一种检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变情况的试剂盒的制作方法

技术特征：
1.一种检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变情况的试剂盒，其特征在于：包括在同一qrt-pcr的反应程序下反应的第一反应管、第二反应管和第三反应管，第一至第三反应管中均含有正向检测引物、反向检测引物、内参正向引物、内参反向引物和内参探针，序列依次如seq id no.01至05所示；第一反应管中还含有如seq id no.06所示的第一检测探针和如seq id no.07所示的第二检测探针；第二反应管中还含有如seq id no.08所示的第三检测探针和如seq id no.09所示的第四检测探针；第三反应管中还含有如seq id no.10所示的第五检测探针；第一检测探针和第四检测探针的5’端修饰有第一荧光基团，3’端修饰有对应于该第一荧光基团的第一猝灭基团；第二检测探针和第三检测探针的5’端修饰有第二荧光基团，3’端修饰有对应于该第二荧光基团的第二猝灭基团；第五检测探针的5’端修饰有第三荧光基团，3’端修饰有对应于该第三荧光基团的第三猝灭基团；内参探针的5’端修饰有第四荧光基团，3’端修饰有对应于该第四荧光基团的第四猝灭基团；第一至第四荧光基团互不相同。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第一荧光基团为fam、rox、hex、cy5、tet或cal-fluor，所述第一猝灭基团为mgb或dabcyl。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第二荧光基团为fam、rox、hex、cy5、tet或cal-fluor，所述第二猝灭基团为mgb或dabcyl。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第四荧光基团为fam、rox、hex、cy5、tet或cal-fluor，所述第四猝灭基团为mgb或dabcyl。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第三荧光基团为tet，所述第三猝灭基团为dabcyl。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述第一荧光基团为rox，所述第二荧光基团为hex，所述第三荧光基团为tet，所述第四荧光基团为fam。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述第一猝灭基团和第二猝灭基团为mgb，所述第三猝灭基团为dabcyl，所述第三猝灭基团为bhq-1。8.如权利要求1至7中任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于：所述第一至第三反应管的反应体系以50μl的终体积计算，其ph为8.0，具体配方包括：tris-hcl 10-30mm，mgcl
2 3-6mm，每种dntp 0.2mm，taqdna聚合酶4-8u，内参正向引物和内参反向引物各0.1-0.4μm，正向检测引物和反向检测引物各0.1-0.4μm，内参探针0.05-0.2μm，相应的检测探针各0.05-0.2μm，海藻糖3-6％，聚乙二醇20000.5-2％，牛血清蛋白0.1-1％，甘露醇0.5-2％。9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述反应程序如下表所示：
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述反应体系的物料在未进行反应前处于冻干状态。

技术总结
本发明公开了一种检测结核分枝杆菌利福平耐药基因突变情况的试剂盒，包括在同一QRT-PCR的反应程序下反应的第一反应管、第二反应管和第三反应管，第一至第三反应管中均含有正向检测引物、反向检测引物、内参正向引物、内参反向引物和内参探针。本发明基于荧光定量聚合酶链式反应(QRT-PCR)类型中衍生的MGB探针法及分子信标法，在相同的反应体系中，使用不同的探针或分子信标，使用共3个反应管对所述耐药基因中的多个点突变位点进行检测，通过各点突变在体系中所表现的Ct值和ΔCt值，判定样本中该耐药基因的点突变类型。中该耐药基因的点突变类型。中该耐药基因的点突变类型。


技术研发人员：黄明翔
受保护的技术使用者：福建省福州结核病防治院
技术研发日：2020.12.03
技术公布日：2022/6/10