一种化合物在制备具有抗病毒作用的产品中的应用

1.本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种化合物在制备具有抗病毒作用 的产品中的应用。


背景技术：

2.甲型流感病毒(iav)是一种会感染人和动物并引发严重呼吸道疾病的病毒， 是造成季节性流行病的最常见的呼吸道病原体。疫苗接种对预防和控制流感是很 重要的一种方式。然而，疫苗接种的有效力通常只有40％-60％，而且在疫苗周期 错配的年份可能低于20％。因此，抗病毒药物疗法是治疗流感的重要选择。到目 前为止，三种抗病毒药物已经被fda批准用于流感预防和治疗，包括m2离子 通道抑制剂(即金刚烷和金刚乙胺)、神经氨酸酶抑制剂(即奥司他韦和扎那米 韦)和一种限制性核酸内切酶抑制剂。然而，由于体内的流感病毒株对金刚烷类 药物产生了耐药性，m2抑制剂现已不再临床使用。此外，2008-2009年北美季节 性h1n1流感病毒株对奥司他韦呈现几乎完全的耐药性。因此，开发一种新型抗 病毒药物是十分必要的。
3.人类呼吸道合胞病毒病毒(rsv)是一种可引致各年龄层次人群急性呼吸道 感染的常见病原体。严重的呼吸道合胞病毒相关的下呼吸道疾病通常仅限于婴儿、 幼儿、免疫缺陷病人和老年人。目前，全球已经报道了超过300万呼吸道合胞病 毒感染病例，全世界每年发生近20万与呼吸道合胞病毒相关的死亡。因为目前 还没有呼吸道合胞病毒疫苗，预防和治疗呼吸道合胞病毒感染仍然是控制病毒传 播的唯一手段。palivizumab是一种人源化的抗rsv融合蛋白单克隆抗体，仅限 用于儿科高危重度rsv感染患者的预防治疗。利巴韦林是一种靶向rna转录和 复制的核苷类似物，已被美国食品和药物管理局(fda)批准用于rsv治疗， 但其有争议的疗效和副作用限制其使用范围。由于这些原因，我们迫切需要寻找 新的抗病毒药物。
4.(-)-bornyl p-coumarate化合物，是一种从木兰科八角属植物八角illiciumverum hook.f.中分离出来的一种苯丙素类化合物，现有技术(antitrypanosomalactivity and effect in plasma membrane permeability of(-)-bornyl p-coumarateisolated from piper cernuum(piperaceae))报道了(-)-bornyl p-coumarate化合物能 破环克氏锥虫的细胞质膜通透性，呈现显著的抗锥虫活性。但现有技术并无报道 其具有抗病毒作用，尤其是抗甲型流感病毒和抗呼吸道合胞病毒的作用。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种化合物 在制备具有抗病毒作用的产品中的应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种化合物在制备具有抗病毒作用的产品中的应用，所述化合物的化学结构 如式i所示；
[0008][0009]
式i所示结构的化合物为已知的化合物(-)-bornyl p-coumarate；发明人在大量 的实验研究中首次发现式i所示结构的化合物(-)-bornyl p-coumarate具有抗病毒 作用；提供了化合物(-)-bornyl p-coumarate的全新制药用途。
[0010]
然而现有技术并未报道化合物(-)-bornyl p-coumarate具有抗病毒作用；本领 域技术人员在现有技术公开的基础上，同样也预料不到化合物(-)-bornylp-coumarate具有抗病毒作用。
[0011]
优选地，所述的病毒为流感病毒和/或呼吸道合胞病毒。
[0012]
发明人通过大量的实验筛选进一步发现：式i所示结构的化合物(-)-bornylp-coumarate对甲型流感病毒的ic
50
为1.74
±
0.47μm；远远小于阳性药利巴韦林 对甲型流感病毒的ic
50
(10.76
±
1.60μm)；这说明式i所示结构的化合物 (-)-bornyl p-coumarate具有十分显著的抗甲型流感病毒活性，且其抗甲型流感病 毒活性要远远优于阳性药利巴韦林；该技术效果是本领域技术人员无法预料的。
[0013]
式i所示结构的化合物(-)-bornyl p-coumarate对呼吸道合胞病毒的ic
50
为 15.29
±
1.22μm，高于阳性药利巴韦林对呼吸道合胞病毒的ic
50
(8.81
±
1.12μm)； 这说明式i所示结构的化合物对呼吸道合胞病毒的ic
50
虽然高于阳性药利巴韦林， 但其ic
50
依然较小，依然显示出优异的抗呼吸道合胞病毒活性。
[0014]
进一步优选地，所述的流感病毒为甲型流感病毒。
[0015]
优选地，所述的产品为药物或保健品。
[0016]
优选地，所述的药物或保健品含有治疗有效量的式i所示结构的化合物和药 学上可接受的载体。
[0017]
优选地，所述的药物或保健品的剂型为散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、 气雾剂或注射剂。
[0018]
有益效果：本发明首次提供了式i所示结构的化合物(-)-bornyl p-coumarate 在制备抗病毒作用的产品中的应用。进一步研究表明：式i所示结构的化合物 (-)-bornyl p-coumarate其具有优异的抗流感病毒作用和抗呼吸道合胞病毒作用； 尤其是抗甲型流感病毒作用，其抗甲型流感病毒的作用要远远优于阳性药利巴韦 林。
附图说明
[0019]
图1为化合物(-)-bornyl p-coumarate化学结构式。
[0020]
图2为化合物(-)-bornyl p-coumarate的分子编号。
[0021]
图3为化合物(-)-bornyl p-coumarate对甲型流感病毒株(pr8)的抑制作用 实验结果图；其中，图3a为化合物(-)-bornyl p-coumarate对狗肾传代细胞(mdck) 的细胞毒性作用；图3b为化合物(-)-bornyl p-coumarate和阳性对照药利巴韦林 在不同浓度下对甲型流感病毒株(pr8)的抑制作用；图3c为化合物(-)-bornylp-coumarate在不同时间对甲
型流感病毒株(pr8)增殖作用的影响；图3d为免 疫荧光技术检测化合物(-)-bornyl p-coumarate在不同浓度下对代表病毒的np蛋 白表达的影响。
[0022]
图4化合物(-)-bornyl p-coumarate的高分辨质谱。
[0023]
图5化合物(-)-bornyl p-coumarate的紫外光谱(溶于甲醇)。
[0024]
图6化合物(-)-bornyl p-coumarate的外红光谱(kbr压片)。
[0025]
图7化合物(-)-bornyl p-coumarate的核磁共振1h谱(400mhz，溶于cdcl3)。
[0026]
图8化合物(-)-bornyl p-coumarate的核磁共振
13
c谱(100mhz，溶于 cdcl3)。
[0027]
图9化合物(-)-bornyl p-coumarate的核磁共振dept-135谱(100mhz，溶 于cdcl3)。
具体实施方式
[0028]
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实 施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商 购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或 按照仪器制造商所建议的条件。
[0029]
实施例1
[0030]
将干燥的20.0kg八角果实粉碎，常温下用95％乙醇(300l)冷浸提取得总 提取物1.0kg。将所得总浸膏分散于纯净水(5l)中，然后依次用石油醚(pe)、 氯仿(chcl3)和乙酸乙酯(etoac)溶剂依次萃取，减压浓缩，得到石油醚萃 取物200.0g、氯仿萃取物121.0g和乙酸乙酯萃取物100.0g。将石油醚萃取物 (200.0g)经200-300目硅胶柱层析，用pe-etoac系统梯度洗脱(1000:0
→
0:1)， 根据tlc检视进行合并，得到6个馏分(fr.a-f)。fr.c(18.3g)馏分以甲醇/水 为流动相经ods柱层析分离，根据tlc检视进行合并，得到3个子馏分(fr.c1-3)， fr.c2(4.4g)由制备型hplc和凝胶sephadex lh-20分离，得到化合物(-)-bornylp-coumarate，化合物结构如式i所示。
[0031]
结构鉴定依据：
[0032]
化合物(-)-bornyl p-coumarate的结构，通过分析高分辨质谱(hresims)、 红外光谱(ir)、和对比文献报道的已知化合物的核磁共振谱(nmr)得到。
[0033]
用高分辨质谱hresims:m/z测定分子量300.1729[m na]

(理论值： 300.1725)，显示分子式为c
19h24
o3。
[0034]
用红外光谱法，测定结果数据显示存在羟基(3378cm-1
)、羰基(1679cm-1
) 和苯环(1604cm-1
、1679cm-1
、1679cm-1
)。
[0035]
表1.(-)-bornyl p-coumarate的1h and 13
c nmr数据(cdcl3,δin ppm,j in hz)
[0036][0037][0038]
核磁共振氢谱(1h nmr)的数据及归属，见表1。数据显示有24个氢信号， 其中包含有7个烯烃氢信号[δ
h 7.62(1h,d,j＝15.9hz),7.42(2h,d,j＝8.5hz), 6.87(2h,d,j＝8.5hz),6.33(1h,d,j＝15.9hz)],2个次甲基氢信号[δ
h 5.01(2h, m),1.70(2h,m)],3个亚甲基信号[δ
h 2.42(1h,m),2.03(1h,m),1.80(1h,m), 1.70(1h,dd,j＝11.8,7.4hz),1.35(1h,m),1.06(1h,dd,j＝13.8,3.5hz)],3个甲 基特征氢信号[δ
h 0.93(3h,s),0.89(3h,s),0.88(3h,s)]。
[0039]
根据核磁共振碳谱(
13
c nmr)的数据及归属，见表1。数据显示有19个 碳信号，包含有1个羰基(δ
c 168.6),8个烯烃碳信号(δ
c 158.4,144.7,130.1,127.0, 116.1,115.8),与氧原子相连的1个季碳(δ
c 49.1),2个次甲基(δ
c 80.4,45.1),3个 亚甲基(δ
c 37.0,28.2,27.4),3个甲基(δ
c 19.8,19.0,13.7)。
[0040]
经文献检索，分离得到的化合物的数据与已知的(-)-bornyl p-coumarate[12] 一致，故确定化合物为(-)-bornyl p-coumarate。化合物(-)-bornyl p-coumarate的 分子编号如图2所示。
[0041]
实验例2化合物(-)-bornyl p-coumarate抗甲型流感病毒活性测试
[0042]
1.用mtt法测定化合物的细胞毒性，将1.5
×
104个细胞置于96孔平板中， 在37℃温度下于5％co2培养箱中培养18h；
[0043]
2.加入含有不同浓度的化合物(100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm， 3.125μm)的琼脂覆盖物培养；
[0044]
3.细胞培养48h后，用mtt法处理4h；
[0045]
4.随后，去除上清液，加入二甲基亚砜(dmso)溶解蓝紫色结晶甲瓒；
[0046]
5.在570nm处测量吸光度,根据细胞存活率的非线性回归分析得到50％ 的细胞毒性浓度(cc
50
)。
[0047]
6.将8
×
105个/孔的狗肾传代细胞(mdck)接种于6孔板中，过夜培养；
[0048]
7.在37℃下，用约50pfu/孔的pr8流感病毒(influenza a virus/puerto rico/8/34h1n1病毒株)处理mdck细胞1h，每15min振摇一次；
[0049]
8.用pbs和不包含化合物的琼脂覆盖物对细胞进行两次洗涤；
[0050]
9.加入含有不同浓度的化合物(100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm， 3.125μm)的琼脂覆盖物培养；
[0051]
10.培养48-72h，固定细胞，结晶紫染色计数斑块数；
[0052]
11.用非线性回归方程在graphpad prime 8.0software(lajolla,ca,usa)中 计算出使斑块数减少50％(ic
50
)所需的浓度；
[0053]
12.在感染后的指定时间点，用pbs洗涤mdck细胞3次，4％多聚甲醛固 定在4℃处15min，室温下用0.25％triton试剂浸泡mdck细胞15min， 然后用抗np单克隆抗体(1:100)孵育1h；
[0054]
13.用pbs洗涤后，与二级抗体alexa fluor 488-conjugated goat anti-mouse lgg(h l)孵育1h；
[0055]
14.细胞核用dapi反染，在共聚焦显微镜下观察细胞形态。
[0056]
表2.化合物(-)-bornyl p-coumarate的抗甲型流感病毒活性
[0057][0058]
从表2实验数据可以看出，式i所示结构的化合物(-)-bornyl p-coumarate 对甲型流感病毒的ic
50
为1.74
±
0.47μm；远远小于阳性药利巴韦林对甲型流感 病毒的ic
50
(10.76
±
1.60μm)；这说明式i所示结构的化合物(-)-bornylp-coumarate具有十分显著的抗甲型流感病毒活性，且其抗甲型流感病毒活性要 远远优于阳性药利巴韦林；该技术效果是本领域技术人员无法预料的。
[0059]
此外，从表2实验数据可以看出，化合物(-)-bornyl p-coumarate对甲型流感 病毒的si值达到了14.3，远远大于最低标准1.00，这说明将化合物(-)-bornylp-coumarate用于制备抗甲型流感病毒的药物，具有更大的安全范围。
[0060]
进一步地，图3a显示，化合物(-)-bornyl p-coumarate在非细胞毒性浓度下 对甲型流感病毒株pr8有显著的浓度依赖性抑制活性。此外，在8μm浓度下， 化合物(-)-bornyl p-coumarate和利巴韦林对pr8的抑制率分别为100％和40％(图 3b)，提示化合物(-)-bornyl p-coumarate对pr8的抑制作用要强于阳性对照药利 巴韦林。用空斑法检测化合物(-)-bornyl p-coumarate对pr8生长曲线的抑制作用， 如图3c所示，在0.001moi甲型流感病毒株pr8感染后，上清液中的子代病毒 数量随着培养时间的延长而增加，并在48h达到高峰，而用化合物(-)-bornylp-coumarate处理后可显著降低24、48或60h细胞中的子代病毒数量。同时，在 36hpi条件下，用免疫荧光法检测np蛋白的表达。绿色荧光代表病毒的np蛋 白，在病毒组中观察到高水平的表达(图3d)。加入化合物(-)-bornyl p-coumarate 后，与pr8感染相关的np蛋白绿色荧光显著降低。以上数据同样表明，化合物 (-)-bornyl p-coumarate在体外对甲型流感病毒有显著的抑制作用。
[0061]
实验例3化合物(-)-bornyl p-coumarate抗呼吸道合胞病毒活性测试
[0062]
1.用mtt法测定化合物的细胞毒性，将1.5
×
104个细胞置于96孔平板中， 在37℃温度下于5％co2培养箱中培养18h；
[0063]
2.加入含有不同浓度的化合物(100μm，50μm，25μm，12.5μm，6.25μm， 3.125μm)的琼脂覆盖物培养；
[0064]
3.细胞培养48h后，用mtt法处理4h；
[0065]
4.随后，去除上清液，加入二甲基亚砜(dmso)溶解蓝紫色结晶甲瓒；
[0066]
5.在570nm处测量吸光度,根据细胞存活率的非线性回归分析得到50％ 的细胞毒性浓度(cc
50
)；
[0067]
6.以最大无细胞毒性浓度(mncc)为第一浓度，检测化合物的抗病毒活 性；
[0068]
7.细胞悬浮液(每孔1.5
×
104个细胞)接种于96孔板中的每孔；
[0069]
8.18h后，用rsv病毒和不同浓度的化合物(-)-bornyl p-coumarate处理单 层hep-2细胞，培养72h；
[0070]
9.通过显微镜观察每孔合胞体的病变程度，通过观察评价其抑制半数cpe 的浓度，即为半数最大抑制浓度(ic
50
)。
[0071]
表2.化合物(-)-bornyl p-coumarate的抗呼吸道合胞病毒活性
[0072][0073]
从表2实验数据可以看出：式i所示结构的化合物(-)-bornyl p-coumarate对 呼吸道合胞病毒的ic
50
为15.29
±
1.22μm，高于阳性药利巴韦林对呼吸道合胞 病毒的ic
50
(8.81
±
1.12μm)；这说明：式i所示结构的化合物对呼吸道合胞病 毒的ic
50
虽然高于阳性药利巴韦林，但其ic
50
依然较小，依然显示出优异的抗 呼吸道合胞病毒活性，只不过其抗呼吸道合胞病毒的活性远远不如抗甲型流感病 毒显著。此外，其si值为3.6，大于最低标准1.00，这将说明化合物(-)-bornylp-coumarate用于制备抗呼吸道合胞病毒的药物，具有有效的安全范围；但其安 全范围要远远小于用于制备抗甲型流感病毒。
[0074]
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本 文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。 应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离 由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、 修改和替换。