一种可降解中空有机硅纳米粒子及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物材料领域，尤其涉及一种可降解中空有机硅纳米粒子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.世界范围内，癌症的发生率和致死率都在逐年上升，因此如何预防癌症以及如何对癌症采取有效的治疗是目前的研究重点所关注的。
3.目前针对癌症的治疗方式主要取决于患者所处的进展期，根据其身体状况及肿瘤情况进行对应的选择包括但不限于放射治疗、化学治疗、手术切除、小分子靶向治疗、免疫疗法等等。目前，临床上的治疗普遍副作用大、患者生存期改善及预后较差，所以目前对癌症治疗的研究除了癌症发病的分子机理、新药的设计合成、新的分子靶点的预测及发现以外主要集中在药物的高效性和合理性递送。硅基相关材料由于其易于合成、修饰便捷、生物相容性良好的特性被作为药物递送的常用材料。
4.气体治疗是近年新兴的领域之一。生物体内存在一系列的特殊的气体分子例如no、co、h2s，其能够与过渡金属相配位结合作为信使传递信号从而对人体内生理过程例如神经系统、心血管系统、免疫系统等进行调控。有研究发现no、co具有选择性抗癌的作用，即通过抗沃伯格效应消耗癌细胞内能量加速癌细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖从而达到抑制肿瘤生长和发展的目的。利用该类气体的选择性抗癌有利于降低治疗的副作用、减少化疗药物的使用。但是这些在血液中的含量过高易引起中毒，所以需要安全有效的载体防止其时空不匹配的释放，实现时空恰当的递送。
5.肿瘤疫苗在近年来也得到了发展，通过将肿瘤抗原如肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白、肿瘤相关多肽、肿瘤相关核酸递送至患者体内，激发患者的自身免疫系统，从而达到抑制肿瘤生长和进展的目的。目前的肿瘤疫苗主要分为通用型的肿瘤疫苗和个性化的肿瘤疫苗，其中通用型的肿瘤疫苗主要采取的是肿瘤相关抗原，即在机体内存在且仅在肿瘤细胞表面高表达的相关蛋白；而个性化的肿瘤疫苗选择将肿瘤细胞特异性表达的相关蛋白作为抗原。通过对抗原进行负载递送，激活免疫也是重要的肿瘤治疗办法。
6.但目前用于药物递送硅基材料存在着降解性、载药量低等的缺点，以硅为载体的纳米粒子以二氧化硅及其衍生硅纳米粒子为主，其主体仅作为载体存在，有着载量低、不可降解、潜在毒性的可能；也有一些研究使用有机硅利用其还原响应性裂解作为载体而降低其潜在毒性的可能但其响应性过于敏感可能会引起药物的提前释放；并且而气体如no、co的直接吸入会造成血液中气体浓度过高，引起中毒，抗原递送也需要响应的载体提高免疫应答的效率。


技术实现要素：

7.为了解决上述技术问题，本发明提供一种可降解中空有机硅纳米粒子及其制备方法和应用。本发明所述的可降解中空有机硅利用壳层中空结构对药物/抗原进行高效负载
有效减少了载体使用量，并且利用有机硅的还原响应性实现药物的可控释放并同时消耗肿瘤细胞内部的过量谷胱甘肽，其无机硅成分为结构提供一定的刚性，能提高整体的选择性，避免药物的提前释放，此种有机硅与无机硅的结合方式合成的纳米载体在递送货物的同时有效降低了无用载体成分的使用量，其本身能消耗肿瘤细胞内的多余谷胱甘肽，也为其可降解的特性为安全递送提供了保证，降低材料整体的潜在毒性在有效杀死肿瘤细胞的同时提高了安全性。
8.第一方面，本发明提供的可降解中空有机硅纳米粒子包含壳层，所述壳层为含二硫键的有机硅与无机硅的复合层，所述复合层由以btes为有机硅源和teos为无机硅源制备而成，所述btes与所述teos的体积比9:1～1:9。
9.本发明提供的具有生物活性的可降解硅纳米粒子为中空结构的含二硫键有机硅与无机硅的复合层。通过采用所述复合层使得水分散性好以及高货物负载量，更好地用于气体前药的递送和抗原及佐剂的递送，并能控制载体的降解性能。同时，可降解硅纳米粒子利用壳层中空结构对药物/抗原进行高效负载有效减少了载体使用量，在递送货物的同时有效降低了无用载体成分的使用量，其本身还能消耗肿瘤细胞内的多余谷胱甘肽，其无机成分也能从结构上保持空心的刚性避免其过早释放。有机无机杂化外壳的设计能更好实现药物/抗原的可控释放，为更安全递送提供了保证，在有效杀死肿瘤细胞的同时提高了安全性。所述的可降解中空有机硅纳米粒子的壳层的硅源采用有机硅源和无机硅源的混合物以调节载体降解速率实现对货物的释放。
10.根据本发明，壳层沉积中有机硅源和无机硅源的体积比例在9:1～1:9。例如可以是9:1、8:2、7:3、6:4、5:5(1:1)、4:6、3:7、2:8或1:9，以及上述数值之间的具体数值，优选的，有机硅源btes和无机硅源teos的体积比为1:1。本发明以特定比例的btes和teos能更好发挥两者间协同作用，能够使得效果更佳，还能更好的调节载体降解速率实现对货物的释放且壳层性能最佳。
11.进一步优选，还包括所述壳层内负载的药物、肿瘤抗原和佐剂中的至少一种；优选的，所述药物为化疗药物、一氧化碳前药和一氧化氮前药中的至少一种；更优选为一氧化碳前药mn2(co)
10
。
12.为了进一步提高载药有机硅纳米颗粒的入胞效果，本发明对纳米粒子结构参数进行了优化，所述壳层的厚度为20～40nm；和/或，所述可降解中空有机硅纳米粒子的粒径为180～240nm。
13.进一步优选，所述可降解中空有机硅纳米粒子的粒径尺寸在150～200nm，例如150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、175nm、180nm、185nm、190nm、195nm或200nm以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，本发明中更佳的粒径尺寸为200nm左右。
14.第二方面，本发明提供一种可降解中空有机硅纳米粒子(载体)的制备方法。可采用硬模板法以分散性超好的二氧化硅球作为模板，以一定比例的有机硅源btes和无机硅源teos作为硅源，在模板表面水解沉积生长一层无机硅和含二硫键的有机硅的复合结构作为壳层最后再选择性刻蚀掉内部的二氧化硅球。具体的，所述的可降解中空有机硅纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
15.1)以氨水为催化剂，teos为无机硅源，在搅拌的条件下在有机溶剂-水复合溶剂体
系中进行水解，进行洗涤重悬，得二氧化硅核；
16.2)将步骤1)中所述二氧化硅核与含ctac、tea的均匀水溶液体系进行混合，搅拌，得到含二氧化硅核的均匀分散液；
17.3)将teos与btes的混合溶液在高温下缓慢滴加入步骤2)中所述含二氧化硅核的均匀分散液中反应一段时间，得到的沉淀进行洗涤，重悬，得核壳复合硅纳米粒子；
18.4)采用刻蚀剂对步骤3)中所述核壳复合硅纳米粒子进行选择性刻蚀，得粗hos；
19.5)利用盐的甲醇溶液对步骤4)中所述粗hos进行萃取，得去除表面活性剂的hos纳米粒子；以及，任选的
20.6)对步骤5)中所述hos纳米粒子进行药物负载。
21.本发明的方法制备可降解中空有机硅纳米粒子能提高药物/抗原的传输量、增强药物疗效、降低药物副作用、增强免疫的目的。
22.作为优选，根据所述的可降解中空有机硅纳米粒子的制备方法，步骤1)中，所述有机溶剂为氯仿、甲醇、乙醇、二氯甲烷或四氢呋喃；优选为乙醇。
23.本发明通过采用优化处理条件下能够使得所制纳米粒子效果更佳。
24.进一步优选，步骤1)中，所述搅拌为磁力搅拌。
25.进一步优选，步骤1)中，所述有机溶剂:水:氨水:teos的体积比为33～40:3～7:0.8～1.5:2～4；优选37:5:1:3。
26.进一步优选，步骤1)中，所述洗涤重悬的步骤为：在7000～9000rpm下离心5～10min；离心后的沉淀中加入5～20ml乙醇，分散均匀，离心，重复多次；再于沉淀中加入5～20ml水，分散，离心，重复多次，然后重悬于10～50ml水中；优选的，在8000rpm下离心8min；离心后的沉淀中加入10ml乙醇，分散均匀，离心，重复三次；然后于沉淀中加入10ml三次水，分散，离心，重复三次，最后重悬于30ml三次水中。
27.根据本发明优选实施方式，所述二氧化硅球具有很好的分散性，所述二氧化硅球的粒径为100nm～400nm，例如可以是100nm左右、200nm左右、300nm左右或400nm左右以及上述数值之间的具体数值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，优选200nm左右。
28.进一步优选，步骤2)中，所述均匀水溶液体系为ctac(溶液)、tea和水按比例1～3g：0.03～0.05g：80～100ml混合的均匀溶液；所述ctac的浓度优选为22～27wt％；进一步优选，所述ctac和所述tea的质量比为2:0.04。ctac(25wt％)，2g；tea，0.04g；三次水，90ml。
29.进一步优选，所述二氧化硅核为步骤1)得到的30ml sio2重悬液。
30.进一步优选，步骤2)中，所述搅拌为磁力搅拌，优选地，搅拌时间2h。
31.作为优选，根据所述的可降解中空有机硅纳米粒子的制备方法，步骤3)中，所述btes与teos的体积比9:1～1:9，优选1:1。
32.进一步优选，步骤3)中，所述高温为75～90℃，优选80℃。
33.进一步优选，步骤3)中，所述搅拌为磁力搅拌。
34.进一步优选，步骤3)中，所述的缓慢滴加为10～15滴/min。
35.进一步优选，步骤3)中，所述反应的时间为1～3h，优选2h。
36.进一步优选，步骤3)中，所述洗涤的试剂为乙醇。
37.进一步优选，步骤3)中，洗涤条件如下：首先离心条件为8000rpm，8min；离心后的
沉淀中加入10ml乙醇，分散均匀，离心，重复两次。再于沉淀中加入10ml三次水，分散，离心，重复三次，最后重悬于30ml三次水中。
38.作为优选，根据所述的可降解中空有机硅纳米粒子的制备方法，步骤4)中，所述刻蚀剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠、碳酸铵和碳酸钠中的一种或多种，优选碳酸钠。
39.进一步优选，步骤4)中，所述刻蚀剂的浓度为0.01～0.1m。
40.本发明中，所述刻蚀剂为碱性试剂，选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠、碳酸铵和碳酸钠中的一种或多种，也可以是其它具有碱性的物质，优选为碳酸钠。所述刻蚀剂的浓度可以为0.01m～0.1m，例如可以是0.01m、0.02m、0.03m、0.04m、0.05m、0.06m、0.07m、0.08m、0.09m或0.1m以及上述数值之间的具体数值，优选0.05m的碳酸钠溶液浓度。刻蚀时间为2h～24h，例如可以是2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h以及上述数值之间的具体数值，优选10h。按此比例合成的可降解中空有机硅纳米粒子稳定好，分散性好，负载量大，有极大潜力作为药物/抗原的递送载体。
41.进一步优选地，步骤4)中，具体包括：
42.a、配置碳酸钠溶液；
43.b、将步骤3)得到的mos溶液进行超声；
44.c、将步骤a中碳酸钠溶液稀释；
45.d、将超声后的mos溶液与稀释后的碳酸钠溶液混合；
46.e、将步骤c中混合溶液搅拌反应；
47.f、将反应产物离心洗涤。
48.优选地，步骤a中，所述的碳酸钠溶液浓度为1m。
49.和/或，步骤b中，所述超声时间为10～20min。
50.和/或，步骤b中，所述的mos溶液体积为10ml。
51.和/或，步骤c中，所述稀释后的碳酸钠溶液的终浓度为0.01～0.1m，优选0.05m。
52.和/或，步骤e中，所述搅拌为磁力搅拌。
53.和/或，步骤e中，所述搅拌的温度为25℃。
54.和/或，步骤e中，所述的反应时间为10h。
55.和/或，步骤f中，所述离心洗涤条件为13000rpm，10min。
56.进一步优选，步骤5)中，所述盐的甲醇溶液为nacl甲醇溶液。
57.进一步优选，步骤5)中，具体包括：将10ml mos粗溶液与质量分数为1.5％的nacl甲醇溶液等体积混合在摇床上孵育10h，然后在13000rpm，10min的条件下离心得到hos沉淀，重悬在10ml甲醇中，再将其与等体积质量分数为1.5％的nacl甲醇溶液等体积混合在摇床上孵育10h，同样的离心条件下用甲醇洗涤两次，水洗涤两次，分散在10ml水中冷冻干燥得到hos粉末。
58.作为优选，根据所述的可降解中空有机硅纳米粒子的制备方法，所述步骤6)中，具体包括：
59.a、将所述冻干后得到的hos纳米粒子溶于有机溶剂，得到第一分散液；
60.b、将一氧化碳前药mn2(co)
10
溶于所述有机溶剂，得到第二溶液；
61.c、将所述第一溶液和所述第二溶液混合，得到第三分散液；
62.d、将第三分散液在2～6℃条件下搅拌；
63.e、将步骤d中经搅拌的第三分散液离心，依次用甲醇和水洗涤。
64.进一步优选，所述步骤b-d在避光条件下进行。
65.进一步优选，步骤a中，所述第一分散液中的hos纳米粒子的浓度为0.1～2mg/ml；例如可以是0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.6mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml 1.8mg/ml、1.9mg/ml、或2mg/ml，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，最优选浓度为1mg/ml，浓度过大过小都会影响载药效率。
66.进一步优选，步骤a和b中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇中的任意一种，优选为甲醇。
67.进一步优选，步骤b中，所述一氧化碳前药mn2(co)
10
的浓度为0.1～2mg/ml；例如可以是0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.6mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml 1.8mg/ml、1.9mg/ml、或2mg/ml，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，最优选浓度为2mg/ml。
68.进一步优选，步骤c中，所述混合的方式为超声，所述第一分散液和所述第二分散液的体积比为0.1:1.9～1.9:0.1；例如可以是0.1:1.9、0.2:1.8、0.3:1.7、0.4:1.6、0.5:1.5、1:1、1.3:0.7、1.8:0.2或1.9:0.1，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值，最优选，所述第一分散液和所述第二分散液的总体积为1ml，所述第一分散液和所述第二分散液的体积比1:1。
69.进一步优选，步骤d中，在3～5℃条件下搅拌，搅拌时间为12～24h。
70.进一步优选，第三分散液在4℃的搅拌时间为12h～24h，例如可以是12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值优选12h。
71.进一步优选，步骤e中，所述离心的转速为8000～12000rpm，离心时间为5min～20min；例如可以是8000rpm、9000rpm、9100rpm、9300rpm、10000rpm、10500rpm、11000rpm或13000rpm，优选13000rpm；离心时间优选为5min～20min，例如5min、8min、12min、15min或20min，优选10min。重悬体积为1ml。
72.本发明制备的具有生物活性的可降解纳米粒子能够增强被负载药物在水中的分散性，增强其对a549肺癌细胞的毒性。且该可降解中空有机硅纳米粒子具有较好安全性，对肺正常上皮细胞b2b生长无明显影响。
73.第三方面，本发明提供所述的可降解中空有机硅纳米粒子或所述的可降解中空有机硅纳米粒子的制备方法在制备抑制a549肺癌细胞肿瘤生长的药物中的应用。
74.本发明的有益效果至少在于：本发明所述的可降解中空有机硅纳米粒子，主要以分散性超好的二氧化硅球为模板，水解法在其表面沉积了有机硅无机硅的复合涂层，其在水中、醇类溶剂中都有较好的分散性，利于水溶性差的药物的负载，利用有机无机复合的特性调节材料的降解能力从而达到时空耦合的药物/抗原释放，其潜力在于能够进行不同修饰，水溶性差药物载带、货物高负载、从而达到有效地增强肿瘤治疗/肿瘤免疫的目的。
附图说明
75.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现
有技术描述中需要使用的附图作简单介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
76.图1实施例1制备得到的sio2、sio2@os、hos的透射电镜图；
77.图2为实施例1步骤(1)制备得到的分散性超好的sio2透射电镜图；
78.图3为实施例1制备得到的hos的高倍透射电镜图；
79.图4为实施例1制备得到的hos和ctac的傅立叶变换红外光谱图；
80.图5为实施例1制备得到的hos的扫描电镜图；
81.图6为实施例1制备得到的hos的能谱图；
82.图7为实施例1制备得到的hos的能谱图；
83.图8为实施例1制备得到的hos的能谱图；
84.图9为实施例1制备得到的hos的能谱图；
85.图10为实施例2制备得到的mn2(co)
10
@hos的上清的标准曲线图；
86.图11为对比例1制备得到的纳米粒子电镜图；
87.图12为对比例2制备得到的纳米粒子电镜图；
88.图13为对比例3制备得到的纳米粒子电镜图；
89.图14为实施例3得到的a549肺癌细胞活力图；
90.图15为实施例4得到的b2b正常肺上皮细胞活力图；
91.图16为实施例5得到的b2b正常肺上皮细胞活力图；
92.图17为实施例6得到的a549肺癌细胞的活力图。
具体实施方式
93.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
94.本发明中，部分缩写的英文全称：
95.hos
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
hollow organic silica nanoparticles；
96.teos
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
tetraethoxysilane；
97.btes
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
bis[3-(triethoxysilyl)propyl]tetrasulfide；
[0098]
sio2@os
ꢀꢀꢀꢀ
organic silica coated sio2。
[0099]
实施例1
[0100]
在本实施例中，通过以下方法制备分散性超好，具体包括以下步骤：
[0101]
(1)sio2核的合成：将37ml无水乙醇，5ml超纯水和1ml氨水(25％～28％)混合，在25℃恒温水浴以800rpm的转速搅拌20min，然后匀速滴加3ml teos。滴加完毕后1分钟将转速调整至400rpm反应1h。反应完毕后在8000rpm，8min的条件下离心弃去上清，在同样的离心条件下用乙醇洗涤三次，水洗三次将白色沉淀产物分散在30ml超纯水中；
[0102]
(2)sio2@os的合成：于250ml圆底烧瓶中加入2g ctac(25％)，0.04g三乙醇胺及
90ml超纯水。在800rpm的转速下混合2h。然后加入30ml前一步骤制备的sio2溶液，在同样的转速条件下再搅拌2h。然后在80℃的油浴条件下滴加0.5ml btes 0.5ml teos的混合溶液，并在此温度下搅拌2h。待产物冷却后离心。将得到的sio2@os产物在8000rpm，8min离心。离心得到沉淀用乙醇在同样的离心条件下洗涤三次，水洗三次，分散在30ml超纯水中，得mos溶液；
[0103]
(3)粗hos的合成：配置5.21ml 1m的碳酸钠溶液待用。将前一步骤的10ml mos溶液超声15min以分散均匀。于250ml圆底烧瓶中加入超纯水和5.21ml 1m的碳酸钠溶液在400rpm的转速下将溶液混合均匀，得0.05m的碳酸钠溶液。待两溶液分别分散均匀后，将10ml mos溶液加入碳酸钠溶液。在同样的转速条件下在25℃反应10h。反应完毕后将产物在13000rpm，10min的条件下离心，用超纯水将得到的沉淀洗涤三次分散在10ml甲醇中得到粗hos溶液；
[0104]
(4)活性剂的去除：将10ml粗hos粗溶液与质量分数为1.5％的nacl甲醇溶液等体积混合在摇床上孵育10h，然后在13000rpm，10min的条件下离心得到hos沉淀，重悬在10ml甲醇中，再将其与等体积质量分数为1.5％的nacl甲醇溶液等体积混合在摇床上孵育10h，同样的离心条件下用甲醇洗涤两次，水洗涤两次，分散在10ml水中冷冻干燥，得到hos粉末。
[0105]
利用透射电镜hitachi ht7700对sio2、sio2@os、hos进行表征，如图1。
[0106]
利用透射电镜hitachi ht7700对sio2的尺寸大小进行了表征，如图2。
[0107]
利用透射电镜hitachi ht7700对hos的介孔结构进行了表征，如图3所示，hos的粒径为200nm左右，介孔层厚度为25nm左右。
[0108]
利用傅立叶变换红外光谱对hos进行表征，如图4。
[0109]
利用扫描电镜s4800对hos进行表征，如图5。
[0110]
利用能谱对hos进行表征，如图6、7、8、9。
[0111]
实施例2
[0112]
在本实施例中，通过以下方法负载制备一氧化碳前药mn2(co)
10
纳米药物，具体包括以下步骤：
[0113]
(1)称取1mg合成的中空硅纳米粒子并加入0.5ml甲醇，充分溶解，得到溶液a；
[0114]
(2)避光条件下，称取1mg一氧化碳前药mn2(co)
10
加入0.5ml甲醇，充分溶解得到溶液b；
[0115]
(3)避光条件下，将溶液a和b于2ml棕色瓶内混合均匀，超声2min，得到溶液c；
[0116]
(4)避光条件下，在4℃搅拌12h；
[0117]
(5)将得到的产物以13000rpm，10min的条件进行离心，并用甲醇洗涤三次收集上清用于测量负载量，再水洗一次重悬于水中冻干保存；
[0118]
利用紫外可见光光谱法对mn2(co)
10
的负载量进行测定，配制mn2(co)
10
的标准浓度的样品用标准曲线法对上清浓度进行测定。测得负载率为331mg mn2(co)
10
/g hos，如图10。
[0119]
对比例1使用氢氧化钠刻蚀mos
[0120]
前面步骤均与实施例1中的(1)(2)一致，仅将0.05m的碳酸钠溶液更换为0.05m的氢氧化钠，刻蚀时间为10h，其余步骤同实施例1。得到的纳米粒子大多因刻蚀过度而结构塌陷(如图11)对比例2使用0.01m碳酸氢钠浓度刻蚀os
[0121]
前面步骤均与实施例1中的(1)(2)一致，碳酸钠的浓度为0.01m，刻蚀时间为10h，
其余步骤同实施例一。得到的纳米粒子大多均为实心颗粒(如图12)。
[0122]
对比例3使用0.02m碳酸氢钠浓度刻蚀os
[0123]
前面步骤均与实施例1中的(1)(2)一致，仅碳酸钠的浓度为0.02m，刻蚀时间为10h，其余步骤同实施例1。得到的纳米粒子大多均为略带壳层的实心颗粒(如图13)。
[0124]
实施例3
[0125]
在本实施例中，通过以下方法进行不同浓度的负载一氧化碳前药mn2(co)
10
纳米药物细胞毒性检测，具体包括以下步骤：
[0126]
将细胞以7000细胞/孔密度接种到96孔板中，待其过夜贴壁后，将含不同浓度一氧化碳前药mn2(co)
10
的纳米药物(来自实施例1和2，其浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)加入孔中，处理24小时后，撤掉培养基；每孔加入110μl，含10％(体积比)cck-8的细胞培养基，等待约半小时后96孔板内细胞变至黄色，在酶标仪上测定450nm处吸光度值，600nm作为参比波长。每组吸光度值扣除空白溶液吸光度值后，每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。每组设置4个平行孔。
[0127]
细胞活力测定结果如图14所示，与对照组相比，实施例1制备的纳米药物载体对a549肺癌细胞能产生显著性的杀伤作用。
[0128]
实施例4
[0129]
在本实施例中，通过以下方法进行不同浓度的hos纳米载体对正常肺上皮细胞的影响检测，具体包括以下步骤：
[0130]
将b2b肺正常上皮细胞以7000细胞/孔密度接种到96孔板中，待其过夜贴壁后，将含不同浓度hos的空纳米载体(来自实施例1，其浓度分别为62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、和250μg/ml)加入孔中，处理24小时后，撤掉培养基；每孔加入110μl，含10％(体积比)cck-8的细胞培养基，在培养箱中继续培养约半小时后孔板内细胞变至黄色，在酶标仪上测定450nm处吸光度值，600nm作为参比波长。每组吸光度值扣除空白溶液吸光度值后，每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。每组设置4个平行孔。
[0131]
细胞活力测定结果如图15所示，与对照组相比，实施例1制备的hos纳米空载体对正常的肺上皮细胞b2b无明显毒性作用，表明制备的纳米空载体具有较高的安全性。
[0132]
实施例5
[0133]
在本实施例中，通过以下方法进行高浓度的hos纳米载体对正常肺上皮细胞的更长时间影响检测，具体包括以下步骤：
[0134]
将b2b肺正常上皮细胞以7000细胞/孔密度接种到96孔板中，待其过夜贴壁后，将、hos的空纳米载体、一氧化碳前药mn2(co)
10
、载带一氧化碳前药mn2(co)
10
的hos(来自实施例1，其浓度为500μg/ml)加入孔中，分别处理24、48小时后，撤掉培养基；每孔加入110μl，含10％(体积比)cck-8的细胞培养基，在培养箱中继续培养约半小时后孔板内细胞变至黄色，在酶标仪上测定450nm处吸光度值，600nm作为参比波长。每组吸光度值扣除空白溶液吸光度值后，每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。每组设置4个平行孔。
[0135]
细胞活力测定结果如图16所示，与对照组相比，实施例1制备的hos纳米空载体在使用的较高浓度下对正常的肺上皮细胞b2b在24小时和48小时培养后均无明显毒性作用，表明制备的纳米空载体具有较高的安全性。
[0136]
实施例6
[0137]
在本实施例中，通过以下方法进行hos纳米载体有效性的检测，具体包括以下步骤：
[0138]
将a549肺癌细胞以7000细胞/孔密度接种到96孔板中，待其过夜贴壁后，将hos的空纳米载体(来自实施例1，其浓度为100μg/ml)游离的一氧化碳前药mn2(co)
10
(其浓度为100ug/ml)、和负载的一氧化碳前药mn2(co)
10
的hos即mn2(co)
10
@hos(来自实施例2，其浓度为100ug/ml)加入孔中，处理24小时后，撤掉培养基；每孔加入110μl，含10％(体积比)cck-8的细胞培养基，在培养箱中继续培养约半小时后孔板内细胞变至黄色，在酶标仪上测定450nm处吸光度值，600nm作为参比波长。每组吸光度值扣除空白溶液吸光度值后，每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。每组设置4个平行孔。
[0139]
细胞活力测定结果如图17所示，与对照组相比，实施例2制备的mn2(co)
10
@hos纳米药物能够明显改善mn2(co)
10
的稳定性和分散性，增强mn2(co)
10
对a549肺癌细胞的细胞毒性。
[0140]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。