一种对艾叶下腺毛、非腺毛和气孔同时进行观察和计数的制片方法

1.本发明涉及植物显微鉴定领域，特别是一种对艾叶腺毛、非腺毛和气孔同时进行观察和计数的制片方法。


背景技术：

2.艾（artemisia argyi）为菊科(compositae) 蒿属(artemisia)植物，艾叶为艾的干燥叶，为常用中药，具有温经止血，散寒止痛的功效。艾在我国分布范围广，除极干旱与高寒地区外，几遍及全国。全国多地有栽培，历史上比较有名的四大艾包括湖北省蕲春县的“蕲艾”，河南省汤阴县的“北艾”，河北省安国市的“祁艾”，浙江省宁波市的“海艾”，近年来河南南阳的“宛艾”也比较有名。艾叶捣碎得“艾绒”，用于做灸条，艾绒是灸法的主要材料。艾的质量与产地和品种是有密切关系的，不同产地的纬度、光照、品种不同，艾叶的质量及其出绒率和艾绒的质量有较大差别。艾叶质量与挥发油和黄酮类等化学成分含量有关，艾叶表面腺毛是艾叶挥发油和黄酮类物质的主要来源，艾叶下表面的非腺毛为艾绒主要组成部分。因而艾叶腺毛和非腺毛的数量直接关系到艾叶和艾绒的质量评价，对艾叶腺毛、非腺毛的数量和分布特点进行研究可以为艾叶的高质量生产、质量控制提供实验数据和理论指导。气孔的大小和密度受阳光、温度、水分等多种因素影响，对于艾叶品种的鉴定和生理生态研究有一定意义。因此艾叶研究者非常需要对艾叶的腺毛、非腺毛和气孔的分布进行观察和计数。
3.艾叶为纸质叶，上表面的腺毛和非腺毛易于观察和计数，下表面毛被厚重，难以通过解离表皮法来观察表皮，对叶片用次氯酸钠漂白后水合氯醛透明制片法在亮视野显微镜下观察也因无法完成对下表面腺毛、非腺毛和气孔同时进行观察和计数；而扫描电子显微镜也因只能看到样品的表面，无法通过观察厚重的毛被来对下表面腺毛、非腺毛和气孔同时进行观察和计数。所以，在迄今为止，国内外研究者无论是采用光学显微镜还是扫描电子显微镜都难以对下表面的腺毛、非腺毛和气孔分布同时进行观察和统计。由于艾叶下表面t型非腺毛密集分布，其极长的顶细胞相互交错缠绕，对其有效观察和计数似乎只有对柄进行观察和统计来完成；下表面的腺毛被密集分布的t型非腺毛交错缠绕的顶细胞所覆盖，另外，受叶绿素等自发荧光所产生背景的影响，腺毛在荧光显微镜下观察起来也较为困难，导致无法同时观察艾叶下表面上腺毛、非腺毛和气孔的分布情况并完成计数。因此，需要新的特殊制片技术来解决上述这些问题。


技术实现要素：

4.针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种对艾叶腺毛、非腺毛和气孔同时进行观察和计数的制片方法，可有效解决无法同时观察艾叶下表面上腺毛、非腺毛和气孔的分布情况的问题。
5.本发明解决的技术方案是，首先采取新鲜艾叶，用小刀在叶片上切取叶片小块，置
于甲醇中浸泡固定6~12h，用蒸馏水漂洗而后转移至次氯酸钠溶液中漂白至无色，用蒸馏水漂洗再转移至组织透明剂中透明5~10min，再将材料取出用0.01~0.1%的番红溶液染色0.5~5min，水封片后，用光学显微镜观察，非腺毛柄部和腺毛染成红色，能清晰观察到下表面腺毛、非腺毛和气孔的分布并完成计数。
6.本发明方法具有操作简单、成本低、工作量小、成功率高、观察清晰的特点，可以圆满解决艾叶腺毛、非腺毛和气孔的观察计数技术难题，且对操作人员技术要求不高，是制片方法上的创新。
附图说明
7.图1为本发明对艾叶下表面腺毛和非腺毛观察示意图。
8.图2为本发明对下表面气孔非腺毛观察示意图。
9.图3为本发明对上表面观察示意图。
具体实施方式
10.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
11.实施例1本发明在具体实施时，具体包括以下步骤：1）采取新鲜艾叶，用蒸馏水漂洗1~3min以除去表面的灰尘；2）将漂洗好的叶晾干表面水分，用小刀在叶上切取长宽各8~10mm的小块叶片，注意尽量不要带有较大的叶脉，置于甲醇中浸泡固定6~12h；3）从甲醇中取出叶片，转移至正己烷中浸泡1~3h；4）将叶片从正己烷中取出，用蒸馏水漂洗1~3min；而后转移至5~8%次氯酸钠溶液中漂白至无色；5）将叶片从次氯酸钠溶液中取出，用蒸馏水漂洗再转移至组织透明剂中透明5~10min；6）再将材料取出用0.01~0.1%的番红水溶液染色0.5~5min；7）将叶片从番红水溶液中取出水封片后，用水漂洗5~10s，用10~20%的稀甘油封片制成临时玻片，压平，放在光学显微镜下观察；8）在亮视野显微镜下调好焦，并调好光亮度后，可以观察到t形非腺毛的柄和腺毛的头部都被番红染成红色，可以清晰看到腺毛和非腺毛的分布并方便计数；9）如果用荧光显微镜观察，在亮视野下观察清晰后，再用蓝光激发，不仅能看到腺毛和非腺毛的分布，并且能看到气孔的分布并完成计数。
12.实施例2本发明在具体实施时，具体包括以下步骤：1）采取新鲜艾叶，用蒸馏水漂洗2min以除去表面的灰尘；2）将漂洗好的叶晾干表面水分，用小刀在叶上切取长宽各9mm的小块叶片，注意尽量不要带有较大的叶脉，置于甲醇中浸泡固定9h；3）从甲醇中取出叶片，转移至正己烷中浸泡2h；4）将叶片从正己烷中取出，用蒸馏水漂洗2min；而后转移至6%次氯酸钠溶液中漂
白至无色；5）将叶片从次氯酸钠溶液中取出，用蒸馏水漂洗再转移至rapiclear 1.52组织透明剂中透明7min；6）再将材料取出用0.05%的番红水溶液染色3min；7）将叶片从番红水溶液中取出水封片后，用水漂洗7s，用15%的稀甘油封片制成临时玻片，压平，放在光学显微镜下观察；8）在亮视野显微镜下调好焦，并调好光亮度后，可以观察到t形非腺毛的柄和腺毛的头部都被番红染成红色，可以清晰看到腺毛和非腺毛的分布并方便计数；9）如果用荧光显微镜观察，在亮视野下观察清晰后，再用蓝光激发，不仅能看到腺毛和非腺毛的分布，并且能看到气孔的分布并完成计数。
13.要指出的是，上述仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或者修饰为等同变化的等效实施例，均落在本发明的保护范围内。
14.本发明制片方法经多次反复试用和实验，结果表明，甲醇固定后不仅能保持叶表皮的形态，也可以破坏叶绿体中的色素，避免对荧光显色的干扰，从而改变了观察的背景，正己烷可以溶解非腺毛和腺毛表面的蜡质层，避免其在用荧光显微镜下观察时自发荧光的干扰，次氯酸钠漂白完全避免色素对亮视野观察时对光透射的影响，rapiclear 1.52组织透明剂代替常用的水合氯醛，可以避免自身产生荧光影响对目标的观察，观察结果如图1-3所示，证明本发明可以在亮视野下看到腺毛和非腺毛的分布（图1），改用蓝光激发，不仅能看到腺毛和非腺毛的分布，并且能看到气孔的分布，从而可以同时观察到腺毛、非腺毛和气孔并完成计数（图2），把叶片翻过来放置后，可以观察到上表面的腺毛、非腺毛（柄部）和表皮细胞形状（图3）。
15.本制片技术操作简单，仅用亮视野显微镜观察时就可以清晰看到腺毛和非腺毛的分布，非常有利于统计腺毛和非腺毛的数量，如果需要同时观察气孔，可以在荧光显微镜下观察即可观察到气孔分布并进行计数，利用该方法可以用同一材料看到上表面的腺毛和非腺毛（毛基）的分布以及表皮细胞形状。
16.综上，本发明找到一种用于观察植物表皮毛形态的染色制片方法，可以圆满解决长期以来困扰研究者观察艾叶表皮毛分布并进行计数的一个技术难题，并且根据需要用同一材料在荧光显微镜下同时可观察到气孔分布并进行计数，且对仪器要求简单，对操作人员技术要求不高，具有操作简单，成本低，工作量小，成功率高，观察清晰，效果好的特点，圆满解决了现有的技术难题，是对艾叶腺毛、非腺毛和气孔同时进行观察和计数的制片方法上的创新，具有良好的经济和社会效益。