一种N2化合物在制备抗真菌的药物中的应用

一种n2化合物在制备抗真菌的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于真菌技术领域，具体地说，涉及一种n2化合物在制备抗真菌的药物中的应用。


背景技术：

2.随着免疫抑制剂的广泛使用以及重症感染病人的增加，全球的真菌感染率逐年增多。另外，手术病人增多和住院天数的增加也导致院内真菌感染的防控面临严峻挑战。临床上，从真菌感染病人血、痰、尿等送检样本中分离的菌株中大部分是念珠菌，而其中白念珠菌的占比又超过40％。因此临床上防治白念珠菌感染，尤其是白念珠菌侵袭性感染至关重要。目前，临床可用的有效抗真菌药物与其他抗细菌或者抗病毒类药物相比，数量十分有限，而且抗真菌药物的长周期使用也容易导致真菌耐药的产生。真菌作为真核生物，与哺乳动物细胞多有相似，因此抗真菌药物易对人体产生毒副作用，这也使抗真菌药物的研究进展缓慢，临床迫切需要研发新的有效的抗耐药真菌的药物。对已知或潜在的具有抗真菌效果的化合物进行进一步筛选，进一步缩小高效抗真菌化合物的范围，可以为之后的研究者提供思路。并通过论证体外具有抗真菌效果的化合物是否适合体内应用，得到其临床应用的可行性。n2-n9是已知化合物，但它们在抗真菌活性领域未见相关文献报道。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种n2化合物在制备抗真菌的药物中的应用。
4.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
5.本发明的第一方面提供了一种n2化合物在制备抗真菌的药物中的应用。
6.所述n2化合物的结构如下：
[0007][0008]
所述真菌选自白念珠菌、氟康唑耐药白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、新生隐球菌。
[0009]
所述真菌选自白念珠菌sc5314、氟康唑耐药白念珠菌(901、904、876、311、538、103、911、849、100、32、1010)、光滑念珠菌537、热带念珠菌293、近平滑念珠菌22019、克柔念珠菌463、新生隐球菌h99、30609。
[0010]
所述抗真菌的药物是指n2化合物作为单一活性成分。
[0011]
所述药物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、微囊微球制剂。
[0012]
所述药物的给药方式为口服、注射。
[0013]
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
[0014]
本发明提供的n2化合物在制备抗真菌的药物中的应用，将n2化合物作为抗真菌的
药物中的活性成分，不仅对标准菌株白念珠菌sc5314敏感，对临床分离的氟康唑耐药白念珠菌(901、904、876、311、538、103、911、849、100、32、1010)、新生隐球菌h99、新生隐球菌30609、光滑念珠菌537、热带念珠菌293、近平滑念珠菌22019、克柔念珠菌463敏感，尤其是对白念珠菌sc5314、氟康唑耐药白念珠菌(901、904、311、103、911、32)、光滑念珠菌537、热带念珠菌293、近平滑念珠菌22019最低抑菌浓度可降到0.5μg/ml，因此，可以作为抗真菌的药物进行开发。
[0015]
本发明不仅明确了n2化合物的体外抗真菌活性，而且为抗真菌耐药性临床治疗提供了新的手段。
[0016]
在抗真菌药物有限的情况下，本发明能发现抑菌浓度低，能有效杀死真菌的新结构，有效解决耐药性问题，为抗真菌耐药性药物的进展提供新思路。
附图说明
[0017]
图1是n2化合物在ypd培养基中对于白念珠菌sc5314生长增殖影响并绘制生长曲线的示意图。
[0018]
图2是n2化合物在rpmi1640培养基中对于白念珠菌sc5314的生长增殖影响并绘制时间-杀菌曲线的示意图。
[0019]
图3是n2化合物在rpmi1640培养基、spider培养基中37℃培养3h诱导白念珠菌菌丝形成的示意图。
[0020]
图4是n2化合物在rpmi1640培养基中对于白念珠菌sc5314生物被膜影响的示意图。
具体实施方式
[0021]
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0022]
实施例1
[0023]
9个化合物的来源：购买获得，美国chemdiv inc公司，规格5mg，纯度90％以上。
[0024]
对9种n系列化合物用微量稀释法测试体外抗真菌活性及抗菌谱：
[0025]
活化后的菌株(表1中两个氟康唑耐药白念珠菌103和538)接种至1mlypd液体培养基中，在恒温培养箱中30℃振荡培养16h，用血细胞计数板计数，以rpmi1640液体培养基稀释菌液至1
×
103cells/ml，用无菌96孔板对药物浓度进行倍比稀释，制成药敏板，在恒温箱中30℃静置培养24h后用酶标仪在630nm处测量各孔od630值，最终od值下降80％以上的孔对应的药物浓度为mic。
[0026]
n系列化合物的结构如表1所示，按照上述方法测试了九种化合物对氟康唑耐药白念珠菌103和538的mic
80
值，具体数据如表1所示：
[0027]
表1：n系列化合物对氟康唑耐药白念珠菌103和538的mic
80
值的测定
[0028]
[0029]
[0030][0031]
从表1中可以看出，n2化合物可以有效抑制氟康唑耐药白念珠菌103和538，而且抑制效果最好。因此，以n2化合物作为抗真菌化合物，用微量稀释法检测n2化合物对多种临床常见致病念珠菌的最低抑菌浓度，数据如表2所示。
[0032]
首先考察了白念珠菌对n2化合物的敏感性，见表2。考察国际标准菌c.albicans sc5314和临床耐氟康唑白念菌株(白念珠菌901、白念珠菌904、白念珠菌876、白念珠菌311、白念珠菌538、白念珠菌103、白念珠菌911、白念珠菌849、白念珠菌100、白念珠菌32、白念珠菌1010)、新生隐球菌h99、新生隐球菌30609、光滑念珠菌537、热带念珠菌293、近平滑念珠菌22019、克柔念珠菌463对n2化合物的敏感性。从表2中数据可以看出，低浓度的n2化合物对临床分离的大部分氟康唑耐药白念珠菌(c.albicans)、光滑念珠菌(c.glabrata)、热带念珠菌(c.tropicalist)、近平滑念珠菌(c.parapsilosis)、新生隐球菌(c.cryptococcus)和克柔念珠菌(c.krusei)也有明显的抑制作用。以上结果表明在常见的临床致病念珠菌中，n2化合物能抑制绝大多数念珠菌的生长。
[0033]
表2微量稀释法检测n2对多种临床常见致病念珠菌的最低抑菌浓度
[0034]
株名称n2mic
80
(μg/ml)c.albicans sc53140.5c.albicans 9010.5c.albicans 9040.5c.albicans 8761c.albicans 3110.5c.albicans 5381
c.albicans 1030.5c.albicans 9110.5c.albicans 8491c.albicans 1001c.albicans 320.5c.albicans 10101cryptococcus h991cryptococcus 306092c.glabrata 5370.5c.tropicalist 2930.5c.parapsilosis 220190.5c.krusei 4632
[0035]
时间-生长曲线与时间-杀菌曲线测定：
[0036]
生长曲线测定：活化菌株sc5314，以ypd培养基稀释菌液至106cells/ml(od630＝0.01)，各管加入不同浓度n2化合物，分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h，测试各管菌液的od630值。
[0037]
n2化合物抑制白念珠菌的时间-生长曲线如图1所示，图1是n2化合物在ypd培养基中对于白念珠菌sc5314生长增殖影响并绘制生长曲线的示意图。从图1中可以看出，n2化合物浓度为4μg/ml时对白念珠菌的生长增殖有明显的抑制作用(p《0.05)。
[0038]
杀菌曲线测定：活化菌株sc5314，以rpmi1640培养基稀释菌液至2～3
×
103cells/ml，各管加入不同浓度n2化合物，放入恒温培养箱30℃、200rpm振荡培养24h，分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h，取100μl菌液，以灭菌pbs10倍梯度稀释，各取100μl涂于sda固体培养基表面，于30℃培养箱静置培养36～48h，计数培养基内克隆数，以log
10
cfu/ml对时间作曲线。
[0039]
为了明确n2化合物是否能杀灭培养基中的白念珠菌，本实验取了n2化合物处理不同时间的白念珠菌涂板，n2化合物抑制白念珠菌的时间-杀菌曲线如图2所示，图2是n2化合物在rpmi1640培养基中对于白念珠菌sc5314的生长增殖影响并绘制时间-杀菌曲线的示意图。从图2中可以看出，n2化合物浓度为8μg/ml时，可以显著降低培养基中白念珠菌的数量，显示出杀菌活性(p《0.05)，n2化合物浓度低于2μg/ml时不能杀灭培养基中的白念珠菌。
[0040]
白念珠菌菌丝形成诱导实验：
[0041]
活化菌株sc5314，收集菌液至1.5ml离心管，离心后去除培养基，以灭菌pbs洗三次，以spider培养基、rpmi1640培养基分别稀释至5
×
105cells/ml，在24孔板中加入稀释好的菌液，加入药物并倍比稀释使得形成浓度梯度，将处理好的孔板放入恒温培养箱37℃静置培养3h，在显微镜下观察并拍照。
[0042]
酵母态向菌丝态的转换是白念珠菌在体内发生侵袭的重要过程。为了考察n2化合物对白念珠菌菌丝形成的抑制作用，本实验采用不同浓度(0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml)的n2化合物处理白念珠菌。如图3所示，图3是n2化合物在rpmi1640培养基、spider培养基中37℃培养3h诱导白念珠菌菌丝形成的示意图。从图3中可以看出，n2化合物在rpmi1640和spider这两种培养基中，n2化合物对白念珠菌菌丝的形成都有一定的抑制作用。在spider培养基中，当药物浓度高于0.25μg/ml时，白念珠菌基本维持在酵母态，菌丝形成被
完全抑制。在rpmi 1640培养基中，当药物浓度高于1μg/ml时，白念珠菌基本维持在酵母态，菌丝形成被完全抑制。
[0043]
白念珠菌生物被膜生成抑制实验：
[0044]
活化菌株sc5314，用无菌pbs洗菌三次离心去上清，然后以rpmi1640培养基稀释菌液至1
×
106cfu/ml，用tc处理的96孔板制备反应板，于培养箱37℃静置培养半小时，使得细胞沉降粘附在孔板底面，而后吸弃上清中rpmi1640培养基并用pbs缓冲液洗涤3次。取一块新的无菌96孔板，在rpmi1640培养基中以倍比稀释的方法获取不同药物浓度，第12列只加含稀释后的菌液相同体积的dmso做阳性对照。将配置好的含有不同药物浓度的rpmi1640培养基加入到反应板中，于37℃静置培养24h，后吸弃上清并用pbs洗涤3次，而后每孔加入200μl xtt/menadione溶液，37℃避光孵育3h后，吸取100μl上层橙色液体至普通的96孔板中，用多功能酶标仪检测490nm处的od值。
[0045]
生物被膜白念珠菌菌丝态和酵母态的混合体，被膜形成是白念珠菌抵御外界刺激和药物杀伤的重要途径。为了进一步考察n2化合物的抗真菌活性，采用xtt法测定了n2化合物对白念珠菌被膜形成的抑制作用。如图4所示，图4是n2化合物在rpmi1640培养基中对于白念珠菌sc5314生物被膜影响的示意图。从图4中可以看出，n2化合物在rpmi1640培养基中，n2化合物浓度高于8μg/ml时对于白念珠菌被膜生成具有显著抑制作用(p＜0.05)。
[0046]
对比例1
[0047]
以文献pharmaceutical chemistry journal(2016),50(8),526-529.作为对比例。
[0048]
本发明所使用的n2化合物与文献中化合物iii对比发现，结构并不相同。
[0049]
抗菌活性方面，文献中仅报道化合物iii对念珠菌有效，最低抑菌浓度为0.9
±
0.2μg/ml，最低杀菌浓度为1.9
±
0.1μg/ml，且未说明测试的菌株编号。而本发明所使用的n2化合物对于测试的多种念珠菌及新型隐球菌均有显著抑制效果，对于临床耐药菌901、904其最低抑菌浓度可达到0.5μg/ml，抗菌活性优于文献报道的化合物iii。
[0050]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。