一株贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂及其应用。


背景技术：

2.世界上食醋的生产和消费主要集中在两个区：以意大利、法国为主的欧洲传统葡萄酒生产区和东南亚的中韩日三国。西方国家食醋主要以葡萄汁为主要原料，通过液态深层发酵工艺进行酿造，其发酵主要是以醋酸菌为主进行发酵，产品风味物质相对单一，口感单薄。而在中国、韩国等东方国家，食醋主要以糯米、高粱或甘薯等淀粉含量较高的粮谷类为主要原料，以谷糠、麸皮为辅料，通过多种微生物的固态发酵工艺进行酿造。固态酿造食醋的主体酸除了乙酸外，还有乳酸、琥珀酸、焦谷氨酸等有机酸和谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸等氨基酸以及众多挥发性风味化合物，这些物质赋予了食醋丰富的口感和协调的香气。此外，参与发酵的微生物还能产生川芎嗪、黄酮、多酚等功能因子，在一定程度上赋予了食醋保健功能。
3.乙偶姻，又名3-羟基-2-丁酮，是一种食品香料添加剂，具有十分浓郁的奶酪香和酯香，合理浓度下给人以愉悦的感受，是国家规定的可以使用的食品添加剂 (gb2760-86)。此外，乙偶姻也是食醋重要功能成分川芎嗪的前体物质，川芎嗪可由乙偶姻与氨基化合物反应生成，川芎嗪不仅具有焙烤坚果的香气，还具有保护心脑血管，抗氧化等保健功能，食醋的保健价值与其含量息息有关，因此川芎嗪可作为鉴别食醋品质的一个特征指标。
4.目前，已研究报道的产乙偶姻的菌株较多，主要有乳酸菌、醋酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等。贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种，有关它的研究也日益增多，但研究重点主要是其对植物生长、抗病虫和诱导系统抗病性等方面。
5.申请号为201910136399.9的中国发明专利“高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用”公布了一种将增香莫海威芽孢杆菌cgmcc 16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，以提高新淋醋中川芎嗪含量的方法。此法利用的增香莫海威芽孢杆菌cgmcc 16910的乙偶姻产量为45.63g/l，最终生产的新淋醋中川芎嗪含量为266.47μg/ml。


技术实现要素：

6.发明目的：本发明的第一目的为提供一株能够提高食醋中乙偶姻和川芎嗪含量的贝莱斯芽孢杆菌，本发明的第二目的为提供一种微生物菌剂，本发明的第三目的为提供该贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂在食品领域中的应用，本发明的第四目的为提供该贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂在食醋酿造中的应用，本发明的第五目的为提供一种改善食醋产品风味、提高产品品质的食醋的酿造方法。
7.技术方案：本发明的贝莱斯芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年6月10日，保藏登
记入册的编号为 cgmcc no.20063。
8.进一步地，本发明的微生物菌剂，微生物菌剂包含贝莱斯芽孢杆菌。贝莱斯芽孢杆菌、微生物菌剂在食品领域中的应用。
9.贝莱斯芽孢杆菌或微生物菌剂在食醋酿造中的应用。优选的，食醋为香醋。
10.本发明的食醋的酿造方法，包括如下步骤：
11.(1)采用贝莱斯芽孢杆菌制备菌株种子液；
12.(2)对菌株种子液进行发酵即得食醋。
13.步骤(1)中，菌株种子液的制备包括一级种子液的制备和二级种子液的制备。
14.一级种子液的制备具体包括如下步骤：按照1％-10％的接种量，将纯化后、处于对数生长期的贝莱斯芽孢杆菌菌液接种到培养基中，温度30-37℃培养，即得一级种子液。
15.二级种子液的制备具体包括如下步骤：使用液态发酵方法，将水加热到90-95℃，加入米粉、高温α-淀粉酶，保温得到醪液；然后将醪液温度降至45-55℃，加入糖化酶保温，制得糖化液；在糖化液中添加0.5％-2％的蛋白胨和0.5％-2％酵母粉，灭菌；冷却至30-37℃后，按照1％-10％的接种量接入一级种子液，通气搅拌，30-37℃保压发酵，即得二级种子液。
16.步骤(2)具体包括如下步骤：将酒醪、麸和大糠混合搅拌，按接种量为酒醪重量的1％-10％接种醋酸菌，再以酒醪重量1％-5％的接种量接入贝莱斯芽孢杆菌的二级种子液，带种、固态分层翻醅发酵；封醅、淋醋及煎醋。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
18.(1)从镇江香醋生产工艺过程的醋醅中分离筛选得到一株较适合于食醋酿造环境的贝莱斯芽孢杆菌，应用在食醋酿造领域，可明显提高食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量，改善产品风味，提高产品品质；
19.(2)该菌株应用在食醋酿造中具有高产乙偶姻的活性，其中，乙偶姻含量可达 23.16g/l，川芎嗪含量可达362.52mg/l；
20.(3)该菌株应用在食醋酿造中，产品的香味及滋味也明显优于对照组；
21.(4)该菌株还可以制作成生物菌剂，菌株可以制作成菌液或生物菌剂进行食醋酿造，提高风味及产品品质。
附图说明
22.图1为本发明的贝莱斯芽孢杆菌hscy3015的菌落形态；
23.图2为一种总酸变化曲线图；
24.图3为另一种总酸变化曲线图。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
26.本发明实施例中高温α-淀粉酶、糖化酶均来自市购。
27.实施例1贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在镇江香醋酿造中的应用
28.1、菌株的扩大培养
29.一级种子液的制备：按照1％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的贝莱斯
芽孢杆菌hscy3015菌液接种到mrs培养基中，温度30℃，转速180r/min培养20h。
30.二级种子液的制备：选用50l液态发酵罐，加水35l，搅拌速度为120r/min，将水加热到90℃，加入经粉碎并过100目筛得到的米粉10kg，加入2万u/ml高温α-淀粉酶，添加量为3.0ml，保温35min得到醪液；然后将醪液温度降至45℃，加入5万 u/g糖化酶，添加量为0.50g，保温35min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加0.5％ (w/v)的蛋白胨和0.5％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min；冷却至30℃后，按照1％的接种量接入一级种子液，调整通气量为0.1vvm，搅拌速度为120r/min，30℃保压发酵20h，活菌数达到108cfu/ml。贝莱斯芽孢杆菌的在固体培养基上生长的菌落形态图如图1所示。
31.2、醋醅接种发酵
32.对照组1：
33.选取500kg大缸，加入酒醪132kg，麸皮45kg，大糠22kg，将所投原料充分拌匀后，接种购自cicc、菌株保藏编号为cicc 20001的醋酸菌，接种量为酒醪重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
34.添加贝莱斯芽孢杆菌组：
35.选取500kg大缸，加入酒醪132kg，麸皮45kg，大糠22kg，将所投原料充分拌匀后，接种购自cicc、菌株保藏编号为cicc 20001的醋酸菌，接种量为酒醪重量的1％，再以酒醪重量1％的接种量接入贝莱斯芽孢杆菌的二级种子液，按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。
36.3、封醅
37.将成熟醋醅压实进行封醅，封存期为7天。对照组1步骤与实施例1保持一致。
38.4、淋醋
39.在封醅结束的醋醅中加入清水浸泡，同时添加发酵原料重量8.0％的炒米色和1.5％的食盐，浸泡结束后，淋放得到生醋液。对照组1步骤与实施例1保持一致。
40.5、煎醋及灌装
41.将生醋进行煎煮，温度100℃，煎煮时间30min，煎煮过程中添加2％的白砂糖。熟醋液进行热灌装，灌装温度不低于70℃，灌装结束即得到成品。对照组1步骤与实施例1保持一致。
42.6、总酸含量检测
43.从发酵第5天开始至发酵第19天结束，每天取底部醋卤进行检测。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。发酵结束时，添加贝莱斯芽孢杆菌组的总酸含量为8.16g/100ml，对照组1为7.60g/100ml，相比于对照组1，总酸提升了7.4％，实施例1和对照组1 的总酸含量变化曲线如图2所示。
44.7、有机酸含量检测
45.采用hplc对发酵结束的醋卤中7种有机酸含量进行分析，结果如表1所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在实施例1中的含量分别为56.85 mg/ml和14.52mg/ml，相比于对照组1分别提高了15.71％和17.19％。
46.表1 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在镇江香醋酿造中的有机酸含量
[0047][0048]
8、生醋液中乙偶姻和川芎嗪含量检测
[0049]
采用肌酸比色法测定乙偶姻含量，具体方法为：精准配制浓度分别为25、50、75、 100、125、175、225mg/l的一系列乙偶姻标准溶液。分别取标准液100μl，加入2.4 m l去离子水、0.5ml肌酸溶液(0.5％，w/v)、0.5ml l-萘酚溶液(5％，w/v)、0.5ml 氢氧化钠溶液(10％，w/v)，混匀，于30℃水浴1h后，测定溶液od
520nm
。以乙偶姻浓度为横坐标，od
520nm
为纵坐标绘制标准曲线。取稀释后样品100μl，根据标准曲线测定方法得到样品od
520nm
，利用标准曲线计算乙偶姻含量。采用hplc法测定川芎嗪含量，具体方法为：精准配制浓度分别为5、10、25、50、100mg/l的一系列川芎嗪标准溶液，利用hplc法得到标准曲线。准确量取10ml醋液，用氢氧化钠调节ph 大于8，用10ml氯仿分两次萃取醋液，合并两次氯仿相，再用9ml稀盐酸溶液(0.2 mol/l)分两次萃取氯仿相，合并水相后用稀盐酸定容至10ml，所得溶液按照标准曲线的测定方法得到川芎嗪峰面积，根据标准曲线计算川芎嗪含量。生醋液中乙偶姻和川芎嗪含量的检测结果如表2所示。
[0050]
表2 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在镇江香醋酿造中的乙偶姻、川芎嗪含量
[0051]
组别乙偶姻(g/l)川芎嗪(mg/l)实施例121.89216.23对照组19.6135.38
[0052]
9、成品醋感官指标分析
[0053]
实施例1与对照组1的食醋产品感官指标评分结果见表3。实施例1的成品醋香味及滋味明显优于对照组1，说明在醋酸发酵阶段添加贝莱斯芽孢杆菌，显著提高了产品品质。
[0054]
表3 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在镇江香醋酿造中的成品醋感官指标分析
[0055]
组别色泽(10分)体态(10分)香味(10分)滋味(10分)实施例19.09.19.69.2对照组18.89.07.06.4
[0056]
实施例2贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在山西老陈醋中的应用
[0057]
1、菌株的扩大培养
[0058]
一级种子液的制备：按照10％(v/v)的接种量，将纯化后、处于对数生长期的贝莱斯芽孢杆菌hscy3015菌液接种到mrs培养基中，温度37℃，转速200r/min培养36h。
[0059]
二级种子液的制备：选用50l液态发酵罐，加水35l，搅拌速度为150r/min，将水加热到95℃，加入经粉碎并过100目筛得到的米粉12kg，加入2万u/ml、高温α
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淀粉酶，添加量为3.5ml，保温40min得到醪液；然后将醪液温度降至55℃，加入5 万u/g糖化酶，添加量为1.0g，保温40min，制得糖化液；在所制备的糖化液中添加 2.0％(w/v)的蛋白胨和2.0％(w/v)酵母粉，115℃灭菌20min，冷却至37℃后，按照10％ (v/v)的接种量接入一级种子液，调
整通气量为0.3vvm，搅拌速度为150r/min，37℃保压发酵36h，活菌数达到108cfu/ml。
[0060]
2、醋醅接种发酵
[0061]
对照组2：
[0062]
选取500kg大缸，加入酒醪150kg，麸皮50kg，大糠33kg，将所投原料充分拌匀后，接种购自cicc、菌株保藏编号为cicc 20001的醋酸菌，接种量为酒醪重量的10％，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行发酵、熏醅、淋醋。
[0063]
添加贝莱斯芽孢杆菌组：
[0064]
选取500kg大缸，加入酒醪150kg，麸皮50kg，大糠33kg，将所投原料充分拌匀后，接种购自cicc、菌株保藏编号为cicc 20001的醋酸菌，接种量为酒醪重量的10％，以酒醪重量5％的接种量接入贝莱斯芽孢杆菌的二级种子液，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行发酵、熏醅、淋醋。
[0065]
3、总酸含量
[0066]
从发酵第3天开始至发酵第12天结束，每天取底部醋卤进行检测。总酸以乙酸计采用酸碱滴定法测定。发酵结束时，添加贝莱斯芽孢杆菌组的总酸含量为5.42g/100ml，对照组2为4.90g/100ml，相比于对照组2，总酸提升了10.61％，实施例2和对照组2 的总酸含量变化曲线如图3所示。
[0067]
4、有机酸含量
[0068]
采用hplc对发酵结束的醋卤中7种有机酸含量进行分析，结果如表4所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在实施例2中的含量分别为29.73 mg/ml和11.36mg/ml，相比于对照组2分别提高了14.83％和17.84％。
[0069]
表4 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在山西老陈醋酿造中的有机酸含量
[0070][0071]
5、生醋液中乙偶姻和川芎嗪含量检测
[0072]
采用肌酸比色法测定乙偶姻含量，采用hplc法测定川芎嗪含量，结果如表5所示。
[0073]
表5 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在山西老醋酿造中的乙偶姻、川芎嗪含量
[0074]
组别乙偶姻(g/l)川芎嗪(mg/l)实施例223.16362.52对照组28.4395.89
[0075]
6、成品醋感官指标分析
[0076]
实施例2与对照组2的食醋产品感官指标评分结果见表6。实施例2的成品醋香味及滋味明显优于对照组2，说明在醋酸发酵阶段添加贝莱斯芽孢杆菌，显著提高了产品品质。
[0077]
表6 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在山西老陈醋酿造中的成品醋感官指标分析
[0078]
组别色泽(10分)体态(10分)香味(10分)滋味(10分)实施例29.59.29.69.7
对照组29.39.07.16.5
[0079]
实施例3贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在液态米醋酿造中的应用
[0080]
1、贝莱斯芽孢杆菌菌剂制备
[0081]
将贝莱斯芽孢杆菌按照10％的接种量接种到mrs培养基中，温度40℃，转速220 r/min培养48h，离心收集菌体，将无菌保护剂与菌体均匀混合放置在45℃的培养箱中热激8s，再利用低温喷雾干燥制得菌剂，贝莱斯芽孢杆菌的活菌数约为108cfu/g菌剂，阴凉干燥条件下贮存期为1年。
[0082]
无菌保护剂的制备：上述的保护剂制备方法为：a：脱脂奶粉10g，蒸馏水100ml， 115℃灭菌15min；b：甘油0.5g、山梨醇2g、木糖醇1g、麦芽糊精1g、蒸馏水100ml， 121℃灭菌15min；a，b分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
[0083]
底物喷雾干燥工艺参数：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间5min，水分含量为≤5％。
[0084]
2、接种发酵
[0085]
选取2个500l发酵罐设为实施例3和对照组3，分别加入100l酒精度为6～8％vol 的米酒，按照10％的接种量接入购自cicc、菌株保藏编号为cicc 20001的醋酸菌，温度为30℃，调整通气量为0.34vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。待酒精度降至3％vol以下时，实施例3发酵罐中加入5g活化好的贝莱斯芽孢杆菌，对照组3发酵罐中不添加，继续进行醋酸发酵。其中活化方法为：1g菌剂溶解到10ml无菌水中， 35℃活化30min后备用。
[0086]
3、理化指标检测
[0087]
发酵结束后分别对酿造的米醋中总酸、乳酸及乙偶姻含量进行检测，如表7所示。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。乳酸采用高效液相色谱法，参照《gb/t 18623-2011 地理标志产品镇江香醋》附录b中方法。乙偶姻含量采用肌酸比色法测定。结果如表7 所示。
[0088]
表7 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在米醋酿造中理化指标检测
[0089][0090][0091]
4、成品醋感官指标分析
[0092]
实施例3与对照组3的米醋产品感官指标评分结果见表8。实施例3成品醋的滋味得分明显优于对照组3，说明在醋酸发酵阶段添加贝莱斯芽孢杆菌，对米醋滋味贡献明显，显著提升了产品品质。
[0093]
表8 贝莱斯芽孢杆菌hscy3015在米醋酿造中的成品醋感官指标分析
[0094]
组别色泽(10分)体态(10分)香味(10分)滋味(10分)实施例39.79.59.89.6对照组39.69.56.97.1