用于癌症患者分级和癌症治疗的化合物、组合物和方法与流程

用于癌症患者分级和癌症治疗的化合物、组合物和方法
1.本技术是基于申请日为2017年2月3日，申请号为201780007766.4， 发明名称为：“用于癌症患者分级和癌症治疗的化合物、组合物和方法”的 专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2015年2月5日提交的美国临时申请no.62/291,935的优先 权和利益，将其公开以其整体在此引入作为参考。
[0004][0005]


背景技术：

[0006]
癌症每年导致美国超过550,000人死亡，全球超过800万人死亡。新的 药物，包括小分子、影响组织特异性生长要求的分子以及免疫调节剂，已被 证明有益于癌症具有独特基因组突变或其他特征的患者亚组。不幸的是，许 多癌症患者仍然没有有效的治疗选择。
[0007]
鉴定新的抗癌剂的一种方法是进行表型筛选，以发现在癌细胞系之间显 示出强选择性的新型小分子，然后通过预测化学基因组学来鉴定与药物反应 相关的细胞特征。在20世纪90年代，weinstein及其同事证明，化合物的细 胞毒性特征可用于鉴定与药物敏感性相关的细胞特征，如基因表达谱和dna 拷贝数。近年来，通过对大批量细胞系的自动化高通量化学敏感性测试以及 细胞系的全面基因组和表型表征，鉴定介导其对小分子的响应的癌细胞系的 特征的能力大大增加。小分子敏感性的表型观察可以与表达模式或体细胞改 变相关联，如在曲妥单抗敏感的her2扩增的乳腺癌或埃罗替尼敏感的 egfr突变肺癌的情况中。
[0008]
savai等(expert opinion on investigational drugs，vol.19，issue 1,2010，p.117-131)指出，用磷酸二酯酶抑制剂靶向癌症可能是治疗癌症的有前途有 前途的方法。然而，几种磷酸二酯酶抑制剂已被批准用于临床治疗，包括用 于心血管适应症和抑制血小板凝血的pde3抑制剂米力农、西洛他唑和左西 孟旦，以及用于血小板增多症的pde3抑制剂阿那格雷，但无癌症适应症。 pde抑制剂最近的质量评价(nature reviews drug discovery 13,290-314， (2014))几乎没有提到癌症。从wo2014/164704中已知一些用于治疗癌症 的新型pde3抑制剂。
[0009]
在分子水平上表征恶性肿瘤的方法可用于对患者进行分级，从而快速指 导他们进行有效的治疗。迫切需要用于预测患有癌症的受试者的响应性的改 进方法。


技术实现要素：

[0010]
如以下所述，本发明涉及鉴定患有癌症(例如本文所述的癌症类型)的患 者的方法，所述癌症对磷酸二酯酶3a(pde3a)调节剂(例如，化合物1-6) 的治疗敏感，其通过在衍生自该患者的癌细胞中检测pde3a和schlafen 12 (slfn12)多核苷酸或多肽的共表达和/或creb3l1多核苷酸或多肽表达减 少的缺失。
[0011]
在一方面，本发明提供杀死所选择的对磷酸二酯酶3a(pde3a)调节剂 有响应的癌
细胞或减少其存活的方法，其包括将细胞与具有以下结构的一种 或多种pde3a调节剂接触从而减少癌细胞的存活，所述调节剂为：化合物 1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和化合物6:
[0012][0013]
其中所选择的细胞相对于参照具有增加水平的pde3a或schlafen 12 (slfn12)多肽或多核苷酸或其组合。
[0014]
在另一方面，本发明提供在受试者中减少癌细胞增殖的方法，所述受试 者为预先经选择的患有对一种或多种具有以下结构的pde3a调节剂有响应 的癌症:
[0015][0016]
包括向受试者给药所述pde3a调节剂从而减少所述受试者中的癌细胞 增殖，其中所述受试者预先通过检测相对于参照，pde3a或schlafen 12 (slfn12)多肽或多核苷酸水平的增加或其组合而选择。
[0017]
在另一方面，本发明提供鉴定患有对pde3a调节有抗性的癌症的受试 者的方法，该方法包括在受试者的生物样品中检测creb3l1或slfn12多 肽或多核苷酸水平相对于参照的降低，从而鉴定所述受试者为患有对pde3a 调节有抗性的癌症。
[0018]
在另一方面，本发明提供鉴定患有对pde3a调节有抗性的癌症的受试 者的方法，该方法包括检测在受试者的生物样品中creb3l1多肽或多核苷 酸水平相对于参照的减少，从而鉴定所述受试者为患有对pde3a调节有抗 性的癌症。
[0019]
在另一方面，本发明提供用于鉴定患有对pde3a调节有抗性的癌症的 受试者的试
剂盒，其包含结合creb3l1多肽或多核苷酸的捕获试剂。在具 体实施方案中，所述试剂盒包含结合slfn12多肽或多核苷酸的捕获试剂。
[0020]
在一方面，本发明提供具有以下结构的化合物:
[0021][0022]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0023]
在另一方面，本发明提供包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂 和具有以下结构的化合物的药物组合物：
[0024][0025]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0026]
在另一方面，本发明提供治疗高增生性疾病，特别是癌症的方法，包括 向需要的受试者给药具有以下结构的化合物
[0027][0028]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0029]
在另一方面，本发明提供治疗高增生性疾病，特别是癌症的方法，包括 向需要的受试者给药具有以下结构的化合物
[0030][0031]
或其药学上可接受的盐、或前药，其中所述癌症对pde3a调节剂有响 应。
[0032]
在另一方面，本发明提供治疗高增生性疾病，特别是癌症的方法，包括 向需要的受试者给药具有以下结构的化合物
[0033][0034]
或其药学上可接受的盐、或前药，其中所述受试者已被诊断为患有对 pde3a调节剂有响应的癌症。在另一方面，本发明提供治疗高增生性疾病， 特别是癌症的方法，包括向需要的受试者给药具有以下结构的化合物
[0035][0036]
或其药学上可接受的盐、或前药，其中所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫 颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头与颈癌、造血细胞 癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、 前列腺癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌。
[0037]
在另一方面，本发明提供在预先经选择对pde3a调节剂有响应的受试 者中减少癌细胞增殖的试剂盒，其包含具有以下结构的化合物:
[0038][0039]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0040]
在另一方面，本发明提供pde3a调节剂在制备用于治疗癌症的药物中 的用途，其中所述pde3a调节剂为具有以下结构的化合物:
[0041][0042]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0043]
在另一方面，本发明提供用于治疗癌症的pde3a调节剂，其中所述 pde3a调节剂为具有以下结构的化合物:
[0044][0045]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0046]
在其它实施方案中，本发明提供用于治疗癌症的pde3a调节剂，其中 所述pde3a调节剂为具有以下结构的化合物:
[0047][0048]
或其药学上可接受的盐、或前药，其中所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫 颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头与颈癌、造血细胞 癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、 前列腺癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌。
[0049]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，所述pde3a调节剂减少 pde3a的活性。
[0050]
在不同实施方案中，所述pde3a调节剂具有以下结构:
[0051][0052]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，该方法包括检测相对于参 照，creb3l1多肽或多核苷酸的表达水平的减少的缺失。
[0053]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，该方法包括检测slfn12水 平的减少。
[0054]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，所述生物样品为包含癌细胞 的组织样品。
[0055]
在不同实施方案中，所述pde3a、slfn12或creb3l1多肽的水平通 过选自以下的方法检测：免疫印迹、质谱分析和免疫沉淀。
[0056]
在不同实施方案中，所述pde3a、slfn12或creb3l1多核苷酸的水 平通过选自以下的方法检测：定量pcr、rna测序、northern印记、微阵 列、质谱分析和原位杂交。
[0057]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，所选择的对磷酸二酯酶3a (pde3a)调节剂有响应的表达creb3l1或相对于参照没有creb3l1表达的 损失。
[0058]
在各种实施方案中，所选择的对磷酸二酯酶3a(pde3a)调节剂有响应 的癌细胞为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤 (gist)、头与颈癌、造血细胞
癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、 黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌。
[0059]
因此，在本文所述的任何方面的各种实施方案中，以上公开的方法进一 步包括相对于参照，creb3l1多肽或多核苷酸的水平减少的缺失。
[0060]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，对磷酸二酯酶3a(pde3a) 调节剂有抗性的癌细胞相对于参照具有减少的creb3l1或slfn12表达或 creb3l1或slfn12表达的损失。
[0061]
在不同实施方案中，所选择的对磷酸二酯酶3a(pde3a)调节剂有响应 的癌细胞为黑素瘤、子宫内膜癌、肺癌、造血细胞/淋巴癌、卵巢癌、子宫颈 癌、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、胶质 母细胞瘤或乳腺癌细胞。在某些实施方案中，所述癌细胞不为b-细胞增殖型 癌症。
[0062]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，所述选择的对磷酸二酯酶3a (pde3a)调节剂有响应的癌细胞具有增加的pde3a或schlafen 12(slfn12) 的表达。
[0063]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，对磷酸二酯酶3a(pde3a) 调节剂有抗性的癌细胞相对于参照具有减少的creb3l1或slfn12表达或 creb3l1或slfn12表达缺失。
[0064]
在本文中“参照”是指在肿瘤细胞或肿瘤细胞系的代表性组中的平均表 达。
[0065]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，所述癌症对pde3a调节剂 有响应。
[0066]
在不同实施方案中，所述受试者已被诊断为患有对pde3a调节剂有响 应的癌症。
[0067]
在不同实施方案中，所述癌症为黑素瘤、子宫内膜癌、肺癌、造血细胞 /淋巴癌、卵巢癌、子宫颈癌、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、胰腺癌、 甲状腺癌、肾癌、胶质母细胞瘤或乳腺癌。
[0068]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，所述pde3a调节剂口服给 药。
[0069]
在本文所述的任何方面的各种实施方案中，所述pde3a调节剂静脉注 射给药。
[0070]
本发明提供治疗患有鉴定为对选自化合物1-6的pde3a调节剂的治疗 有响应的癌症的受试者的方法，其通过检测癌症中pde3a和/或schlafen 12 (slfn12)多核苷酸或多肽的共表达和/或creb3l1多核苷酸或多肽表达减 少的缺失。
[0071]
因此，本发明进一步提供检测creb3l1多核苷酸或多肽的表达用于患 者分级的方法，其使用creb3l1多核苷酸或多肽的表达作为生物标记。
[0072]
本发明进一步提供检测pde3a和/或schlafen 12(slfn12)多核苷酸或 多肽的表达用于患者分级的方法，其使用pde3a和/或schlafen 12(slfn12) 多核苷酸或多肽的表达作为生物标记。
[0073]
由本发明定义的组合物和制品是根据下面提供的实施例分离或制造的。 本发明的其它特征和优点将从发明详述和权利要求中显而易见。
[0074]
定义
[0075]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领 域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发 明中使用的许多术语的一般定义：singleton等人,dictionary of microbiologyand molecular biology(2nd ed.1994)；the cambridge dictionary of scienceand technology(walker ed.,1988)；the glossary of genetics,5th ed.,r.riegeret al.(eds.),springer verlag
(1991)；和hale&marham,the harper collinsdictionary of biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具 有下面赋予它们的含义。
[0076]
所谓“阿那格雷”(iupac名称6,7-二氯-1,5-二氢咪唑并(2,1-b)喹唑啉
ꢀ‑
2(3h)-酮)是指小分子磷酸二酯酶抑制剂，其具有以下结构:
[0077][0078]
所谓“西洛酰胺”(iupac名称n-环己基-n-甲基-4-[(2-氧代-1h-喹啉-6
‑ꢀ
基)氧基]丁酰胺)是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0079][0080]
所谓“西洛他唑”(iupac名称6-[4-(1-环己基-1h-四唑-5-基)丁氧 基]-3,4-二氢-2(1h)-喹啉酮)是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0081][0082]
所谓“dnmdp”(iupac名称6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5
‑ꢀ
二氢哒嗪-3(2h)-酮)是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0083][0084]
所谓“福斯高林”(iupac名称 (3r,4ar,5s,6s,6as,10s,10ar,10bs)-6,10,10b-三羟基-3,4a,7,7,10a-五甲基-1-氧 代-3-乙烯基十二氢-1h-苯并[f]色烯-5-基乙酸酯)是指小分子抑制剂，其具有 以下结构:
[0085][0086]
所谓“左西孟旦”(iupac名称(e)-2-氰基-1-甲基-3-(4-(4-甲基-6-氧代
ꢀ‑
1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基)苯基)胍)是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0087][0088]
所谓“米力农”(iupac名称2-甲基-6-氧代-1,6-二氢-3,4'-联吡啶-5-甲腈) 是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0089][0090]
所谓“罂粟碱”(iupac名称1-(3,4-二甲氧基苄基)-6,7-二甲氧基异喹啉) 是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0091][0092]
所谓“氰胍佐旦”(iupac名称(e)-2-氰基-1-甲基-3-(4-(4-甲基-6-氧代
ꢀ‑
1,4,5,6-四氢哒嗪-3-基)苯基)胍)是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0093]
[0094]
所谓“昔多芬”(iupac名称1-[4-乙氧基-3-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙 基-1h-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)苯基磺酰基]-4-甲基哌嗪)是指小分子抑制剂， 其具有以下结构:
[0095][0096]
所谓“曲喹辛”(iupac名称9,10-二甲氧基-3-甲基-2-(2,4,6-三甲基苯基) 亚氨基-6,7-二氢嘧啶并[6,1-a]异喹啉-4-酮)是指小分子抑制剂，其具有以下结 构:
[0097][0098]
所谓“伐地那非(vardenifil)”(iupac名称4-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1
‑ꢀ
基)磺酰基-苯基]-9-甲基-7-丙基-3,5,6,8-四氮杂双环[4.3.0]壬-3,7,9-三烯-2-酮) 是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0099][0100]
所谓“扎达维林(iupac名称3-[4-(二氟甲氧基)-3-甲氧基苯基]-1h-哒嗪
ꢀ‑
6-酮)”是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0101]
[0102]
所谓“化合物1”是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0103][0104]
所谓“化合物2”是指小分子抑制剂，其具有以下结构：
[0105][0106]
所谓“化合物3”是指小分子抑制剂，其具有以下结构:
[0107][0108]
所谓“化合物4”是指小分子抑制剂，其具有以下结构：
[0109][0110]
所谓“化合物5”是指小分子抑制剂，其具有以下结构：
[0111][0112]
所谓“化合物6”是指小分子抑制剂，其具有以下结构：
[0113]
[0114]
所示结构包括围绕键所有可能的旋转。
[0115]
在一些实施方案中，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物 5和化合物6的任一种为小分子磷酸二酯酶抑制剂。
[0116]
在一些其它实施方案中，所述化合物西洛酰胺、西洛他唑、dndmp、 福斯高林、左西孟旦、米力农、罂粟碱、氰胍佐旦、昔多芬、曲喹辛、伐地 那非和扎达维林的任一种为小分子磷酸二酯酶抑制剂。
[0117]
在一些实施方案中，可使用小分子磷酸二酯酶抑制剂或调节剂的组合。
[0118]
在一些实施方案中，可使用化合物1-6的任何组合。
[0119]
在一些实施方案中，可使用小分子磷酸二酯酶抑制剂或调节剂，尤其是 化合物1-6，更具体是化合物6，与抗癌剂的组合。
[0120]
本发明另一方面为制备化合物6的方法，所述方法包括以下步骤
[0121]
在10-15℃的温度范围(包括10
°
和15
°
)，将外消旋化合物3a
[0122][0123]
与乙酸中的naocl反应以得到外消旋化合物6a
[0124][0125]
随后分离化合物6a的对映异构体以得到化合物6。
[0126][0127]
本发明另一方面为制备化合物6的方法，所述方法还包括任选在之前的 步骤中分离化合物3a的对映异构体
[0128][0129]
以得到化合物3
[0130][0131]
且在10-15℃的温度范围(包括10
°
和15
°
)与乙酸中的naocl的反应步 骤使用对映异构体化合物3进行且任选进一步包括随后分离对映异构体。
[0132]
本发明另一方面为制备化合物6的方法，其中使对映异构体化合物3反 应
[0133][0134]
以得到对映异构体化合物6
[0135][0136]
化合物6。
[0137]
本发明另一方面化合物3制备化合物6的用途
[0138][0139][0140]
所谓“creb3l1多肽”是指与genbank登录号aah14097.1提供的序 列具有至少85％氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段，其在内质网应激时被 切割并具有转录因子活性。genbank登录号aah14097.1提供的氨基酸序列 如下所示。
[0141][0142]
所谓“creb3l1多核苷酸”是指编码creb3l1多肽或其片段的任何核酸 分子，包括dna和rna。示例性creb3l1核酸序列在ncbi ref： nm_052854.3提供。ncbi ref：nm_052854.3提供的序列如下再现:
[0143]
[0144][0145]
所谓“pde3a多肽”是指与在ncbi ref no.np_000912.3提供的序列具 有至少85％氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段，其催化环一磷酸腺苷 (camp)和环一磷酸鸟苷(cgmp)的水解。示例性的人全长pde3a氨基酸序 列如下提供：
[0146][0147]
已知三种pde3a同工型：pde3a1、pde3a2和pde3a3。pde3a1包 含全长pde3a氨基酸序列的氨基酸146-1141，pde3a2亚型2包含全长 pde3a氨基酸序列的氨基酸299-1141，且pde3a3包含全长pde3a氨基酸 序列的氨基酸483-1141。
[0148]
所谓“pde3a多核苷酸”是指编码pde3a多肽或其片段的任何核酸分 子，包括dna和rna。示例性pde3a核酸序列在ncbi ref：nm_000921.4 提供:
[0149]
[0150]
[0151]
[0152][0153]
所谓“schlafen 12(slfn12)多肽”是指与在ncbi ref no.np_060512.3 提供的序列具有至少85％氨基酸序列同一性的蛋白质或其片段，其当与本文 所述的化合物之一结合时与pde3a相互作用。示例性人slfn12氨基酸序 列如下提供：
[0154][0155]
所谓“schlafen 12(slfn12)多核苷酸”是指编码slfn12多肽或其片段的 任何核酸分子，包括dna和rna。示例性slfn12核酸序列在ncbi ref： nm_018042.4提供:
[0156]
[0157][0158]
在一些方面，所述化合物为异构体。"异构体"为具有相同分子式的不同 化合物。"立体异构体"为不同仅在于原子在空间排列的方式的异构体。如本 文所述，术语"异构体"包括任何和所有几何异构体和立体异构体。例如，" 异构体"包括几何双键顺-和反-异构体，也称为e-和z-异构体；r-和s-对映 异构体；非对映异构体，(d)-异构体和(l)-异构体，其外消旋混合物；和它们 的其它混合物也落在本发明的范围内
[0159]
符号表示可以为如本文描述的单键、双键或三键的键。本文提供由 取代基排列在碳-碳双键周围或取代基排列在碳环周围得到的各种几何学异 构体及其混合物。碳-碳双键周围的取代基指定为“z”或“e”构型，其中 术语“z”和“e”是根据iupac标准使用。除非另有说明，描述双键的结 构同时涵盖“e”和“z”异构体。
[0160]
碳-碳双键周围的取代基可选地可以称为“顺式”或“反式”，其中“顺 式”代表取代基在双键同侧，
″
反式
″
代表取代基在双键对侧。取代基在碳 环周围的排列也可以指定为
″
顺式
″
或
″
反式
″
。术语“顺式”代表取代基 在环平面的同侧，术语“反式”代表取代基在环平面的对侧。其中取代基位 于环平面的同侧和对侧的化合物的混合物指定为“顺式/反式”。
[0161]
术语“对映异构体”是指具有彼此为不能重叠的镜像的一对立体异构体。 具有不对称组的取代基的原子可产生对映异构体。一对对映异构体的任何比 例的混合物可以称为“外消旋”混合物。当合适时，术语“(
±
)”用于指外 消旋混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子的立体异构体， 且彼此不成镜像。绝对立体化学是根据cahn-ingold-prelogr-s系统指定的。 当化合物为对映异构体时，各个手性碳的立体化学可以表示为r或s。未知 绝对构型的拆分化合物可根据其使波长为钠d线的平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)来指定( )或(-)。本文描述的某些化合物包含一个或多个不对称 中心，因此可生成对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，可以根 据在各不对称原子的绝对立体化学将其定义为(r)-或(s)-。本发明化学实体、 药物组合物和方法意味着包括所有此类可能的异构体(包括外消旋混合物、 光学基本上纯形式和介于其间的混合物)。
[0162]
光学活性的(r)-异构体和(s)-异构体可使用例如手性合成子或手性试剂 制备，或使用常规技术拆分。可以通过本领域技术人员已知的任何方法从外 消旋混合物分离对映异构体，所述方法包括手性高压液相色谱(hplc)、手性 盐的形成和结晶或者通过不对称合成制备。
[0163]
光学异构体可通过根据常规方法拆分外消旋混合物，例如通过用光学活 性酸或碱处理来形成非对映异构盐加以获得。适当酸的实例为酒石酸、二乙 酰基酒石酸、二苯甲
酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。通过结晶 分离非对映异构体的混合物，随后使光学活性碱从这些盐释放提供异构体的 分离。另一方法涉及通过使公开的化合物与呈活化形式的光学纯酸或光学纯 异氰酸酯反应来合成共价非对映异构分子。合成的非对映异构体可通过常规 手段，诸如色谱法、蒸馏、结晶或升华来分离，接着水解以提供对映异构富 集的化合物。光学活性化合物也可通过使用活性起始物质来获得。在一些实 施方案中，这些异构体可呈游离酸、游离碱、酯或盐形式。
[0164]
在某些实施方案中，本发明的化合物可是互变异构体。如本文所用，术 语“互变异构体”是一种类型的异构体，其包括两种或更多种由氢原子的至 少一种形式迁移和至少一种化合价变化(例如单键成为双键，三键成为单键， 或反之亦然)产生的可互相转化的化合物。“互变异构”包括质子移变或质子 转移互变异构，其被视为酸-碱化学的一个亚组。“质子移变互变异构”或“质 子转移互变异构”涉及伴有键级变化的质子迁移。互变异构体的精确比率取 决于若干因素，包括温度、溶剂和ph。当互变异构是可能的(例如在溶液中) 时，可达到互变异构体的化学平衡。互变异构(即提供互变异构对的反应)可 由酸或碱催化，或可在无外部试剂作用或存在下发生。示例性互变异构体包 括但不限于酮至烯醇；酰胺至酰亚胺；内酰胺至内酰亚胺；烯胺至亚胺；以 及烯胺至(不同)烯胺互变异构。酮-烯醇互变异构的一个具体实例是戊烷-2,4
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二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的相互转化。互变异构的另一实例是 酚-酮互变异构。酚-酮互变异构的一个具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1h)-酮 互变异构体的相互转化。
[0165]
除非特别指明具体的立体化学或异构体形式，否则结构的所有手性、非 对映异构体、外消旋和几何异构体形式都是预期的。用于制备本发明化合物 和其中制备的中间体的所有方法被认为是本发明的一部分。所示或描述的化 合物的所有互变异构体也被认为是本发明的一部分。
[0166]“试剂”是指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
[0167]“改善”意指降低、抑制、减弱、减少、阻滞或稳定疾病的发展或进展。
[0168]
"改变"是指基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)，如本领 域标准的已知方法所检测，如本文所述的那些。如本文所述，在一个实施方 案中，改变包括表达水平的约10％变化，优选约25％变化，更优选约40％ 变化，且最优选表达水平的约50％或更大变化。在某些实施方案中，改变包 括表达水平的10％或更少(包括10％)的变化，优选25％或更少(包括25％)的 变化，更优选40％或更少(包括40％)的变化，且最优选表达水平的50％或更 少(包括50％)或更大变化。在其它实施方案中，改变包括表达水平的9％-11％ (包括9％和11％)的变化，优选10％-25％(包括10％和25％)的变化，更优选 25％-40％(包括25％和40％)的变化，且最优选表达水平的40％-50％(包括 40％-50％)或大于50％(包括50％)的变化。在其它某些实施方案中，改变包 括表达水平的9％-11％(包括9％和11％)的变化，优选22％-28％(包括22％ 和28％)的变化，更优选35％-45％(包括35％和45％)的变化，且最优选表达 水平的45％-55％(包括45％-55％)或大于或等于55％的变化。
[0169]“类似物”意指不相同但是具有类似的功能或结构特征的分子。例如， 多肽类似物保留相应的天然存在的多肽的生物学活性，同时相对于天然存在 的多肽具有增强类似物的功能的某些生物化学修饰。此类生物化学修饰可以 提高类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类 似物可以包括非天然的氨基酸。
[0170]
在本公开中，“包含”、“包括”、“含有”和“具有”等可以具有美国专 利法赋予它们的意义，并且可以意指“包括”等；同样地，“基本上由
…
组 成”同样具有美国专利法赋予的意义，并且该术语是开放式的，允许存在叙 述项以外的其他因素，只要叙述项的基本或新颖特征不因该叙述项以外的因 素的存在而变化，但是排除现有技术实施方案。
[0171]“检测”指鉴定要检测的分析物的存在、不存在或量。在具体实施方案 中，所述分析物为pde3a或slfn12多肽。
[0172]“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何疾患或病 症。疾病的实例包括黑素瘤、腺癌、肺癌、子宫颈癌、肝癌和乳腺癌。
[0173]“有效量”意指相对于未治疗的患者改善疾病症状需要的本文所述的化 合物的量。用于实施本发明以治疗性处理疾病的活性化合物的有效量随施用 方式、受试者的年龄、体重和一般健康而变化。最后，主治医生或兽医会决 定合适的量和剂量方案。此类量称为“有效”量。在其它实施方案中，所述 pde3a调节剂为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、或化 合物6。
[0174]
本发明提供了许多靶标，其可用于开发治疗以本文描述的方法为特征的 病症的高度特异性的药物。此外，本发明的方法提供了一种简便的方法来鉴 定对受试者安全使用的疗法。此外，本发明的方法提供了用于分析几乎任何 数目的化合物对本文所述疾病的影响的途径，其具有高体积通量、高灵敏度 和低复杂性。
[0175]
"片段"是指多肽或核酸分子的一部分。该部分包含，优选地，参照核酸 分子或多肽整个长度的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、 约60％、约70％、约80％、或约90％。在某些实施方案中该部分包含，优 选地，参照核酸分子或多肽整个长度的至少9％-11％(包括9％和11％)、 18％-22％(包括18％和22％)、27％-33％(包括27％和33％)、36％-44％(包括 36％和44％)、45％-55％(包括45％和55％)、54％-66％(包括54％和66％)、 63％-77％(包括63％和77％)、72％-88％(包括72％和88％)、或81％-99％(包 括81％和99％)。一个片段可包含约10、约20、约30、约40、约50、约60、 约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约 700、约800、约900、或约1000个核苷酸或氨基酸。在某些实施方案中， 一个片段可包含9-11、约18-22、27-33、36-44、45-55、54-66、63-77、72-88、 81-99、90-110、180-220、270-330、360-440、450-550、540-660、630-770、 720-880、810-990、或900-1100个核苷酸或氨基酸(包括各个所述的极限值， 例如对于“9-11”意味着包括9和11)。
[0176]“血液肿瘤”包括侵袭性和惰性形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、 慢性和急性髓性白血病(cml/aml)、急性成淋巴细胞白血病(all)，霍 奇金病，多发性骨髓瘤和t细胞淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征，浆细 胞瘤，副肿瘤综合征，原发部位未知的癌症以及aids相关的恶性肿瘤。
[0177]“杂交”是指氢键合，其可以是互补核碱基之间的watson-crick、 hoogsteen或反向hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱 基，其通过形成氢键而配对。
[0178]“高增生性疾病”包括例如牛皮癣、瘢痕瘤和其它影响皮肤的增生，良 性高增生性疾病，造血系统高增生性疾病，癌症(特别是转移性或恶性肿瘤， 更具体地是实体瘤和血液肿瘤)。
[0179]“良性高增生性疾病”包括例如，子宫内膜异位、平滑肌瘤和良性前列腺 增生。
[0180]“造血高增生性疾病”也称为肌增殖(myoproliferative)疾病包括例如真性 红细胞增多症、特发性血小板增多症、血小板增多症、原发性骨髓纤维化， 等等。
[0181]
所谓“标记”或“生物标记”是指具有与疾病或障碍相关的表达水平或活性 (例如，在蛋白质或mrna水平)的改变的任何蛋白质或多核苷酸。在具体实 施方案中，本发明的标记为pde3a或slfn12或creb3l1。
[0182]“调节剂”是指任何与多肽结合并改变多肽的生物学功能或活性的试 剂。调节剂包括但不限于降低或消除多肽的生物学功能或活性的试剂(例如
ꢀ“
抑制剂”)。例如，调节剂可以抑制多肽的催化活性。调节剂包括但不限于 增加或减少多肽与另一种试剂结合的试剂。例如，调节剂可以促进多肽与另 一种多肽的结合。在一些实施方案中，pde3a多肽的调节剂是dnmdp。在 一些其他实施方案中，pde3a多肽的调节剂是阿那格雷或扎达维林。在其 他实施方案中，pde3a多肽的调节剂是化合物1、化合物2、化合物3、化 合物4、化合物5、或化合物6。
[0183]
术语“前药(一种或多种)”表示本身可以是生物学活性或无活性的化合 物，但在它们在体内的停留时间内转化(例如代谢或水解)成本发明的化合 物。在生物系统中转化为化合物6或其盐的化合物6及其盐的衍生物(生物 前体或前药)包括在本发明中。所述生物系统可以是例如哺乳动物生物，特 别是人类受试者。生物前体例如通过代谢过程转化为化合物6或其盐。
[0184]
所谓“参照”是指标准或对照条件。
[0185]
可用于本发明的方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任 何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列是100％相同的，而是通 常会展现出基本上同一性。与内源序列具有“基本上同一性”的多核苷酸通 常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明的方法的核酸分子 包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内 源核酸序列是100％相同的，而是通常会展现出基本上同一性。与内源序列 具有“基本上同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂 交。
[0186]“杂交”指在各种严苛条件下配对以形成互补多核苷酸序列(例如本文 中描述的基因)或其部分间的双链分子。(参见，例如，wahl，g.m.and s.l. berger(1987)methods enzymol.152:399；kimmel，a.r.(1987)methodsenzymol.152:507)。
[0187]
例如，严苛的盐浓度通常是小于约750mm nacl和75mm柠檬酸三钠， 优选小于约500mm nacl和50mm柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mmnacl和25mm柠檬酸三钠。可以在不存在有机溶剂，例如甲酰胺的情况下 获得低严苛性杂交，而可以在存在至少约35％甲酰胺，并且更优选至少约 50％甲酰胺的情况下获得高严苛性杂交。严苛温度条件通常会包括至少约30 ℃，更优选至少约37℃，并且最优选至少约42℃的温度。改变其他的 参数，如杂交时间、去污剂，例如十二烷硫酸钠(sds)的浓度和载体dna的 纳入或排除是本领域技术人员公知的。通过根据需要组合这些各种条件实现 各种严苛性水平。在优选的实施方案中，在30℃在750mm nacl、75mm 柠檬酸三钠和1％sds中发生杂交。在更优选的实施方案中，在37℃在 500mm nacl、50mm柠檬酸三钠、1％sds、35％甲酰胺和100μg/ml变性 的鲑鱼精dna(ssdna)中发生杂交。在最优选的实施方案中，在42℃在 250mm nacl、25mm柠檬酸三钠、1％sds、50％甲酰胺和200μg/ml ssdna 中发生杂交。这些条件的有用的变化对于本领域技术
人员是非常显而易见 的。
[0188]
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤在严苛性上也发生变化。洗涤严苛 性条件可以以盐浓度和温度限定。如上文，可以通过降低盐浓度或者通过提 高温度提高洗涤严苛性。例如，用于洗涤步骤的严苛的盐浓度优选将是小于 约30mm nacl和3mm柠檬酸三钠，并且最优选小于约15mm nacl和1.5mm 柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严苛温度条件一般将包括至少约25℃，更优 选至少约42℃，并且甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方案 中，在25℃在30mm nacl、3mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生洗涤步 骤。在更优选的实施方案中，在42℃在15mm nacl、1.5mm柠檬酸三钠 和0.1％sds中发生洗涤步骤。在更优选的实施方案中，在68℃在15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生洗涤步骤。这些条件的另外的 变化对于本领域技术人员将是非常显而易见的。杂交技术是本领域技术人员 公知的，并且记载于例如benton和davis(science 196:180，1977)；grunstein 和hogness(proc.natl.acad.sci.，usa 72:3961，1975)；ausubel等人(currentprotocols in molecular biology，wiley interscience，new york，2001)；berger 和kimmel(guide to molecular cloning techniques，1987，academic press， new york)；和sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual， cold spring harbor laboratory press，new york。
[0189]“实体瘤”包括例如乳腺、呼吸道、脑、骨、中枢和外周神经系统、结 肠、直肠、肛门、生殖器官(例如，子宫颈、卵巢、前列腺)、胃肠道、泌 尿生殖道、内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、甲状腺、甲状旁腺、食道、 子宫内膜、眼、生殖细胞、头部和颈部、肾、肝、喉和下咽、肺、间皮瘤、 胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、皮肤、软组织、胃、睾丸、输尿管、阴道 和外阴和结缔组织的肿瘤，以及这些肿瘤的转移。恶性肿瘤包括遗传性癌症， 例如视网膜母细胞瘤和维尔姆斯肿瘤。
[0190]
可治疗的“乳腺肿瘤”包括，例如，具有阳性激素受体状态的乳腺癌、具 有阴性激素受体状态的乳腺癌、her-2-阳性乳腺癌、激素受体-和her-2-阴性 乳腺癌、brca-相关的乳腺癌和炎性乳腺癌。
[0191]
可治疗的“呼吸道肿瘤”包括，例如，非小细胞支气管癌和小细胞支气管 癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
[0192]
可治疗的“脑肿瘤”包括，例如，神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞 瘤、脑膜瘤和成神经管细胞瘤。
[0193]
可治疗的“男性生殖器官肿瘤”包括，例如，前列腺癌、恶性附睾肿瘤、 恶性睾丸瘤和阴茎癌。
[0194]
可治疗的“女性生殖器官肿瘤”包括，例如，子宫内膜癌、子宫颈癌、卵 巢癌、阴道癌和外阴癌。
[0195]
可治疗的“胃肠道肿瘤”包括，例如，结肠直肠的癌、肛门癌、胃癌、胰 腺癌、食管癌、胆囊癌、小肠癌、唾液腺癌、神经内分泌肿瘤和胃肠道间质 瘤。
[0196]
可治疗的“泌尿生殖道肿瘤”包括，例如，膀胱癌、肾细胞癌、和肾盂和 泌尿道的癌。
[0197]
可治疗的“眼肿瘤”包括，例如，视网膜母细胞瘤和眼内黑素瘤。
[0198]
可治疗的“肝肿瘤”包括，例如，肝细胞癌和胆管细胞癌。
[0199]
可治疗的“皮肤肿瘤”包括，例如，恶性黑素瘤、基底细胞瘤、spinalioma、 卡波西肉瘤和梅克尔细胞癌。
[0200]
可治疗的“头与颈肿瘤”包括，例如，喉癌以及咽部和口腔癌。
[0201]
可治疗的“肉瘤”包括，例如，软组织肉瘤、滑膜肉瘤、横纹肌样肉瘤和 骨肉瘤。
[0202]
可治疗的淋巴瘤包括，例如，非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、皮肤淋 巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤和aids-相关的淋巴瘤。
[0203]
可治疗的白血病包括，例如，急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、 急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和毛细胞白血病。
[0204]“基本上相同”意指与参照氨基酸序列(例如本文中描述的任一种氨基 酸序列)或核酸序列(例如，本文中描述的任一种核酸序列)展现至少50％同一 性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列与用于比较的序列在氨基酸水平或 核酸上是至少60％，更优选80％或85％，并且更优选90％、95％或甚至99 ％相同。
[0205]
通常使用序列分析软件(例如，sequence analysis software package of thegenetics computer group,university of wisconsin biotechnology center,1710university avenue,madison,wis.53705，blast，bestfit，gap或 pileup/prettybox程序)测量序列同一性。此类软件通过将同源性程度归 属到各种取代、缺失和/或其它修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常 包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬 氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸； 和苯丙氨酸，酪氨酸。在测定同一性程度的示例性的方法中，可以使用blast 程序，在e-3
和e-100
之间的概率得分指示紧密相关的序列。
[0206]“受试者”意指哺乳动物，包括但不限于人或非人哺乳动物，如牛、马、 犬、绵羊或猫。
[0207]
本文中提供的范围理解为该范围内的所有数值的速记。例如，1至50 的范围理解为包括来自下组的任何数目、数目的组合或亚范围：1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
[0208]
如本文中使用，术语“治疗/处理”等指降低或改善病症和/或与其相关 的症状。应当理解，虽然未排除，但是治疗病症或疾患不需要完全消除病症、 疾患或与其相关的症状。
[0209]
除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“或”理解为 包括在内的。除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“一 个/种”和“所述/该”理解为单数或复数。
[0210]
除非明确叙述或根据上下文明显的，如本文中使用，术语“约”理解为 在本领域中的正常容差的范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以 理解为在所述数值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1 ％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外根据上下文清楚，本文中提 供的所有数值以术语“约”来修饰。
[0211]
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，如果提供范围， 则总是意味着包括上限和下限。
[0212]
本文中的变量的任何定义中的一批化学基团的叙述包括定义所述变量 为所列基团的任何单一基团或组合。本文中的变量或方面的实施方案的叙述 包括作为任何单一实
施方案或与任何其它实施方案或其部分组合的该实施 方案。
[0213]
本文中提供的任何组合物或方法可以与本文中提供了一种或多种任何 其它组合物和方法组合。
[0214]
1.杀死经选择对磷酸二酯酶3a(pde3a)调节剂有响应的癌细胞或减少 其存活的方法，该方法包括将细胞与选自具有以下结构的化合物的pde3a 调节剂接触:
[0215][0216][0217]
其中所述细胞经选择相对参照具有增加水平的pde3a和/或schlafen 12 (slfn12)多肽或多核苷酸，从而减少所述癌细胞的存活。
[0218]
2.在预先经选择患有对pde3a调节剂有响应的癌症的受试者中减少癌 细胞增殖的方法，该方法包括向所述受试者给予选自具有以下结构的化合物 的pde3a调节剂:
[0219][0220]
其中所述受试者通过检测相对于参照，pde3a和/或schlafen 12 (slfn12)多肽或多核苷酸的水平增加而预先被选择，从而减少所述受试者中 的癌细胞增殖。
[0221]
3.项1或2所述的方法，其中所述pde3a调节剂具有以下结构:
[0222][0223]
4.项1或2所述的方法，还包括检测相对于参照，creb3l1多肽或多 核苷酸的表达水平减少的缺失。
[0224]
5.鉴定患有对pde3a调节有抗性的癌症的受试者的方法，该方法包括 检测在受试者的生物样品中相对于参照，creb3l1多肽或多核苷酸水平的 减少，从而鉴定所述受试者为患有对pde3a调节有抗性的癌症。
[0225]
6.项5所述的方法，还包括检测slfn12水平的减少。
[0226]
7.项1-6任一项所述的方法，其中所述pde3a、slfn12或creb3l1 多肽的水平通过选自以下的方法检测：免疫印迹、质谱分析和免疫沉淀。
[0227]
8.项1-6任一项所述的方法，其中所述pde3a、slfn12或creb3l1 多核苷酸的水平通过选自以下的方法检测：定量pcr、rna测序、northern 印记、微阵列、质谱分析和原位杂交。
[0228]
9.项1-6任一项所述的方法，其中所述经选择的对磷酸二酯酶3a (pde3a)调节剂有响应的癌细胞为以下癌细胞：骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、 结肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头与颈癌、造血细胞癌、肾 癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺 癌、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌。
[0229]
10.项1或2所述的方法，其中所述pde3a调节剂减少pde3a的活 性。
[0230]
11.项2所述的方法，其中所述pde3a调节剂口服或静脉内给药。
[0231]
12.项5所述的方法，其中所述生物样品为包含癌细胞的组织样品。
[0232]
13.用于鉴定患有对pde3a调节有抗性的癌症的受试者的试剂盒，所 述试剂盒包含结合creb3l1多肽或多核苷酸的捕获试剂。
[0233]
14.项13的试剂盒，还包含结合slfn12多肽或多核苷酸的捕获试剂。
[0234]
15.具有以下结构的化合物:
[0235][0236]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0237]
16.药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和 具有以下结构的化合物：
[0238][0239]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0240]
17.治疗高增生性疾病的方法，包括向需要的受试者给药具有以下结 构的化合物
[0241][0242]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0243]
18.根据项17的方法，其中所述高增生性疾病为癌症。
[0244]
19.根据项17的方法，其中所述受试者已被诊断为患有对pde3a调 节剂有响应的癌症。
[0245]
20.根据项17的方法，其中所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结 肠癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头与颈癌、造血细胞癌、肾癌、 平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、 软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌。
[0246]
21.在预先经选择的对pde3a调节剂有响应的受试者中减少癌细胞 增殖的试剂盒，该试剂盒包含具有以下结构的化合物:
[0247][0248]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0249]
22.pde3a调节剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述 pde3a调节剂为具有以下结构的化合物:
[0250][0251]
或其药学上可接受的盐、或前药。
[0252]
23.项22的用途，其中所述癌症为骨癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、 子宫内膜癌、胃肠道间质瘤(gist)、头与颈癌、造血细胞癌、肾癌、平滑 肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、软组 织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道癌。
[0253]
24.制备项15的化合物6的方法，所述方法包括以下步骤
[0254]
在10-15℃的温度范围(包括10
°
和15
°
)使外消旋化合物3a
[0255][0256]
与乙酸中的naocl反应以得到外消旋化合物6a
[0257][0258]
随后分离化合物6a的对映异构体以得到化合物6
[0259][0260]
25.根据项24的方法，还任选在之前的步骤中包括分离化合物3a的对 映异构体以得到化合物3
[0261][0262]
且在10-15℃的温度范围(包括10
°
和15
°
)使对映异构体化合物3与乙 酸中的naocl进行反应的步骤，且任选进一步包括随后分离对映异构体。
[0263]
26.根据项24的方法，其中使对映异构体化合物3反应
[0264][0265]
以得到对映异构体化合物6
[0266][0267]
27.化合物3在制备化合物6中的用途
[0268][0269][0270]
附图简述
[0271]
图1a-1d显示了6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪
ꢀ‑
3(2h)-酮(dnmdp)的鉴定和表征，dnmdp是一种有效的选择性癌细胞细 胞毒性剂。图1a是1924种化合物的散点图，显示tp53突变体nci-h1734 细胞(其为非小细胞肺癌细胞系)和tp53野生型a549细胞(另一种肺癌 细胞系)在以浓度为10μm处理48小时后的平均存活率。dnmdp用大箭 头表示。选择性杀死nci-h1734细胞的其他化合物用小箭头表示。阳性对照 星形孢菌素用长箭头表示。图1b是线性图，显示用指定浓度的dnmdp处 理48小时的一组细胞系。图1c是显示用指定浓度的dnmdp的分离的对映 体处理48小时的hela细胞系的线性
图。(r)-对映体的ec
50
为(s)-对映体的 500分之一。图1d是(r)-dnmdp的结构。
[0272]
图2显示dnmdp选择性地杀死nci-h1734并且不影响a549中的细胞 活力。用指定的化合物和浓度处理nci-h1734和a549细胞系48小时。
[0273]
图3显示(r)-6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)
‑ꢀ
酮(r)-dnmdp)和类似物的合成方案。反应条件如下：(a)ac2o，(91％)；(b) 90％hno3，h2so4，(19％)；(c)naoh，meoh/h2o，(100％)，然后ch3cho， nabh(oac)3，(7％)；(d)(brch2ch2)2o，k2co3，dmf，(46％)；(e)ch3cho， nabh3cn，meoh，(82％)。
[0274]
图4a-4c显示了6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪
ꢀ‑
3(2h)-酮(dnmdp)的超临界流体(scf)色谱图(从上到下：es ，二极 管阵列，es-迹线)。图4a是三个色谱图，显示峰1(cro分离)；图4b是 三个色谱图，显示峰2(cro分离)；图4c是三个色谱图，显示合成的 (r)-dnmdp(峰1:2通过uv确定为5:95比率)。
[0275]
图5a-5c显示磷酸二酯酶3a(pde3a)表达与对6-(4-(二乙基氨基)-3
‑ꢀ
硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(dnmdp)的敏感性相关，但抑制 pde3a介导的camp水解与细胞毒性无关。图5a是散点图，显示dnmdp 敏感性与766个基因组上表征的细胞系中18,988个基因的表达之间的相关 性。将细胞系处理72小时，浓度范围为66.4μm-2nm，以2倍步骤稀释。 pde3a表达与对dnmdp敏感性之间皮尔森相关性的z分数为8.5。图5b 是散点图，显示来自图a的细胞系的结果，其用480种化合物处理。dnmdp 显示pde3a表达与敏感性之间的最佳相关性。图5c是散点图，显示公布的 pde3抑制剂ic
50
值和用至多10μm的指定化合物处理hela细胞48小时的 ec
50
值。在图7b中测定用于pde3a抑制的dnmdp的ic
50
浓度。
[0276]
图6a-6c分别显示6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪
ꢀ‑
3(2h)-酮(dnmdp)、氰胍佐旦和左西孟旦的化学结构。
[0277]
图7a和7b为显示6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪
ꢀ‑
3(2h)-酮(dnmdp)的磷酸二酯酶3a(pde3a)体外ic
50
测定的图。图7a 显示用指示浓度的阳性对照曲喹辛的pde3a体外抑制(ic
50
曲线通过caliper 进行)。图7b显示用指示浓度的dnmdp的pde3a体外抑制(ic
50
曲线通 过caliper进行)。
[0278]
图8a和8b是显示camp信号传导的诱导不表型模拟由6-(4-(二乙基氨 基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(dnmdp)诱导的细胞毒性的 图。福斯高林：fsk。图8a显示了在hela细胞中用指定化合物和浓度处理 后1小时测量的camp浓度。图8b显示用指定的化合物和浓度处理48小时 的hela细胞的活力。
[0279]
图9a-9c显示非致死性磷酸二酯酶3(pde3)抑制剂通过竞争与pde3a 结合拯救了由6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮 (dnmdp)诱导的细胞死亡。图9a是显示用浓度为20μm的1600种生物活 性化合物与30nm(ec70)dnmdp组合处理48小时的hela细胞的活力 的散点图。所述活力经计算为未处理的dmso对照的百分比。图9b是显示 用dnmdp与指定浓度的非致死性pde3和泛pde抑制剂组合处理48小时 的hela细胞的活力的线性图。图9c显示sds-page凝胶，其描绘了对200 μg hela细胞裂解物进行亲和纯化的结果，其中使用附着到固相的dnmdp 接头-类似物，其具有与非致死性pde3抑制剂相同的拯救特征。将指示的化 合物与接头-类似物共孵育。亲和纯化分级在sds-page凝胶上运行并探测pde3a。
[0280]
图10a和10b显示连接基化合物(r)-(2-(2-(2-(乙基(4-(4-甲基-6-氧代
ꢀ‑
1,4,5,
6-四氢哒嗪-3-基)苯基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯 (dnmdp)-2l的结构和拯救表型。图10a显示dnmdp-2l的结构。图10b 是显示用指定化合物和浓度处理48小时的hela细胞的活力的线性图。
[0281]
图11a-11c显示磷酸二酯酶3a(pde3a)在敏感细胞系中不是必不可少 的，但是是传递细胞毒性信号所必需的。图11a是western印迹。用cas9 感染hela细胞并显示针对pde3a的指导rna(sgrna)。在指定的时间点 针对pde3a探测western印迹。图11b是条形图，其显示用指定sgrna感 染2周并用1μm的6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪
ꢀ‑
3(2h)-酮(dnmdp)处理48小时的hela细胞的拯救百分比。将拯救百分比 标准化为仅cas9对照。图11c是显示用指定的sgrna感染并用各种浓度的 6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(dnmdp)处理 的细胞的活力的图。
[0282]
图12a和12b是western印迹和图表，其显示磷酸二酯酶3a(pde3a) 蛋白水平的降低导致对6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪
ꢀ‑
3(2h)-酮(dnmdp)的抗性。在图12a中，用混杂的对照sirna或靶向pde3a 的四种不同sirna的组合处理hela细胞。在指定的时间点裂解细胞并 pde3a和肌动蛋白进行免疫印迹。图12b是显示用指定浓度的dnmdp类 似物3处理48小时的hela细胞的活力的线性图。
[0283]
图13a-13c显示在6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪
ꢀ‑
3(2h)-酮(dnmdp)存在下的磷酸二酯酶3a(pde3a)免疫沉淀揭示新的 sirt7和slfn12相互作用。图13a显示了在hela细胞中进行的pde3a 的亲和富集和随后的定量蛋白组学的示意图。所有细胞在裂解之前用10μm 指定化合物处理4小时。整个实验过程中都保持了所有化合物的存在，包括 洗涤步骤。图13b是散点图，其显示与对pde3a抗体特异性的阻断肽存在 下的抗-pde3a免疫沉淀物相比，在dmso处理的hela细胞中的抗-pde3a 免疫沉淀物中富集的蛋白的log2比率；每个点代表一种蛋白。图13c是显示 与曲喹辛，在dnmdp存在下，与pde3a结合的蛋白的变化的log2比率的 散点图。每个点表示单个蛋白的每个条件的两次重复(replicate)的平均值。在 所有情况下，绘制的数据通过bland-altman检验，其重现性的置信区间为95％。
[0284]
图14a-14c显示了在不同条件下使用pde3a作为诱饵的重复pde3a
‑ꢀ
蛋白相互作用研究的结果。每个散点图显示了在阻断肽存在下，通过pde3a 富集在不同条件下由pde3a富集的两个蛋白重复的log2比率。每个点代表 该特定蛋白的log2比率，中灰点对应于benjamini-hochberg调整的p值《0.01， 浅灰点代表在95％置信区间内重现性落在blandt-altman检验外面的蛋白。 在图14a中，通过使用抗pde3a的免疫沉淀完成蛋白富集。在图14b中， 通过在dnmdp存在下使用抗pde3a的免疫沉淀完成蛋白富集。在图14c 中，蛋白富集在曲喹辛的存在下通过使用抗-pde3a免疫沉淀完成。
[0285]
图15a-15e显示具有双重表达slfn12和pde3a的细胞系显著富集 dnmdp敏感性细胞系。图15a是散点图，其显示来自具有所示敏感细胞系 的癌细胞系百科全书(ccle)数据库(一大组人类癌细胞系的详细遗传特征) 的pde3a和slfn12的mrna稳健多芯片平均(robust multichip average) (rma)表达值(barretina等人，nature 483,603-607,2012)。根据曲线下面积 (auc)等级，将21个敏感细胞系分为三组，每组7个。图15b是显示与其 他细胞系相比，具有高表达slfn12和pde3a二者(rma log2》5)的细胞系 的dnmdp敏感性的fisher精确检验结果的条形图。右边的条形的上半部分 表示黑素瘤细胞系。图15c是显
示来自rna测序数据的pde3a和slfn12 的mrna rpkm 1表达值的散点图。图15d是显示用shslfn12转导的 hela细胞中slfn12的qpcr表达变化归一化为gapdh的条形图。图15e 是显示用指定的shrna试剂转导并用指定浓度的dnmdp处理72小时的 hela细胞的活力的图。
[0286]
图16a和16b是散点图，其显示slfn12表达是与dnmdp敏感性相 关的最相关基因。图16a显示了在766个基因组表征的细胞系中dnmdp 敏感性与18,988个基因的表达之间的相关性。将细胞系以2倍步骤稀释以 66.4μm-2nm的浓度处理72小时。图16b是显示766个基因组表征的细胞 系中dnmdp敏感性与18,988个基因表达之间相关性的散点图。如前所述， 针对pde3a表达校正表达水平(kim等人，genetica 131,151-156,2007)。将 细胞系以2倍步骤稀释以66.4μm-2nm的浓度处理72小时。
[0287]
图17a-17b显示dnmdp诱导hela细胞凋亡。图17a是显示用指示 浓度的dnmdp处理48小时的hela细胞的活力的图。半胱天冬酶-glo代 表半胱天冬酶3/7活性，从而表明细胞凋亡的诱导。celltiter-glo反映活力。 图17b是免疫印迹。用指定的化合物和浓度处理hela细胞36小时。收获 hela细胞并针对parp裂解产物进行免疫印迹，指示细胞凋亡。
[0288]
图18是766个癌细胞系的pde3a mrna表达和对dnmdp的敏感性 的散点图。
[0289]
图19是显示dnmdp在hela细胞中诱导pde3a与sirt7和slfn12 之间的相互作用的免疫印迹。用指定的质粒转染hela细胞，并用终浓度为 10μm的指定化合物处理4小时。将内源性pde3a免疫沉淀并对v5进行免 疫印迹以鉴定与sirt7和slfn12的新的相互作用(上面两幅图)。对于免疫 沉淀输入，就pde3a和v5进行免疫印迹(下两个图)。v5-slfn12在全细 胞裂解物中检测不到。
[0290]
图20是显示使用亲和试剂证实本文质谱结果的免疫印迹。图20显示， slfn12是dnmdp活性所需的。图20显示dnmdp和阿那格雷(但不是曲 喹辛)诱导pde3a和sfln12复合物形成(阿那格雷较弱)。
[0291]
图21a-21c显示剂量依赖性pde3a/slfn12复合物形成与hela细胞中 的细胞杀伤效力相关。图21a是显示用化合物7、化合物8和化合物3处理 的细胞中slfn12-v5水平的免疫印迹。图21b是显示hela细胞中复合物 形成的图，通过定量图21a中用化合物7、化合物8和化合物3处理的细胞 中slfn12-v5的水平测量。图21c是显示用化合物7、化合物8和化合物3 处理的hela细胞中细胞杀伤的图。化合物的结构如下所示：
[0292][0293]
图22是一组表格，显示slfn12和creb3l在已获得对dnmdp的抗 性的细胞中丢失。
[0294]
图23a是显示通过slfn12的表达对dnmdp抗性hela细胞系敏化的 图，其被pde3a抑制剂曲喹辛竞争掉。
[0295]
图23b是显示通过slfn12的表达或sfln12和pde3a的表达对 dnmdp抗性细胞系(a549)敏化的图。
[0296]
图24是显示基于slfn12和pde3a表达水平的平滑肌肉瘤(lms)对 pde3a调节的预测敏感性的散点图。
[0297]
表1显示用dnmdp处理的766个癌细胞系的敏感性数据。将细胞系以 2倍步骤稀释以66.4μm-2nm的浓度处理72小时。
[0298]
表1a显示通过化合物6的细胞增殖测量结果获得的ic
50
值。
[0299]
表2显示了通过caliper实施的19个磷酸二酯酶抑制反应的结果。 dnmdp浓度是100nm。
[0300]
表3显示了多种健康组织类型中slfn12和pde3a表达的rpkm值。
[0301]
表4显示平滑肌肉瘤经预测对dnmdp敏感。
[0302]
表5显示了dnmdp与pde3a(677-1141)的结合。
[0303]
结合下面提供的实施例，将由本发明限定的组合物和物品分离或另外制 造。根据详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
[0304]
发明详述
[0305]
如下所述，本发明的特征在于通过在来源于患者的癌细胞中检测 pde3a和schlafen 12(slfn12)多肽或者多核苷酸的共表达来鉴别患有对磷 酸二酯酶3a(pde3a)调节剂治疗敏感的癌症(例如本文所述的癌症类型)的 患者的改进方法。本发明至少部分地基于以下发现：在766个癌细胞系中对 于磷酸二酯酶3a调节剂如6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢 哒嗪-3(2h)-酮或者dnmdp的敏感性与磷酸二酯酶3a基因pde3a的表达 相关。像dnmdp一样，pde3a抑制剂的一个子集杀死选定的癌细胞，而 另一些则没有杀死选定的癌细胞；这些对细胞宽容(cell-sparing)的pde3a抑 制剂反而阻断dnmdp诱导的细胞毒性。此外，pde3a消耗导致dnmdp 抗性。dnmdp与pde3a的结合促进pde3a与sirtuin 7(sirt7)和schlafen 12(slfn12)之间的相互作用，表明具有一种新形态活性，并且slfn12和 pde3a共表达与dnmdp敏感性相关。这些结果表明，pde3a调节剂是有 前途有前途的癌症治疗剂，并证明了预测性化学基因组学在小分子发现和靶 标鉴定中的作用。
[0306]
因此，本发明提供了选择患有对pde3a调节剂应答的癌症的受试者的 方法，其中所述选择方法涉及在来源于这种受试者的癌细胞中检测pde3a 和schlafen 12(slfn12)多肽或多核苷酸的共表达。
[0307]
在一个具体的实施方案中，creb3l1或slfn12多核苷酸或多肽的表 达在已获得对pde3a调节剂的抗性的癌细胞中降低或不可检测。
[0308]
pde3a调节剂
[0309]
pde3a调节剂的鉴定是与被设计用于鉴定突变tp53背景中的细胞毒性 小分子的表型筛选相关联的。预测性化学基因组学方法补充了靶标驱动的药 物研发计划，其由广泛的体外和体内靶标验证组成，并且也可以被称为逆向 化学基因组学(zheng等人，curr issues mol biol 4,33-43,2002)。许多美国食 品和药物管理局(fda)批准的靶向疗法已经以此方式研发，其中包括靶向致 癌体细胞驱动突变的小分子激酶抑制剂(moffat等人，nat rev drug discov 13, 588-602,2014)。然而，靶向疗法的发现和研发往往受到靶标生物学功能知识 的局限性、其作用机制和选择性抑制靶标的可用化学物质的限制。
[0310]
表型筛选可以发现癌症治疗的新靶点，其特定分子机制通常由未来研究 阐明(swinney等人，nat rev drug discov 10,507-519,2011)。近年来，通过 无偏的表型筛选
努力发现的两类抗癌药物已经被fda批准。发现来那度胺 和泊马度胺是e3-连接酶的调节剂，其改变了其靶标的亲和力，导致谱系特 异性转录因子的降解(等人,science 343,301-305,2014；lu等人, science 343,305-309,2014)，而罗米地辛和伏立诺他后来被确定为组蛋白脱 乙酰酶(hdac)抑制剂(moffat等人,nat rev drug discov 13,588-602,2014； nakajima等人,exp.cell res.241,126-133,1998,marks等人,nat biotechnol25,84-90,2007)。
[0311]
肿瘤抑制基因的改变是表型筛选的合适目标，因为它们不能用小分子直 接靶向，尽管合成致死方法如奥拉帕尼治疗brca1/brca2突变型癌症已被 证明是有效的。根据目前的知识，tp53肿瘤抑制基因是人类癌症中发生频率 最高的突变，在进行整个外显子组测序的4742例癌症中有36％检测到体细 胞突变。尽管进行了许多尝试，但没有发现选择性杀死tp53突变细胞的化合 物。
[0312]
被研发用于鉴定在tp53突变体癌细胞中引起合成致死性的小分子的表 型筛选能够偶然发现一类用作磷酸二酯酶3a(pde3a)调节剂的癌症选择性 细胞毒性剂，如下文所述。环核苷酸磷酸二酯酶催化第二信使分子环状腺苷 一磷酸(camp)和环状鸟苷一磷酸(cgmp)的水解，并且在许多生理过程中很 重要。几种磷酸二酯酶抑制剂已被批准用于临床治疗，包括用于心血管适应 症和血小板凝固抑制的pde3抑制剂米力农，西洛他唑和左西孟旦，以及用 于血小板增多症的pde3抑制剂阿那格雷。其它pde3a抑制剂从wo 2014/164704已知。pde5抑制剂如瓦地那非用于包括勃起功能障碍和肺动脉 高压在内的平滑肌障碍，以及pde4抑制剂罗氟司特减少慢性阻塞性肺病 (copd)的恶化。
[0313]
磷酸二酯酶抑制剂通过直接抑制其靶标或通过变构调节起作用；例如， pde4的结构分析导致设计pde4d和pde4b变构调节剂(burgin等人，natbiotechnol 28,63-70,2010；gurney等人，neurotherapeutics 12,49-56,2015)。 下文提供的数据表明癌症细胞毒性磷酸二酯酶调节剂dnmdp可能通过类 似的变构机制起作用。
[0314]
因此，本发明提供了用于基于包含癌细胞的受试生物样品中的pde3a 和slfn12表达水平来鉴定患有可能对pde3a调节剂治疗有应答的恶性肿 瘤的受试者的方法。在一些其他实施方案中，所述pde3a调节剂为dnmdp。 在一些其它实施方案中，pde3a调节剂为阿那格雷或者扎达维林。在其它 实施方案中，所述pde3a调节剂为化合物1、化合物2、化合物3、化合物 4、化合物5、或化合物6。
[0315]
在具体的实施方案中，本发明提供了鉴定患有对pde3a调节剂治疗具 有抗性的恶性肿瘤的受试者的方法，其是基于creb3l1或slfn12表达水 平的丧失或相对于参照的降低。
[0316]
化合物形式和盐
[0317]
本发明的化合物包括化合物自身以及其盐和前药(如果可适用的话)。盐 例如可在阴离子与本文所述的化合物上的荷正电的取代基(例如，氨基)之间 形成。适合的阴离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、硝酸根、磷酸 根、柠檬酸根、甲磺酸根、三氟乙酸根和乙酸根。同样地，盐还可在阳离子 与本文所述的化合物上的荷负电的取代基(例如，羧酸根/盐)之间形成。适合 的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵阳离子例如四甲基铵离 子。前药的实例包括羧酸基团的c
1-6
烷基酯，其在施用于个体后能够提供活 性化合物。
[0318]
本发明的化合物的可药用盐包括衍生自可药用的无机和有机酸和碱的 那些。如本文使用的，术语“可药用盐”是指通过将可药用酸或碱加至本文 所公开的化合物而形成的盐。如本文使用的，短语“可药用的”是指从毒理 学前景来说对于在药物应用中的使用是可接受的并且不会不利地与活性成 分相互作用的物质。
[0319]
本发明化合物的合适的药学上可接受的盐可以是，例如，在链或环中带 有氮原子的本发明化合物的酸加成盐，例如，它是足够碱性的，例如，与无 机酸或“矿物酸”的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺 酸、重硫酸(bisulfuric acid)、磷酸或硝酸，或与有机酸的酸加成盐，如甲酸、 乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、 月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、 环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟碱、双羟萘酸、果胶酯酸、 3-苯基丙酸、新戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、 乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、 柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、 海藻酸、马来酸、富马酸、d-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷 酸、天冬氨酸、磺基水杨酸或硫氰酸。
[0320]
合适的酸式盐的其它实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、 苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸 盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖 酸盐(glucoheptanoate)、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢 溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺 酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯 基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、 硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。其它酸(例如草酸)， 其本身并非药学上可接受的，但是可以在制备盐中用作中间体，以获得本发 明化合物及其可药用的酸加成盐。
[0321]
此外，足够碱性的化合物1-6，尤其是化合物6的其它合适的药学上可 接受的盐，是碱金属盐，例如钠或钾盐，碱土金属盐，例如钙、镁或锶盐， 或铝或锌盐，或衍生自氨或具有1至20个碳原子的有机伯、仲或叔胺的铵 盐，如乙基胺、二乙基胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、 三乙醇胺、二环己基胺、二甲基氨基乙醇、二乙基氨基乙醇、三(羟基甲基) 氨基甲烷、普鲁卡因、二苄基胺、n-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、1,2-乙二 胺、n-甲基哌啶、n-甲基-葡糖胺、n,n-二甲基-葡糖胺、n-乙基-葡糖胺、1,6
‑ꢀ
己烷二胺、葡糖胺、肌氨酸、丝氨醇、2-氨基-1,3-丙二醇、3-氨基-1,2-丙二 醇、4-氨基-1,2,3-丁三醇，或具有含1至20个碳原子的季铵离子的盐，如四 甲基铵、四乙基铵、四(正丙基)铵、四(正丁基)铵、n-苄基-n,n,n-三甲基铵、 胆碱或苄烷铵。
[0322]
在某些实施方案中，衍生自适当的碱的盐包括碱金属(例如钠)盐、碱土 金属(例如镁盐)、铵盐和n-(烷基)
4
盐。本发明也涉及本文中所公开的任何 碱性含氮基团的季铵化。通过此类季铵化可以获得水或油溶性或可分散的产 物。本文中任何式的化合物的盐形式可以为羧基的氨基酸盐(例如l-精氨酸、 l-赖氨酸、l-组氨酸盐)。
[0323]
适合的盐的列表记载于remington's pharmaceutical sciences，第17版， mackpublishing company，easton，pa.，1985，第1418页；journal ofpharmaceutical science，66，2(1977)；和“pharmaceutical salts：properties， selection，and use a handbook；wermuth，c.g.and stahl，p.h.(eds.)verlaghelvetica chimica acta，
zurich，2002[isbn 3-906390-26-8]，其全部内容各 自通过引用并入本文。本领域技术人员将进一步认识到，要求保护的化合物 的酸加成盐可以通过化合物与适当的无机或有机酸通过许多已知方法中的 任何一种反应来制备。或者，本发明的酸性化合物的碱金属和碱土金属盐通 过各种已知方法使本发明化合物与适当的碱反应来制备。
[0324]
本发明包括本发明化合物的所有可能的盐，作为单一盐，或所述盐的任 何比例的任何混合物。
[0325]
可通过将盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而使化合物的 中性形式再生。化合物的母体形式在某些物理性质方面(例如极性溶剂的溶 解度)不同于各种盐形式，但是为了本发明的目的，在其它方面盐与化合物 的母体形式相等。
[0326]
除盐形式以外，本发明提供呈前药形式的化合物。本文所述的化合物的 前药是在生理条件下经受化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。此 外，前药可通过化学或生物化学方法在离体环境中转化为本发明的化合物。 例如，当与合适的酶或化学试剂一起放置在透皮贴剂贮库中，前药可缓慢地 转化为本发明的化合物。前药通常是有用的，因为在某些情况下，它们比母 体药物更容易施用。例如，它们通过口服施用的生物利用度可高于母体药物。 与母体药物相比，前药在药理学组合物中还可具有改善的溶解度。多种前药 衍生物在本领域中已知，例如依赖于前药的水解性切割或氧化激活的那些。 前药的实例(不限于)是作为酯(“前药”)施用但是然后可被代谢水解成活性 实体羧酸的本发明化合物。另外的实例包括本发明的化合物的肽基衍生物。
[0327]
本发明还包括化合物的各种水合物和溶剂合物形式。
[0328]
本发明的化合物还可包含一个或多个组成此类化合物的原子中的非天 然比例的原子同位素。例如，化合物可用放射性同位素进行放射性标记，例 如氚(3h)、碘-125(
125
i)或碳-14(
14
c)。本发明化合物的所有同位素变化，无论 是否具有放射性，意图包括在本发明的范围之内。特别是含氘的化合物。
[0329]
术语化合物或试剂的“同位素变体”定义为表现出构成化合物的一种或 多种同位素的非天然比例的化合物。
[0330]
表述“非天然的比例”是指高于其天然丰度的同位素的比例。在本上下 文中应用的同位素的天然丰度描述在“isotopic compositions of the elements 1997”，pure appl.chem.，70(1)，217-235，1998。
[0331]
这种同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的稳 定和放射性的同位素，分别如2h(氘)、3h(氚)、
11
c、
13
c、
14
c、
15
n、
17
o、 18
o、
32
p、
33
p、
33
s、
34
s、
35
s、
36
s、
18
f、
36
cl、
82
br、
123
i、
124
i、
125
i、
129
i和 131
i。
[0332]
关于治疗和/或预防本文所述的疾病，化合物1-6(特别是化合物6)的 一种或多种同位素变体优选含有氘(“含氘的”)。其中掺入一种或多种放射 性同位素，例如3h或
14
c的化合物1-6(特别是化合物6)的同位素变体可 用于例如药物和/或底物组织分布研究。这些同位素由于其易于掺入和检测是 特别优选的。可以将正电子发射同位素，例如
18
f或
11
c掺入化合物1-6(特 别是化合物6)。化合物1-6的这些同位素变体可用于体内成像应用。在临床 前或临床研究的情况下，含氘和含
13
c的化合物1-6可用于质谱分析。
[0333]
化合物1-6的同位素变体通常可通过本领域技术人员已知的方法，例如 本文中方案和/或实施例中描述的那些，通过将试剂替换为所述试剂的同位素 变体，优选替换为含
氘试剂制备。取决于所需氘化位点，在一些情况下，可 以将来自d2o的氘直接掺入化合物中或掺入可用于合成这样的化合物的试 剂中。氘气也是可用于将氘掺入分子中的试剂。烯属键的催化氘化和炔属键 的催化氘化是掺入氘的快速途径。在氘气存在下，金属催化剂(即pd、pt 和rh)可用于将含官能团的烃中的氢直接交换成氘(j.g.atkinson等人,美 国专利3966781)。各种氘化试剂和合成结构单元从例如c/d/n isotopes, quebec,canada；cambridge isotope laboratories inc.,andover,ma,usa和 combiphos catalysts,inc.,princeton,nj,usa的公司商业可得。
[0334]
术语“含氘的化合物1-6”定义为以下化合物，其中一个或多个氢原子 被一个或多个氘原子替代并且其中在化合物1-6任一个的每个氘化位置的氘 的丰度高于氘的自然丰度，其为约0.015％。特别地，在含氘的化合物1-6任 一个中，在化合物的每个氘化位置的氘的丰度高于10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％或80％，优选高于90％、95％、96％或97％，甚至更优选 在所述一个或多个位置高于98％或99％。应理解的是在各氘化位置的氘的丰 度与其它一个或多个氘化位置的氘的丰度无关。
[0335]
将一个或多个氘原子选择性掺入化合物1-6任一个可改变分子的物理化 学性质(例如酸度[c.l.perrin，等人，j.am.chem.soc.，2007，129，4490]， 碱度[c.l.perrin等人，j.am.chem.soc.，2005，127，9641]，亲脂性[b.testa 等人,int.j.pharm.,1984,19(3),271])和/或代谢曲线并可导致母体化合物与 代谢物的比率的改变或所形成的代谢物的量的改变。这样的改变可导致某些 治疗优点并因此在一些情况下可以是优选的。已报道了降低的代谢速率和代 谢转换，其中代谢物的比率改变(a.e.mutlib等人，toxicol.appl.pharmacol.， 2000，169，102)。暴露于母体药物和代谢物的这些改变对于含氘的通式(i) 的化合物的药效学、耐药性和效力可具有重要结果。在一些情况下，氘取代 降低或消除不期望或毒性代谢物的形成并提高所需代谢物的形成(例如奈韦 拉平：a.m.sharma等人，chem.res.toxicol.，2013，26，410；依非韦伦： a.e.mutlib等人，toxicol.appl.pharmacol.，2000，169，102)。在其它情况 下，氘化的主要作用是降低全身清除速率。因此，化合物的生物半衰期提高。 潜在的临床益处可包括保持相似的全身暴露伴有降低的峰值水平和增加的 谷水平的能力。这可导致降低的副作用和提高的效力，取决于具体化合物的 药代动力学/药效学关系。ml-337(c.j.wenthur等人,j.med.chem.,2013,56, 5208)和奥当卡替(k.kassahun等人,wo2012/112363)是该氘化效果的实 例。已报道了另一些情况，其中降低的代谢速率导致增加的药物暴露而没有 改变全身清除速率(例如罗非考昔:f.schneider等人,arzneim.forsch.drug. res.,2006,56,295；特拉匹韦:f.maltais等人,j.med.chem.,2009,52,7993)。 显示该效果的氘化的药物可具有降低的给药需要(例如降低的给药次数或降 低的剂量以达到所需效果)和/或可产生降低的代谢物负载。
[0336]
化合物1-6可具有多个潜在的代谢攻击位点。为了优化上述物理化学性 质和代谢分布的效果，可以选择具有一种或多种氘-氢交换的特定模式的含 氘的化合物1-6。特别地，一种或多种含氘的化合物1-6的一个或多个氘原 子连接至碳原子和/或位于化合物1-6的作为代谢酶，例如细胞色素p450的 攻击位点的那些位置。
[0337]
药物组合物
[0338]
化合物1-6，尤其是化合物6，可能具有全身和/或局部活性。为此目的， 它们可以
以合适的方式施用，例如通过口服、肠胃外、肺、鼻、舌下、舌、 含剂、直肠、阴道、皮肤、透皮、结膜、耳部途径或作为植入物或支架。
[0339]
对于这些给药途径，化合物1-6可以以合适的给药形式给药。
[0340]
对于口服给药，可以将化合物1-6配制成本领域已知的剂型，其快速和 /或以改良的方式递送本发明的化合物，例如片剂(未包衣或包衣片剂，例如， 具有延迟溶解或不溶解的肠溶或控释包衣、口腔崩解片剂、薄膜/薄片、薄膜 /冻干物、胶囊(例如硬或软明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、粉末、 乳液、悬浮液、气溶胶或溶液。可以将化合物1-6以结晶和/或无定形和/或 溶解形式掺入所述剂型中。
[0341]
可以在避免吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰内)或 包括吸收(例如肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)的情况下进行肠胃外给药。 适于肠胃外给药的给药形式尤其为溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干物或无菌粉 末形式的用于注射和输注的制剂。
[0342]
适合于其它给药途径的实例为用于吸入的药物形式[尤其是粉末吸入 器、喷雾器]、滴鼻剂、鼻溶液、鼻喷雾剂；用于舌、舌下或口腔给药的片 剂/薄膜/薄片/胶囊；栓剂；滴眼剂、眼药膏、眼部浴液、眼部插入物、滴耳 剂、耳喷雾剂、耳粉、耳洗液、耳塞；阴道胶囊、水性悬浮液(洗剂、振荡 合剂(mixturae agitandae))、亲脂悬浮液、乳剂、软膏、乳膏、透皮治疗系统(例如贴剂)、乳液、糊剂、泡沫、粉剂、植入物或支架。
[0343]
根据本发明的化合物可以掺入所述的给药形式中。这可以通过与药学上 合适的赋形剂混合以本身已知的方式实现。药学上合适的赋形剂尤其包括：
[0344]
·
填料和载体(例如纤维素、微晶纤维素(例如，)、乳糖、甘露 醇、淀粉、磷酸钙(例如，)),
[0345]
·
软膏基质(例如矿脂、石蜡、甘油三酯、蜡、羊毛蜡、羊毛蜡醇、羊 毛脂、亲水性软膏、聚乙二醇),
[0346]
·
栓剂基质(例如聚乙二醇、可可脂、硬脂),
[0347]
·
溶剂(例如水、乙醇、异丙醇、甘油、丙二醇、中链-长度甘油三酯脂 肪油、液体聚乙二醇、石蜡),
[0348]
·
表面活性剂、乳化剂、分散剂或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)、卵磷 脂、磷脂、脂肪醇(例如，)、脱水山梨醇脂肪酸酯(例如，)、 聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(例如，)、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯(例如， )、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、甘油脂肪酸酯、泊 洛沙姆(例如，),
[0349]
·
缓冲剂、酸和碱(例如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸、乙酸、盐酸、氢氧 化钠溶液、碳酸铵、氨丁三醇、三乙醇胺),
[0350]
·
等渗剂(例如葡萄糖、氯化钠),
[0351]
·
吸附剂(例如高度分散二氧化硅(silicas)),
[0352]
·
粘度-增强剂、凝胶形成剂、增稠剂和/或结合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、 甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧基甲基纤维素-钠、淀 粉、卡波姆、聚丙烯酸(例如，)；藻酸盐、明胶),
[0353]
·
崩解剂(例如改性淀粉、羧基甲基纤维素-钠、羟乙酸淀粉钠(例如， )、
交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素-钠(例如，)),
[0354]
·
流动调节剂、润滑剂、助流剂和脱模剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑 石、高度分散二氧化硅(例如，)),
[0355]
·
包衣材料(例如糖、虫胶)和用于膜或快速或以改性方式溶解的扩散膜 的成膜剂(例如聚乙烯吡咯烷酮(例如，)、聚乙烯醇、羟丙基甲基 纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、乙 酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、例如， )),
[0356]
·
胶囊材料(例如明胶、羟丙基甲基纤维素),
[0357]
·
合成聚合物(例如聚交酯、聚乙交酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(例 如，)、聚乙烯吡咯烷酮(例如，)、聚乙烯醇、聚乙酸乙 烯酯、聚氧化乙烯、聚乙二醇和它们的共聚物和嵌段共聚物),
[0358]
·
增塑剂(例如聚乙二醇、丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙 酰基酯、二丁基邻苯二甲酸酯),
[0359]
·
渗透增强剂、
[0360]
·
稳定剂(例如抗氧化剂例如，抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血 酸钠、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯),
[0361]
·
防腐剂(例如对羟苯甲酸酯、山梨酸、硫柳汞、苯扎氯铵、乙酸氯己 定、苯甲酸钠),
[0362]
·
着色剂(例如无机颜料例如，氧化铁、二氧化钛),
[0363]
·
香料、增甜剂、增香剂-和/或气味-掩蔽剂。
[0364]
本发明进一步涉及药物组合物，其包含至少一种化合物1-6，尤其是化 合物6，和与一种或多种药物合适的赋形剂，且涉及它们根据本发明的用途。
[0365]
组合
[0366]
根据另一方面，本发明涵盖药物组合，特别是药物，其包含化合物1-6 至少之一，尤其是化合物6和至少一种或多种其它活性成分，尤其用于治疗 和/或预防高增生性疾病，尤其是癌症。
[0367]
特别地，本发明涉及一种药物组合，其包含：
[0368]
·
一种或多种第一活性成分，特别是化合物1-6中的一种，尤其是化合物 6，如上文所定义，和
[0369]
·
一种或多种其他活性成分，特别是过度增殖性疾病，尤其是癌症
[0370]
本发明中的术语“组合”如本领域技术人员已知使用，所述组合可以是 固定组合、非固定组合或部件套件。
[0371]
在本发明中，如同本领域技术人员已知那般使用“固定组合”，并且定 义为这样的组合，其中例如第一活性成分例如化合物1-6中的一种或多种， 和其它活性成分共同存在于一个单位剂量中或者单个实体中。“固定组合
”ꢀ
的一个实例是药物组合物，其中第一活性成分和其它活性成分存在于同时施 用的混合物中，例如制剂中。“固定组合”的另一个实例是药物组合，其中 第一活性成分和其它活性成分存在于一个单位中，而不是在混合物中。
[0372]
在本发明中，如同本领域技术人员已知那般使用非固定组合或者“部件 套件”，并且定义为这样的组合，其中第一活性成分和其它活性成分存在于 多于一个单位中。非固定组合或者部件套件的一个实例是这样的组合，其中 第一活性成分和其它活性成分分开存在。非固定组合或者部件套件的组分可 以分开、相继、同时、并行或者按时间顺序错开施用。
[0373]
本发明化合物可以作为唯一的药剂给药或与一种或多种其它药物活性 成分组合给药，其中该组合不会引起不可接受的副作用。本发明还涵盖这些 药物组合。例如，本发明化合物可与已知的抗癌剂和改善这些抗癌剂可能具 有的潜在副作用的药剂组合。
[0374]
这些药剂的实例包括:
[0375]
131i-chtnt、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、阿达木单抗、曲妥珠单 抗抗体-药物偶联物(ado-trastuzumab emtansine)、阿法替尼、阿柏西普、阿地 白介素、艾乐替尼、阿仑珠单抗、阿仑膦酸、阿利维a酸、六甲蜜胺、氨磷 汀、氨鲁米特、氨基酮戊酸己酯、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、安西司亭、 茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮(anethole dithiolethione)、anetumab ravtansine、血 管紧张素ii、抗凝血酶iii、阿瑞匹坦、阿西莫单抗、arglabin、三氧化二砷、 天冬酰胺酶、阿特珠单抗、阿西替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、 苯达莫司汀、贝索单抗、贝利司他、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比 生群、博来霉素、博纳吐单抗、硼替佐米、布舍瑞林、博舒替尼(bosutinib)、 brentuximab vedotin、白消安、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼、降钙素、 亚叶酸钙、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡罗单抗、卡马西平、卡铂、卡波醌、 卡非佐米、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来考昔、西莫白介素、色瑞 替尼、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、西多福韦、西那卡塞、 顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、氯法拉滨、考比替尼、库潘尼西(copanlisib)、 crisantaspase、克里唑蒂尼、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放 线菌素d、达雷木单抗、达贝泊汀α、达拉菲尼、达沙替尼、柔红霉素、地 西他滨、地加瑞克、denileukin diftitox、地舒单抗、地普奥肽、地洛瑞林、 二去水卫矛醇、右雷佐生、二溴螺氯铵、二去水卫矛醇、双氯芬酸、地努图 希单抗、多西他赛、多拉司琼、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星 雌酮、 屈大麻酚、依库珠单抗、依决洛单抗、依利醋铵、埃罗妥珠单抗、艾曲波帕、 内皮抑素、依诺他滨、恩杂鲁胺、表柔比星、环硫雄醇、阿法依伯汀、倍他 依泊汀、泽塔依泊汀、依他铂、eribulin、厄洛替尼、埃索美拉唑、雌二醇、 雌莫司汀、乙炔雌二醇、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、芬太尼、 非格司亭、氟甲睾酮、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、亚叶酸、福 美坦、福沙吡坦、福莫司汀、氟维司群、钆布醇、钆特醇、钆特酸葡甲胺、 钆弗塞胺、钆塞酸、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗、 羧肽酶、glutoxim、gm-csf、戈舍瑞林、格拉司琼、粒细胞集落刺激因子、 二盐酸组胺、组氨瑞林、羟基脲、i-125种子、兰索拉唑、伊班膦酸、替伊 莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫德、英丙舒 凡、吡地司琼、英卡膦酸、巨大戟醇甲基丁烯酸酯、α干扰素、β干扰素、 γ干扰素、碘比醇、碘苄胍(123i)、碘美普尔、伊匹木单抗、伊立替康、伊 曲康唑、伊沙匹隆、伊沙佐米、兰瑞肽、兰索拉唑、拉帕替尼、lasocholine、 来那度胺、乐伐替尼、来格司亭、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、 左炔诺孕酮、左甲状腺素钠、麦角乙脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索 罗酚、甲羟孕酮、甲地孕酮、美拉胂醇、美法仑、美雄烷、巯嘌呤、美司钠、 美沙酮、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基酮戊酸甲酯、甲基泼尼松龙、甲睾酮、 甲酪氨酸、米伐木肽、米替福新、miriplatin、二溴甘露醇、米托胍腙、二
溴 卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、mogamulizumab、莫拉司亭、莫派 达醇、盐酸吗啡、硫酸吗啡、大麻隆、nabiximols、那法瑞林、纳洛酮 喷 他佐辛、纳曲酮、那托司亭、耐昔妥珠单抗、奈达铂、奈拉滨、奈立膦酸、 奈妥吡坦/帕洛诺司琼、nivolumab、喷曲肽(pentetreotide)、尼洛替尼、尼鲁 米特、尼莫拉唑、尼妥珠单抗、尼莫司汀、尼达尼布、二胺硝吖啶、nivolumab、 obinutuzumab、奥曲肽、奥法木单抗、奥拉帕尼、olaratumab、高三尖杉酯碱 (omacetaxine mepesuccinate)、奥美拉唑、昂丹司琼、奥普瑞白介素、奥古蛋 白(orgotein)、orilotimod、奥希替尼、奥沙利铂、羟考酮、羟甲烯龙、 ozogamicine、p53基因疗法、紫杉醇、帕布昔利布、帕利夫明、钯-103种子、 帕洛诺司琼、帕米膦酸、帕尼单抗、帕比司他、泮托拉唑、帕唑帕尼、培门 冬酶、peg-倍他依泊汀(甲氧基peg-倍他依泊汀)、pembrolizumab、培非司 亭、peg干扰素α-2b、派姆单抗、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛 霉素、全氟正丁烷、培磷酰胺、帕妥珠单抗、溶血性链球菌制剂、匹鲁卡品、 吡柔比星、匹克生琼、普乐沙福、普卡霉素、聚氨葡糖、聚磷酸雌二醇、聚 乙烯吡咯烷酮 透明质酸钠、多糖-k、泊马度胺、帕纳替尼、卟吩姆钠、 普拉曲沙、泼尼莫司汀、强的松、丙卡巴肼、丙考达唑、普萘洛尔、喹高利 特、雷贝拉唑、racotumomab、氯化镭-223、雷多替尼、雷洛昔芬、雷替曲 塞、雷莫司琼、雷莫芦单抗、雷莫司汀、拉布立酶、雷佐生、refametinib、 瑞格非尼(regorafenib)、利塞膦酸、铼-186依替膦酸、利妥昔单抗、罗拉吡 坦、罗米地新、romiplostim、罗莫肽、roniciclib、钐(153sm)lexidronam、沙 格司亭、沙妥莫单抗、促胰液素、司妥昔单抗、西普鲁塞t、西佐喃、索布 佐生、甘氨双唑钠(sodium glycididazole)、索尼吉布、索拉非尼、司坦唑醇、 链佐星、舒尼替尼、他拉泊芬、talimogene laherparepvec、他米巴罗汀、他莫 昔芬、他喷他多、他索纳明、替西白介素、technetium(99mtc)nofetumomabmerpentan、99mtc-hynic-[tyr3]-奥曲肽、替加氟、替加氟 吉美嘧啶 奥替 拉西、替莫泊芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度 胺、塞替派、胸腺法新、促甲状腺素α、硫鸟嘌呤、托珠单抗、托泊替康、 托瑞米芬、托西莫单抗、曲贝替定、曲美替尼、曲马多、曲妥珠单抗、曲妥 珠单抗-emtansine缀合物、曲奥舒凡、维甲酸、三氟尿苷 tipiracil、曲洛司 坦、曲普瑞林、曲美替尼、曲磷胺、促血小板生成素、色氨酸、乌苯美司、 瓦他拉尼、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、vemurafenib、长春碱、长春新碱、 长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、维莫德吉、伏林司他、伏氯唑、钇-90玻 璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星。
[0376]
实用性
[0377]
化合物6为pde3a抑制剂，因此根据用磷酸二酯酶抑制剂靶向癌症可 能为有前途的方法的事实，化合物6可用于治疗癌症。
[0378]
本发明另一方面为化合物6，其用于治疗高增生性疾病。
[0379]
本发明另一方面为化合物6，其用于治疗高增生性疾病，其为造血高增 生性疾病，包括真性红细胞增多症，特发性血小板增多症，原发性骨髓纤维 化，等等。
[0380]
另一方面为预防和/或治疗高增生疾病的方法，包括施用有效量的包括化 合物6在内的一种或多种化合物，尤其是治疗高增生性疾病的方法。
[0381]
化合物6也适合预防和/或治疗良性高增生性疾病，例如子宫内膜异位， 平滑肌瘤和良性前列腺增生。
[0382]
因此在另一方面该高增生性疾病为良性高增生性疾病。
[0383]
本发明另一方面为化合物6，其用于治疗癌症。其特别用于治疗转移性 或恶性肿瘤。
[0384]
因此本发明另一方面为治疗癌症的方法，包括施用有效量的至少一种化 合物6。
[0385]
本发明另一方面为治疗转移性或恶性肿瘤的方法，包括施用有效量的化 合物6。
[0386]
本发明另一方面化合物6治疗实体瘤的用途。
[0387]
本发明另一方面为化合物6，其用于治疗实体瘤。
[0388]
本发明另一方面为治疗实体瘤的方法，包括施用有效量的化合物6。
[0389]
本发明另一方面为化合物6治疗实体瘤的用途，实体瘤包括乳腺、呼吸 道、脑、骨、中枢和外周神经系统、结肠、直肠、肛门、生殖器官(例如， 子宫颈、卵巢、前列腺)、胃肠道(包括胃肠间质肿瘤)、泌尿生殖道、内分泌 腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、甲状腺、甲状旁腺、食道、子宫内膜、眼、 生殖细胞、头部和颈部、肾、肝、喉和下咽、肺、间皮瘤、胰腺、前列腺、 直肠、肾、小肠、皮肤、软组织、胃、睾丸、输尿管、阴道和外阴和结缔组 织的肿瘤，以及这些肿瘤的转移。恶性瘤形成包括遗传性癌症，例如视网膜 母细胞瘤和维尔姆斯肿瘤。
[0390]
本发明另一方面为治疗上述肿瘤的方法，包括施用有效量的化合物6。
[0391]
本发明另一方面为化合物6治疗血液肿瘤的用途。
[0392]
本发明另一方面为化合物6，其用于治疗血液肿瘤。
[0393]
本发明另一方面为治疗血液肿瘤的方法，包括施用有效量的化合物6。
[0394]
本发明另一方面为化合物6治疗癌症的用途，其中癌症类型为骨、乳腺、 子宫颈、结肠、子宫内膜、胃肠道间质瘤(gist)、头颈部(尤其是头、更具 体是神经胶质瘤、胶质母细胞瘤)、造血细胞、肾、平滑肌肉瘤、肝、肺、 淋巴、黑素瘤、卵巢、胰腺、前列腺、软组织肉瘤、甲状腺癌、泌尿道的癌 症。
[0395]
本发明另一方面为化合物6治疗黑素瘤、腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子 宫内膜癌、胶质母细胞瘤、造血细胞/淋巴癌、肾癌、平滑肌肉瘤、肝癌、 肺癌、卵巢癌、胰腺癌、软组织肉瘤、甲状腺癌或泌尿道癌症的用途。
[0396]
本发明另一方面化合物6治疗癌症的用途，其中所述癌症类型为黑素瘤， 子宫内膜癌、肺癌、造血细胞癌、淋巴癌、卵巢癌、子宫颈癌、软组织肉瘤、 平滑肌肉瘤、泌尿道癌、胰腺癌、甲状腺癌。
[0397]
本发明另一方面化合物6治疗皮肤癌(尤其是黑素瘤)、肺癌(尤其是肺 腺癌)和子宫颈癌的用途。
[0398]
本发明另一方面化合物6治疗骨、中枢神经系统(尤其是多形性胶质母 细胞瘤和神经胶质瘤)、结肠、造血和淋巴样组织(尤其是红白血病和t-细胞 淋巴瘤)、肝、肺(尤其是肺腺癌和小细胞肺癌(sclc))、卵巢、皮肤(尤其 是黑素瘤)的癌症的用途。
[0399]
诊断学
[0400]
本发明的一个特征为用于表征癌症的诊断测定法。在一个实施方案中， 在受试者样品中测量pde3a、schlafen 12(slfn12)或creb3l1多核苷酸或 多肽的水平，并用作对pde3a调节剂治疗有反应的癌症指标。在另一个实 施方案中，在受试者的生物样品中测量creb3l1多核苷酸或多肽的水平。 相对于参照，受试者的生物样品(例如，包含癌细胞的生物样品)中creb3l1 或slfn12多核苷酸或多肽表达水平的丧失或降低表明该癌症对用pde3a 调节剂治疗具有抗性。pde3a、schlafen 12和/或creb3l1多核苷酸的水平 可以通过
标准方法测量，例如定量pcr、rna测序、northern印迹、微阵 列、质谱和原位杂交。标准方法可用于测量源自肿瘤的生物样品中pde3a， schlafen 12和/或creb3l1多肽的水平。这些方法包括免疫测定、elisa、 使用结合pde3a、schlafen 12和/或creb3l1的抗体的western印迹，以及 放射免疫测定。相对于参照，升高水平的pde3a和schlafen 12多核苷酸或 多肽被认为是对用pde3a调节剂治疗有反应的癌症的阳性指标。降低的 creb3l1或slfn12多核苷酸或多肽的水平被认为是对用pde3a调节剂治 疗具有抗性的癌症的指标。
[0401]
生物样品的类型
[0402]
在表征受试者中恶性肿瘤对pde3a调节剂治疗的反应性时，在不同类 型的生物样品中测量pde3a、slfn12和/或creb3l1表达的水平。在一个 实施方案中，生物样品是肿瘤样品。
[0403]
pde3a和/或slfn12在从对pde3a调节剂治疗有反应的受试者获得的 样品中的表达高于在非反应性受试者中的表达水平。在另一个实施方案中， pde3a和/或slfn12在患有恶性肿瘤的受试者中为在健康对照中的至少约 5倍、10倍、20倍或30倍。使用本领域已知的任何方法确定倍数变化值。 在一个实施方案中，相对于参照，creb3l1或slfn12表达降低或不可检 测。在特定实施方案中，creb3l1或slfn12表达降低约10％、25％、50 ％、75％、85％、95％或更多。在一个实施方案中，通过计算癌细胞中pde3a、 slfn12和/或creb3l1的表达与非响应性癌细胞中存在的水平或相应的健 康对照细胞中存在的水平的差异来确定变化。
[0404]
治疗方法的选择
[0405]
如下文所报道的，可以在选择治疗方法的过程中测试患有过度增殖性疾 病的受试者的pde3a、slfn12和/或creb3l1表达。表征为相对于参照水 平具有增加的pde3a和/或slfn12的患者被鉴定为对pde3a调节剂治疗 有响应。相对于参照具有降低的或不可检测的slfn12或creb3l1表达水 平的受试者被鉴定为对pde3a调节剂治疗具有抗性。
[0406]
试剂盒
[0407]
本发明提供了用于表征受试者对pde3a调节剂治疗的反应性或抗性的 试剂盒。
[0408]
本文还提供了试剂盒，其可包括例如在单位剂型中含有有效量的pde3a 调节剂的治疗组合物。
[0409]
在一个实施方案中，本发明的诊断试剂盒提供用于测量pde3a和 slfn12的相对表达的试剂。此类试剂包括捕获分子(例如，识别pde3a 和slfn12多肽的抗体或与pde3a和slfn12多核苷酸杂交的核酸探针)。
[0410]
在另一个实施方案中，诊断试剂盒包括结合creb3l1多肽或多核苷酸 的捕获试剂(例如，抗体或核酸探针)。
[0411]
在一些实施方案中，试剂盒包含无菌容器，其包含治疗或诊断组合物； 这种容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已 知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或 适于容纳药物的其他材料制成。
[0412]
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于测量pde3a、slfn12和/或creb3l1水平的试剂。如果需要，该试剂盒还包括用于测量pde3a和/ 或slfn12的说明书和/或用于将pde3a调节剂给予患有恶性肿瘤的受试者 的说明书，例如选择的对pde3a调节剂治疗有反应的恶性肿瘤。在特定实 施方案中，说明书包括以下中的至少一种：治疗剂的描述；剂量方
案和用于 治疗或预防恶性肿瘤或其症状的给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症； 超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。说明书可以直接 印在容器上(当存在时)，或作为施加于容器的标签，或作为在容器中或与 容器一起提供的单独的薄片、小册子、卡片或文件夹。
[0413]
除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生 物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在本领域 技术人员的知识范围内。这些技术在文献中有充分的解释，例如“molecularcloning:a laboratory manual”,第二版(sambrook,1989)；“oligonucleotidesynthesis”(gait,1984)；“animal cell culture”(freshney,1987)；“methods inenzymology”“handbook ofexperimental immunology”(weir,1996)；“genetransfer vectors for mammalian cells”(miller和calos,1987)；“currentprotocols in molecular biology”(ausubel,1987)；“pcr:the polymerasechain reaction”,(mullis,1994)；“current protocols in immunology”(coligan, 1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，因此，可以在制 备和实施本发明时考虑这些技术。用于特定实施例的特别有用的技术将在以 下部分中讨论。
[0414]
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明 的测定、筛选和治疗方法的完整公开和描述，并且不旨在限制本发明的范围。
实施例
[0415]
实施例1.细胞-选择性细胞毒性小分子的鉴定
[0416]
为了鉴定具有细胞选择性细胞毒性活性的抗癌化合物，在两种肺腺癌细 胞系a549和nci-h1734中进行了无偏差的化学筛选，两种肺腺癌细胞系均 带有致癌kras突变体和截短stk11突变体，并且分别是tp53野生型和突 变体(r273l)。在a549和nci-h1734细胞系中以单一10μm浓度以384孔 形式一式两份地筛选了molecular libraries small-molecule repository验证组 中的1,924个化合物。在化合物处理48小时后测量atp含量作为细胞活力 的代表(proxy)。
[0417]
与a549细胞系相比，三个化合物对于nci-h1734细胞系显示出细胞活 力的选择性降低，在nci-h1734细胞系中减少约50％，与a549细胞系中从 中位数的中位数绝对偏差《1的微小变化相比，其从中位数向负方向上的中 位数绝对偏差》4(图1a)。在剂量-应答分析中重新测试了三个化合物，证实 一个化合物(6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮或 者dnmdp)对于nci-h1734细胞系具有特异性毒性(图2)。
[0418]
用dnmdp测试其他细胞系显示出明显的细胞选择性细胞毒性，对于另 外两种肺腺癌细胞系nci-h1563和nci-h2122以及hela宫颈癌细胞，其 ec
50
在10至100nm之间，但是对于a549、mcf7和pc3细胞，其ec
50
大于1μm(图1b；图1c)。因此本发明的一个方面为dnmdp治疗肺腺癌和 子宫颈癌的用途。在经dnmdp处理的hela细胞中，通过半胱天冬酶敏感 的萤光素酶测定和通过聚adp核糖聚合酶(parp)裂解来测定半胱天冬酶活 性，从而表明敏感细胞在dnmdp暴露后经历凋亡(图17a-17b)。
[0419]
为了进一步表征对dnmdp的细胞敏感性，以2倍稀释步骤以66.4μm 至2nm的浓度筛选766个基因组表征的癌细胞系的dnmdp敏感性，历时 72小时(参见如下进一步描述的大规模细胞系活力测量)。从这些细胞系中， 22个细胞系被归类为具有低于-4的稳健z评分的敏
感性，其代表包括多种 黑色素瘤细胞系在内的多种谱系(表1)。
[0420]
接下来，通过手性超临界流体(scf)色谱分离dnmdp对映异构体。一 种对映异构体在hela细胞中的有效性比另一种对映异构体高500倍(图1c 和d)。(r)-对映异构体由可商购的起始原料合成(图3)。该合成的对映体具 有与更有效的分离物质相似的活性，并且通过手性scf色谱鉴定是相同的， 从而证实了活性对映体的立体化学(图4a-4c)。合成了dnmdp的两个(r)
‑ꢀ
去-硝基类似物，两者都与(r)-dnmdp类似地进行测试(图3)。图4a-4c显 示了6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(dnmdp) 的超临界流体(scf)色谱(顶部至底部：es 、二极管阵列、es-迹线)。图4a 显示峰1(cro分离)；图4b显示峰2(cro分离)；和图4c显示合成的 (r)-dnmdp(通过uv测定，峰1:2的比率为5:95)。
[0421]
表1：用dnmdp治疗的766种癌细胞系的敏感性数据
[0422]
[0423]
[0424]
[0425]
[0426]
[0427]
[0428]
[0429]
[0430]
[0431]
[0432]
[0433]
[0434]
[0435]
[0436]
[0437]
[0438][0439]
[0440]
实施例1b
[0441]
细胞增殖测量
[0442]
在人癌细胞中体外检测了通式(i)化合物的抗增殖活性。为此目的， 将1000个细胞接种在具有适当生长培养基的384孔板中，并在37℃下孵育 过夜。24小时后，用30μl/腔的ctg溶液(promega cell titer glo(目录号 g755b和g756b))处理一个板(0小时板)上的细胞，并在室温下孵育10 分钟，并通过victor v(perkin elmer)测量发光，以确定治疗开始时的细胞 活力。将测试板上的细胞用通式(i)的化合物处理，并在37℃下孵育72小 时。通过hp d300数字分配器以10步2.5倍稀释系列将化合物加入细胞中。 作为对照，用载体(dmso，终浓度0.3％)处理细胞。72小时后，用30μ l/腔的ctg溶液(promega cell titer glo(目录号g755b和g756b))处理 细胞，并在室温下孵育10分钟，并通过victor v(perkin elmer)测量发 光，以确定治疗结束时的细胞活力。使用来自0小时平板(＝最大抑制)和 dmso对照(＝最小抑制)的值测定每种测试物质对细胞生长的影响百分比 和由此得到的ic
50
。使用4-参数拟合计算ic
50
值。
[0443]
对于化合物6，获得以下ic
50
：
[0444]
表1a细胞增殖结果
[0445]
细胞系适应症ic50[m]a549肺腺癌》6,00e-7(无活性)skmel3黑素瘤4,41e-10hela子宫颈癌3,27e-10
[0446]
因此本发明另一方面为化合物6治疗皮肤癌(尤其是黑素瘤)和子宫颈 癌的用途。
[0447]
实施例2.预测性化学基因组学的应用和pde3a作为dnmdp的推定 靶标的鉴定
[0448]
鉴于6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮 (dnmdp)的有效的细胞选择性生长抑制，对其作用机制进行了更详细的研 究。为了确定dnmdp的分子靶标，对先前表征了突变、拷贝数和基因表达 特征作为癌细胞系百科全书(ccle，barretina等人，2012)的一部分的766 个测试细胞系进行了化学基因组分析，以寻找这些基因组特征与dnmdp敏 感性之间的相关性。针对dnmdp敏感性与整个细胞系集合中各个基因的表 达之间的皮尔森相关性的分析显示出与编码磷酸二酯酶3a的pde3a基因 的表达强烈相关(图5a)。dnmdp敏感性与pde3a表达之间的相关性并不 完美(图18)，可能一些误差是由于细胞系敏感性表征的高通量性质引入的， 因为对所有766个细胞系进行手动验证在实践中是不可行的。相反，突变和 拷贝数特征与dnmdp敏感性不相关。相反，在测试的480个化合物中， dnmdp敏感性与pde3a表达最密切相关(图5b)，表明具有高pde3a表达 的癌细胞系对dnmdp比对任何其他测试化合物更明显敏感。与初始筛选的 动机相反，tp53突变或其他p53功能测量与dnmdp敏感性之间没有相关 性。
[0449]
鉴于这些结果以及dnmdp与已知pde3抑制剂(例如左西孟旦和氰胍 佐旦(图6a-6c))的明显结构相似性，进行了dnmdp针对代表11个pde超 级家族的19种磷酸二酯酶的生化分析。在浓度为100nm时，dnmdp特异 性抑制pde3a和pde3b，弱抑制pde10，并且对其他磷酸二酯酶几乎没有 或没有可检测的作用(表2)。
[0450]
由于pde3a表达与dnmdp敏感性之间的细胞相关性、dnmdp对 pde3a和pde3b的体外抑制以及dnmdp与已知pde3抑制剂的结构相似 性，分析了是否所有pde3抑制剂会表现出与
dnmdp相似的细胞毒性性质。 令人惊讶的是，在一系列测试化合物中，在体外酶促pde3a抑制的ic
50
和 hela细胞的细胞毒性之间几乎没有相关性(图5c和图7a和7b)。实际上， 以任何可检测的方式，有效的pde3抑制剂曲喹辛(pde3 ic
50
＝0.25nm, ruppert等人,life sci.31,2037
–
2043,1982)不影响hela细胞活力。尽管它们 对hela细胞活力具有不同作用，但是非细胞毒性pde3抑制剂曲喹辛和强 效细胞毒性化合物dnmdp对福斯高林处理的hela细胞中的细胞内camp 水平具有相似的作用(图8a和8b)。该结果表明，抑制pde3a的camp和 cgmp水解功能对于dnmdp的细胞毒性活性是不充分的。
[0451]
表2：磷酸二酯酶抑制反应的结果
[0452][0453][0454]
实施例3.pde3a的靶标验证
[0455]
在磷酸二酯酶3a(pde3a)抑制和细胞杀伤之间具有复杂关系，其中 6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(dnmdp)和一 些pde3抑制剂杀死hela和其他dnmdp敏感细胞，而其它pde3抑制剂 不影响细胞活力，这表明几种可能的解释，
包括：1)细胞毒活性可能不依赖 于pde3并且是由于作用于不同的蛋白，尽管通过筛选234种激酶蛋白没有 发现10μm dnmdp抑制的激酶；2)细胞毒性和非细胞毒性的pde3抑制剂 可以结合蛋白内的不同位点并发挥不同的活性；或3)细胞毒性和非细胞毒性 pde3抑制剂可以结合pde3活性位点，但对蛋白的构象和活性具有不同的 作用。第三种可能性可能是意料不到的，但pde4变构调节剂已显示结合 pde4活性位点并与上游(ucr2)和下游(cr3)调节结构域相互作用，从而稳 定特定的非活性构象(burgin等人，nat biotechnol 28，63-70,2010)。最重要 的是，在体外对camp水解具有相似ic
50
的pde4竞争性抑制剂和pde4变 构调节剂在动物研究中具有不同的细胞活性和安全性特征(burgin等人，natbiotechnol 28,63-70,2010)。为了评估pde抑制剂或其他小分子是否与 dnmdp竞争，筛选了1600个生物活性化合物的pharmakon 1600集合 (pharmakon 1600是来自美国和国际药典的1600个已知药物的独特集合) 以鉴定能够拯救由dnmdp诱导的细胞死亡的化合物。用30nm dnmdp (ec
70
浓度)和20μm每个生物活性化合物共同处理hela细胞。如前所述通 过atp消耗评估48小时处理后的细胞活力。拯救由dnmdp诱导的细胞死 亡的五个最有效的化合物都是pde抑制剂，并且三个最有效的化合物左西 孟旦、米力农和西洛他唑都是选择性pde3抑制剂(图9a)。
[0456]
在后续实验中，证实西洛酰胺、左西孟旦、米力农和几种其他非细胞毒 性选择性pde3抑制剂能够以剂量依赖性方式拯救dnmdp细胞毒性(图 9b)。最有效的dnmdp竞争者是曲喹辛，具有《1nm的“rc
50”(达到50％拯 救的浓度)；相反，pde5抑制剂如西地那非和伐地那非以及泛pde抑制剂 idubulast和双嘧达莫在该测定中直至10μm浓度也不是有效竞争物(图9b)。 这表明非细胞毒性pde3抑制剂和dnmdp竞争结合至介导细胞毒性表型的 相同分子靶标。
[0457]
为了鉴定dnmdp的分子靶标，使用与hela细胞裂解物一起孵育的(r)
‑ꢀ
去-硝基-dnmdp的固相固定连接基类似物(图10a)进行亲和纯化。该连接基 类似物具有与上述非细胞毒性pde3抑制剂相同的dnmdp细胞毒性拯救表 型(图10b)，表明它也与相同的分子靶标结合。通过添加过量的曲喹辛或单 独的dnmdp对映体(其中只有(r)-对映体具有细胞毒性)，从而竞争分子靶 标。亲和纯化材料的pde3a的免疫印迹显示pde3a确实结合连接基类似物。 pde3a与连接基类似物的结合被曲喹辛和(r)-dnmdp阻断，而不被非细胞 毒性对映异构体(s)-dnmdp阻断(图9c)。因此，曲喹辛和(r)-dnmdp都阻 止pde3a与固定的dnmdp类似物的结合，并且推断两个分子都直接结合 pde3a。
[0458]
基于dnmdp敏感细胞表达高水平pde3a并且dnmdp与非细胞毒性 抑制剂竞争pde3a结合的观察结果，假设dnmdp通过与pde3a的相互 作用介导其细胞毒性表型，并且pde3a丰度是dnmdp敏感性的直接细胞 决定因素。为验证这一假设，测试了降低pde3a水平对dnmdp应答的影 响。用靶向pde3a基因座中三个不同位点的三个向导rna(sgrna)靶向成 簇的规则间隔的短回文(crispr)相关的cas9酶导致pde3a表达的完全丧 失(cong等人，science 339,819-823，2013)，sgrna2和sgrna3几乎完全 降低pde3a蛋白水平，而sgrna1对pde3a表达具有中等影响(图11a)。 重要的是，sgrna2和sgrna3均导致对有活性的细胞毒性dnmdp类似物 3导致的毒性的显著拯救(图11a和11b和图5a-5c)。sgrna2和sgrna3 均导致对dnmdp毒性的显著拯救(图11c)。未观察到由于pde3a表达降低 导致的hela细胞中增殖速率或形态的变化，表明pde3a不是细胞存活所 需的。在使用含有靶向pde3a的四种不同sirna的sirna智能池(sirnasmart-pool)的独立方法中，在hela细胞系中pde3a表达在转染后24至
72 小时之间较低，最大有效性为70％。与对照sirna条件相比，用sipde3a 处理的hela细胞对dnmdp类似物具有更高的ec
50
(图12a和12b)。不受 理论束缚，得出结论：dnmdp细胞毒性需要pde3a，并且dnmdp可能 调节pde3a的功能。
[0459]
实施例4.dnmdp的作用机制的确定
[0460]
6-(4-(二乙基氨基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(dnmdp) 细胞毒性对磷酸二酯酶3a(pde3a)蛋白丰度的依赖性表明了其机制可能类 似于最近针对来那度胺观察到的机制，其通过稳定cereblon与ikaros家族 锌指1(ikzf1)和ikzf3之间的相互作用通过新形态或超形态机制起作用 (等人，science 343,301-305,2014；lu等人，science 343,305-309, 2014)。另外，已显示pde4变构调节剂(而不是竞争性抑制剂)结合和稳定已 独立显示独特地结合pde4-配偶体蛋白disc1的“封闭”蛋白构象(millar等 人，science 310,1187-1191,2005)。在正常条件下表征了pde3a残基所在的 蛋白复合物，并且研究了当pde3a与dnmdp或非细胞毒性pde3抑制剂 曲喹辛结合时这些复合物如何改变。在dnmdp和曲喹辛存在下，将来自 hela细胞的pde3a和相互作用蛋白免疫沉淀，随后用等量稳定同位素标记 物标记相对丰度并通过质谱定量(itraq/ms，图13a)。来自hela细胞的 pde3a免疫沉淀物富含多种蛋白磷酸酶亚基，包括蛋白磷酸酶2亚基 (ppp2ca、ppp2r1a、ppp2r1b、ppp2r2a、ppp2r2d)、钙神经素(ppp3r1、ppp3ca，beca等人，circ.res.112,289-297,2013)、14-3-3(ywhab、 ywhaq、ywhag、ywhaz，pozuelo rubio等人，biochem.j.392,163-172, 2005)和微管蛋白(tuba1c、tuba1b)家族成员(图13b和图14a)。此外， 发现pde3a和pde3b存在于先前已报道的相同蛋白复合物中(malovannaya 等人，cell 145,787-799,2011)。
[0461]
dnmdp的结合改变了与pde3a共免疫沉淀的相互作用蛋白的组成。 在用dnmdp处理后在pde3a免疫沉淀物中特异性富集的蛋白包括sirtuin 7(sirt7)和schlafen 12(slfn12)(图13c和图14b)。这些蛋白在dnmdp 存在下特异性地与pde3a相互作用，但是在曲喹辛处理的对照中未观察到， 而已知的pde3b相互作用物(含有水解酶结构域的蛋白15(abhd15，chavez 等人，biochem.biophys.res.commun.342,1218-1222,2006))在来自曲喹辛 处理的细胞的免疫沉淀物中富集(图13c和图14c)。用亲和试剂验证了由 dnmdp促进的在pde3a与sirt7和slfn12之间的相互作用。通过共免 疫沉淀证明，在用dnmdp而不是dmso或曲喹辛处理的hela细胞中，内 源性pde3a的免疫沉淀增强了异位表达的v5标记的sirt7和slfn12与 pde3a的复合物形成(图19)。dnmdp和阿那格雷(而不是曲喹辛)诱导 pde3a和sfln12复合物形成(图20)，阿那格雷较弱。不受理论束缚， pde3a/slfn12复合物形成与细胞杀伤相关(图21a-21c)。
[0462]
与pde3a类似，slfn12的过表达似乎对dnmdp敏感细胞系具有细 胞毒性作用，这增加了在全细胞裂解物中检测slfn12的难度。
[0463]
pde3a与sirt7和slfn12增强的相互作用表明这些相互作用蛋白中 的一种或多种可能有助于dnmdp敏感性。在所有测试的细胞中，sirt7 mrna表达相对恒定，但slfn12和pde3amrna的共表达显示与dnmdp 敏感性强相关；几乎所有的dnmdp敏感的细胞系均表达高水平的 slfn12(图15a-15c)。重要的是，发现几乎一半表达高水平slfn12和 pde3a的敏感细胞系是黑素瘤细胞系(图15b)。单独的slfn12表达也是与 dnmdp敏感性相关的最相关基因之一，这证实了slfn12可能在功能上参 与dnmdp诱导的细胞毒性的假设(图16a)。此外，
当校正pde3a表达时， slfn12表达是与dnmdp敏感性最高相关的基因(图16b)。为了评估 slfn12是否是dmndp的细胞毒性表型所需要的，我们通过在hela细胞 中用两种shrna敲低将slfn12 mrna表达减少60％(图15d)。类似于pde3a表达的减少，slfn12表达的减少不导致细胞毒性，并且事实上对 dnmdp的敏感性降低(图15e)。这些结果显示slfn12如同pde3a一样对 于dmndp的细胞毒性表型是所需的。gtex聚生体对slfn12和pde3a 的正常表达的表征(pierson,e.等人，plos comput.biol.11,e1004220(2015)) 显示正常组织中slfn12的表达低，而很少观察到pde3a和slfn12的高 共表达(表3)。这可能表明dnmdp和相关化合物的所需(on-target)毒性可能 受到潜在限制。
[0464]
表3：多种健康组织类型中slfn12和pde3a表达的rpkm值
[0465]
[0466][0467]
图22显示在获得对dnmdp抗性的细胞中丧失slfn12和creb3l1。 最初对dnmdp敏感的细胞系通过持续暴露于dnmdp并随后通过rna-seq 分析而产生抗性。两种基因在hela和h2122中均下调：slfn 12和 creb3l1。因此，creb3l1和/或slfn 12水平的降低表明细胞已
经对 dnmdp和其他pde3a调节剂产生抗性。
[0468]
两种不同的细胞系hela和h2122通过长时间暴露对dnmdp产生抗 性，它们具有通常下调的两种基因slfn12和creb3l1的表达(图22)。 slfn12的重新表达恢复了对dnmdp的敏感性(图23a)。不受理论束缚， 恢复的敏感性依赖于pde3a，因为它被pde3a抑制剂曲喹辛所竞争掉。通 过表达slfn12或表达sfln12和pde3a将dnmdp抗性细胞系a549敏 化(图23b)。slfn12的表达足以对a549细胞赋予dnmdp敏感性。添加 pde3a表达导致进一步致敏。
[0469]
平滑肌肉瘤是恶性平滑肌瘤。分析来自平滑肌肉瘤的患者肿瘤样品的 pde3a和slfn12表达以预测平滑肌肉瘤(lms)对dnmdp的敏感性。由于 在表达升高的pde3a和slfn12水平的高纯度tcga样品中的流行(图24， 表4)，预计平滑肌肉瘤对dnmdp敏感。生物标志物表达与平滑肌肉瘤谱系 关联的p值：0.0001。
[0470]
表4.平滑肌肉瘤经预计对dnmdp敏感
[0471] 预测敏感的预测不敏感的lms1731非lms381516
[0472]
差示扫描荧光测定法(dsf)用于证明dnmdp与纯化的pde3a催化结 构域pde3a(677-1141)的结合。在该实验中，如表5中所示，将5μm hspde3a (640-1141)在不存在或存在100μm化合物的情况下孵育。结合缓冲液：20mmhepes ph 7.4、100μm tcep、1mm mgcl2、150mm nacl。
[0473]
表5.dnmdp与pde3a(677-1141)的结合
[0474][0475][0476]
使用预测性化学基因组学，发现了一类化合物，例如dnmdp，其通过 小分子调节pde3a靶向新的癌症依赖性。这些化合物以与非细胞毒性pde3 抑制剂相互排斥的方式结合pde3a，并且对pde3a的功能产生新形态或超 形态效应，导致其蛋白-蛋白相互作用的改变。一种独特的蛋白相互作用配 偶体slfn12在dnmdp敏感的细胞系中高表达，表明细胞毒性信号传递途 径中的功能性作用。因此，dnmdp在一大组癌细胞系中具有选择性和有效 性。
[0477]
在这里，鉴定出一种新的细胞毒性化合物，其对多种谱系的癌细胞系具 有很高的选择性和低nm效力。使用基因表达与预测性化学基因组学相关联， pde3a被鉴定为该小分子dnmdp的推定靶标。有趣的是，pde3a表达的 丧失导致对dnmdp的抗性。此外，pde3a免疫沉淀和随后的对相对丰度 的等量稳定同位素标记和质谱定量(itraq/ms)确定slfn12和sirt7是 dnmdp结合后pde3a的新蛋白-蛋白相互作用配偶体，这可能是由于 pde3a功能的变构调节。重要的是，当校正pde3a表达时，slfn12表达 是与dnmdp敏感性最高相关的基因。
单基因或多基因表达相关性已经显示 有助于阐明小分子的作用机制和相关信号传导途径。一种新的癌症治疗生物 化学靶标被发现，而靶标识别方法(例如功能丧失筛选或基因组分析)不太可 能找到这种靶标。
[0478]
pde3a属于磷酸二酯酶超家族，并与pde3b一起形成pde3家族。pde3 家族具有双重底物亲和力并水解camp和cgmp。pde3a在心血管系统、 血小板、肾脏和卵母细胞中的表达最高(ahmad等人，horm metab res 44, 776-785,2012)。由于血小板中的pde3a抑制会损害活化和血小板凝固 (bedenis等人，cochrane database syst rev 10,cd003748,2014)，因此已研 发临床pde3抑制剂西洛他唑以治疗间歇性跛行。其它pde3抑制剂，例如 米力农、氨力农和左西孟旦适用于治疗充血性心力衰竭，其中血管舒张和升 高的心脏camp水平的组合增加心脏收缩性(movsesian等人，curr opinpharmacol 11,707-713,2011)。这些临床抑制剂都不能重复dnmdp的细胞毒 性表型，表明环状核苷酸水解不足以在dnmdp敏感的细胞系中诱导细胞死 亡。
[0479]
然而有趣的是，其他pde3抑制剂如扎达维林、阿那格雷和喹齐酮先前 已报道在一定数量的癌细胞系中具有细胞毒性特征(sun等人，plos one 9, e90627,2014；等人，j biomol screen 11,457-468,2006)。根据目前 的发现，发现其他pde3和pde4抑制剂不重复扎达维林的细胞毒性表型， 其中据报道视网膜母细胞瘤蛋白视网膜母细胞瘤1(rb1)表达将扎达维林敏 感性细胞系与非敏感性细胞系分开(sun等人，plos one 9,e90627,2014)。 这一发现与目前的数据相反，其中在dnmdp的细胞毒活性与rb1的拷贝 数或mrna表达之间的相关性未被鉴定。另一种pde3抑制剂阿那格雷独特 地抑制巨核细胞分化，从而导致细胞凋亡。其他被测试的pde3抑制剂不具 有这种活性(wang等人，br.j.pharmacol.146,324-332,2005；espasandin,y. 等人，j.thromb.haemost.n/a-n/a,2015,doi:10.1111/jth.12850)。据推测，报 道的扎达维林对细胞活力和阿那格雷对巨核细胞分化的作用是通过本研究 中所述的相同的pde3a调节介导的。
[0480]
多种pde3抑制剂是竞争性抑制剂并且已显示其占据camp和cgmp 的催化结合位点(card等人，structure 12,2233-2247,2004；zhan等人，mol. pharmacol.62,514-520,2002)。另外，扎达维林已经与pde4d在复合物中共 结晶，其中它占据了camp结合位点，并且已经以类似的方式模拟了结合 pde3b(lee等人，febs lett.530,53-58,2002)。鉴于dnmdp与扎达维林 的结构相似性，并且dnmdp抑制pde3a和pde3b二者，推测dnmdp 的结合模式与扎达维林的结合模式非常相似。这表明除了充当camp/cgmp 竞争性抑制剂之外，dnmdp变构诱导了产生其细胞毒性表型的构象。先前 已经描述了pde4的磷酸二酯酶的变构调节，其中小分子结合在活性位点中 并且同时与跨越pde4活性位点的调节结构域相互作用。结果，变构调节剂 稳定了蛋白构象，该蛋白构象已经显示差异结合不同pde4配偶体蛋白 (burgin等人，nat biotechnol 28,63-70,2010)。
[0481]
对与pde3a相关的蛋白的研究可能阐明pde3a调节剂如dnmdp杀 死癌细胞的正常功能以及方式。pde3a与蛋白磷酸酶2亚单位相互作用， 其涉及致癌病毒转化并且在人类癌症中突变(nagao等人，int.symp.princesstakamatsu cancer res.fund 20,177
–
184,1989；imielinski等人，cell 150, 1107-1120,2012；lawrence等人，nature 499,214-218,2013)，从而表明pde3a 在癌细胞信号传导中的作用。尽管这些相互作用不是由dnmdp结合诱导 的，但蛋白磷酸酶在癌症生物学中的重要性值得进一步研究。
[0482]
通过dnmdp与pde3a结合促进的pde3a和slfn12之间的增强的 相互作用以及在对dnmdp的敏感性和slfn12表达之间的相关性强烈表明 有必要了解pde3a-slfn12相互作用的功能影响。然而，目前对slfn12 在人体生理学和癌症生物学中的功能作用知之甚少。slfn12是schlafen基 因家族的一部分，其在人类和啮齿动物之间变化很大。这种巨大的差异是由 于快速的基因进化和正选择(bustos等人，gene 447,1-11,2009)。因此， slfn12没有鼠类的蛋白直系同源性，妨碍了在充分了解的模式生物体中对 slfn12进行研究。关于slfn12的唯一出版物显示slfn12异位表达后对 前列腺癌细胞系的调节(kovalenko等人，j.surg.res.190,177-184,2014)。 对slfn12功能及其与pde3a相互作用的进一步研究可阐明dnmdp细胞 毒性的机制。两个观察结果表明，dnmdp对pde3a功能起到了新形态或 超形态的作用：1)dnmdp敏感的癌细胞系的存活不依赖于pde3a表达， 然而，pde3a敲低导致dnmdp抗性；和2)dnmdp在与pde3a结合后诱 导或增强蛋白-蛋白相互作用。来那度胺是小分子作为一个新形态或超形态 起作用而不是酶抑制剂的一个例子。来那度胺调节cereblon泛素连接酶和 ikaros转录因子之间的特异性蛋白-蛋白相互作用，然后将其靶向降解(等人，science 343,301-305,2014；lu等人，science 343,305-309,2014)。类 似地，dnmdp可以直接稳定pde3a-slfn12相互作用，或者dnmdp可 以变构稳定结合slfn12的pde3构象。这些机制都可能导致新或超形态表 型。由dnmdp诱导的新形态表型的进一步表征可以促进合成不通过pde3a 抑制环核苷酸水解的小分子。此类小分子的毒性特征应与用于心血管适应症 的pde3抑制剂不同。
[0483]
这项研究揭示了以前未知的pde3a在癌症维持中的作用，其中pde3 抑制剂的一个亚组可以修饰其功能，导致对一部分癌细胞系的毒性。这些数 据表明，dnmdp及其类似物对pde3a具有超形态或新形态的作用，从而 导致细胞毒性，这由随着细胞pde3a水平降低后细胞对dnmdp变得不敏 感所证实。这些观察结果与磷酸二酯酶变构调节的其他报道吻合(burgin等 人，nat biotechnol 28,63-70,2010)，表明dnmdp和类似物可能对pde3a 具有相似的作用。细胞选择性细胞毒性的确切机制目前尚不清楚；然而，进 一步研究与slfn12和可能的sirt7的新的相互作用可能是有益的。
[0484]
总之，本文的研究使用差异细胞毒性筛选来发现癌细胞细胞毒性小分子 dnmdp。dnmdp在766个基因组表征的癌细胞系中的性质分析揭示了在 约3％的测试细胞系中的立体特异性纳摩尔有效性。对预测敏感性的基因组 特征的搜索显示pde3a表达升高与dnmdp应答强烈相关。dnmdp抑制 pde3a和pde3b，对其他pde几乎没有或没有活性。然而，出人意料的是， 大多数其他测试的pde3a抑制剂不表型模拟dnmdp，包括有效的和选择 性的pde3a抑制剂曲喹辛。用曲喹辛共同处理dnmdp敏感细胞竞争掉 dnmdp的癌细胞细胞毒性活性，并且敲除pde3a拯救了敏感细胞免于 dnmdp诱导的细胞毒性，这导致我们推测pde3a是dnmdp杀死癌细胞 所需的，其诱导pde3a的新形态改变。单独或在dnmdp或曲喹辛存在下 pde3a免疫沉淀物的质谱分析揭示了仅在dnmdp存在下slfn12和sirt7 的差异结合。与pde3a类似，在dnmdp敏感的细胞系中slfn12表达水 平升高，并且用shrna敲低slfn12降低了细胞对dnmdp的敏感性，这 表明dnmdp诱导的pde3a与slfn12的复合物形成对于癌细胞细胞毒性 表型是关键的。因此，本文的结果暗示pde3a调节剂作为候选的癌症治疗 剂并且证明了预测性化学基因组学在小分子发现中的作用。
[0485]
上述实验用以下方法和材料进行:
[0486]
在nci-h1734和a549细胞系中的化合物库筛选
[0487]
将1500个nci-h1734或1000个a549细胞在384孔板中在40μl补充 有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的rpmi中铺板。在铺板24小时后， 以10μm的浓度添加1924个小分子的化合物库。使用浓度为10μm的星状 孢子素作为细胞毒性的阳性对照，并且使用浓度为1％的dmso作为阴性对 照。所有化合物与指定的小分子一起孵育48小时。在48小时后，从培养箱 中取出384孔板并冷却至室温20分钟。细胞活力通过以下方法评估：用 thermo combi
tm
或多通道移液管加入40μl 25％ (promega)的pbs溶液并孵育10分钟。使用perkin-elmer envision读取发光 信号。通过归一化至dmso对照计算活力百分比。
[0488]
在细胞系中的化合物敏感性测试
[0489]
将1000个hela(dmem)、1000个a549(rpmi)、500个mcf-7(dmem)、 4000个pc3(f12-k)、1000个nci-h2122(rpmi)或者1500个nci-h1563 (rpmi)细胞在384孔板中在40μl补充有10％胎牛血清的相应的生长培养基 中铺板。铺板24小时后，以指定浓度加入指定的化合物并孵育48小时。如 在nci-h1734和a549细胞系中的化合物库筛选中所述评估细胞活力。在 hela细胞活力测定中测试化合物6，并确定其ec50为1.1nm。
[0490]
在hela细胞中的半胱天冬酶活性
[0491]
将1000个hela细胞在384孔板中在40μl补充有10％胎牛血清的相 应的生长培养基中铺板。铺板24小时后，以指定浓度加入指定的化合物并 孵育48小时。根据制造商建议添加来自promega的半胱天冬酶-glo，并如 在nci-h1734和a549细胞系中的化合物库筛选中所述测定发光。
[0492]
大规模细胞系活力测量
[0493]
从23种不同的谱系中测量777种癌细胞系(ccl)对dnmdp的敏感性。 癌细胞系是癌细胞系百科全书的一部分，并通过snp阵列和体细胞dna改 变证实其身份。每个细胞系以500个细胞/孔的密度在白色不透明1536板中 在优选培养基中铺板。在孵育过夜之后，通过声传递(acoustic transfer)以2 倍连续稀释的66.4μm-2nm的16个浓度添加dnmdp，一式两份(labcyteecho 555,labcyte inc.,sunnyvale,ca)。在处理72小时后，使用viewlux微 孔板成像仪(perkinelmer，waltham，ma)根据制造商的方案测量细胞atp水 平作为活力的代表(promega corporation,madison,wi)， 并且归一化至背景(仅培养基)和媒介物(dmso)处理的对照孔。
[0494]
通过非线性拟合将浓度响应曲线拟合为覆盖所有16个浓度的2-或3-参 数s形函数，且低浓度渐近线设置为dmso标准化的值，并确定跨越化合 物敏感性范围的最佳8点剂量曲线。通过数值积分计算8点剂量曲线下面积 (auc)作为进一步分析的敏感性度量。已经获得了480个其他化合物的集合 的类似的敏感性测量结果，从而能够分析鉴定对dnmdp唯一应答的细胞系(参见broad institute cancer therapeutics response portal，该数据集用于全面 鉴定在人癌细胞系的遗传和谱系特征和全部化合物列表的小分子敏感性之 间的关系)。
[0495]
敏感度测量与基础基因表达的相关性
[0496]
从癌细胞系百科全书(ccle，一大组人类癌细胞系的详细遗传特征； barretina等人，nature 483,603-607,2012)下载了在affymetrix genechiphuman genome u133 plus 2.0阵列上测量的以基因为中心的稳健多芯片平均 (rma)-标准化的基础mrna基因表达数
据。在760个重叠ccl上计算基因 表达(18,988个转录物)和曲线下面积(auc)之间的皮尔森相关系数。为了比 较暴露于不同数量ccl的小分子，使用fisher变换来转换相关系数。
[0497]
pde3a酶抑制的方法
[0498]
可商购的3h-camp闪烁亲近测定法(spa，perkin elmer)系统用于酶抑 制研究。为了测定测试物质对pde3a反应的体外作用，将2μl在dmso中 的相应测试化合物溶液(连续稀释)置于微量滴定板(isoplate-96/200w；perkinelmer)的孔中。添加在缓冲液a(50mm tris/hcl ph 7.5，8.3mm mgcl2，1.7 mm edta，0.2％bsa)中的源自过表达人全长pde3a(sb drug discovery， uk)的sf9细胞的50μl稀释的pde3a细胞提取物。选择pde3a细胞提 取物的稀释度使得反应动力学是线性的并且消耗少于70％的底物(典型稀释 度1:5000)。通过添加缓冲液a中的50μl(0.025μci)1:2000w/o bsa稀释 的底物[8-3
h]3'，5'-环磷酸腺苷(1μci/μl；perkin elmer)开始反应。在室温下 孵育60分钟后，通过加入25μl含有18mg/ml钇闪烁邻近珠(perkin elmer) 的水悬浮液终止反应。将微量滴定板密封并在microbeta闪烁计数器 (perkinelmer wallac)中测量。通过绘制百分比pde3a活性对log化合物 浓度，从s形曲线确定ic
50
值。对于化合物6，ic
50
值分别为2.4nm(pde3a ic50)和3.4nm(pde3b ic50)。
[0499]
用于人冷冻肝细胞的方法:
[0500]
冷冻保存的人肝细胞的体外代谢稳定性研究(包括肝脏体内血液清除率(cl)和最大口服生物利用度(fmax)的计算)
[0501]
将冷冻保存的肝细胞(例如购自celsis invitrotechnologies)简单解冻， 用45ml预热的体外gro ht培养基洗涤，并以50
×
g离心5分钟。将细胞 沉淀重悬于5ml krebs-henseleit butter(khb)中。通过台盼蓝排除法测定 细胞活力。
[0502]
对于代谢稳定性测定，在玻璃小瓶中将肝细胞以1.0
×
106活细胞/ml的 密度分布在含有5％fcs的wme中。加入测试化合物至终浓度为1μm。 在温育期间，以580rpm连续摇动肝细胞悬浮液，并在2、8、16、30、45和 90分钟取出等分试样，立即加入等体积的冷甲醇。将样品在-20℃下冷冻过 夜，随后在3000rpm下离心15分钟，并用具有lcms/ms检测的agilent 1290 hplc系统分析上清液。
[0503]
从浓度-时间图确定测试化合物的半衰期。从半衰期计算出内在清除率。 与肝脏血流量、体内和体外肝细胞量的附加参数一起。计算肝脏体内血液清 除率(cl)和最大口服生物利用度(fmax)。使用下式计算肝脏体内血液清 除率(cl血液)和最大口服生物利用度(fmax)：cl'内在[ml/(min*kg)]＝kel [1/min]/((cellno/培养的体积[ml])*fu,inc)*(cellno/肝重量[g])*(具体肝 重量[g肝/kg体重])；cl血液孔-搅拌[l/(h*kg)]＝(qh[l/(h*kg)]*fu,血液* cl'内在[l/(h*kg)])/(qh[l/(h*kg)] fu,血液*cl'内在[l/(h*kg)])；fmax ＝1-cl血液/qh且使用以下参数值:肝血流量
–
1.32l/h/kg人；具体肝重 量
–
21g/kg体重；体内肝细胞-1.1x 108细胞/g肝,体外肝细胞
–
1.0x 106/ml.；fu,inc和fu,血液取1。
[0504]
相比(5r)-6-[3-氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮 (wo 2014/164704的化合物3)(平均代谢稳定性(fmax)＝49％)，(5r)-6-[3
‑ꢀ
氯-5-氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮(化合物6)显示在 人肝细胞中增加的稳定性(平均代谢稳定性(fmax)＝93％)。
[0505]
化学实验方法
[0506]
通用细节
[0507]
所有反应均在氮气(n2)气氛下进行。所有的试剂和溶剂都是从商业供应 商处购买的，并按原样使用。在bruker(300或400mhz 1
h，75或101mhz 13
c) 波谱仪上记录核磁共振(nmr)波谱。质子和碳化学位移以相对于nmr溶剂 的ppm(δ)报告。数据报道如下：化学位移，多重性(br＝宽，s＝单峰，d＝双 峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰；偶合常数(hz))。在teledyne iscocombiflash rf上使用40-60μm硅胶(目)进行快速色谱法。串联液相色谱 /质谱(lc/ms)在waters 2795分离模块和3100质谱检测器上进行，使用 waters symmetry c18柱(3.5μm，4.6x 100mm)，梯度为0-100％ch3cn的 水溶液，历时2.5分钟，含有恒定的0.1％甲酸。在em reagent 0.25mm硅胶 60-f板上进行分析薄层色谱(tlc)。元素分析由robertson microlitlaboratories，ledgewood nj进行。
[0508]
(r)-dnmdp的合成
[0509][0510]
在5ml乙酸酐中，将2.00g(9.84mmol)(r)-6-(4-氨基苯基)-5-甲基-4,5
‑ꢀ
二氢哒嗪-3(2h)-酮(a，toronto research chemicals)搅拌1小时，然后添加 30ml水，过滤，用水清洗固体且干燥以得到2.20g产物b(91％)。1h nmr (300mhz，dmso-d6)δ10.92(s，1h)，10.13(s，1h)，7.74(d，j＝8.9，2h)， 7.65(d，j＝8.8，2h)，3.41
–
3.33(m，1h)，2.68(dd，j＝6.8，16.8，1h)， 2.23(d，j＝16.7，1h)，2.08(s，3h)，1.07(d，j＝7.3，3h)。
13
c nmr(75mhz， dmso-d6)δ168.50，166.27，152.25，140.27，129.24，126.24，118.70，33.47， 26.91，24.02，15.87。hplc：r
t 0.72分钟，纯度》95％。ms：246(m 1)。
[0511]
向溶于30ml硫酸且在冰浴中冷却的3.09g b(15.3mmol)中通过加料漏 斗经10分钟添加8ml硫酸中的0.72ml 90％硝酸(15mmol)。搅拌1小时 后，将混合物倒至冰上。将黄色固体过滤掉且水用etoac清洗几次，然后干 燥且与黄色固体合并。用己烷中的40-60％etoac进行色谱法得到1.12g (25％)产物，其为黄色固体，将其从etoac重结晶。1h nmr(300mhz， dmso-d6)δ11.13(s，1h)，10.41(s，1h)，8.25(d，j＝1.8，1h)，8.07(dd， j＝1.8，8.6，1h)，7.71(d，j＝8.6，1h)，3.55
–
3.40(m，1h)，2.74(dd，j ＝6.9，16.8，1h)，2.27(d，j＝16.8，1h)，2.09(s，3h)，1.08(d，j＝7.2， 3h)。
13
c nmr(75mhz，dmso-d6)δ168.57，166.31，150.37，142.19，131.69， 131.32，130.60，125.07，121.70，33.30，26.81，23.44，15.64。tlc：rf 0.25 (1:1etoac:己烷)。hplc：r
t 0.87分钟，纯度》95％。ms：291(m 1)。 hrms精确质量(m 1)：291.1088。实测值：291.1091
[0512]
向溶于10ml meoh中的58mg c(0.20mmol)中添加48mg naoh(1.2 mmol)在0.5ml水
中的溶液。1小时后将反应浓缩，添加水且用etoac冲洗， 将etoac干燥且浓缩以得到48mg(93％)产物d。1h nmr(300mhz， dmso-d6)δ10.92(s，1h)，8.28(d，j＝2.0，1h)，7.87(dd，j＝2.1，9.0， 1h)，7.76(s，2h)，7.06(d，j＝9.0，1h)，3.33(s，1h)，2.67(dd，j＝6.8， 16.8，1h)，2.22(d，j＝16.6，1h)，1.06(d，j＝7.3，3h)。
13
c nmr(75mhz， dmso-d6)δ166.25，151.12，146.69，132.72，129.80，122.57，122.19，119.80， 33.43，26.70，15.77.ms：249(m 1)。
[0513]
向溶于0.5ml二甲基甲酰胺(dmf)中的35mg胺d(0.14mmol)添加70 mg乙醛(1.6mmol)和170mg nabh(oac)3(0.80mmol)和10μl(0.2mmol) hoac。搅拌3小时后，添加水和etoac，分离etoac，干燥，浓缩且用己 烷中的30-50％etoac色谱层析以分离3mg(r)-dnmdp(7％)。通过tlc、 hplc和1h nmr测定，合成的材料等同于购买的外消旋材料。1h nmr(300 mhz，cdcl3)δ8.58(s，1h)，8.04(d，j＝2.3，1h)，7.84(dd，j＝2.3，9.0， 1h)，7.11(d，j＝9.0，1h)，3.30-3.36(m，1h)，3.26(q，j＝7.1，4h)， 2.71(dd，j＝6.8，16.9，1h)，2.48(d，j＝17.0，1h)，1.25(d，j＝7.4，3h)， 1.16(t，j＝7.1，6h)。tlc：rf 0.25(1:1etoac:己烷)。hplc：r
t 1.27分 钟，纯度》95％。ms：305(m 1)。精确质量(m 1)：305.1608实测值： 305.1616.
13
c nmr(75mhz，cdcl3，购买的材料)δ166.28，152.02，145.24， 141.21，129.77，124.94，123.94，121.00，46.10，33.80，27.81，16.24，12.56。
[0514]
(r)-dnmdp的光学纯度使用手性scf色谱法测定且与商购的外消旋材 料比较：柱：chiralpak as-h，250x 4.6mm，5μm，流动相修饰剂：100％甲 醇，梯度：5至50％甲醇经10分钟，流速：4ml/min，反压：100bar，柱 温度：40c。uv检测为200-400nm。分离异构体的保留时间：5.36，6.64 分钟；(r)-dnmdp的保留时间，6.60分钟，检测到1:19比例的对映异构体。
[0515][0516]
2.向溶于5ml meoh中的200mg(0.98mmol)a添加87mg乙醛(2.0 mmol)、113ul hoac(2.0mmol)和124mg(2.0mmol)nabh3cn且将反应在 室温搅拌过夜。第二天添加相同量的试剂且将反应再搅拌24小时。将混合 物浓缩且在ch2cl2和水之间分配，分离ch2cl2，干燥，且浓缩，然后用己 烷中的20-40％etoac进行色谱法分离出210mg产物，其为白色固体(82％)。 1
h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.95(s，1h)，7.64(d，j＝8.7，2h)，6.66(d， j＝8.7，2h)，3.37(dd，j＝9.6，16.4，5h)，2.67(dd，j＝6.5，16.8，1h)， 2.43(d，j＝16.8，1h)，1.41
–
1.02(m，10h)。
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ 166.82，154.55，148.79，127.32，120.81，111.08，44.32，33.92，27.74，16.37， 12.50.tlc：rf 0.25(1:1etoac:己烷)。hplc：r
t 1.05分钟，纯度》95％. ms：260(m 1)。hrms精确质量(m 1)：260.1757.实测值：260.1764
[0517]
[0518]
3.向溶于1ml二甲基甲酰胺(dmf)中的200mg(0.984mmol)a添加 250μl(2.00mmol)双(2-溴乙基)醚和400mg k2co3，且将混合物在60℃ 搅拌过夜。第二天添加额外250μl双(2-溴乙基)醚和170mg k2co3。3小 时后，添加etoac和水，将水用etoac冲洗，将合并的etoac洗涤物干燥 且浓缩。用ch2cl2中的0-4％meoh进行色谱法得到125mg产物(46％)。 1
h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.61(s，1h)，7.68(d，j＝8.8，2h)，6.92(d， j＝8.8，2h)，3.99
–
3.76(m，4h)，3.44
–
3.31(m，1h)，3.29
–
3.22(m，4h)， 2.70(dd，j＝6.7，16.8，1h)，2.46(d，j＝16.7，1h)，1.24(d，j＝7.3，3h)。 13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ166.64，154.05，152.18，127.10，125.33，114.73， 66.69，48.33，33.93，27.94，16.36.tlc：r
f 0.1(1:50meoh:ch2cl2)。hplc：r
t 1.05分钟，纯度》95％.ms：274(m 1)。hrms：计算值274.1556(m 1)；实测值274.1552.分析。c
15h19
n3o2的计算值：c，65.91；h，7.01； n，15.37；实测值65.81，h，6.66，n，15.26.
[0519][0520]
dnmdp-2l.向溶于0.4ml二甲基甲酰胺(dmf)中的130mg a(0.64 mmol)中添加100mg2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)-乙基氨基甲酸叔丁酯 (toronto research chemical，0.32mmol)和90mg k2co3(64mmol)且将混合 物在60℃搅拌过夜。冷却后，添加水且用etoac清洗几次。将合并的etoac 层干燥，浓缩，且用50-70％etoac进行色谱法以得到81mg产物(58％)。1h nmr(300mhz，cdcl3)δ9.06(s，1h)，7.59(d，j＝8.8hz，2h)，6.62(d， j＝8.8hz，2h)，5.15(s，1h)，4.53(s，1h)，3.72(t，j＝5.2hz，2h)，3.65 (s，4h)，3.55(t，j＝5.2hz，2h)，3.32(m，5h)，2.67(dd，j＝16.8，6.7hz， 1h)，2.42(d，j＝16.4hz，1h)，1.44(s，9h)，1.22(d，j＝7.4hz，3h)。
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ166.83，155.99，154.45，149.64，127.33，123.24， 112.58，79.28，70.30，70.26，70.22，69.45，43.14，40.39，33.96，28.43， 27.89，16.40；hplc：r
t 2.50分钟(7.5分钟run)，纯度》95％.ms：435(m 1)。将该产物(0.19mmol)溶解在1ml meoh中，并向溶液添加乙醛(50ul, 0.89mmol)、10ul hoac(0.2mmol)和12mg nabh3cn(0.19mmol)。在1 小时之后，添加nahco3(水溶液)和ch2cl2，分离ch2cl2并将水用ch2cl2洗涤两次。将合并的ch2cl2干燥，浓缩，并用60-70％etoac的己烷溶液色 谱纯化，得到71mg产物，其为澄清油状物(82％)。1h nmr(400mhz，cdcl3) δ8.91(s，1h)，7.63(d，j＝8.9hz，2h)，6.69(d，j＝8.9hz，2h)，5.07(s， 1h)，3.65(t，j＝6.0hz，2h)，3.61(s，4h)，3.55(dt，j＝9.9，5.5hz，4h)， 3.46(q，j＝7.0hz，2h)，3.38-3.22(m，3h)，2.67(dd，j＝16.8，6.7hz， 1h)，2.43(d，j＝16.7hz，1h)，1.45(s，10h)，1.23(d，j＝7.3hz，3h)， 1.18(t，j＝7.0hz，3h)。
13
c nmr(101mhz，cdcl3)δ166.84，155.96，154.46， 148.89，127.35，121.38，111.28，79.22，70.68，70.27，70.24，68.74，49.95， 45.49，40.32，33.97，28.43，27.80，16.43，12.14.r
t 2.99分钟(运行7.5分 钟)，纯度》95％.ms：463(m 1)。
[0521]
化合物6的合成
[0522]
a.化合物3
[0523]
化合物3可通过两种不同途径获得:
[0524]
途径1
[0525][0526]
或
[0527]
途径2
[0528][0529]
1-(3-氟-4-吗啉代苯基)丙-1-酮.
[0530]
向1l单颈烧瓶添加40g 3,4-二氟苯丙酮(235mmol)、400ml ch3cn， 250ml吗啉(2.86mol)和50ml dipea(360mmol)且将溶液在100℃加热 过夜。第二天将反应冷却且浓缩。将混合物溶于ch2cl2且用水冲洗几次， 然后用盐水冲洗几次，且干燥(mgso4)，过滤且浓缩。将大多数粗产物溶于 约1l热己烷且冷却过夜。过滤后，更多晶体出现在母液中。将母液浓缩且 从己烷重结晶。总共得到52.5g干燥的白色固体(94％)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.72(dd，j＝8.4，1.9hz，1h)，7.66(dd，j＝14.0，2.0hz，1h)， 6.93(t，j＝8.5hz，1h)，3.94
–
3.85(m，4h)，3.26
–
3.17(m，4h)，2.94(q， j＝7.3hz，2h)，1.23(t，j＝7.3hz，3h)。
19
f nmr(376mhz，cdcl3)δ
ꢀ‑
121.48.ms：238(m 1)。
[0531]
4-(3-氟-4-吗啉代苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸乙酯.
[0532]
向2l三颈烧瓶添加200ml无水thf和200ml lihmds溶液(1m在 thf中)且将烧瓶在干冰/异丙醇浴上冷却。一旦冷却，通过插管添加溶于300 ml thf的46.5g(3-氟-4-吗啉代)苯丙酮(196mmol)。搅拌1h后，添加溶 于44ml thf的44ml溴乙酸乙酯(202mmol)，且将反应混合物搅拌过夜， 温热至室温。第二天早上，该反应仍然有点冷。向其添加nh4cl溶液，然后 添加etoac和己烷。分离层，将水层用etoac冲洗两次，合并的有机层用 盐水冲洗，干燥(mgso4)，且浓缩至65.6g淡黄色油状物(100％)，将其以 粗物质加以应用。
[0533]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.74(dd，j＝8.4，1.8hz，1h)，7.67(dd， j＝14.1，1.9hz，1h)，6.93(t，j＝8.5hz，1h)，4.09(q，j＝6.9hz，2h)， 3.93
–
3.78(m，5h)，3.28
–
3.14(m，4h)，
2.93(dd，j＝16.8，8.5hz，1h)， 2.43(dd，j＝16.8，5.6hz，1h)，1.21(dt，j＝7.1，3.6hz，6h)。
19
f nmr(376 mhz，cdcl3)δ-121.33。1h nmr、
19
f nmr和lc指示杂质为5-10％。
[0534]
5r)-6-[3-氟-4-(吗啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氢哒嗪-3(2h)-酮化合物3a (化合物3-外消旋化合物)
[0535]
将粗4-(3-氟-4-吗啉代苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸乙酯(65.6g，202mmol) 溶于400ml etoh且向其添加31.6ml肼(1.01mol)，且将反应在回流温度 加热过夜。第二天早上，许多白色沉淀存在于烧瓶中，将其冷却至室温，将 固体过滤且用冷etoh冲洗。将固体放入1l单颈烧瓶且置于旋转式蒸发器 上以去除残余etoh，得到42g清洁固体(71％)。
[0536]1h nmr(300mhz，cdcl3)δ8.46(s，1h)，7.50(dd，j＝2.1，14.4，1h)， 7.43(dd，j＝1.8，8.4，1h)，6.93(t，j＝8.7，1h)，3.95-3.83(m，4h)，3.37
ꢀ‑
3.23(m，1h)，3.21-3.11(m，4h)，2.70(dd，j＝6.8，16.9，1h)，2.47(d， j＝17.1，1h)，1.24(d，j＝7.4，3h)。
13
c nmr(75mhz，cdcl3)δ166.45， 155.33(d，j
c-f
＝246.3)，152.71，141.1(d，j
c-f
＝8.6)，128.75(d，j
c-f
＝7.6)， 122.20(d，j
c-f
＝3.0)，118.09(d，j
c-f
＝3.6)，113.80(d，j
c-f
＝23.0)，66.83，50.50(d，j
c-f
＝3.9)，33.84，27.96，16.29。
19
f nmr(282mhz，cdcl3)δ
ꢀ‑
121.51。质量：292(m 1)。
[0537]
分析型分离方法
[0538]
仪器：thar分析型sfc
[0539]
柱：chiralpak as-h，250
×
4.6mm
[0540]
流动相：a为co2且b为meoh(0.05％dea)
[0541]
梯度：b 40％
[0542]
流速：2.4ml/min
[0543]
反压：100bar
[0544]
柱温：35℃
[0545]
波长：220nm
[0546]
制备型分离方法
[0547]
仪器：thar200制备型sfc
[0548]
柱：chiralpak as-10μm，300
×
50mmi.d.
[0549]
流动相：a为co2且b为etoh(0.1％nh3
·
h2o)
[0550]
梯度：b 45％
[0551]
流速：200ml/min
[0552]
反压：100bar
[0553]
柱温：38℃
[0554]
波长：220nm
[0555]
样品制备：
[0556]
将化合物3a溶于乙醇至～100mg/ml，注射：每次注射5ml。
[0557]
后处理：
[0558]
分离后，将级分通过旋转式蒸发器在浴温度40℃干燥以得到所需异构 体化合物3
其为较慢洗脱的对映异构体，保留时间3.76 分钟(其它对映异构体
–
化合物3b保留时间2.76min)。
[0559][0560]
将95mg对映体纯的化合物3的溶液(330mmol)溶于2ml hoac。向 其通过注射器添加0.13ml 10-15％naocl
(水溶液)
溶液。约30分钟后将额外的 0.25ml 10-15％naocl
(水溶液)
溶液添加至反应混合物，将其搅拌约30分钟， 然后添加水和ch2cl2。分离层，将ch2cl2层用nahso
3(水溶液)
和nahco
3(水溶液)
冲洗。将溶液干燥(mgso4)，浓缩且用己烷中的0-50％etoac色谱层析以 得到52mg化合物6，其为白色固体(49％)。
[0561]1h nmr(400mhz，cdcl3)δ9.08(s，1h)，7.62
–
7.55(m，1h)，7.40(dd， j＝13.3，2.1hz，1h)，3.92
–
3.77(m，4h)，3.32
–
3.18(m，5h)，2.72(dd， j＝17.0，6.9hz，1h)，2.50(d，j＝17.0hz，1h)，1.25(d，j＝7.4hz，3h)。 19
f nmr(376mhz，cdcl3)δ-118.69.
13
c nmr(101mhz，cdcl3)δ166.50， 159.68(d，j＝249.9hz)，151.35(d，j＝2.9hz)，137.26(d，j＝13.4hz)， 133.00(d，j＝7.3hz)，131.36(d，j＝8.9hz)，123.41(d，j＝2.6hz)，112.97 (d，j＝24.0hz)，67.57，51.08(d，j＝4.7hz)，33.72，27.84，16.23。质量326 (m 1)。
[0562]
产物的手性scf色谱层析显示没有对映异构体纯度的损失：
[0563]
柱：chiralpak as-h，250x4.6mm，5um，
[0564]
流动相修饰剂：100％甲醇，
[0565]
梯度：5至50％甲醇，经10分钟，
[0566]
流速：4ml/min，
[0567]
反压：100bar，
[0568]
柱温：40℃。
[0569]
uv检测在200-400nm。
[0570]
分离的对映异构体的保留时间：6.11((r))和8.82((s))分钟。
[0571]
对映异构体
–
化合物6a的分析型分离
[0572]
仪器：waters acquity upc2
[0573]
柱：chiralpak as-h，250
×
4.6mm i.d.
[0574]
流动相：a为co2且b为meoh
[0575]
梯度：3至50b 5分钟，10分钟运行
[0576]
流速：1.5ml/min
[0577]
反压：100bar
[0578]
柱温：45℃
[0579]
波长：210nm
[0580]
化合物6的保留时间-7.23min；无活性对映异构 体化合物6b的保留时间-6.28分钟。
[0581]
化合物6在hela细胞活力测定中测试且其ec50测定为1.1nm。
[0582]
连接至树脂
[0583]
向18毫克dnmdp-2l(0.04毫摩尔)在0.8毫升ch2cl2中的溶液中加入 0.2毫升三氟乙酸(tfa)，将该溶液搅拌2小时，然后浓缩并溶解于0.5毫升 dmso中。向其中加入10ul et3n(0.07mmol)和12mg碳酸n,n'-二琥珀酰亚 胺基酯(dsc)(0.05mmol)，并将溶液搅拌过夜。lc分析表明反应未完成，加 入另外25mg的碳酸n,n'-二琥珀酰亚胺基酯(0.1mmol)。2小时后的lc分析 显示约5:1比率的dsc产物:胺。将1ml affi-gel 102树脂样品用离心机用 dmso冲洗5次，然后悬浮在0.5ml dmso中。向树脂中加入30μl dsc产 物溶液和25μl et3n并将混合物涡旋。在2天后，dmso溶液的lc分析显 示dcs加合物完全消失；未衍生的胺仍然存在。通过离心除去dmso并滗 析，并用dmso冲洗树脂数次并保存在pbs缓冲液中。
[0584]
拯救dnmdp诱导的细胞毒性的生物活性剂筛选
[0585]
将1000个hela细胞在384孔板中在40μl补充有10％胎牛血清和1％ 青霉素/链霉素的dmem中铺板。在铺板24小时之后，以20μm的浓度添 加1600个生物活性分子(pharmacon)的化合物库。平行于生物活性化合物孵 育，加入dnmdp至30nm的最终浓度并孵育48小时。如在nci-h1734和 a549细胞系中的化合物库筛选中所述评估细胞活力。
[0586]
dnmdp分子靶标的连接基亲和纯化和免疫印迹
[0587]
将hela细胞用冰冷pbs洗涤，然后用补充有无edta的蛋白酶抑制剂 (roche)和磷酸酶抑制剂混合物i和ii(calbiochem)的np-40裂解缓冲液(150 mm nacl,10％甘油,50mm tris-cl ph 8.0,50mm mgcl2,1％np-40)裂解。将 细胞裂解物在冰上孵育至少2分钟，随后在4℃以15,700x g离心10分钟， 之后使用bca蛋白测定试剂盒(pierce)定量上清液。将200μg总hela细胞 裂解物与结合至亲和连接基dnmdp-2l的3μl affi-gel 102树脂(biorad)以 400μl的总体积孵育4小时。在孵育之前，将指定的化合物加入到亲和纯化 中，终浓度为10μm。将样品用含有10μm相应化合物浓度的裂解缓冲液洗 涤三次。将与affi-gel 102树脂结合的蛋白还原、变性和用tris-甘氨酸凝胶 (novex)分离，并使用iblot转移系统(novex)转移至硝酸纤维素膜。将膜在4℃ 与抗pde3a的一抗(1:1000，bethyl)孵育过夜。根据制造商
的建议在室温与 二抗(1:20,000,li-cor biosciences)孵育2小时并随后检测(odyssey imagingsystem,li-cor biosciences)。
[0588]
parp裂解免疫印迹
[0589]
将hela细胞用指定浓度的dnmdp和星状孢子素处理36小时。如在 dnmdp分子靶标的连接基亲和纯化和免疫印迹中所述将hela细胞裂解并 处理。将膜与抗parp的抗体(1:1000,cell signaling#9532)和肌动蛋白孵育， 并随后如在dnmdp分子靶标的连接基亲和纯化和免疫印迹中所述成像。
[0590]
使用crispr靶向pde3a基因座
[0591]
使用mit crispr设计工具(在线mit crispr设计入口)确定crispr 靶标位点。为了克隆sgrna，将正向和反向寡核苷酸(oligos)退火，磷酸化 并连接到bsmbi消化的pxpr_brd001中。寡核苷酸序列如下：
[0592][0593]
为了产生慢病毒，使用磷酸钙将293t细胞与pxpr_brd001、pspax2 和pmd2.g共转染。用2ug/ml嘌呤霉素选择感染的hela细胞。
[0594]
使用sirna减少pde3a表达
[0595]
将hela细胞铺在96孔板中，并在24小时后根据制造商的建议用 pde3a和非靶向sirna智能池(smartpool)(on target plus，thermo scientific) 转染。在转染后24小时和72小时获得hela细胞裂解物，并如在dnmdp 分子靶标的连接基亲和纯化和免疫印迹中所述对pde3a和肌动蛋白 (1:20,000，cell signaling)进行免疫印迹。将hela细胞用指定浓度的化合物 3处理48小时。如在nci-h1734和a549细胞系中的化合物库筛选中所述评 估细胞活力。
[0596]
测量hela细胞中的细胞camp浓度
[0597]
将5000个hela细胞铺在96孔板中。在铺板后24小时，将hela细胞 与指定浓度的指定化合物孵育1小时。根据制造商的推荐，用camp-glo
tm
测定法(promega)测定camp水平。根据制造商建议通过归一化至产生的标 准曲线来确定camp的细胞浓度。
[0598]
用于pde3a-蛋白相互作用研究的扩展的蛋白质组学方法
[0599]
在hela细胞中pde3a的免疫沉淀
[0600]
将hela细胞用10μm指定化合物处理四个小时，然后裂解：dmso、dnmdp和曲喹辛。将hela细胞用modripa裂解缓冲液(1％np-40：50mmtris-hcl,ph 7.8,150mm nacl,0.1％脱氧胆酸钠,1mm edta)裂解，所述 modripa裂解缓冲液补充有如在dnmdp分子靶标的连接基亲和纯化和免疫 印迹中所述的蛋白酶和磷酸酶抑制剂和如上所述最终浓度为10μm的指定 化合物。将13mg hela总细胞裂解物与0.5％pde3a抗体(bethyl)孵育，并 孵育过夜。在相应
的条件下，与pde3a抗体同时加入针对pde3a抗体的阻 断肽(bethyl)。然后将全细胞裂解物和抗体混合物与10μl蛋白a加琼脂糖 (protein a plus agarose)(fisher scientific)在4℃孵育30分钟。然后用含有浓 度为10μm的指定化合物的裂解缓冲液洗涤蛋白a加琼脂糖两次。最后， 将蛋白a加琼脂糖用不含np-40和含浓度为10μm的指定化合物的裂解缓 冲液洗涤一次。
[0601]
珠上消化
[0602]
将来自免疫纯化的珠子用ip裂解缓冲液洗涤一次，然后用pbs洗涤三 次，将每个重复的三种不同裂解物重悬于90μl消化缓冲液(2m尿素，50mmtris hcl)中，加入2μg测序级胰蛋白酶，以700rpm摇动1小时。取出上清 液并置于新鲜管中。然后用50μl消化缓冲液将珠子洗涤两次并与上清液合 并。将合并的上清液还原(2ul 500mm dtt，30分钟，室温)，烷基化(4ul 500 mm iaa，45分钟，黑暗)并进行更长的过夜消化：2μg(4ul)胰蛋白酶，摇 动过夜。然后用20ul 10％叶酸(fa)淬灭样品并在10mg柱上脱 盐。
[0603]
肽的itraq标记和强阳离子交换(scx)分级
[0604]
根据制造商的说明书(ab sciex，foster city，ca)，用相对和绝对定量 的同位素标签(itraq)试剂标记脱盐的肽。将肽溶于30μl 0.5m teab ph8.5溶液中，并将标记试剂加入70μl乙醇中。在孵育1小时后，用50mmtris/hcl ph 7.5终止反应。将差异标记的肽混合并随后在10mg柱上脱盐。
[0605][0606][0607]
如rappsilber等人所述进行差异标记和组合的肽的scx分级。 (rappsilber等人，nat protoc 2,1896-1906,2007)，其具有如下的6个ph步 骤(缓冲液全部含有25％乙腈)：
[0608]
1：乙酸铵50mm ph 4.5,
[0609]
2：乙酸铵50mm ph 5.5,
[0610]
3：乙酸铵50mm ph 6.5,
[0611]
4：碳酸氢铵50mm ph 8,
[0612]
5：氢氧化铵0.1％ph 9,
[0613]
6：氢氧化铵0.1％ph 11。
[0614]
empore scx盘用于制作停止-并-进行-提取-提示 (stop-and-go-extraction-tips)(stagetips)，如论文中所述。
[0615]
ms分析
[0616]
将重建的肽在在线纳流(nanoflow)easy-nlc
tm 1000 uhplc系统 (thermo fisher scientific)上分离，并在台式orbitrap q exactive
tm
质谱仪 (thermo fisher scientific)上进行分析。将肽样品注射到内部用20cm c18二 氧化硅材料(1.9μmc18-aq介质,dr.maisch gmbh, r119.aq)填充的毛细管柱(具有10μm
顶部开口/75μm直径的 new objective,pf360-75-10-n-5)上。将uhplc装置与定制微型适配器三通 (custom-fit microadapting tee)(360μm，idex health&science，uh-753)连接， 并将毛细管柱在柱加热器套筒(phoenix-st)中加热到50℃以减少uhplc分 离过程中的反压。将进样的肽以200nl/min的流速用从100％溶剂a(3％乙 腈,0.1％甲酸)至30％溶剂b(90％乙腈,0.1％甲酸)的线性80分钟梯度和随后 的从30％溶剂b至90％溶剂b的线性6分钟梯度分离。每个样品运行120 分钟，包括样品加载和柱平衡时间。q exactive
tm
仪器在数据依赖模式下 运行，采用3x106离子的ms1离子靶和5x104离子的ms2靶，在12个最高 丰度离子的每个ms1扫描(r＝70,000)后获取高能碰撞解离(hcd)ms/ms扫 描(r＝17,500)。用于ms/ms扫描的最大离子时间为120ms；hcd归一化碰 撞能量设为27；动态排除时间被设定为20s，并且肽匹配和同位素排除功能 被启用。
[0617]
肽和蛋白的定量和鉴定
[0618]
所有质谱都使用spectrum mill软件包v4.1 beta(agilent technologies)进 行处理，其中包括由申请人为基于相对和绝对定量的同位素标签(itraq)的 定量研发的模块。使用每种前体离子的提取离子色谱(xic's)进行前体离子定 量。通过spectrum mill软件在液相色谱(lc)-ms/ms运行的干预高分辨率 ms1扫描中使用围绕同位素簇的每个单独成员的窄窗口自动计算经受 ms/ms的每种前体离子的xic的峰面积。基于ms扫描分辨率、前体电荷 和m/z，根据同位素簇中的峰相对于理论值的相对分布的质量度量，动态确 定时域和m/z域中的峰宽。合并在 /-60秒内以相同解离模式在相同前体m/z 上获得的类似ms/ms谱图。前体电荷》7和ms/ms质谱质量差的ms/ms 质谱图被排除在搜索之外，因其不具有序列标签长度》1(即，由氨基酸的链 内质量分开的3个质量的最小值)而未通过质量过滤器。
[0619]
对于肽鉴定，针对的人类通用蛋白资源(uniprot)数据库(附加了常见的实 验室污染物蛋白)搜索ms/ms谱图。搜索参数包括：esi-q exactive
tm-hcd评分参数、具有最多两次缺失裂解的胰蛋白酶特异性、 40％最小匹配峰强度、 /-20ppm前体质量容差、 /-20ppm产品质量容差、 半胱氨酸的氨基甲酰甲基化和作为固定修饰的赖氨酸和肽n端的itraq标 记。允许的可变修饰是甲硫氨酸的氧化、n-末端乙酰化、焦谷氨酸(n-termq) 脱酰胺化(n)、pyro carbamidomethyl cys(n-termc)，其前体mh 位移范围 为-18至64da。通过针对每个液相色谱(lc)-ms/ms中的每个前体电荷状态 分别优化分数和δ秩1-秩2分数阈值，同时在频谱级别允许基于目标诱饵的 最大错误发现率(fdr)为1.0％，为各个光谱解释的身份被自动指定为有效。
[0620]
在计算蛋白水平的分数并报告鉴定的蛋白时，以下列方式解决冗余：蛋 白分数是不同肽的分数的总和。一种独特的肽是通过ms/ms谱检测到的肽 的单个最高得分实例。特定肽的ms/ms谱可能已被多次记录(即，作为不同 的前体电荷状态，从邻近的scx组分分离，通过met的氧化修饰)，但仍计 为单一不同的肽。当序列数据库中的多个蛋白条目中含有长度》8个残基的 肽序列时，将蛋白分组在一起，并报道最高得分的一个及其登录号。在一些 情况下，当蛋白序列以这种方式分组时，存在独特的肽，其独特地代表该组 的较低评分成员(同种型或家族成员)。这些实例中的每一个都会产生一个亚 组，并报告多个亚组，并计入蛋白总数。itraq比率是从spectrum mill的 蛋白比较输出表中获得的。为了获得itraq蛋白比率，计算在每个重复中 分配给蛋白亚组的所有不同肽的中位数。为了分配相互作用的蛋白，如前所 述使用r环境中的limma包来计算缓和的t检验p，并添加blandt-altman 检
验以筛选出ci重现性低于95％的蛋白(udeshi等人，mol cell proteomics 11, 148-159,2012)。
[0621]
使用免疫沉淀和免疫印迹验证dnmdp诱导的pde3a蛋白相互作用
[0622]
hela细胞用表达v5标记的sirt7，v5标记的slfn12或v5标记的 gfp的orf过表达构建体转染。从trc获得orf表达构建体(克隆id： trcn0000468231,trcn0000476272,ccsbbroad304_99997)。在转染后72小 时，将细胞用10μm dnmdp或曲喹辛处理4小时，随后使用modripa裂 解缓冲液裂解并且免疫沉淀pde3a。对于每种条件，将2mg总蛋白裂解物 与1μg抗pde3a抗体在4℃孵育过夜，然后分别加入7.5μl蛋白a-和蛋白 g-dynabeads(life technologies 10001d和10003d)，并再孵育1小时。洗涤 珠子并用30μl lds page凝胶上样缓冲液洗脱结合的蛋白。输入(～60μg总 蛋白裂解物)和ip产物在4-12％tris-甘氨酸page凝胶上拆分并用抗v5抗 体(life technologies r96205,1:5000)、bethyl抗-pde3a抗体(1:1000)和来自 licor biosciences的二级抗体(目录号926-32210和926068021,各自为 1:10,000)进行免疫印迹。使用licor odyssey红外成像仪清洗印迹并成像。
[0623]
使用shrna敲低slfn12表达并测试药物敏感性
[0624]
表达靶向slfn12的shrna的构建体或对照载体被包装入慢病毒并通 过病毒转导递送到hela细胞中。使用了三种slfn12靶向shrna，所有这 些都是从trc获得的(克隆id：trcn0000152141和trcn0000153520)。用 1μg/ml嘌呤霉素选择感染的细胞3天，然后在非选择性培养基中再生长3 天。然后将细胞铺板到384孔测定板中并如上所述测试药物敏感性。通过 qpcr验证slfn12的敲低。使用试剂盒试剂(rneasy mini kit(qiagen#74104) 和qiaschredder(qiagen#79656))提取总rna。cdna使用试剂盒试剂 (superscript iii first-strand synthesis system(life technologies#18080-051)) 产生。根据制造商的建议对gapdh和slfn12(life technologieshs00430118_m1)进行qpcr。将slfn12表达归一化为相应的样品gapdh ct 值。
[0625]
其它实施方案
[0626]
从前面的描述中，显而易见的是，可以对本文描述的发明进行变化和修 改，以将其用于各种用法和条件。这些实施例也在以下权利要求的范围内。
[0627]
本文的变量的任何定义中的元素列表的叙述包括将该变量定义为所列 元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文中的实施方案的叙述包括作为 任何单个实施方案的实施方案或与任何其他实施方案或其部分的组合。
[0628]
通过引用合并
[0629]
本说明书中提及的所有专利和出版物均以引用的方式并入本文，其程度 如同每个独立专利和出版物被具体且单独地指出通过引用并入。