苗，最近的成功由等人(2018)取得。
[0131]
在植物中开发有效的可食用疫苗的最重要挑战是抗原材料的足够高的异位表达水平(rybicky，2009；rojas-anaya等人，2009)。叶绿体转化是克服表达不足的一种有吸引力的方法，因为每个植物细胞都有10,000个叶绿体基因组拷贝可用于表达构建体(shahid和daniell，2016)，并且转质体基因组(transplastomic)表达研究表明其产生高达》70％的总可溶性蛋白(ruhlman等人，2010，另参见mcbride等人，1995)。其它优点包括减少转基因扩散的母系遗传(heifetz，2000)、每次转化事件的多顺反子表达(hanson等人，2013)以及同源重组导致的基因沉默减少(参见adem等人，2017和其中的参考文献)。
[0132]
尽管叶绿体转化的大部分成功都是在烟草属中报道的(rigano等人，2012)，但除了如大豆、莴苣和苜蓿等其它双子叶作物(cardi等人，2010，wei等人，2011)，类似的成功在禾本科的谷类中较为罕见，因为单子叶植物似乎对于当前转基因方法较为顽固。
[0133]
在本文中介绍了几种将外源基因引入宿主植物基因组，例如高粱和粟的谷类物种的方法。一种方法是靶向宿主植物的叶绿体基因组进行例如位点特异性整合。
[0134]
因此，在一些实施例中，合成能够表达此处所述的某些抗原(例如，白细胞毒素或其片段)的免疫原性组合物(例如，植物基组合物)的当前方法将涉及将外源核酸材料整合到宿主物种的质体基因组(例如，叶绿体基因组)中，尤其是经由同源重组，从而得到适合口服施用于反刍牲畜的推定疫苗。
[0135]
某些挑战仍然存在于植物基疫苗的开发中，包括物种特异性挑战，特别是在使用叶绿体转化时。例如，基因改造植物的稳定性、储存、调配和/或给药和施用以及公众意见已经并且确实对植物基疫苗的开发和使用提出了挑战。此外，某些谷类作物，包括高粱和粟，已证明对许多转化方法具有抗性，包括农杆菌介导的核转化，并且在这些物种中尚未证明可成功地将一个或多个转基因靶向并整合到叶绿体基因组中以表达外源抗原序列。
[0136]
一般来说，成功的叶绿体转化尤其依赖于详细的质体基因组序列信息，以例如标识适合同源重组和安全转基因并入的叶绿体基因组的区域。然而，除了原始序列信息之外，还必须做大量工作以确定用于整合外源核酸(例如，感兴趣的转基因)的最佳或甚至可行的位点。与开发和/或施用植物基疫苗相关联的其它挑战在本文中得到解决，并且包括可以整合到例如高粱、粟和麦类物种的叶绿体基因组内的特定位置并实现抗原(例如，白细胞毒素或其片段)的表达的靶标特异性核酸构建体的开发。
[0137]
本公开涵盖的方法和组合物的另一特征是监测植物中的外源核酸序列的成功转化和/或表达的程度和性质的能力。例如，一种监测植物中的外源基因表达的方法是共表达一个或多个标志物(“选择标志物”)，例如在适当条件下发射荧光的那些标志物。此类标志物包含已在水母(维多利亚多管发光水母)中标识的绿色荧光蛋白(gfp)(ormo等人，1996)，以及产生青色荧光蛋白(goedhard等人，2012)和黄色荧光蛋白(yfp，nagai等人，2002)的维多利亚多管发光水母突变体，以及在蘑菇海葵(圆盘海葵)物种中标识的红色荧光蛋白(dsred，bevis等人，2002)。在一些实施例中，本公开提供了一种或多种此类蛋白质在确认转基因材料的并入和/或表达中的用途。
[0138]
为了适当地表达外源蛋白质，有必要为编码这些蛋白质的基因配备适当的dna标
签，以促进遗传材料的正常细胞加工。一般来说，外源蛋白表达需要三类主要的dna标签；两个在编码区的5'端处以及一个在3'端处。在5'端的是：启动子——用作rna结合位点的dna标签，和5'非翻译区(也被称为前导序列)，它帮助新产生的rna结合到核糖体。在3'端处，转录终止子序列对于使转录复合物脱离并标记转录结束是必需的。
[0139]
总之，在一些实施例中，核酸材料被设计成将编码例如感兴趣的抗原的外源核酸序列递送到质体基因组(例如，叶绿体基因组)以进行同源重组整合，并且可以包含1)补充宿主物种的叶绿体的dna标签，2)编码一个或多个感兴趣抗原的一个或多个转基因，和3)一个或多个遗传标志物，以及4)正确翻译和表达转基因的遗传体系。在一些实施例中，此体系可以全部或部分地由外源供应和/或在非天然控制机制的控制下。在一些实施例中，此体系可以全部或部分地对植物和/或植物细胞器是内源的。
[0140]
植物物种
[0141]
根据各个实施例，根据本公开所涵盖的方法来使用多个植物物种中的任一者，例如以整合和表达外源核酸(例如，编码感兴趣的抗原)。本公开的植物物种或宿主物种可以包括但不限于整株植物、成熟植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞及其子代。植物细胞可以包括但不限于来自种子、幼苗、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉和小孢子的一种或多种细胞。本公开的植物可以包括但不限于粮食作物、经济作物、蔬菜作物、豆类、水果、花卉、草、树木、工业原料作物、饲料作物或药用作物。
[0142]
粮食作物，例如谷类作物，可以包括水稻、玉米、大豆、菜豆、山药、马铃薯、无壳大麦、蚕豆、小麦、大麦、大蒜、粟、黑麦、燕麦、黑小麦、苏丹草、大豆和高粱。经济作物可以包括但不限于油茶、油菜籽、葡萄籽、亚麻、亚麻荠(camelina sativa)、花生、油麻(linum usitatissimum)、大麻(cannabis sativa)、向日葵、烟草、棉花、甜菜、甘蔗。
[0143]
蔬菜作物可以包括但不限于萝卜、大白菜、番茄、黄瓜、洋葱、玉米、绿叶蔬菜(例如，菠菜、羽衣甘蓝、宽叶羽衣甘蓝、莙荙菜和莴苣)、芥末、甘薯、卷心菜、芹菜、甜菜、甜菜根、萝卜、芜菁、辣椒、胡萝卜、芦笋、西兰花、卷心菜、花椰菜、茄子、胡椒和马铃薯。
[0144]
水果可以包括但不限于梨、苹果、核桃、樱桃、草莓、枣或桃。花卉包括观赏花卉，例如兰花、菊花、康乃馨、玫瑰和绿植。
[0145]
草和树木可以包括但不限于杨树、橡胶树、红豆杉以及城市绿化用草木或沙漠中及干旱等恶劣条件中存活的草木。
[0146]
饲料作物可以包括用于饲喂如牛、兔、羊、马、鸡和猪等家畜，例如用于牲畜食用的任何植物，或牲畜的饲料。实例包括但不限于粟、高粱、燕麦、小麦、苜蓿、大麦、浮萍、三叶草、草、玉米、干草、稻草、青贮饲料、发芽谷物、豆类(例如，豆芽、新鲜麦芽或废麦芽)。
[0147]
示例性药用作物包括但不限于人参、当归和灵芝。
[0148]
在一些实施例中，本公开的植物物种可以是亚种的任何植物物种的杂交。例如，在一些实施例中，谷类物种可以包括两个高粱物种的杂交。在一些实施例中，高粱物种包括高丹草，其由(sorghum bicolor((l.)moench)
×
(sorghum
×
drummondii)(nees ex.steud.))的杂交产生。
[0149]
核酸材料
[0150]
本公开的核酸材料可以仅包含核酸或包含核酸与一个或多个其它试剂或组合物的组合。在一些实施例中，核酸材料还可以指dna构建体。根据各个实施例，核酸材料的组分
可以包括但不限于一个或多个靶向序列、选择序列、外源dna序列、增强子序列、启动子序列和终止序列。
[0151]
在一些实施例中，核酸材料是或包含rna寡核苷酸、dna寡核苷酸、质粒或其任何组合。dna寡核苷酸可以是单链dna寡核苷酸、双链dna寡核苷酸。在一些实施例中，dna寡核苷酸可以来自任何dna来源，包括但不限于基因组dna、质粒dna、噬菌体dna、cdna、合成dna序列或任何其它适当的dna来源。在一些实施例中，rna寡核苷酸可以包含mrna、snrna、sirna或mirna寡核苷酸中的一者或多者。
[0152]
在一些实施例中，核酸材料可以包含与包含上述元件的dna序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性并且例如在图1-4中的构建体1-4中(seq id no:17-20)示出的dna构建体。本公开的dna构建体可以包括包含图1-4中的构建体1-4中示出的组分的任何组合dna构建体。
[0153]
外源核酸序列
[0154]
如本文使用，术语外源核酸序列是指对生物体或宿主细胞而言非天然的任何核酸(即通常不在特定生物体中表达，也被称为“转基因”)。
[0155]
在一些实施例中，外源核酸序列可以是或包括编码多于一个感兴趣的转基因的核酸序列。在一些实施例中，外源核酸序列可以编码感兴趣的多肽，例如单克隆抗体、片段抗原结合(fab)片段、细胞因子、受体、抗原、人疫苗、动物疫苗和植物多肽。在一些实施例中，转基因是感兴趣的抗原的免疫原性部分。
[0156]
抗原
[0157]
在一些实施例中，外源核酸序列可以编码特定抗原或抗原性片段。在一些实施例中，编码抗原或抗原性片段的外源核酸序列，当被引入植物细胞中时，当由人或动物等受试者消耗时，可以起到疫苗的作用。在一些实施例中，感兴趣的外源核酸序列可以包括但不限于编码病毒(例如，病原病毒，例如包含毒力因子)或其一部分(例如，其片段或变体)、细菌(例如，病原细菌)或其一部分(例如，其片段或变体)、或真菌(例如，病原真菌)或其一部分(例如，其片段或变体)、或原生动物(例如，病原原生动物)或其一部分(例如，其片段或变体)的序列。在一些实施例中，抗原可以是或包含由病原病毒(包含毒力因子)、病原细菌、病原真菌和/或病原原生动物提供或与其相关联的全长蛋白质或肽的免疫原性部分或片段。
[0158]
病原病毒的实例可以包括但不限于单链rna病毒(有和没有包膜)、双链rna病毒和单链和双链dna病毒，例如(但不限于)烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、豌豆耳突花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、马铃薯病毒x和y、康乃馨潜伏病毒、甜菜黄化病毒、玉米褪绿病毒、烟草坏死病毒、芜菁黄花叶病毒、番茄丛矮病毒、南方菜豆花叶病毒、大麦黄矮病毒、番茄斑萎病毒、莴苣坏死黄化病毒、伤瘤病毒、玉米条纹病毒和花椰菜花叶病毒。
[0159]
在一些实施例中，抗原是或包含细菌或其一部分(例如，其片段或变体)，例如由细菌产生的毒力因子或其片段或变体。在一些实施例中，毒力因子可以由通常感染反刍牲畜或另一非人类动物的细菌产生。在一些实施例中，细菌可以包括但不限于坏死梭杆菌(包括例如其亚种，坏死梭杆菌坏死亚种和坏死梭杆菌基形亚种中的一者)、溶血性曼氏杆菌(巴氏杆菌)、伴放线放线杆菌、溶血性巴氏杆菌、伴放线放线杆菌，细菌病原体的实例包括来自以下属和种的细菌：衣原体(例如，肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体)、军团菌(例如，嗜肺军团菌)、李斯特菌(例如，单核细胞增生李斯特菌)、立克次体(例如，澳洲立克次体、立
氏立克次体、小株立克次体、康氏立克次体、西伯利亚立克次体、日本立克次体、非洲立克次体、斑疹伤寒立克次体、普氏立克次体)、不动杆菌(例如，鲍氏不动杆菌)、博代氏杆菌(例如，百日咳博代氏杆菌)、芽孢杆菌(例如，炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌)、拟杆菌属(例如，脆弱拟杆菌)、巴尔通体(例如，汉氏巴尔通体)、疏螺旋体(例如，伯氏疏螺旋体)、布鲁氏菌(例如，流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌)、弯曲杆菌(例如，空肠弯曲杆菌)、梭菌(例如，肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌)、棒状杆菌(例如，白喉棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌)、肠球菌(例如，粪肠球菌、屎肠球菌)、埃希氏杆菌(例如，大肠埃希氏杆菌)、弗朗西斯菌(例如，土拉弗朗西斯菌)、嗜血杆菌(例如，流感嗜血杆菌)、螺杆菌(例如，幽门螺杆菌)、克雷伯菌(例如，肺炎克雷伯菌)、钩端螺旋体(例如，问号钩端螺旋体)、分枝杆菌(例如，麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌)、支原体(例如，肺炎支原体)、奈瑟菌(例如，淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌)、假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)、沙门氏菌(例如，伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠道沙门氏菌)、志贺氏菌(例如，痢疾志贺氏菌、宋内志贺氏菌)、葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌)、链球菌(例如，无乳链球菌、肺炎链球菌、产脓链球菌)、密螺旋体(例如，苍白密螺旋体)、弧菌(例如，霍乱弧菌、创伤弧菌)和耶尔森菌(例如，鼠疫耶尔森菌)。
[0160]
在一些实施例中，毒力因子通常可以包括但不限于内毒素和/或外毒素。在一些实施例中，毒力因子可以包括但不限于霍乱毒素、破伤风毒素、肉毒杆菌毒素、白喉毒素、链球菌溶血素、肺炎链球菌溶血素、α-毒素、α-毒素、磷脂酶c、β-毒素、链球菌有丝分裂外毒素、链球菌致热毒素、白细胞毒素a、血凝素、溶血素、透明质酸酶、蛋白酶、凝固酶、脂肪酶、脱氧核糖核酸酶和肠毒素、m蛋白、脂磷壁酸、透明质酸胶囊、破坏性酶(包括链激酶、链道酶和透明质酸酶)、链球菌溶血素、阿林素a(alin a)、内化素b、李斯特菌溶血素o、acta和细胞致死膨胀毒素。
[0161]
原生动物病原体的实例包括以下生物体：隐孢子虫、内阿米巴(例如，溶组织内阿米巴)、贾第鞭毛虫(例如，蓝氏贾第鞭毛虫)、利什曼原虫(例如，杜氏利什曼原虫)、疟原虫某些种(例如，恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫)、弓形虫(例如，刚地弓形虫)、毛滴虫(例如，阴道毛滴虫)和锥虫(例如，布氏锥虫、克氏锥虫)。其它原生动物的文库也可以根据本文所述的方法产生和使用。
[0162]
真菌病原体的实例包括以下：曲霉、念珠菌(例如，白色念珠菌)、孢子菌(例如，粗球孢子菌)、隐球菌(例如，新型隐球菌)、组织胞浆菌(例如，荚膜组织胞浆菌)和肺孢子虫(例如，卡氏肺孢子虫)。
[0163]
在一些实施例中，转化植物细胞，例如用作或产生植物基疫苗，可以用于治疗和/或预防反刍牲畜的常见疾病，包括但不限于酮血症、酸中毒、橡子中毒、无形体病、炭疽、黑腿病、胃气胀、蓝舌病、肉毒杆菌中毒、牛贫血、牛巴贝虫病、牛呼吸道疾病综合征(brdc)、牛海绵状脑病(bse)、牛滴虫病、蕨中毒、brsv(牛呼吸道合胞病毒)、布鲁氏菌病、bvd(牛病毒性腹泻)、犊牛白喉、犊牛肺炎、犊牛白痢、梭菌病、球虫病、母牛低温综合征、铜中毒、隐孢子虫病、卵巢囊肿、蹄炎、皱胃移位、流行性出血性疾病、脂肪肝、再生牧草热、口蹄疫、腐蹄病、鹅口疮、肠道蠕虫、睡眠嗜血杆菌、高镁血症、ibr(传染性牛鼻气管炎)、传染性牛鼻气管炎(ibr)、约尼氏病(johnes)、关节病、铅中毒、钩端螺旋体病、虱子、李斯特菌病、肝脓肿、肝吸虫、疥癣、乳腺炎、钼中毒、坏死性肠炎、新孢子虫病、新森林眼病、硝酸盐中毒、溶血性巴氏
杆菌、多杀性巴氏杆菌、近断奶腹泻、感光过敏症、pi3(3型副流感)、瘙痒/发热/出血综合征、假牛痘、狂犬病、千里光中毒、雨斑病、重复繁殖综合征、胎衣滞留、裂谷热、癣、轮状病毒腹泻、瘤胃酸中毒、瘤胃炎、沙门氏菌、施马伦贝格病、硒缺乏、足底溃疡、夏季乳腺炎、破伤风、血栓形成、外伤性网胃炎、锥虫病、结核病(tb)、溃疡性乳头炎、弧菌病和木舌病。
[0164]
在一些实施例中，抗原可以包括编码任何一种以上标识的抗原和/或来自任何以上标识的生物体的抗原的序列的免疫原性片段、变体或截短序列。在一些实施例中，白细胞毒素a的截短序列(例如，如sun等人2009中所标识)可以用于在受到梭杆菌感染的生物体中引发免疫保护作用。在一些实施例中，外源核酸序列编码包含与由genbank:dq672338.1表示的白细胞毒素a(ltka)蛋白具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列或其片段或变体的肽。在一些实施例中，ltka的免疫原性片段可以包含编码选自由pl1(genbank:dq672338.1 1-501)、pl4(dq672338.1 5637-6606)以及pl1和pl4的组合组成的群组的ltka的区域的序列(如图1-4中的dna构建体1-4中所示)或其任何片段或变体。在一些实施例中，ltka的免疫原性片段可以包含与编码选自由pl1(dq672338.1 1-498)、pl2(dq672338.1 946
–
1911)、pl3(dq672338.1 3950-6052)、pl4(dq672338.1 5637-6606)、pl5(dq672338.1 9226-9721)组成的群组的ltka的至少一个区域的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列(例如，如图1-4中的dna构建体1-4中所示)或任何其片段或变体。
[0165]
在一些实施例中，外源核酸序列可以包含编码完整天然抗原序列的免疫原性片段、变体或截短序列的序列。在一些实施例中，外源核酸序列可以包含编码与天然抗原序列具有至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的天然抗原序列的免疫原性片段变体或截短序列的序列或其片段。
[0166]
在一些实施例中，外源核酸序列可以包含一个或多个不同的转基因的序列，其编码例如一个或多个蛋白质，例如一个或多个抗原。在一些实施例中，外源核酸序列可以包含来自一个抗原的一个或多个免疫原性片段的序列。在一些实施例中，外源核酸序列可以包含来自多个抗原的一个或多个免疫原性片段的序列。
[0167]
除了外源核酸序列之外，核酸材料可以包含一个或多个控制元件，所述控制元件以允许和/或增强其在用核酸材料转化的细胞中的转录、翻译和/或表达的方式可操作连接到外源核酸。表达控制序列可以包含适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的rna处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号；稳定细胞质mrna的序列；增强翻译效率的序列(即kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当期望时，包含增强编码产物的分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然、组成型、诱导型的和/或组织特异性启动子，是本领域已知的并且可以包含在本文所述的载体中。
[0168]
启动子
[0169]
除了编码感兴趣的转基因的外源核酸序列外，核酸材料(例如，dna构建体)可以包含在外源核酸序列附近(上游)的一个或多个启动子，以发起由外源核酸序列(例如，抗原)编码的蛋白质的转录。启动子可以是“可操作连接的”，例如与核酸材料中的一个或多个dna片段(例如，外源核酸)相关联，使得一个或多个dna片段，例如蛋白质编码dna的功能受启动子控制。
[0170]
在一些实施例中，启动子天然存在于宿主细胞的基因组中，也被称为内源启动子。
在一些实施例中，内源启动子可以用于控制通常不与所述启动子相关联的基因(例如，转基因)。在一些实施例中，启动子序列可以与天然或内源启动子具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性。在一些实施例中，启动子是非天然或外源启动子。
[0171]
在一些实施例中，核酸材料可以包含组成型启动子。在一些实施例中，组成型启动子可以包含可操作连接到外源核酸序列以例如编码感兴趣的转基因的天然或非天然启动子。
[0172]
在一些实施例中，组成型启动子是组成型表达构建体的一部分并且可以包含本文所述的重组表达载体。
[0173]
在一些实施例中，核酸材料可以包括受调节的启动子。在一些实施例中，受调节的启动子可以包含可操作连接到编码感兴趣的转基因的外源核酸序列的天然或非天然启动子。
[0174]
在一些实施例中，受调节的启动子是可调节表达构建体的一部分并且可以包含本文所述的重组表达载体。
[0175]
在一些实施例中，启动子可以是能够在宿主植物中发起转录的植物启动子。在一些实施例中，启动子可以包含从植物、植物病毒和/或如农杆菌和慢生根瘤菌等细菌获得的任何启动子dna。处于发育控制下的启动子的实例可以包括在如叶、根或种子等某些组织中优先发起转录的启动子，即“组织优选的”启动子。在一些实施例中，启动子可以是“组织特异性的”，即仅在某些组织中发起转录的启动子被称为“组织特异性的”。在一些实施例中，启动子可以是“细胞类型”特异性启动子，即主要驱动一个或多个器官中的某些细胞类型，例如根或叶中的血管细胞中的表达的启动子。
[0176]
示例性启动子包括但不限于常见的cmv、e1f、vav、tcrvβ、mcsv、pgk、ppsba、prrn、prna、psaa、prbcl、camv35s、rbcs、patpi和patpb或a3或rs324启动子。可以使用其它类型的启动子，并且可以取决于例如宿主植物的物种。在一些实施例中，植物启动子可以来源于任何已知植物，包括例如粮食作物、经济作物、蔬菜作物、豆类、水果、花卉、草、树木、工业原料作物、饲料作物或药用作物。
[0177]
在例如如dna构建体等核酸材料包含多于一个外源核酸序列的一些实施例中，启动子可以可操作连接到每个外源核酸序列。在核酸材料包含多个启动子的一些实施例中，每个启动子可以是相同或不同的启动子。
[0178]
靶向序列
[0179]
核酸材料可以包含一个或多个靶向序列，例如以便整合到宿主基因组内的特定位置中。在一些实施例中，可以使用多于一个的靶向序列，例如第一和第二靶向序列。在一些实施例中，靶向序列是与例如植物中的感兴趣的核酸上的靶序列互补，例如至少80、85、90、95、98或99％互补，例如完全互补的核酸序列，所述靶序列例如与宿主细胞的内源核酸序列互补的序列(例如，与期望整合点相邻的序列)。
[0180]
在一些实施例中，第一和/或第二靶向序列被设计成与宿主基因组的区域互补，所述区域侧接转基因的靶内源核酸序列和/或靶整合位点(例如，与其相邻)。在一些实施例中，宿主是植物细胞，并且内源核酸序列是作为宿主基因组(例如，质体基因组)内的内源序列的序列。在一些实施例中，植物细胞来自上述任何植物。在一些实施例中，靶向序列与核基因组内的序列互补。在一些实施例中，靶向序列与叶绿体基因组内的序列互补。在一些实
施例中，叶绿体基因组可以是高粱植物物种(如由高粱(sorghum bicolor(l.)moench，genbank:nc_008602.1表示)的叶绿体基因组、粟(例如，“黄黍”panicum miliaceum l.，genbank:ku343177.1；“细柄黍”panicum sumatrense，ncbi登录号kx756177；“珍珠稷”cenchrus americanus/pennisetum americanum/p.glaucum，ncbi登录号kj490012；“狗尾粟”setaria italic，ncbi登录号nc_022850)的叶绿体、或任何麦类物种(例如，如middleton等人，2013，《公共科学图书馆-综合(plos one)》，9.3(2014):e85761中所述；例如，普通小麦，genbank:fn645450.1、kc912694.1或nc_002762.1)的叶绿体基因组。
[0181]
在一些实施例中，靶向序列可以侧接核基因组内的两个基因之间的靶区域(例如，期望的转基因整合的位点)或内源区域。
[0182]
在一些实施例中，靶向序列可以侧接叶绿体基因组内的两个基因之间的靶区域或内源区域。例如，在一些实施例中，所述两个基因可以包括叶绿体基因组和/或核基因组内的第一和第二基因。在一些实施例中，第一叶绿体基因可以选自以下基因：trni、trna、trnm、trng、rrn16、rps12/7、tsca、psac、trnv、trna、rbcl、accd、rp132、trnl、3'rps12/7、trnv、peta、psbj、trn16/v、16srrna、trnfm、trng、atpb、rbcl、trn、trnr、ycf3、trns、rps7、ndhb、trny、gua、trnd、guc、trng、ucc、trnm、trnt和/或cau。在一些实施例中，第二叶绿体基因可以选自以下基因：trni、trna、trnm、trng、rrn16、rps12/7、tsca、psac、trnv、trna、rbcl、accd、rp132、trnl、3'rps12/7、trnv、peta、psbj、trn16/v、16srrna、trnfm、trng、atpb、rbcl、trn、trnr、ycf3、trns、rps7、ndhb、trny、gua、trnd、guc、trng、ucc、trnm、trnt和/或cau。
[0183]
在一些实施例中，第一和第二靶向序列涉及位于两个基因的染色体坐标之间的靶序列，所述染色体坐标选自trni-trna、trnm-trng、rrn16-rps12/7、tsca-psac、trnv-trna、rbcl-accd、rp132-trnl、3'rps12/7-trnv、peta-psbj、trn16/v-16srrna、trnfm-trng、atpb-rbcl、trn-trnr、ycf3-trns、rps7-ndhb、trny-gua-trnd-guc、trng-ucc-trnm-cau和trnt-trnl。
[0184]
靶向序列可以通过其在宿主叶绿体基因组(即高粱叶绿体基因组、粟叶绿体基因组等)内靶向的互补区域的位置(即坐标)来描述。本领域的技术人员将了解，相同的靶向序列可以由不同的坐标描述，这取决于所获得的测序基因组的特定版本。对于许多植物物种，它们的叶绿体基因组已被不同的群组测序，并且存在一定程度上有所不同的多个版本，无论是物种变异，或甚至是由于已知的遗传材料随时间的重新排列而导致的特定物种内的局部变异。在这种情况下，靶向序列可以基于其序列或其所计划靶向的序列来描述，而不是基于其所靶向的宿主基因组内的特定位置(即坐标)来描述。经设想，本领域的技术人员可以基于独特的靶向序列来确定特定版本的测序叶绿体基因组内的坐标。
[0185]
在一些实施例中，如本文所公开的核酸材料的靶向序列可以包括与seq id no:1、8、15、16和23具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的序列。
[0186]
在一些实施例中，第一和第二靶向序列分别对应于粟叶绿体基因组(genbank登录号ku343177)的碱基47318至48218和48219至49116。在一些实施例中，第一和第二靶向序列分别对应于粟叶绿体基因组(genbank登录号ku343177)的16408至16845和16846至17960。在一些实施例中，第一和第二靶向序列对应于粟叶绿体基因组(genbank登录号ku343177)的碱基46391至47746和47747至49115。
[0187]
在一些实施例中，第一和第二靶向序列对应于高粱叶绿体基因组(genbank登录号nc_008602)的碱基14048至14793和14794至15561。在一些实施例中，第一和第二靶向序列对应于高粱叶绿体基因组(genbank登录号nc_008602)的碱基13151至14490和14491至15560。
[0188]
增强子元件
[0189]
在本公开的各个方面，本公开的核酸材料可以包含一个或多个增强子序列，例如以增加外源核酸的转录。例如，在一些实施例中，一个或多个增强子序列可以包含在5'非翻译区(也被称为前导序列)处，其可以帮助新产生的rna结合到核糖体。
[0190]
在一些实施例中，增强子序列可以包括一个或多个增强子序列，其选自：ggagg、rrn5'utr、t7gene10 5'utr、lrbcl 5'utr、latpb 5'utr、烟草花叶病毒ω'5'utr(genbank:km507060.1)、lcry9aa2 5'utr、atpi 5'utr、psba5'utr、cry2a、rrnb、rps16、petd、psba、paba及其任何组合或变体。
[0191]
在一些实施例中，本公开的核酸材料可以包含一个或多个终止序列。在一些实施例中，终止序列可以包括烟草trps16(genbank登录号mf580999)、tpsba、trbcl、trpl32和tpetd。
[0192]
在一些实施例中，核酸材料中包含的一个或多个增强子可以包括在seq id no:3、5、9、11和13中标识(并且如图1-4的dna构建体中示出)的增强子序列中的任一者。
[0193]
选择序列
[0194]
根据各个实施例，核酸材料，例如本文所述的dna构建体，可以包含一个或多个选择序列。在一些实施例中，选择序列可以用于提供有效系统，以标识已成功转化并瞬时和/或稳定表达外源核酸序列的那些细胞，例如在接受dna构建体并将其整合到它们的基因组中之后。在一些实施例中，选择序列可以提供一个或多个选择标志物(例如，促进或允许其表达)，其赋予对如抗生素或除草剂等选择试剂的耐药性。然后，例如，可以将潜在转化的细胞暴露于选择试剂，并且存活细胞群体将是通常整合了耐药性赋予基因并以足以允许细胞存活的水平对其进行表达的那些细胞。在一些实施例中，可以进一步测试细胞以确认外源dna的稳定整合。常用的选择序列可以编码赋予抗生素耐药性的基因，例如卡那霉素和巴龙霉素(nptii)、潮霉素b(aph iv)和庆大霉素(aac3和aacc4)、壮观霉素和链霉素耐药基因(aada)，或赋予对草铵膦(bar或pat)和草甘膦(aroa或epsps)等除草剂的耐药性的基因。在一些实施例中，赋予抗生素耐药性的基因是16s rrna基因，例如具有一个或多个突变的16srrna基因。在一些实施例中，对抗生素的耐药性是被动耐药性。在一些实施例中，对抗生素的耐药性是“结合型”耐药性。此类选择序列和/或选择试剂的实例示出于美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中，所有这些都通过引用并入本文。在一些实施例中，抗生素选择序列可以包括编码壮观霉素耐药基因、庆大霉素耐药基因、链霉素耐药基因、卡那霉素耐药基因、新霉素耐药基因、β内酰胺耐药基因或其任何组合的核酸序列。
[0195]
在一些实施例中，选择序列还可以提供视觉识别转化子的能力(例如，通过编码可观察的部分)，例如编码以下的核酸序列：有色或荧光蛋白，例如荧光素酶或绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)、青色荧光蛋白(cfp)、his标签、gus uida lacz或表达其各种显色底物已知的β葡萄糖醛酸酶或uida基因(gus)的基因或其任何组合。
[0196]
在一些实施例中，选择序列可以是或包含编码黄色荧光蛋白(yfp，genbank:
gq221700.1或seq id no:6)、红色荧光蛋白(dsred，genbank:ky426960.1或seq id no:12)或青色荧光蛋白(cfp，genbank:hq993060.1或seq id no:14)(如图1-4的构建体中示出)。
[0197]
载体
[0198]
在一些实施例中，载体用于在宿主细胞中表达和/或整合核酸材料(即dna构建体)。在一些实施例中，载体具有每个细胞大于25个、50个、75个、100个、150个、200个或250个拷贝的拷贝数。根据各个实施例，用于在植物中进行多肽表达的可用载体包含病毒载体或质粒。实例包括但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关联病毒载体(aav)、pet载体(novagen)、pdest载体(invitrogen)、pgex载体(amersham biosciences)、ppro载体(bd biosciences)、pbad载体(invitrogen)、plex载体(invitrogen)、pmal
tm
载体(new england biolabs)、pgemex载体(promega)和pqe载体(qiagen)。用于产生噬菌体文库的载体系统是已知的，并且包括novagen 载体、pmx载体质粒(invitrogen的geneart基因合成)和new england biolabs ph.d.
tm
肽展示克隆系统。在一些实施例中，载体可以是或包括植物特异性载体。在一些实施例中，植物特异性载体可以是或包括根癌农杆菌的ti质粒、烟草花叶病毒(tmv)、马铃薯病毒x、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、菜豆黄矮病毒、双生病毒、小麦矮病毒(wdv)、小麦条纹花叶病毒(wsmv)、大麦条纹花叶病毒(bsmv)、卷心菜卷叶病毒(calcuv)、烟草脆裂病毒(trv)和豇豆花叶病毒。
[0199]
引入核酸材料的方法
[0200]
可以使用多种方法将核酸材料引入(即转化、转导和/或转染)到植物细胞中。可以经由任何合适的技术将核酸材料引入植物，包括但不限于直接dna摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的dna转移、轰击(例如，基因枪)、纳米颗粒引导的生物分子递送、脂质体、原生质体、愈伤组织、碳化硅纤维和花粉管转化、或农杆菌介导的转化。包括某种形式的轰击的方法可以包括但不限于本领域已知的方法，包括使用如美国专利公开号us20060117412a1和daniell 1997(《自然-生物技术(nature biotech)》，(16):345-348)中所述的生物弹射装置pdsiooo/he(bio-rad)。
[0201]
在一些实施例中，可能有用的是，将重组dna随机引入，即在靶植物的基因组中的非特定位置处。在一些实施例中，在将核酸材料引入(即转化)到植物细胞中之后，去除核酸材料中的一部分外源核酸序列，例如选择标志物。在一些实施例中，可能是有用的是，靶向核酸材料的插入，以便实现位点特异性整合，以例如替换基因组中的现有基因，使用植物基因组中的现有启动子，或在已知对基因表达有活性的预定位点处插入重组多核苷酸。存在几种已知在植物中起作用的位点特异性重组系统，包括美国专利4,959,317中公开的cre-lox和美国专利5,527,695中公开的flp-frt，两者均通过引用并入本文。
[0202]
在一些实施例中，将外源核酸序列引入(例如，转化、转导和/或转染)到质体基因组中。在一些实施例中，将外源核酸序列引入植物细胞的叶绿体基因组中。在一些实施例中，将外源核酸序列引入植物细胞的核基因组中。在一些实施例中，进行外源核酸序列的引入，使得植物细胞用外源核酸序列稳定转化，即永久转化(例如，通过位点特异性同源重组)，包括其子代。在一些实施例中，稳定转化的外源核酸材料能够在植物细胞中自主表达核苷酸编码区以产生至少一个多肽(例如，抗原)。在这种情况下，将外源核酸序列引入植物细胞中，使得植物细胞可以瞬时表达外源核酸序列(即抗原)。
[0203]
在一些实施例中，本公开所涵盖的转化方法可以在体外和/或在受控环境中实践。受体细胞靶标可以包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚和配子细胞，例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。根据各个实施例，经设想，可以再生可育植物的任何细胞可用作受体细胞。愈伤组织可以起源于组织来源，所述组织来源包括但不限于未成熟胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的细胞也是进行遗传转化的受体细胞。用于制造本发明的转基因植物的实用转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚细胞的转化和可育转化植物的后续再生公开于美国专利6,194,636和6,232,526中，其通过引用并入本文。
[0204]
在一些实施例中，包含根据本公开的一个或多个核酸材料的植物可以自花授粉以提供纯合子的转化植物。在其它实施例中，将获自包含一个或多个核酸材料的植物的花粉与农艺上重要的品系的种子生长植物杂交。在其它实施例中，来自包含一个或多个核酸材料的植物的花粉可以用于为天然存在的植物授粉。可以使用本领域的技术人员已知的方法培养包含编码例如抗原的外源核酸序列的本发明的转化植物。
[0205]
病毒载体
[0206]
如本文所述，可以使用将核酸材料递送到宿主细胞的各种方法。在一些实施例中，可以将如本文所述的外源核酸序列引入病毒载体中的植物细胞中。
[0207]
载体设计
[0208]
在一些实施例中，病毒载体可以来源于任何已知的基于植物的或植物相容的病毒载体。可以基于许多因素来选择病毒载体，例如，所转化的植物物种、外源核酸的大小和宿主基因组内的靶向位置。例如，用于改造植物的病毒载体的病毒dna被设计和构建成优化感染性、在整个植物宿主细胞中的移动和高倍增。
[0209]
在一些实施例中，如本文所述的外源核酸序列可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒、植物病毒或粘粒中。
[0210]
在一些实施例中，病毒可以包括例如根癌农杆菌的ti质粒、烟草花叶病毒(tmv)、马铃薯病毒x、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、菜豆黄矮病毒、双生病毒、小麦矮病毒(wdv)、小麦条纹花叶病毒(wsmv)、大麦条纹花叶病毒(bsmv)、卷心菜卷叶病毒(calcuv)、烟草脆裂病毒(trv)、番茄金花叶病毒(tgmv)、苜蓿花叶病毒(almv)、等轴不稳环斑病毒、黄瓜花叶病毒，例如黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)、烟草蚀纹病毒(tev)、豇豆花叶病毒(cmv)、以及雀麦草花叶病毒群中的病毒，例如雀麦草花叶病毒(bmv)、蚕豆斑驳病毒、豇豆褪绿斑驳病毒、水稻坏死病毒(rnv)、木薯潜伏病毒(clv)和玉米条纹病毒(msv)。替代载体可以包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体以及非植物来源的病毒载体。
[0211]
在一些实施例中，载体可以具有一个或多个转录终止区。转录终止区是控制转录物的3'端的形成的序列，例如聚腺苷酸化序列和自切割核酶。在其它生物体中表达的终止信号在文献中是众所周知的。还可以包含用于准确剪接转录物的序列。实例是内含子和转座子。
[0212]
如sambrook等人(《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，2001)和其它病毒学和分子生物学手册中所述，病毒载体设计和技术在本领域中是众所周知的。
[0213]
病毒转导
[0214]
病毒在将核酸递送到特定细胞类型方面非常有效，同时通常会避免被感染的宿主免疫系统检测到。这些特征使某些病毒成为可作为将核酸材料引入靶细胞(例如，植物细胞)的媒剂的有吸引力的候选者。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物和植物细胞中。一般来说，合适的载体包含在至少一个生物体中其作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选择标志物。本文所述的病毒载体可以是dna或rna形式。
[0215]
在一些实施例中，病毒载体可以用于将各种大小的外源核酸序列递送到宿主细胞(例如，植物细胞)。在一些实施例中，病毒载体可以容纳长度大于50、100、200、400、500、1000个核苷酸的外源核酸序列。
[0216]
在一些实施例中，可以将外源核酸序列克隆到病毒载体中，然后引入宿主细胞(例如，植物细胞)中。在一些实施例中，可以使用轰击(例如，基因枪)、农杆菌介导的转化或本公开涵盖的任何其它方法将病毒载体引入植物宿主细胞。
[0217]
根据本领域的技术人员已知的任何技术，可以将用于促进靶植物的感染的多种方法中的任何一种应用于植物的细胞。例如，在一些实施例中，合适的技术包括但不限于手工接种，例如摩擦接种(叶摩擦、在缓冲溶液中摩擦)、机械化喷雾接种、真空浸润、粒子轰击和/或电穿孔。
[0218]
在一些实施例中，可以通过根、子叶、叶、种皮、种子、豆荚、茎接种等将病毒载体递送到处于如幼苗期、叶期、开花、种子形成和成熟期等不同生长期的植物。在一些实施例中，病毒载体可以应用于宿主植物的一个或多个位置。例如，病毒载体可以同时或相继施用于叶和根。在一些实施例中，病毒载体可以在同一位置(例如，在给定的叶上)以连续的间隔应用不止一次。时间间隔可以取决于实验条件和待沉默的靶基因。可以将能够引入两个不同基因的两种类型的载体(例如，局部和全身)混合并应用于给定位置或多于一个位置。一旦应用，就可以采集样本并筛查病毒感染。
[0219]
在一些实施例中，可以设计和构建病毒载体用于全身感染。在一些实施例中，病毒载体也可以以靶基因沉默的起始还会发起来自植物的载体的破坏和消除(接种后大约15-20天)的方式进行工程改造。在一些实施例中，可以设计和构建病毒载体用于局部感染，例如，如果叶被感染，则感染不会扩散到所述叶之外。
[0220]
纳米颗粒和纳米管
[0221]
在一些实施例中，如本文所述的核酸材料可以经由纳米颗粒递送到和/或转化到宿主细胞(例如，植物细胞)中。
[0222]
在一些实施例中，纳米颗粒是直径小于1000纳米(nm)、小于300nm或小于100nm的颗粒。在一些实施例中，纳米颗粒是胶束，因为其包含通过胶束膜与本体溶液分离的闭合区室，所述胶束膜通常包含包围且围封空间或区室(例如，以界定内腔)的两亲实体。在一些实施例中，胶束膜包含至少一种聚合物，诸如例如生物相容性和/或生物可降解聚合物。
[0223]
在一些实施例中，纳米颗粒可以具有或包含纳米颗粒膜或纳米颗粒外表面和周围环境之间的边界或界面。在一些实施例中，纳米颗粒膜是具有外表面和边界内腔的聚合物膜。
[0224]
在一些实施例中，纳米颗粒缀合到核酸材料。在一些实施例中，纳米颗粒缀合到外源核酸序列以递送到宿主细胞(例如，植物细胞)。
[0225]
在一些实施例中，纳米颗粒可以是纳米管。已经证明，某些纳米管能够穿过植物细胞中的刚性细胞壁，包括叶绿体的两个脂质双层。在一些实施例中，如纳米管等纳米颗粒的大小和尺寸被确定成使得纳米颗粒可以穿透细胞膜以及例如植物细胞中的叶绿体包膜。在一些实施例中，纳米颗粒大小和表面电荷基于外源核酸整合在植物细胞中的位置来选择(例如，使用kwak、seon-yeong等人(2019，《自然-纳米技术(nature nanotechnology)》，(14.5):447)中描述的脂质交换包膜穿透(leep)模型。在一些实施例中，纳米管是碳纳米管。在一些实施例中，纳米管是单壁纳米管或单壁碳纳米管(swcnt)。缀合外源核酸序列的方法可以是任何已知方法，包括但不限于在kwak、seon-yeong等人(2019，《自然-纳米技术(nature nanotechnology)》，(14.5):447)中描述的那些方法。将核酸材料缀合到纳米颗粒(例如，swcnt)可以包括将纳米颗粒与核酸材料一起孵育(例如，在透析盒中)。
[0226]
在一些实施例中，核酸材料可被递送到植物宿主基因组内的特定细胞器。根据各个实施例，细胞器可以是植物宿主细胞内的任何细胞器，包括细胞核或叶绿体。在一些实施例中，可以修饰纳米管以促进递送到特定细胞器和/或促进有效递送。在一些实施例中，纳米管或纳米颗粒可以是共价修饰的。在一些实施例中，纳米管或纳米颗粒可以是非共价修饰的。在一些实施例中，纳米管可以是壳聚糖包裹纳米管和/或壳聚糖包裹单壁纳米管(cs-swnt)。在一些实施例中，纳米颗粒(例如，纳米管)可以是聚乙二醇化的。在一些实施例中，纳米管可以非共价键合到5,000mw peg。在一些实施例中，可以修饰纳米颗粒(例如，纳米管)，使得修饰保护外源核酸免于核酸酶降解。在一些实施例中，经修饰的纳米颗粒(例如，纳米管)具有小于200nm、小于150nm、小于100nm或小于50nm的半径。
[0227]
在一些实施例中，纳米颗粒被设计和构建(例如，使用壳聚糖)，使得核酸材料缀合到植物细胞内(例如，植物细胞溶胶内)的一个位置中的纳米颗粒，并从另一位置(例如，叶绿体基质内)中的纳米颗粒释放。在一些实施例中，纳米颗粒被设计和构建成使得纳米颗粒在暴露于具有大于6.0、大于6.5、大于7.0、大于7.5或大于8.0的ph的环境时从核酸材料释放。
[0228]
在一些实施例中，使用局部浸润将缀合到核酸材料的纳米颗粒递送到植物细胞。在一些实施例中，将含有缀合到核酸材料的纳米颗粒的溶液注入植物的一个或多个部分中。
[0229]
在一些实施例中，溶液以约1-1,000μl、20-1,500μl、30-1,000μl、40-750μl、50-500μl、100μl-10ml的量注入。在一些实施例中，溶液以至少1μl、10μl、100μl、1000μl、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml或10ml的量注入。在一些实施例中，递送到植物细胞的核酸材料的量为约1ng、5ng、10ng、20ng、50ng或更多。在一些实施例中，递送到植物细胞的核酸材料的量为约1μg、5μg、10μg、20μg、50μg或更多。在一些实施例中，纳米颗粒与核酸材料的比率为至少1:1、3:1或6:1(w/w)。
[0230]
在一些实施例中，缀合到核酸材料的纳米颗粒在使用或不使用生物弹射力的情况下被递送到植物细胞。在一些实施例中，使用包括例如通过无针注射器的背轴表面叶注入和/或通过有针注射器的茎注射的方法将缀合到核酸材料的纳米颗粒递送到植物细胞。
[0231]
外源核酸序列的表达
[0232]
在一些实施例中，本公开包括，已经转化植物，使得植物或植物细胞的质体基因组(例如，叶绿体基因组)已经根据本发明的方法(例如，通过位点特异性同源重组)稳定转化，
即永久转化，包括其子代。在一些实施例中，核酸材料包含一个或多个克隆或表达载体；例如，包含如本文所述的一个或多个组合物或转化植物的疫苗可以包含多个表达载体，每个表达载体能够在植物细胞中自主表达核苷酸编码区以产生至少一个免疫原性多肽。在这种情况下，转化植物可以瞬时表达外源核酸序列(即抗原)。在一些实施例中，转化植物含有外源核酸序列，其中序列(即抗原)的表达由组成型表达的启动子驱动。在一些实施例中，转化植物含有外源核酸序列，其中序列(即抗原)的表达由差异表达的启动子驱动，例如在不存在或存在光的情况下。
[0233]
在一些实施例中，在宿主物种的转化/接种后1小时可检测到外源核酸材料的表达。在一些实施例中，在宿主物种转化/接种后至少1、2、3、4、5、6、7、14或21天仍可检测到外源核酸材料的表达。在一些实施例中，在宿主物种转化/接种后至少1、2、3、4、5、6或12个月仍可检测到外源核酸材料的表达。
[0234]
在一些实施例中，当外源核酸序列的表达大于对照细胞(即非转化细胞)中的表达时，可以确定检测到植物细胞的转化。在一些实施例中，当外源核酸序列的表达大于对照细胞(即非转化细胞)中的表达至少0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更大比例时，可以确定检测到植物细胞的转化。
[0235]
测量表达的方法可以包括但不限于使用可以检测特定核苷酸序列的探针的dna印迹分析或通过pcr的转基因扩增。如本公开所涵盖的测量/检测由转化植物产生的外源蛋白质(例如，抗原)的表达的方法包括但不限于elisa(酶联免疫吸附测定)、蛋白质印迹、竞争测定和斑点印迹。检测手段可以是或包括例如化学发光、荧光或比色检测。一种使用已知抗体测量抗原的结合的合适方法是luminex xmap系统，其中肽缀合到含染料的微球。在一些实施例中，使用其它系统来测定多个标志物，例如可以使用以下系统中的任何一者进行分析：抗原微阵列、珠微阵列、纳米条码颗粒技术、来自cdna表达文库的阵列蛋白质、蛋白质原位阵列、活转化子的蛋白质阵列、通用蛋白质阵列、微流控芯片实验室(lab-on-a-chip microfluidics)和针上肽(peptides on pins)。另一类型的临床测定是检测抗原-抗体结合的化学发光测定。
[0236]
生产
[0237]
根据各个实施例，可以使用用于生长/生产转化植物以及将所述转化植物调配成免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)的多种方法中的任一种。如本文使用，术语“植物基疫苗”或“植物基疫苗组合物”包括包含植物的一个或多个部分或在植物中产生的一个或多个组分(例如，外源核酸序列)的组合物。生产和/或调配的方法可以取决于例如免疫原性组合物所施用到的受试者的物种、植物的类型或待在转化植物中表达的感兴趣的抗原。
[0238]
培育和繁殖转化植物的各种方法可以包括在养殖业和农业中使用的任何系统或程序，并且可以取决于在特定应用中使用的植物物种。在一些实施例中，转化植物的种子可以从能育转化植物收获，并且可以用于培育转化植物的子代。在一些实施例中，使用选择序列来选择已经用外源核酸序列转化的植物。除了用核酸材料直接转化植物外，转化植物可以通过将第一转化植物与第二非转化植物杂交来制备。例如，可以将编码抗原蛋白的外源核酸序列引入到第一植物品系中，所述植物品系经受转化以产生转基因植物，所述转基因植物可以与第二植物品系杂交以将外源核酸引入第二植物品系。
[0239]
在一些实施例中，将表达编码感兴趣的抗原的外源核酸序列(或其片段)的转化植
物培育至某一融合度和/或成熟度，然后随后收获。在一些实施例中，切割并湿法收获转化植物(例如，含有约65％水分)。在一些实施例中，处理和/或保存所收获的植物材料，例如通过晒干(以加工处理植物材料)。在一些实施例中，对所收获的植物材料进行加工(例如，通过脱水和例如进一步打捆)。在一些实施例中，将所收获的植物材料打捆并用作牲畜动物的干燥(例如，晒干)饲料。
[0240]
在一些实施例中，转化植物作为干草收获(例如，风干的85-90％干物质)。在一些实施例中，当干草通过筛网(例如，2-3"筛网)磨碎时收获转化植物。在一些实施例中，将所收获的干草混合到日粮中以作为非人类动物的饲料，例如占日粮中的总粗饲料的35-45％。
[0241]
在一些实施例中，当所收获的植物材料被例如通过脱水加工时，干燥的材料被进一步加工，例如压缩成颗粒饲料形式或较大块状饲料，使得其可以向牲畜动物饲喂。颗粒饲料可以作为补充剂施用，例如由受过训练的专业人员施用。在一些实施例中，可以将压缩块形式的植物材料放入一只或多只牲畜动物的生活区域中，使得它们全天都可以触及块状饲料并通过舔食块状饲料来摄取植物材料(例如，可以自由地触及植物材料)。
[0242]
在一些实施例中，将所收获的植物材料加工成青贮饲料(地窖里贮存的作物)。在一些实施例中，将所收获的植物材料在不干燥的情况下在地窖里贮存，并且可以例如每天、每隔一天、每周、每月或间歇地向牲畜动物饲喂所收获的湿(例如，含有约65％水分)植物材料。在一些实施例中，所收获的植物材料在例如每天、每隔一天、每周、每月或间歇地向牲畜动物饲喂之前不在地窖里贮存。在一些实施例中，收获转化植物，然后直接向牲畜动物饲喂(例如，无需进一步加工，例如，“青刈饲料”)。
[0243]
在一些实施例中，可以通过使牲畜动物以产生抗原的活植物细胞系为食来向牲畜动物施用产生感兴趣的抗原的植物细胞(即已经用外源核酸序列转化)。因此，随着对活植物的食用的发生，通过食用向动物的递送是恒定的，即递送是整天、每天几次、以规则或不规则的间隔进行的。
[0244]
在一些实施例中，转化植物细胞系可以用于培育和扩展表达特定抗原的植物群，使得可以收获它，并且可以从转化植物细胞纯化抗原并将其进一步加工成不同的形式，例如常规疫苗的形式。在一些实施例中，从转化植物细胞纯化的抗原可以是抗原的片段，例如免疫原性片段。在一些实施例中，从转化植物细胞纯化的抗原可以浓缩至特定抗原浓度和纯度，这取决于例如组合物的用途。
[0245]
在一些实施例中，培养转化植物以产生特定的感兴趣的蛋白抗原并且可以与对照植物进行比较。如本文使用，“对照植物”意指不含编码特定的感兴趣的蛋白抗原的外源核酸序列的植物或“非转化”植物。对照植物可以用于标识和选择产生(例如，表达)特定的感兴趣的抗原的转化植物。在一些实施例中，合适的对照植物可以是用于生成转化植物的亲本品系的非转化植物，即没有编码特定的感兴趣的抗原的外源核酸序列。在一些实施例中，合适的对照植物可以是转化植物品系的子代，其不含有编码特定的感兴趣的抗原的外源核酸，被称为阴性分离子。可以收获和量化所培养的转化植物，以便制备特定浓度的抗原，以用于待提供给非人类动物进行治疗的免疫原性组合物(例如，植物基疫苗，即剂量)。
[0246]
免疫原性组合物
[0247]
在一些实施例中，可以将一个或多个植物(例如，植物混合物)调配成免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)并施用于受试者。作为进一步的非限制性实例，指定量的转化植物
(例如，转基因植物)可以用非转化植物稀释，例如以实现转化植物质量与非转化植物质量的特定比率，以实现抗原在免疫原性组合物中的期望浓度(或浓度范围)等。在一些实施例中，期望浓度将取决于若干因素中的任何一个，例如免疫原性组合物的使用时机(即是预防性地使用还是用于治疗性治疗)、特定受试者(例如，物种、年龄、大小)、所治疗的疾病或感染的进展以及期望的特定给药方案。
[0248]
在一些实施例中，免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)可以包含用于向受试者(例如，反刍动物)施用所提供的免疫原性组合物的递送系统。在一些实施例中，递送系统可以包含将抵抗由于胃和肠环境引起的降解的材料和/或涂层。在一些实施例中，递送系统可以包含但不限于脂质体、蛋白酶体、螺旋体、病毒样颗粒、免疫刺激复合物、微粒和纳米颗粒(例如，纳米管)。
[0249]
在一些实施例中，免疫原性组合物可以包含使用本文所述的系统和/或方法生产的转化植物和应用适当的载体或赋形剂。
[0250]
本文所述的免疫原性组合物的调配物可以通过本领域已知或以后开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括使转化植物与稀释剂(例如，非转化植物)、载体和/或一个或多个其它辅助成分相关联的步骤，然后如果需要和/或期望，将产品成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单元(例如，形成颗粒饲料或块状饲料)。
[0251]
根据本公开的免疫原性组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或出售。如本文使用，“单位剂量”是离散量的组合物，其包含预定量的至少一种使用本文所述的系统和/或方法生产的植物基产品。
[0252]
使用本文所述的系统和/或方法生产的转化植物、载体和/或任何附加成分在免疫原性组合物中的相对量可以取决于待治疗的受试者(例如，非人类动物的物种、年龄、大小)、靶细胞、疾病或病症而有所不同，并且还可能进一步取决于组合物施用的途径。
[0253]
药物组合物
[0254]
根据一些实施例，免疫原性组合物可以包含从转化植物细胞纯化的抗原，所述抗原被浓缩至特定浓度和纯度。经纯化和/或浓缩的抗原可以与附加组分，例如药学上有效的载体或赋形剂组合成药物组合物(例如，疫苗)。
[0255]
药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，如本文使用，其包括适用于期望特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。《雷明顿：药学的科学与实践(remington's the science and practice of pharmacy)》，第21版，a.r.gennaro(利平科特
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威廉斯
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威尔金斯出版公司，巴尔的摩，马里兰，2006；通过引用并入本文)公开了用于调配药物组合物的各种赋形剂及其制备的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不期望的生物效应或与药物组合物的任何其它组分以有害方式相互作用，其用途预期在本公开的范围。
[0256]
在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施例中，赋形剂经批准用于人类和供兽用。在一些实施例中，赋形剂经美国食品和药物管理局批准。在一些实施例中，赋形剂是医药级的。在一些实施例中，赋形剂符合美国药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。
[0257]
在药物组合物的制造中使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、
分散和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可以任选地包含在药物调配物中。例如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂的赋形剂可以存在于组合物中。
[0258]
可以调配药物组合物，使得它们适合施用于人和/或非人类动物受试者。在一些实施例中，药物组合物基本上不含内毒素或外毒素。内毒素包括热原，例如脂多糖(lps)分子。药物组合物也可以基本上不含非活性蛋白片段。在一些实施例中，药物组合物具有比工业用水、自来水或蒸馏水更低水平的热原。可以使用本领域已知的方法纯化药物组合物的其它组分，例如离子交换色谱法、超滤或蒸馏。在其它实施例中，热原可以在施用于受试者之前被灭活或破坏。药物组合物的原料，例如水、缓冲液、盐和其它化学物质也可以进行筛选和除热原。药物组合物可以是无菌的，并且可以测试每批药物组合物的无菌性。因此，在某些实施例中，药物组合物中的内毒素水平低于usfda设定的水平，例如鞘内注射组合物的0.2内毒素(eu)/kg产品；非鞘内注射组合物的5eu/kg产品，无菌水的0.25-0.5eu/ml。优选的是，药物组合物在合理的风险-效益比内具有低毒性或无毒性。
[0259]
适合引入药物组合物的调配物根据施用途径而有所不同。适用于肠胃外施用，例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、鼻内和皮下途径的调配物，包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。调配物可以装在如安瓿和小瓶等单位剂量或多剂量密封容器中。
[0260]
可以由先前所描述种类的无菌粉末、颗粒以及片剂制备注射溶液和悬浮液。
[0261]
适用于药物组合物口服施用的调配物可以包括(a)液体溶液，例如悬浮在如水、盐水或peg 400等稀释剂等中的有效量的多肽或包装核酸；(b)胶囊、小袋或片剂，每一种都含有预定量的液体、固体、颗粒或明胶形式的活性成分；(c)适当液体中的悬浮液；(d)合适的乳液。片剂形式可以包括以下中的一或多者：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、黄蓍胶、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶态二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药理学上相容的载剂。口含片形式可以包含活性成分于调味剂中，所述调味剂通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶，锭剂也包含活性成分于如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶等惰性基质中，除了活性成分之外还含有本领域中已知的载体。在一些实施例中，药物组合物可以封装在例如脂质体中，或封装在提供活性成分的缓慢释放的调配物中。
[0262]
药物组合物可以被制成气雾剂调配物(例如，它们可以被“雾化”)以经由吸入施用。气雾剂调配物可以被放入如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等可接受加压推进剂中。
[0263]
用于药物组合物的阴道或直肠施用的合适调配物可以包括例如栓剂，其由药物组合物以及栓剂基质组成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，还可以使用明胶直肠胶囊，其由药物组合物与基质的组合组成，所述基质包括例如液体甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃。
[0264]
免疫原性组合物的组分
[0265]
在某些实施例中，免疫原性组合物，包括例如一种或多种转化植物或包含从转化植物细胞纯化的抗原的药物组合物，可以如上所述调配和/或另外与一个或多个附加组分
一起调配。在一些实施例中，附加组分可以是或包含以下中的一者或多者：佐剂、稳定剂、缓冲液、表面活性剂、控释组分、盐、防腐剂和对所述抗原具有特异性的抗体。
[0266]
佐剂
[0267]
在一些实施例中，免疫原性组合物和/或转化植物可以包含佐剂或与佐剂一起施用。在免疫原性组合物包含一种或多种转化植物的一些实施例中，含有木质素和hsp(热休克蛋白)的转化植物细胞可以在被施用免疫原性组合物的受试者(例如，非人类动物)中充当佐剂。例如，如高粱和粟等植物物种含有大量的皂苷，并且可以在被施用包含转化高粱或粟的免疫原性组合物的受试者中充当佐剂。
[0268]
在一些实施例中，免疫原性组合物可以另外包含生物佐剂或与生物佐剂一起施用。生物佐剂的实例可以包括霍乱毒素b亚基(ctb)、乙型肝炎病毒核心抗原(hbcag)、大肠杆菌不耐热肠毒素b亚基(ltb)和单磷酰脂a。
[0269]
在一些实施例中，佐剂可以包括无机佐剂。无机助剂的实例包括明矾盐，例如磷酸铝、无定形羟基磷酸硫酸铝和氢氧化铝。
[0270]
在一些实施例中，佐剂可以包含皂苷。通常，皂苷是一种三萜糖苷，例如从皂树的树皮中分离出的那些。来自生物来源的皂苷提取物可以进一步分级(例如，通过色谱法)以分离具有最佳佐剂活性和可接受毒性的提取物的部分。用作佐剂的来自皂树的提取物的典型级分被称为级分a和c。示例性皂苷佐剂是qs-21，其可从antigenics获得。qs-21是一种寡糖缀合的小分子。任选地，qs-21可以与如3d-mpl或胆固醇等脂质混合。
[0271]
可以用于本文所述的免疫原性组合物的特定形式的皂苷是免疫刺激复合物(iscom)。iscom是本领域公认的一类佐剂，其通常包含皂树皂苷级分和脂质(例如，胆固醇和磷脂，如磷脂酰胆碱)。
[0272]
在一些实施例中，佐剂可以包含tlr(toll样受体)配体。tlr是可能存在于白细胞膜上的蛋白质，并且其识别外来抗原(包括微生物抗原)。示例性tlr配体是ic-31，其可从intercell获得。ic31包含抗微生物肽klk和免疫刺激性寡脱氧核苷酸odn1a。ic31具有tlr9激动剂活性。另一实例是含cpg的dna，不同种类的含cpg的dna可从prizer(coley)获得：vaximmune是cpg 7909(一种含(cpg)的寡脱氧核苷酸)，actilon是tlr9激动剂cpg 10101(一种含((cpg)的寡脱氧核苷酸)。
[0273]
在一些实施例中，免疫原性组合物(例如，如上所述的药物组合物)可以包含共价结合到抗原(例如，从转化植物纯化，如上所述)的佐剂。在一些实施例中，佐剂可以与抗原重组融合。可以共价结合到抗原的其它示例性佐剂包括但不限于多糖、合成肽、脂肽和核酸。
[0274]
在一些实施例中，佐剂可以被共表达并且是编码抗原的外源核酸序列的一部分。在一些实施例中，佐剂可以在转化植物细胞中与任何感兴趣的抗原共表达(例如，使用2a序列)。
[0275]
佐剂可以单独地或与另一佐剂相组合包含在免疫原性组合物中或与免疫原性组合物一起施用。可以组合佐剂以增加对抗原的免疫反应的幅度。在一些实施例中，相同佐剂或佐剂混合物存在于每个剂量的免疫原性组合物中。在一些实施例中，佐剂可以与免疫原性组合物的第一剂量一起施用，而不与随后的剂量一起施用。在一些实施例中，强佐剂可以与免疫原性组合物的第一剂量一起施用，而较弱佐剂或较低剂量的强佐剂可以与随后的剂
量一起施用。佐剂可以在施用免疫原性组合物之前、施用免疫原性组合物的同时或在向受试者施用免疫原性组合物之后(有时在1、2、6或12小时内，有时在1、2或5天内)施用。某些佐剂适用于人类患者、非人类动物或两者。
[0276]
免疫原性组合物的附加组分
[0277]
在一些实施例中，免疫原性组合物，包括例如药物组合物，可以包含一个或多个任选的附加组分。
[0278]
在一些实施例中，免疫原性组合物可以包含一个或多个稳定剂，例如糖(例如，蔗糖、葡萄糖或果糖)、磷酸盐(例如，磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或磷酸一钠)、谷氨酸盐(例如，l-谷氨酸单钠)、明胶(例如，经加工的明胶、水解明胶或猪明胶)、氨基酸(例如，精氨酸、天冬酰胺、组氨酸、l-组氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及其烷基酯)、肌苷或硼酸钠。
[0279]
在一些实施例中，免疫原性组合物可以包含一个或多个缓冲剂，例如碳酸氢钠和抗坏血酸的混合物。在一些实施例中，疫苗调配物可以在盐水中施用，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或蒸馏水。在某些实施例中，免疫原性组合物包含一种或多种盐，例如氯化钠、氯化铵、氯化钙或氯化钾。在某些实施例中，免疫原性组合物中包含防腐剂。在其它实施例中，不使用防腐剂。在某些实施例中，防腐剂是2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇和/或山梨酸。
[0280]
在某些实施例中，免疫原性组合物或药物组合物是控释调配物。
[0281]
施用
[0282]
可以使用向受试者(例如，非人类动物，例如反刍牲畜)施用转化植物和/或特定免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)的各种方法。
[0283]
施药途径
[0284]
在一些实施例中，向非人类动物(例如，牲畜动物)饲喂转化植物(例如，表达编码感兴趣的抗原的外源核酸序列的植物)或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)。
[0285]
在一些实施例中，本文的免疫原性组合物可以通过施用于个体，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮内、皮下、透皮、真皮下、颅内、鼻内、粘膜、肛门、阴道、口服、舌下、颊部途径，或它们可以被吸入)来递送，或者它们可以通过局部应用来施用。
[0286]
在一些实施例中，免疫原性组合物可以经由肌肉内途径施用。通常，以这种途径，疫苗被注射到肌肉组织的可及区域。在一些实施例中，在三角肌、股外侧肌、腹臀肌或背臀肌中进行肌肉内注射。注射通常与皮肤表面成大约90度角，因此疫苗可以穿透肌肉。
[0287]
还可以皮下施用免疫原性组合物。注射通常与皮肤表面成45度角，因此疫苗施用于皮下组织而不是肌肉。
[0288]
在一些实施例中，皮内施用免疫原性组合物。皮内施用与皮下施用类似，但注射深度不深，靶皮肤层为真皮。注射通常与皮肤表面成10-15度角，因此疫苗仅递送到表皮下方。
[0289]
施用时机
[0290]
在一些实施例中，在施用之前收获转化植物并将其包含在调配物或饲料组合物中。在一些实施例中，可以产生转化植物以稳定表达感兴趣的抗原，然后收获并进一步培养，以便生成表达感兴趣的抗原(例如，白细胞毒素a蛋白)的子代。
[0291]
在一些实施例中，非人类动物自施用转化植物和/或免疫原性组合物，例如食用转
化植物和/或免疫原性组合物。在转化植物瞬时表达感兴趣的抗原的一些实施例中，抗原序列的表达可以在施用之前进行测试。
[0292]
在一些实施例中，施用可以是或包括一个或多个剂量的转化植物和/或免疫原性组合物。作为具体实例，可以在一长段时间内向非人类动物多次施用(例如，饲喂)转化植物。在一些实施例中，一长段时间可以是超过1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时或1、2、3、4、5、6或7天的一段时间。在一些实施例中，在1、2、3、4、5、6、7天或更长时间内进行转化植物和/或免疫原性组合物的施用。
[0293]
在一些实施例中，在超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周的时间(例如，连续多周)内向非人类动物施用(例如，饲喂)转化植物和/或免疫原性组合物。在一些实施例中，每小时、每天、每天多次(例如，2-4次)、每周、每月或每年向非人类动物施用(例如，饲喂)转化植物和/或免疫原性组合物。在一些实施例中，每周1或2天向非人类动物施用转化植物和/或免疫原性组合物。在一些实施例中，每月至少1、2、3、4、5、6或7天(例如，连续多天)向非人类动物施用(例如，饲喂)转化植物和/或免疫原性组合物。在一些实施例中，仅施用一个剂量的转化植物和/或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)以实现上述结果。在其它实施例中，在初始给药后，受试者接受一个或多个附加剂量，总共两个、三个、四个或五个剂量。例如，在初始剂量后约1个月、2个月、4个月、6个月或12个月，可以施用第二或附加剂量，例如，一种给药方案可以涉及在0个月、0.5-2个月之间、4-8个月之间施用。可能有利的是，通过相同或不同途径施用分次剂量的免疫原性组合物。
[0294]
在一些实施例中，向非人类动物连续施用(例如，饲喂)转化植物和/或免疫原性组合物(例如，允许其连续食用)。在一些实施例中，向非人类动物连续(例如，饲喂)转化植物和/或免疫原性组合物至少1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时或1、2、3、4、5、6或7天。在一些实施例中，向非人类动物连续(例如，饲喂)转化植物和/或免疫原性组合物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。如本文使用，术语“连续”意指特定小时、天或周的每一餐。
[0295]
在一些实施例中，以特定量的饲料向非人类动物施用(即饲喂)剂量，或允许非人类动物饲喂一段指定时间(即“脉冲”饲喂)。在一些实施例中，脉冲饲喂方案包括每周一天脉冲(例如，在第0天、第7天和第14天)。
[0296]
在一些实施例中，治疗方案包括第一剂量的转化植物和/或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)，然后是第二剂量、第三剂量或第四剂量。在一些实施例中，第一剂量的免疫原性组合物包含免疫原性组合物，其含有一个或多个感兴趣的抗原、或编码一个或多个感兴趣的抗原的核酸、或一个或多个感兴趣的抗原和编码其的核酸的组合或其它感兴趣的抗原。在一些实施例中，用与第一剂量相同的感兴趣的抗原、编码其的核酸或组合来调配剂量。在一些实施例中，用与第一剂量不同的感兴趣的抗原、编码其的核酸或与不同抗原的组合来调配第二或附加剂量。在一些实施例中，佐剂与一个或多个剂量的转化植物和/或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)同时或依次递送。
[0297]
给药
[0298]
在一些实施例中，待递送的抗原的适当量将取决于受试者(例如，非人类动物，例如反刍牲畜)的年龄、体重和健康(例如，免疫受损状态)。
[0299]
如本文所述的免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)可以采用多种剂型。在某些实
施例中，组合物以固体或粉末(例如，冻干)形式提供；它也可以溶液形式提供。在某些实施例中，剂型以冻干组合物的剂量和至少一个单独的无菌稀释剂容器的形式提供。
[0300]
在一些实施例中，免疫原性组合物的剂量是基于期望递送到受试者(即非人类动物)的抗原量来计算的。在一些实施例中，抗原以每剂量1μmol的量调配。在一些实施例中，抗原以每剂量10nmol到100nmol的剂量递送。待递送的抗原的适当量可以由本领域的技术人员确定。在一些实施例中，待递送的抗原的适当量将取决于非人类动物受试者的年龄、体重和健康(例如，免疫受损状态)和物种。
[0301]
本文公开的免疫原性组合物(在一些实施例中)以足以引发抗体产生作为免疫原性反应的一部分的量施用。在一些实施例中，可以将组合物调配成含有5μg/0.5ml抗原或10μg/1ml到200μg/1ml范围内的量的抗原。在其它实施例中，组合物可以包含抗原的组合。多个抗原可以各自为相同浓度，也可以为不同浓度。在一些实施例中，被调配成植物基疫苗的免疫原性组合物将包含比被调配成常规疫苗或药物组合物的免疫原性组合物更高量和/或浓度的抗原。在一些实施例中，被调配成植物基疫苗的免疫原性组合物将包含被调配成常规疫苗或药物组合物的免疫原性组合物至少2倍、3倍、4倍或5倍量和/或浓度的抗原。在一些实施例中，可以将组合物调配成待向非人类动物施用(即饲喂)的饲料日量。在一些实施例中，待包含在日粮中的抗原浓度是基于抗原浓度占日粮中总可溶性蛋白的百分比的。在一些实施例中，日粮或组合物包含的抗原量为日粮或组合物中的总可溶性蛋白的至少约0.1％。在一些实施例中，日粮或组合物包含的抗原量为日粮或组合物中的总可溶性蛋白的至少约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％或5.0％或更大比例。在一些实施例中，日粮或组合物中的抗原量在日粮或组合物中的总可溶性蛋白的约0.5％到约2％的范围内。
[0302]
在一些实施例中，免疫原性组合物将以剂量递增方式施用，使得免疫原性组合物的连续施用包含比先前施用更高浓度的组合物。在一些实施例中，免疫原性组合物将以某一方式施用，使得免疫原性组合物的连续施用包含比先前施用更低浓度的组合物。
[0303]
在一些实施例中，仅施用一个剂量(一次施用)的免疫原性组合物。在其它实施例中，免疫原性组合物以多个剂量和/或多次施用。在各个实施例中，免疫原性组合物被施用一次、两次、三次或多于三次。施用于受试者的剂量数可以取决于例如免疫原性组合物中的抗原、疾病的程度或预期的疾病暴露程度以及受试者(例如，非人类动物)对组合物的反应。
[0304]
转化植物和/或免疫原性组合物的用途
[0305]
在一些实施例中，本文所述的转化植物和/或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)可以用于感染(例如，由梭杆菌引起的感染)的预防性和/或治疗性治疗。转化植物和/或免疫原性组合物的用途可以取决于例如许多因素，包括但不限于受试者(例如，非人类动物，例如反刍牲畜)的年龄、体重和健康(例如，免疫受损状态)、受试者是否已暴露于特定抗原、受试者呈现的症状或无症状以及受试者中存在的其它疾病。
[0306]
预防性用途
[0307]
在预防性实施例中，向受试者施用本文所述的转化植物和/或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)以诱导免疫反应，所述免疫反应可以帮助保护免受感染(例如，牲畜动物常见的感染，例如引起瘤胃酸中毒、瘤胃炎和肝脓肿的梭杆菌感染)。
[0308]
在一些实施例中，转化植物和/或免疫原性组合物赋予保护性免疫，从而允许受试
者(例如，反刍动物)由于暴露于转化植物和/或免疫原性组合物(例如，记忆反应)而表现出感染的症状发作的延迟或症状严重程度的降低。在某些实施例中，症状严重程度的降低是至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。已经施用本公开的转化植物和/或免疫原性组合物的一些动物可能在接触抗原(例如，梭杆菌)后不表现出症状，或者甚至不表现出例如梭杆菌感染的感染。在一些实施例中，在施用本文所述的疫苗调配物后，已经施用转化植物和/或免疫原性组合物的动物的血清中的igg效价可以提高1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或甚至100倍或更多倍。在某些实施例中，释放的ifn-γ的量增加为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或甚至100倍。在一些实施例中，在暴露于所述抗原之前由抗原呈递所赋予的保护性免疫将降低未来感染的可能性。
[0309]
保护性免疫的持续时间可以根据各个实施例而有所不同。在一些实施例中，保护性免疫持续六个月、一年、两年、五年、十年、二十年或甚至终生。在一些实施例中，保护性免疫仅持续数小时、数天或数周(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周、两周、三周)。
[0310]
在一些实施例中，特异性多肽抗原(例如，ltka的免疫原性片段)的组合可以证明对治疗感染(例如，梭杆菌感染)或上述症状的发作是有效的。用于预防性用途的示例性免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)可包含载体、选自pl1、pl2、pl3、pl4和pl5的ltka的免疫原性片段的任何组合或其任何片段或变体。
[0311]
治疗性用途
[0312]
在包括治疗应用的一些实施例中，可以将包含抗原和/或编码本文所述抗原的核酸的转化植物和/或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)以足以治疗受试者(例如，非人类动物，例如反刍牲畜)的量施用于患有疾病、病症或病状(例如，牲畜动物常见的感染，例如梭杆菌感染)的非人类动物受试者。在这种情况下，治疗受试者可以指延迟和/或减少感染的一种或多种症状。在某些实施例中，施用如本文所提供的转化植物和/或免疫原性组合物可以实现，相较于受试者接受转化植物和/或免疫原性组合物之前，将一种或多种症状减少至少5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。
[0313]
如本文所提供的植物或组合物的第一(或后续)剂量的施用时机可以以应用适当的方式(例如，相对于感染或症状表现的时机)而有所不同。例如，免疫原性组合物可以在感染后立即施用，例如在症状出现之前施用，或可以在症状出现期间或之后施用。在一些实施例中，转化植物和/或免疫原性组合物可以防止早期感染的内源性再激活。
[0314]
在一些实施例中，转化植物和/或免疫原性组合物以在非人类动物中导致免疫反应的量施用。评估免疫反应的方法包括例如测试抗体反应。在一些实施例中，抗体反应通过从用转化植物和/或免疫原性组合物治疗的非人类动物(例如，患有或易患梭杆菌感染的非人类动物)获得血清并测量对于特定抗原(例如，梭杆菌的毒力因子或其免疫原性片段)具有特异性的抗体来测量。在一些实施例中，使用抗体效价测定(例如，elisa)来检测抗体。
[0315]
在一些实施例中，免疫反应通过确定各个炎性标志物(例如，触珠蛋白、血清-淀粉样蛋白a、纤维蛋白原、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α)的表达和/或分泌水平来测量。
[0316]
用于治疗梭杆菌感染的转化植物
[0317]
在一些实施例中，本公开的转化植物和/或免疫原性组合物可以用于治疗梭杆菌感染。梭杆菌是革兰氏阴性厌氧菌属，其包括几个物种，包括坏死梭杆菌和具核梭杆菌。具核梭杆菌是最常从人类中分离出的物种，包括5个亚种。
[0318]
坏死梭杆菌包括两个亚种(坏死梭杆菌坏死亚种和坏死梭杆菌漏斗形亚种)。坏死梭杆菌经常从非人类动物中分离出，可以引起多种感染(例如，腐蹄病、肝脓肿、口腔炎和坏疽性皮炎)。在人类中，坏死梭杆菌通常表现为“雷米尔氏综合征”(咽峡后脓毒症)。坏死梭杆菌引起的其它感染包括肝脓肿、肺脓肿、女性生殖道感染、腹腔内感染和皮肤结构感染。动物和人类中的典型致命疾病是由坏死梭杆菌坏死亚种引起的(citron，diane m，《临床传染病(clinical infectious diseases)》，35.副刊_1(2002):s22-s27)。
[0319]
坏死梭杆菌的定植可以导致腐蹄病等症状，腐蹄病(例如，牛或绵羊)是由坏死梭杆菌在蹄部创伤部位区域定植，然后暴露于潮湿(wet/damp)环境中而引起的，其特征在于受感染动物的趾间皮肤的疼痛性炎症。所述疾病的影响包括跛行、食欲不振、体重减轻和死亡。
[0320]
还已知坏死梭杆菌会引起肝脓肿等症状，这可能是由瘤胃溃疡引起的，坏死梭杆菌(在一些情况下，驻留于胃肠道微生物群落中)通过瘤胃进入血流，并继续通过门静脉侵入肝脏并引起脓肿。
[0321]
在一些实施例中，用于治疗梭杆菌感染的转化植物是表达编码白细胞毒素a的外源核酸序列或其片段或变体的转化植物。在一些实施例中，用于治疗梭杆菌感染的转化植物是表达编码梭杆菌的另一毒力因子的外源核酸序列或其片段或变体的转化植物。在一些实施例中，转化植物和/或免疫原性组合物赋予保护性免疫，从而允许受试者(例如，反刍动物)由于暴露于转化植物和/或免疫原性组合物(例如，记忆反应)而表现出梭杆菌感染的症状发作的延迟或症状严重程度的降低。在一些实施例中，转化植物和/或免疫原性组合物导致受试者(例如，反刍动物)的体重(weight/body mass)增加。
[0322]
在包括治疗性应用的一些实施例中，可以将包含如白细胞毒素a等抗原和/或编码本文所述的抗原的核酸的转化植物和/或免疫原性组合物(例如，植物基疫苗)以足以治疗受试者(例如，非人类动物，例如反刍牲畜)的量施用于患有由梭杆菌感染引起的症状的非人类动物受试者。
[0323]
本发明的其它特征在示例性实施例的以下描述过程中将变得显而易见，所述示例性实施例为了说明本发明而给出并且不旨在对本发明进行限制。
[0324]
实例
[0325]
以下实例公开了用包含编码白细胞毒素a的一个或多个免疫原性片段的外源核酸序列的核酸材料(例如，dna构建体)转化植物细胞(例如，来自高粱或粟植物物种)的示例性方法。以下描述的方法进一步包括将转化植物调配成免疫原性组合物，并将免疫原性组合物施用于患有由梭杆菌感染引起的疾病、病症或病状的非人类动物受试者(例如，反刍牲畜)。
[0326]
实例1：核酸构建体
[0327]
下面的实例利用白细胞毒素的两个免疫优势区，即pl1和pl4，来开发合成这些蛋白质的选定作物物种，使得它们可以用作草场反刍动物的植物基疫苗。出于本实例的目的，选择高粱叶绿体(sorghum bicolor(l.)moench，genbank:nc_008602.1)和粟叶绿体(panicum miliaceum l.，genbank:ku343177.1)作为宿主质体基因组用于合成示例性植物基疫苗。高粱质体基因组将产生三个免疫原性蛋白质操纵子：pl1(seq id no:4)、pl4(seq id no:10)和pl1 pl4。将通过将产生pl1和pl4的植物与仅用pl1或pl4中的一者转化植物进
id no:5)；
[0342]
○
用于pl4的烟草lrbcl前导序列(genbank:eu224430.1或seq id no:9)；
[0343]
○
用于dsred的烟草latpb前导序列(genbank:dq672338.1或seq id no:11)；和
[0344]
○
用于cfp的烟草花叶病毒ω'翻译前导序列(genbank:km507060.1或seq id no:13)。
[0345]
启动子序列
[0346]
除了增强子序列外，本实例中使用的dna构建体还包含位于外源核酸序列的5'端附近(上游)的启动子序列，以发起抗原(在本实例中为pl1、pl4或pl1 pl4)的转录。选择了来自烟草的单个组成型表达的rrna启动子prrn(genbank:mf580999.1或seq id no:2、21)或ppsba(seq id no:24)，并且其被表明在几个植物物种中成功合成多顺反子操纵子，包括拟南芥。
[0347]
终止序列
[0348]
在本实例的dna构建体中，选择了单个终止子序列来停止转基因操纵子的转录，并将其置于dna构建体内相对于编码抗原的外源核酸序列的位置(在编码pl1、pl4的序列的3'端处)。具体地，选择烟草基因rps16(genbank:mf580999.1或seq id no:7或seq id no:22)是因为它已经在多个叶绿体转化载体中成功使用。
[0349]
高粱核酸构建体
[0350]
本实例中的上述元件被排列和并入以形成待引入(例如，通过转化)到宿主植物(在本特定实例中，宿主植物是高粱)中的dna构建体。
[0351]
在本例中，根据上述内容，制造了三个高粱靶向构建体：
[0352]
构建体1：左侧翼
高粱
–
prrn
烟草
–
lgene10 t7噬菌体
–
pl1
梭杆菌
–
lcry9aa2
芽孢杆菌
–
yfp
–
trps16
烟草
–
右侧翼
高粱
；4022个碱基(图1，seq id no:17)
[0353]
构建体2：左侧翼
高粱
–
ppsba
烟草
–
lrbcl
烟草
–
pl4
梭杆菌
–
latpb
烟草
–
dsred
圆盘海葵
–
[trps16
烟草
或trps16
烟草
alt]
–
[右侧翼
高粱
或右侧翼
高粱
alt]4607个碱基(图2；seq id no:18)
[0354]
构建体3：左侧翼
高粱
–
prrn
烟草
–
lgene10 t7噬菌体
–
pl1
梭杆菌
–
lrbcl
烟草
–
pl4
梭杆菌
–
lω'
烟草花叶病毒
–
cfp
–
trps16
烟草
–
右侧翼
高粱
或右侧翼
高粱
alt]；5069个碱基(图3，seq id no:19)
[0355]
粟核酸构建体
[0356]
本实例中的上述元件被排列和并入以形成待引入(例如，通过转化)到宿主植物(在本特定实例中，宿主植物是粟)中的dna构建体。
[0357]
在本实例中，根据上述内容，制造了一个粟靶向构建体：
[0358]
构建体4：左侧翼
黍
–
prrn
烟草
–
lgene10 t7噬菌体
–
pl1
梭杆菌
–
lrbcl
烟草
–
pl4
梭杆菌
–
lω'
烟草花叶病毒
–
cfp
–
trps16
烟草
–
右侧翼
panicum
；5940个碱基(图4，seq id no:20)
[0359]
实例2：生成核酸构建体的方法
[0360]
为了获得待引入宿主植物基因组的dna构建体的足够拷贝，获得dna构建体，然后使用标准pcr反应进行拷贝，然后从产物纯化并调配以递送到宿主植物基因组。
[0361]
通过invitrogen的geneart基因合成(www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis)服务在pmx载体质粒内生成核酸构建体。将制造商提供的干燥dna重悬至100ng dna/μl 10mm tris，1mm edta ph 8.0。
[0362]
每个dna构建体的大量拷贝将通过聚合酶链式反应(pcr)使用分别与相应左侧翼
区的5'端和右侧翼区的3'端比对的特异性正向和反向引物(由eurofins genomics(布鲁塞尔，比利时)合成)来生成。反应组分将如下组装：
[0363]
反应组分最终浓度激烈火球菌聚合酶0.4单位10x pcr缓冲液(200mm tris hcl(ph 8.4)，500mm kcl)1x10mm dntp1mm50mm mgcl250mm正向引物1pmol反向引物1pmol质粒dna20ng双蒸馏h2o至多20μl
[0364]
每个pcr反应靶向模板》1kb将在biorad cfx96光学热循环仪(biorad)中进行如下所述的热循环：
[0365][0366]
将在2％琼脂糖中对所得的反应物进行大小分级，并且将根据制造商的说明使用qia快速凝胶提取试剂盒(qiagen，芬洛，荷兰)切除和清洁适当大小的扩增子。经清洁的扩增子将使用applied biosystems(ab)3500xl毛细管测序仪进行序列确认，并使用序列分析v5.4软件(thermofisher scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞)进行分析。将至少10μg每个经序列确认的扩增子在4℃下储存直至处理。
[0367]
实例3：示例性递送方法
[0368]
一旦dna构建体以例如每个序列10μg的量分离和纯化，就用载体调配dna构建体(上述四种中的每一者)。在本实例中，载体有助于转化到宿主植物细胞中的效率和准确性。
[0369]
在本实例中，使用与demirer等人(2019)所描述的类似程序将单壁碳纳米管(swcnt，sigma)用来引导构建体到高粱和粟叶的叶绿体。swcnt将以以下方式制备：
[0370]
1.将干燥的swcnt重悬于水中至1mg/ml的浓度；
[0371]
2.将1mg/ml swcnt加入到2％十二烷基硫酸钠:水(sds)中；
[0372]
3.对混合物进行浴槽超声处理10分钟(40％振幅，～12w)；
[0373]
4.在冰上用6mm尖端脂肪40％振幅(～12w)对混合物进行尖端超声处理60分钟；
[0374]
5.将混合物在室温下静置30分钟；
[0375]
6.将混合物以16,100x g离心60分钟；和
[0376]
7.将上清液转移到新试管中，使用uv-vis-nir光谱仪进行光谱分析。
[0377]
所获得的上清液中的期望swcnt浓度应为～1mg swcnt/ml2％sds(使用632nm处的swcnt吸光度浓度/消光系数0.036)。将至少1mg每个经序列确认的扩增子在4℃下储存直至处理。
[0378]
一旦制备了含有swcnt的混合物，swcnt就可以与上面制备的dna构建体接触并缀
合。将根据制造商的说明使用孔大小的透析盒(slide-a-lyzer，themorfisher)通过透析将所储存的dna构建体的扩增子吸附到制备好的swcnt上，从而产生缀合dna-swcnt。将swcnt缀合到dna构建体的方法如下：
[0379]
1.将1ug准备好的swcnt和10μg准备好的dna构建体经由注射器针头(已提供)直接加入到透析盒中；
[0380]
2.加入2％sds直至透析盒装满；
[0381]
3.将盒附接到浮标(提供)；
[0382]
4.将具有附接浮标的透析盒放入装有0.1m氯化钠(nacl)和磁力搅拌棒的1l烧杯中；和
[0383]
5.连续磁力搅拌透析盒四天，并每天更换透析缓冲液。
[0384]
dna吸附到swcnt的确认将通过将dna缀合swcnt的红外荧光与对照样本进行比较来进行，对照样本是在没有dna构建体的情况下透析的swcnt。通过比对照样本更高的红外荧光，观察到dna吸附到swcnt。
[0385]
实例4：叶绿体的转化
[0386]
然后，将制备好的缀合到swcnt的dna构建体(dna-swcnt)调配成用于引入宿主植物细胞(例如，经由转化)。在本实例中，将使用移液器吸头或剃刀将缀合dna-swcnt浸润到植物叶片的较小的轻轻刺破的背轴表面(取决于进入粟或高粱的植物叶的dna构建体)。将使用无针注射器通过施加较轻压力将总共100μl缀合dna-swcnt应用于刺破区域。在同源重组24
–
72小时后，将使用以下评价转化的成功：
[0387]
○
将使用定量实时pcr，通过使用rneasy植物迷你试剂盒(qiagen)、iscript cdna合成试剂盒(bio-rad)和powerup sybr green master mix(applied biosystems)提取总rna并将与基因特异性引物的反应和与“管家”基因的反应之间的量化阈值进行比较来评价转基因基因表达的水平。
[0388]
○
将使用共聚焦显微镜，通过切除一小部分浸润叶，将其置于载玻片和盖玻片之间并将玻片暴露于适当的激发波长以观察选择序列(yfp、dsred和cfp，取决于构建体)的荧光来观察荧光。
[0389]
来自转化植物的抗原产生量将使用elisa来量化。量化从转化植物产生的抗原量的方法包括以下：
[0390]
1.用研钵及研杵研磨新鲜叶组织(100mg)；
[0391]
2.将磨碎的组织重悬于500μl提取缓冲液(100mm nah2po4、8m尿素和0.5m nacl；ph 8)中；
[0392]
3.还将铺板标准曲线(1-10μg)的由thermofisher scientific(www.thermofisher.com/ca/en/home/life-science/antibodies/primary-antibodies/polyclonal-antib odies)提供的纯重组pl1和pl4抗原在碳酸盐缓冲液(ph 9.6)中的稀释液；
[0393]
4.将样本置于微量离心管中，并在4℃下以14,000rpm离心10分钟。
[0394]
5.将蛋白质提取物(在碳酸盐缓冲液中的稀释液)在选定elisa板孔中于4℃下孵育过夜；
[0395]
6.用pbst(3.2mm na2hpo4、0.5mm kh2po4、1.3mm kcl、135mm nacl、0.05％吐温20，
ph 7.4)洗涤板；
[0396]
7.用2％脱脂奶粉的碳酸盐缓冲液溶液封闭板60分钟；
[0397]
8.用pbst洗涤板一次；
[0398]
9.将板与抗pl1和抗pl4多克隆抗体(1:500 2％脱脂奶粉)一起孵育60分钟；
[0399]
10.用pbst洗涤；
[0400]
11.将板与第二单克隆抗体(1:10000 2％脱脂奶粉)一起孵育60分钟；
[0401]
12.加入0.3mg/l2-20连氮-双-3乙基苯并噻唑啉-6-硫酸(abts；sigma，密苏里，美国)和0.1m柠檬酸，ph 4.35；
[0402]
13.使用multiskan ascent(thermo scientific，马萨诸塞，美国)酶标仪，记录405nm处的光密度；和
[0403]
14.所表达的pl1和pl4将通过将100mg总蛋白中的od
405
与标准曲线的od
405
进行比较来量化。
[0404]
实例5：叶绿体转化
[0405]
在本实例中，尤其出于工程改造可食用疫苗以保护放牧牛免受坏死梭杆菌白细胞毒素a的侵害的目的，将宿主植物叶绿体基因组用pl1、pl4和pl1 pl4(坏死梭杆菌白细胞毒素a的免疫优势区)转化。通过接种预先装载有质体表达盒的功能化单壁碳纳米管来靶向宿主叶绿体基因组。初步结果表明，观察到成功的盒注入、质体表达盒的整合以及坏死梭杆菌免疫原性亚基转录物的表达。
[0406]
寄主植物材料
[0407]
在本实例中，使寄主植物谷类物种高丹草(sorghum bicolor((l.)moench)
×
(sorghum
×
drummondii)(nees ex.steud.))种子在jiffy泥炭颗粒中发芽，并将一周龄幼苗移植到装有vigoro通用盆栽土壤的盆中，在环境自然采光的房间中放置三周。
[0408]
构建体开发
[0409]
编码两个免疫原性亚基坏死梭杆菌白细胞毒素a，即pl1和pl4(参见sun等人，2009)的dna序列来源于genbank登录号dq672338，并分别对应于seq id no:4和10。
[0410]
高丹草叶绿体转化载体被设计成促进转基因材料在trng和trnm基因之间的整合。载体的左和右侧翼区对应于高粱(sorghum bicolor)叶绿体完整基因组(genbank登录号nc_008602)的碱基13151至14490和14491至15560。表达载体“pl1”(其在实例1中示出为“构建体1”并在seq id no:17中标识)设计有烟草启动子prrn，在genbank mf580999中标识，以驱动pl1的多顺反子表达，配备有增强子t7噬菌体基因10前导序列(genbank登录号eu520588)和黄色荧光蛋白(yfp；genbank登录号gq221700)，配备有增强子苏云金芽孢杆菌cry9aa2基因前导序列(genbank登录号mf461355)，并以烟草trps16(genbank登录号mf580999)终止。
[0411]
表达载体“pl4”(其在实例1中示出为“构建体2”并在seq id no:18中标识)设计有烟草启动子ppsba，在genbank dq459069中标识，以驱动pl4的多顺反子表达，配备有烟草增强子rbcl(genbank登录号eu224430)和红色荧光蛋白(dsred；genbank登录号ky426960)，配备有烟草增强子latpb(genbank登录号eu224425)，并以烟草trps16终止。
[0412]
表达载体“pl1 pl4”(其在实例1中示出为“构建体3”并在seq id no:19中标识)设计有烟草启动子prrn，以驱动pl1和pl4的多顺反子表达，分别配备有增强子t7噬菌体基因
10和烟草rbcl以及青色荧光蛋白(mturquoise2；genbank登录号hq993060)，配备有增强子tmvω'翻译前导序列(genbank登录号km507060)，并以烟草trps16终止。
[0413]
粟叶绿体转化载体被设计成在genbank登录号ku343177的基因trnt和trnl之间进行整合，其中左和右侧翼靶向区分别对应于碱基46391至47746和47747至49115。本多顺反子载体被设计成表达pl1和pl4(分别配备有增强子t7噬菌体基因10和烟草rbcl)以及青色荧光蛋白(配备有增强子tmvω'翻译前导序列)，并由烟草启动子prrn驱动，并且具有由烟草trps16终止的表达(其在实例1中示出为“构建体4”并在seq id no:20中标识)。
[0414]
表达载体合成外包给genscript(新泽西，美国)。每个载体作为含在质粒骨架中的干燥dna接收。在由phusion u热启动dna聚合酶(thermofisher，马萨诸塞，美国)、1x pcr缓冲液、水和10μm高粱或粟叶绿体引物(参见表1)构成的50μl反应物中对表达载体进行pcr扩增，以分别从5pg高粱或粟质粒模板生成扩增子。这些pcr反应在biorad cfx 384(biorad laboratories，加利福尼亚，美国)热循环仪上使用以下条件进行：98℃下初始变性三分钟，98℃下变性10秒，63℃下变性30秒，72℃下变性5分钟，72℃下最后扩展10分钟。将十微升pcr产物在1％凝胶上进行大小分级，在dark reader透照仪(clare chemical research，科罗拉多，美国)上通过gelstar核酸染剂(thermofisher)照射。剩余的pcr产物用exosap-it pcr产物清理试剂(thermofisher)清洁。
[0415]
表1.用于扩增表达载体的引物。
[0416][0417]
纳米材料的制备
[0418]
使用kwak等人(2019)描述的方法，用壳聚糖和非共价键合m
w 5,000聚乙二醇对单壁碳纳米管(swcnt)进行功能化。简而言之，将0.3％乙酸与0.3g低分子量脱乙酰壳聚糖(cs，sigma，密苏里，美国)和0.15g高压一氧化碳(hipco)合成的swcnt(nanointegris，魁北克，加拿大)混合。将本混合物置于冰浴中并以40％的振幅进行尖端超声处理40分钟，并在去离子水中用100kda分子量截止膜透析过夜。这些cs-swcnt以16,100g离心两次，持续两小时。cs-swcnt的聚乙二醇化通过在室温下将0.1当量的ho-peg5k-nhs(sigma)与壳聚糖纳米管混合六小时，然后以16,100g离心75分钟来进行。将cs
peg5k-swcnt在2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液中重构，稀释至1.5mg/l，并与经清洁的pcr产物混合至dna-cs
peg5k-swcnt比率为6:1w/w。
[0419]
植物的接种
[0420]
通过通过无针注射器(～5ml)的背轴表面叶注入或通过有针注射器(～0.5ml)的茎注射，对健康、完全发育的高丹草植物进行dna-cs
peg5k-swcnt的接种。植物在组织采集前正常维持两天。用高粱叶绿体靶向构建体接种总共18株高粱植物。分别用pl1构建体、pl4构建体和pl1 pl4构建体分别接种六株植物，并使三株植物在未接种的情况下生长。
[0421]
为了评价植物内源dna酶活性，将20μl牛基因组dna(2.5ng/μl)分别注射到三株未经处理的高粱植物的茎中，随后在总dna提取之前分别使其正常生长一天、两天和一周。
[0422]
组织采集和核酸制备
[0423]
接种两天后，将高粱组织从活植物中切下并立即浸入足够体积的rnalater(thermofisher)中，随后冷冻直至核酸提取。
[0424]
根据制造商的说明使用magbind植物dnaplus试剂盒提取总dna，并根据制造商的说明使用magbind总rna试剂盒提取总rna。使用制造商的说明使用onescript逆转录酶试剂盒(thermofisher)将一部分总rna合成为cdna。pcr反应中使用的oligo dt引物在表2和3中示出。
[0425]
表2.用于基于sybr的pcr反应以检测免疫原性白细胞毒素亚基编码dna和高粱参考表达基因的引物组。
[0426][0427]
表3.用于基于taqman的pcr反应以检测免疫原性白细胞毒素亚基编码dna和高粱和粟参考表达基因的引物组。
[0428][0429]
表4.用于pcr反应以确认转基因构建体插入高粱和粟叶绿体基因组的引物组。
[0430]
和粟叶绿体。
[0431][0432]
实时pcr
[0433]
核酸制剂用作使用表2和3中详述的引物组的实时pcr反应中的模板。丝氨酸/苏氨酸-蛋白磷酸酶(pp2a，genbank登录号xm_002453490)用作高粱研究的校准基因，因为它在应激条件下表现出稳定的表达水平(参见reddy等人，2016)。cdna的基于sybr的实时pcr反应在使用powerup sybr green master mix(applied biosystems，马萨诸塞，美国)、10μm正向和反向引物和1μl模板(dna、rna、cdna或水)的biorad cfx384(biorad实验室)中，于具有绝对qpcr光学胶带密封(thermofisher)的犰狳pcr板(thermofisher)中进行，并用biorad cfx管理器软件v3.1(biorad)使用线性回归分析以确定定量循环(cq)。dna和cdna的基于taqman的实时pcr反应在使用0.4u accustart ii taq聚合酶(quantabio，新泽西，美国)、10μm正向和反向引物、0.4μm基因特异性探针和1μl模板(dna、rna、cdna或水)的biorad cfx384(biorad laboratories)中，于具有绝对qpcr光学胶带密封(thermofisher)的犰狳pcr板(thermofisher)中进行，并用biorad cfxx管理器软件v3.1(biorad)使用线性
回归分析以确定定量循环(cq)。
[0434]
测序
[0435]
使用applied biosystems 3500xl遗传分析仪和pop-7聚合物协议(applied biosystems用户指南-4337036)，直接使用原始反应的基因特异性引物以及bigdye terminator v1.1循环测序试剂盒(applied biosystems，福斯特城，加利福尼亚，美国)对pcr产物进行测序。
[0436]
结果
[0437]
构建体的验证
[0438]
含有叶绿体转化载体的质粒以干燥dna的形式到达，随后在te中重组为5pg/μl工作储备液，以用作pcr扩增表达载体的模板。经大小分级的pcr产物表明，扩增子具有合适的大小(参见图5)，从而证实样本含有表达载体。
[0439]
rna制剂和cdna合成的评价
[0440]
为了确保对总rna适当处理并从表达的转录物中忠实合成cdna，靶向pp2a(一种已知在粟(saha和blumwald，2014)和高粱(reddy等人，2016)的地上组织中稳定表达的基因)的pcr测定是在由未接种和接种粟(图9a)和高粱(图9b)植物制备的cdna上进行的。结果表明，rna均得到了适当处理，并且cdna是由本研究中使用的所有植物适当合成的。
[0441]
活植物组织中的构建体持久性
[0442]
为了评估表达载体dna是否存在并持久存在于接种植物组织中，从而指示叶绿体转化成功，在未接种和接种植物的dna提取物上进行一系列pcr反应。接种两天后，对来自所有接种植物的dna进行pl1和pl4表达构建体测试。每个测试的结果示出在图6-8中。这些结果证实，在所测试的所有五株转化高粱植物中都存在pl1(图6)、pl4(图7)和pl1 pl4(图8)。
[0443]
免疫原性白细胞毒素a亚基的表达和叶绿体染色体整合的证据
[0444]
为了收集构建体有效地穿梭到高粱叶绿体、通过同源重组成功地与质体基因组重组并表达为白细胞毒素mrna的证据，使用来自天然高粱叶绿体区域的引物以及pl1和pl4测定进行了一系列pcr，在适用的情况下使用dna和cdna模板。
[0445]
如下所述在biorad cfx96光学热循环仪(biorad)中进行pcr反应：
[0446][0447]
结果表明，一株接种了pl1 pl4构建体的高粱植物表现出可检测的转录表达水平(图10a)。此外，用位于构建体的左侧翼之外且插入序列(具体是pl1序列)之内的引物靶向来自本pl1 pl4接种高粱植物的dna模板的pcr产生了预期大小的产物(1612个碱基，图10a)。此外，使用位于插入序列(具体是mturquoise序列)之内且构建体的右侧翼之外的引物生成了预期大小的产物(1363个碱基)(图10b)。这表明，存在从天然高粱叶绿体延伸到坏死梭杆菌抗原的连续模板，即转化载体和高粱叶绿体基因组之间发生了成功的重组。通过cdna测序进行的确认表明，50个连续碱基与本pcr产物和相对应的pl4序列同一性匹配(图11)。
[0448]
开发表达免疫原性白细胞毒素亚基的成熟高粱植物的后续努力以与上述类似的方式用缀合到pl1 pl4叶绿体转基因构建体的功能化纳米管(如本文所述)接种。验证转基因构建体插入高粱叶绿体(即转化)的pcr结果示出了预期大小的条带(1612个碱基，图12)，来源于所述植物数据的随后的mrna的rt-qpcr结果示出了pl4亚基以及pp2a参考基因和相关对照的转基因表达(图13)。
[0449]
为了确认构建体有效地穿梭到粟叶绿体并通过同源重组成功地与质体基因组重组，进行用位于构建体的左侧翼之外且插入序列(具体是pl1序列)之内的引物靶向来自pl1 pl4接种粟植物的dna模板的pcr。结果示出了预期大小的条带(1895个碱基，图14)，从而表明存在从天然粟叶绿体延伸到坏死梭杆菌抗原的连续模板。
[0450]
本接种粟植物的后续rt-qpcr示出了pl1和pl4 cdna的扩增(图15)，从而提供了转基因构建体dna正在诱导粟植物表达期望的坏死梭杆菌mrna的证据。
[0451]
接种后三个月的构建体存在的证据
[0452]
由于核酸提取涉及牺牲所采样的植物，一系列高粱植物被接种并放置数月，使得可以针对构建dna是否在宿主植物的环境中持久存在来对它们进行评价。为了评估这种可能性，收获接种后三个月的茎注射部位上方的植物组织(接种物可能在此处传播，并且推测分生组织位于此处)，提取它们的核酸(分别提取rna和dna)，并进行制备以用作pcr反应以及pl1和pl4测定中的模板。在先前数月接种和组织收获后存活的植物也以这种方式进行了测试，以查看是否可以收集到构建体持久性的附加证据。所有这些实验的结果在图16中示出。值得注意的是，一株接种了pl1 pl4构建体且先前未进行过测试的植物示出了pl1和pl4靶标的证据。在rna提取和cdna合成后，上述植物均未表现出pl1和pl4的mrna表达(结果未示出)。
[0453]
为了进一步验证pl1和pl4扩增的标识，将图16中这些相应pcr扩增子的序列与它们的预期序列进行比对(图17和18)。这些比对示出了与已知的pl1序列(pl1-dnaseq；图17)比对的具有同一性的pl1 pcr产物中的序列(pl1_pcrprod)的22个碱基，与已知的pl4序列(pl4-dnaseq；图18)比对的具有同一性的pl4 pcr产物中的序列(pl4_pcrprod)的16个碱基。
[0454]
讨论
[0455]
此处提供的结果示出了成功的转化和表达事件发生在高粱幼苗中的证据。这一发现证实，叶绿体转化载体的设计至少会导致宿主物种中的叶绿体染色体整合和异位表达。这一结果是高粱叶绿体基因组的首次已知尝试和成功转化。
[0456]
此处提供的结果还示出了用粟转基因构建体成功转化粟叶绿体的证据。如用于同源重组的质体基因组靶标的本文公开的构建体的遗传元件的选择、及烟草和噬菌体调节元件的使用、以及与纳米管的相关联作用(功能化、dna缀合、接种等)这一研究领域中没有确定的先例，并且代表了一个独特组合。
[0457]
图10图(a)和图10图(b)中示出的扩增证实，关于选定高粱侧翼区和盒表达组分(例如，启动子)所做的选择足以分别诱导同源重组和从盒引发mrna表达，而图14证实，关于选定侧翼区的选择足以诱导粟叶绿体基因组中的同源重组。
[0458]
此外，表现出pl4亚基的表达的植物已接种了pl1 pl4构建体，这表明pl1也可能被表达，但水平低于本实例中使用的方法的检测限。
[0459]
另一令人鼓舞的结果是，dna构建体中的靶标在植物中物理持久存在，因为在接种两天后在所有植物中都观察到靶标(图6-8)，并且一株植物在接种三个月后表现出靶标扩增(图16)。天然植物dna酶尤其响应于机械损伤和叶浸润而被诱导(mittler和lam，1996)。由于机械损伤和叶浸润都发生在注射和注入接种期间，因此它支持接种物dna到达其预期的叶绿体目的地并避开经质外体释放的dna酶的消化。为了进一步探索这种可能性，我们以与构建体注射相同的方式向高粱植物注射牛基因组dna，并测试这些dna在随后的几天内是否可观察到，未发现在注射部位或上方的叶组织处在注射后24小时内存在牛dna的证据(数据未示出)。
[0460]
此处提供的结果提供了编码梭杆菌白细胞毒素免疫原性亚基的高粱叶绿体靶向dna构建体成功引入植物组织的证据，其中它们避开了dna酶消化至少两天(在一种情况下，超过三个月)，并且一株此类植物在接种两天后从接种构建体产生了转录物。此外，植物在注射后三个月内保留了可检测到的梭杆菌构建体dna的拷贝，这一观察结果表明，所述构建体成功整合并保留在高粱叶绿体基因组中。
[0461]
实例6：施用
[0462]
一旦用构建体1-4转化的高粱和粟植物合成了足够量的抗原(pl1、pl4或pl1 pl4)，便将转化植物将稀释成具有非转化高粱和/或粟的免疫原性组合物至各种抗原浓度，并针对每种浓度向至少5头牛饲喂。将监测牛的行为和症状差异，寻找任何明显的不良反应。免疫原性组合物引发对pl1和pl4免疫原性片段的免疫反应的能力将通过为定量pl1/pl4抗体而采集的定期血清样本来确定。测量血清中的pl1和pl4抗体的方法包括：
[0463]
1.在pl1和pl4抗原(在碳酸盐缓冲液中的稀释液)中包被elisa板：
[0464]
2.在pbst中洗涤板；
[0465]
3.用2％脱脂奶粉的碳酸盐缓冲液溶液封闭板60分钟；
[0466]
4.将牛血清(1:50碳酸盐缓冲液溶液)施加到孔中；
[0467]
5.将孔在37℃下孵育60分钟；
[0468]
6.在pbst中洗涤板；
[0469]
7.加入1:5000第二抗体与辣根过氧化物酶的缀合物(zymed，圣弗朗西斯科，加利福尼亚，美国)；
[0470]
8.在pbst中洗涤板；
[0471]
9.加入0.3mg/l2-20连氮-双-3乙基苯并噻唑啉-6-硫酸(abts；sigma，密苏里，美国)和0.1m柠檬酸，ph 4.35；
[0472]
10.使用multiskan ascent(thermo scientific，马萨诸塞，美国)酶标仪，记录405nm处的光密度；和
[0473]
11.所表达的pl1和pl4将通过将100mg总蛋白中的od405与标准曲线的od405进行比较来量化。
[0474]
来自未接种疫苗的牛的血清将用作elisa中的阴性对照。以不同剂量饲喂免疫原性组合物的牛的随时间的免疫原性反应将针对标准曲线进行校准。为了确定牛血清结果，我们将使用以下公式将od值转换为elisa单位：
[0475]
(平均净样本od-平均净阴性对照od)
÷
(平均净阳性对照od-平均净阴性对照od)
×
100
[0476]
最后，将比较来自这些动物的胴体信息(与对照动物进行比较和在各个治疗组之间进行比较)，特别是检查梭杆菌相关脓肿的潜在减少，并确定免疫原性组合物的最佳剂量以及使用一个或多个ltka片段的效果。
[0477]
实例7:牛肝脓肿治疗方法的开发
[0478]
先前的实例已经展示了将含有白细胞毒素的免疫优势区(pl1和/或pl4)的细菌dna构建体插入高粱和粟植物的叶绿体中并表达免疫优势区。下面的实例利用这些表达细菌抗原的转化高粱和粟植物来进行牲畜的饲料疫苗接种。下面的实例展示了开发/使用肝脓肿挑战模型的方法；将叶绿体转化植物施用于牛的方法；测量不良事件并使用测定法来测量植物基抗原(即白细胞毒素的pl1和/或pl4)引起的牛血清转化(抗体效价)，将叶绿体转化的植物施用于牛的特定给药方案，和确定饲喂叶绿体转化的植物在预防牛肝脓肿发展方面的功效。
[0479]
肝脓肿挑战模型
[0480]
为了提供所提供疗法的有效性的可靠度量，通过超声引导的经皮导管将坏死梭杆菌注射到肝门静脉或尾静脉中来产生肝脓肿诱导模型，以便接近坏死梭杆菌暴露后的牛的肝脓肿的自然发展(lechtenberg等人，1989和1991)。本领域的技术人员将了解，其它施用形式也可以实现相同的目标(例如，将抗原分布到循环中)。
[0481]
挑战模型将能够重复诱导年幼犊牛肝脓肿的中等患病率和严重程度。进行此挑战的能力将允许在受控环境中对肝脓肿预防(疫苗)或治疗进行后续测试，同时需要相对少量的测试产品。
[0482]
坏死梭杆菌培养。将使从肉牛肝脓肿中分离出的一种剧毒的、产生高白细胞毒素的坏死梭杆菌坏死亚种菌株在37℃厌氧条件下在versatrek redox 2(trek diagnostic systems，俄亥俄)上生长，并且我们预计在生长12小时后，细胞将以大约1.0x10
12
cfu/ml(nasem 2016)收获。将使用梭杆菌选择性琼脂(anaerobe systems，加利福尼亚)在37℃厌氧条件下进行连续稀释铺板和cfu计数，持续24到48小时。
[0483]
在本实例中，将存在两个实验阶段：
[0484]
阶段治疗i。将二十头公犊牛随机分配到四个实验治疗组(每个实验治疗组n＝5头犊牛)。
[0485]
●
conpv：对照犊牛将接种无菌盐水
[0486]
●
fusopv8：犊牛将接种10ml无菌盐水，其中接种2x107cfu/ml坏死梭杆菌。总接种量为2x108cfu坏死梭杆菌。
[0487]
·
fusopv9：犊牛将接种10ml无菌盐水，其中接种2x108cfu/ml坏死梭杆菌。总接种量为2x109cfu坏死梭杆菌。
[0488]
●
fusopv10：犊牛将接种10ml无菌盐水，其中接种2x109cfu/ml坏死梭杆菌。总接种量为2x10
10
cfu坏死梭杆菌。
[0489]
对于每个治疗组，将使用超声引导的经皮导管插入技术进行门静脉内接种。
[0490]
阶段治疗ii。将二十头公犊牛随机分配到四个实验治疗组(每个实验治疗组n＝5头犊牛)。
[0491]
·
coniv：对照犊牛将接种无菌盐水
[0492]
●
fusoiv9：犊牛将接种10ml无菌盐水，其中接种2x108cfu/ml坏死梭杆菌。总接种
量为2x109cfu坏死梭杆菌。
[0493]
·
fusoiv10：犊牛将接种10ml无菌盐水，其中接种2x109cfu/ml坏死梭杆菌。总接种量为2x10
10
cfu坏死梭杆菌。
[0494]
●
fusoiv11：犊牛将接种10ml无菌盐水，其中接种2x10
10
cfu/ml坏死梭杆菌。总接种量为2x10
11
cfu坏死梭杆菌。
[0495]
所评价的剂量基于先前建立的鼠模型，并针对小鼠和犊牛的体重差异进行了调整(参见nagaoka,k.等人，2013)。剂量将通过颈静脉注入施用。
[0496]
数据采集。在这两个阶段中，将在接种前和接种后1、2、5和7天进行肝脏超声检查，以评价肝脓肿的进展。在同一时间点，将采集血液并分析血液白细胞计数和血浆急性期蛋白触珠蛋白和血清淀粉样蛋白a的浓度。这些结果将证明肝脓肿的发展并测量与坏死梭杆菌挑战相关联的炎性反应。在整个研究过程中，将监测犊牛的不良事件并记录直肠温度。
[0497]
在研究结束时，将对犊牛实施安乐死并进行尸检，以确认肝脓肿和其它病理的存在和严重程度。
[0498]
给药方案
[0499]
为了校准提所供的示例性疗法，进行剂量发现研究。所述研究将包括确定产生抗体反应的免疫原性植物的有效饲喂水平。将测试各种给药方案，包括向牛连续和“脉冲饲喂”施用免疫原性植物，并且将观察牛的抗体反应以及监测任何不良事件。
[0500]
方法：
[0501]
动物。本实验将利用反刍犊牛(bw》300lb.)。在研究的持续时间期间，犊牛将被圈养在单独的牛圈中，其可随意触及水并被饲喂混合日粮，所述混合日粮被调配成符合或超过营养需求(nasam 2016)。
[0502]
治疗。在为期28天的实验期间，免疫原性植物将基于抗原浓度占免疫原性植物中总可溶性蛋白的百分比作为总饲料日粮的一部分包含在日粮中。将使用含有表达活性蛋白的转基因花生以提供0.5％总可溶性蛋白的日粮。如果可能，剂量范围的目标是提供0.5％、1％和2％总可溶性蛋白。
[0503]
预期将使用七个治疗组(每个治疗组n＝5头反刍犊牛)(包括3个剂量
×
2种给药时间线 1个对照)。
[0504]
·
阴性对照：不饲喂免疫原性植物。
[0505]
●
locon：低剂量(0.5％)免疫原性植物，连续饲喂28天。
[0506]
·
medcon：中等剂量(1％)免疫原性植物，连续饲喂28天。
[0507]
●
hicon：高剂量(2％)免疫原性植物，连续饲喂28天。
[0508]
·
lopul：低剂量(0.5％)免疫原性植物，在第0天、第7天和第14天以3个单天脉冲饲喂。
[0509]
●
lopul：中等剂量(1％)免疫原性植物，在第0天、第7天和第14天以3个单天脉冲饲喂。
[0510]
·
hipul：高剂量(2％)免疫原性植物，在第0天、第7天和第14天以3个单天脉冲饲喂。
[0511]
实验饮食和饲喂。免疫原性植物将作为干草收获，进行干燥(风干85-90％干物质)，并通过2-3"筛网磨碎。干草将使用适合批量大小的混合设备进行混合，作为生长日粮
的一部分(预期总粗饲料浓度为35-45％)。在整个实验过程中，每天向牛随意饲喂实验日粮。
[0512]
测量和数据采集。在整个实验过程中，将每天评价犊牛的不良事件和疾病迹象。在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天，将采集血液以进行急性期蛋白和细胞因子确定(触珠蛋白、纤维蛋白原、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α)。
[0513]
将使用抗体效价测定来检测与免疫原性植物中利用的抗原相关联的抗体的存在。抗体效价测定将包括对免疫原性植物中包含的坏死梭杆菌的截短区域具有特异性的抗体，以及对白细胞毒素a的抗体效价进行整体量化的测定。将使用获自细菌模型的pl1和pl4抗原来获得和抗原特异性抗体。
[0514]
将使用急性期蛋白数据来确定与饲喂免疫原性植物相关联的炎性反应，并且抗体效价将测量记忆免疫反应。将使用第28天的抗体浓度来选择后续实验的剂量。
[0515]
尸检。在实验期间死亡的任何动物都将进行尸检。在实验结束时，将对牛实施安乐死并提交进行全面尸检。将观察肝脏是否存在肝脓肿及其严重程度，并记录其它发病机制。可以提交特定组织进行组织病理学检查。
[0516]
延长免疫
[0517]
将评价各个给药区域(例如，连续和脉冲饲喂方案)的引发延长免疫保护的能力和延长施用期间的安全性。为此，牛将根据以上评价的给药方案饲喂至多16周的时间。在整个饲喂期间，将测量抗体反应，并将监测牛的不良事件。
[0518]
方法：
[0519]
动物。本实验将利用反刍犊牛(bw＝700lb.)。在研究的持续时间期间，犊牛将被圈养在单独的牛圈中，其可随意触及水并被饲喂混合日粮，所述混合日粮被调配成符合或超过营养需求。
[0520]
治疗。将在16周内饲喂五个治疗组(每个治疗组n＝10头反刍犊牛)。将每周测量抗体效价和急性期蛋白反应。
[0521]
治疗组：
[0522]
1.con：阴性对照，未饲喂免疫原性植物
[0523]
2.short：免疫原性植物的短期连续饲喂，持续7天
[0524]
3.long：免疫原性植物的连续饲喂，持续连续16周
[0525]
4.short pulse：在第0天、第7天和第14天的免疫原性植物的短期脉冲给药。
[0526]
5.weekly：每周一次饲喂免疫原性植物，持续连续16周
[0527]
实验饮食和饲喂。免疫原性植物将作为干草收获，进行干燥(风干85-90％干物质)，并通过2-3"筛网磨碎。干草将使用适合批量大小的混合设备进行混合，作为生长日粮的一部分(预期总粗饲料浓度为35-45％)。在整个实验过程中，每天向牛随意饲喂实验日粮。
[0528]
测量和数据采集。在整个实验过程中，将每天评价犊牛的不良事件和疾病迹象。在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天、第56天、第84天和第112天，将采集血液以进行急性期蛋白和细胞因子确定(触珠蛋白、纤维蛋白原、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α)抗体效价的测量(以上的实验2)。将使用急性期蛋白数据来确定与饲喂免疫原性植物相关联的炎性反应，并且抗体效价将测量记忆免疫反应。
[0529]
尸检。在实验期间死亡的任何动物都将进行尸检。
[0530]
收获。在实验结束时，将在商业屠宰场收获牛，在那里将根据肝脓肿的存在和严重程度对肝脏进行评分。
[0531]
确定保护的肝脓肿挑战模型
[0532]
为了评价免疫原性植物降低牛脓肿的严重程度的能力，将使用肝脓肿挑战模型来在牛中发展肝脓肿，随后将向所述牛饲喂以上实例中包括的如本文所述的免疫原性植物。将检查健康的牛以确定免疫原性植物的饲喂是否提供了对脓肿发展的保护。在整个治疗过程中(即在免疫原性植物的施用期间)，两种情况下的牛都将进行监测。
[0533]
方法：
[0534]
本研究将使用所测试的各个给药方案。将使用反刍犊牛(每个治疗组至少5头)，并将包括阴性对照治疗组(不饲喂免疫原性植物的犊牛)。在饲喂实验饲料至少28天后，将使用所述的坏死梭杆菌模型对犊牛进行挑战。
[0535]
在实验期间，将使用肝脏超声检查来评价肝脓肿的进展，并且在接种前和接种后1、2、5和7天进行进行。在同一时间点，将采集血液并分析血液白细胞计数和血浆急性期蛋白触珠蛋白和血清淀粉样蛋白a的浓度。血液白细胞计数和血浆急性期蛋白触珠蛋白和血清淀粉样蛋白a的浓度的血清分析将测量与坏死梭杆菌挑战相关联的炎性反应。在整个研究过程中，将监测犊牛的不良事件并记录直肠温度。
[0536]
在研究结束时，将对犊牛实施安乐死并进行尸检，以确认肝脓肿和其它病理的存在和严重程度。
[0537]
生产环境中的免疫保护和性能
[0538]
生产环境涉及特定条件(即牛圈大小、动物数量、动物年龄等)。为了在生产环境中测试免疫原性植物的安全性和功效，将对这些环境进行建模，并向肥育阉牛饲喂免疫原性植物。将监测肥育阉牛的不良事件。此外，还将测量饲喂免疫原性植物的牛的肥育性能和胴体特征。通过这种监测，将确定免疫原性叶绿体转化植物对肝脓肿患病率和严重程度的影响。
[0539]
方法：
[0540]
动物。本研究将使用肉牛、阉牛或小母牛。数量将基于所选择的治疗设计来确定。每个治疗组将具有至少10个牛圈重复(每个牛圈n＝70头)。牛将被圈养在焊接钢管结构的开放式、泥地牛圈(60英尺宽x172英尺深)中。每个牛圈将具有一个连续的混凝土饲喂槽，并与相邻的牛栏共用一个浮子控制的水槽。
[0541]
治疗。治疗组将包括阴性对照，其中向牛饲喂非免疫原性叶绿体转化植物或泰乐菌素；和2到3个含有免疫原性植物的治疗组。将利用基于初始实验的给药方案。实验饮食将被调配成满足或超过营养需求。治疗组之间的调配物将是相同的，除了包含免疫原性植物用于必要的治疗日粮。对照饮食将被调配成含有等浓度的非转化植物。
[0542]
将使用广义随机区组设计或随机完全区组设计，其中牛圈用作实验单元(每个牛圈n＝60到70头，每个治疗组至少10个牛圈重复)。预先准备好的经由microsoft excel随机数生成器创建的滑槽顺序随机计划表将为每个研究候选者分配牛圈并为每个牛圈分配饮食治疗。在对治疗组进行随机时被确定为平均有效体重(pay weight)
±
两个标准偏差(根据设施记录确定的标准偏差)的牛以及其它不适合研究(生病或受伤)的任何动物将被排除
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序列表
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等同物和范围
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本领域的技术人员仅仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同物。本发明的范围不旨在限于上述说明书，而是如随附权利要求书中所述。