一种基于动物模型评价薄荷醇添加对口含烟烟碱代谢影响的方法与流程

1.本发明涉及动物模型评价方法，具体涉及一种基于动物模型评价薄荷醇添加对口含烟烟碱代谢影响的方法。


背景技术：

2.口含烟经消化道吸收的生物利用率低，主要因为大量烟碱在肝脏的首过代谢中被消耗。而人体摄入烟碱的70-80%都由cyp2进行代谢，其中cyp2a6发挥主要作用，cyp2b6、cyp2d6和cyp2a13，则贡献较小。理论上可影响烟碱被上述酶代谢的因素都有可能影响烟碱利用率。文献报道可能影响烟碱代谢酶活性的物质主要包括：薄荷醇、植物提取物（葡萄柚汁、小麦草汁等）、烟草次要生物碱、影响酶代谢活性的药物等。动物实验也被广泛应用于该领域研究。据文献报道，甲氧补骨脂素能抑制小鼠的cyp2a5和人的cyp2a6，降低烟碱的代谢能力，使得小鼠尿中烟碱浓度增加，并增加了人体内烟碱的全身暴露。烟碱代谢产物也与人类更为一致。薄荷醇抑制烟碱氧化代谢成可替宁和烟碱的葡萄糖醛酸化，也有文献发现薄荷醇卷烟吸烟者血清可替宁水平更高。并且薄荷醇是口香糖中普通添加的化学成分，所以考察薄荷醇在口含烟的添加效果具有重要应用价值。
3.基于国外经验和行业自主创新，目前针对口含烟产品存在的核心技术难题已提出了多项改良方案，例如添加可能具有烟碱代谢酶抑制作用的添加剂来提高烟碱生物利用率等。根据产品研发人员的经验和文献报道，目前行业针对袋装口含烟进行了技术改进并试制了相关产品，但其在体内的真实代谢情况及改进效果则需要有效的评价，相关改进技术还需要准确可靠的动物模型进行效果评价。上述改良技术是否取得了理想的效果还需要准确的烟碱实时递送评价，以服务各类口含烟产品的开发。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于动物模型评价薄荷醇添加对口含烟烟碱代谢影响的方法，本发明利用口含烟经消化道途径吸收代谢的的动物模型，评价烟碱含量相同、但有无薄荷醇的产品药代动力学曲线以及同时监测的脑区神经递质释放情况。通过比较，得到薄荷醇对烟碱在体内代谢的潜在影响程度。
5.为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：（1）取200 g左右雄性sd大鼠，分组，麻醉后做脑部微透析套管埋置手术，自由进食恢复1～2天；（2）对步骤（1）处理后的大鼠进行麻醉，做颈静脉埋置血液微透析探针手术，随后将脑微透析探针插入头部探针导管内，分别连通血、脑微透析管路。采用滤过的复方氯化钠注射液以2.0 μl/min的速度灌流，清醒平衡120 min后开始同时收集脑和血的透析液样品。（3）于4 ℃下每15 min收集1管透析液，第4管收集结束时，采用蠕动泵导流，以大鼠胃部灌胃插管的方式分别向两组大鼠消化道按比例输送含与不含薄荷醇的口含烟口腔模拟溶出物，给药时间内蠕动泵匀速灌胃给药，灌胃的同时继续在4 ℃下实时同步自动收集血、脑
透析液至灌胃给药后5 h。通过检测分析两组大鼠血、脑内透析液中的烟碱及多种代谢物和脑透析液中的单胺类神经递质含量变化，得到两种口含烟经消化道吸收的药动学和药效学特征。对所得的数据指标进行分析，对比两种口含烟的经消化道的给药效果，得出添加薄荷醇的口含烟经消化道吸收的动物模型的评价方法。
6.所述的麻醉是采用0.1 ml/100 g的舒泰50肌肉注射的方法对大鼠进行全身麻醉。
7.所述口腔模拟溶出物是通过现有机械自动化的溶出模拟设备获得的口含烟萃取溶液。该装置是中国烟草总公司郑州烟草研究院开发的口含烟动态释放模拟装置，针对袋装口含型烟草制品模拟溶出的工艺特点，开发了一款单通道的口含烟专用溶出模拟装置，模拟口含烟制品在人工口腔内的人工咀嚼或含服,通过人工唾液模拟烟草成分溶出液过程，并且准确获得一致对应的萃取溶液（已有相应的发明专利，cn201120086627.5）。
8.在本发明中，通过模拟咀嚼装置模拟嚼烟在口腔中的咀嚼行为，并通过蠕动泵灌胃模式与动物消化道相连，最终形成口腔咀嚼和动物消化道暴露的连接。采用蠕动泵导流，向大鼠胃部灌胃插管的方式向大鼠消化道按比例输送口腔模拟溶出物。结合胶基型嚼烟在消费者使用时预期的咀嚼时间，例如30分钟，则对200g体重大鼠应按照30分钟内蠕动泵匀速灌胃给药，给药体积为1-2ml/100g，给药剂量参照人体体重进行等体重给药剂量的换算。
9.脑部微透析套管定位于纹状体，坐标为：ap（前后） 0.2 mm，ml（左右）
‑ꢀ
3.0 mm，dv（上下）
‑ꢀ
3.5 mm。
10.所述的口腔模拟溶出物是红茶味和薄荷味（含有薄荷醇）的口含烟，为同一个品牌口含烟的两种不同口味，但是烟碱含量相同。
11.采集时间间隔为15 min，收集4管给药前的血和脑的基础透析液，灌胃开始给药后收集5 h，共24管透析液样品。
12.在本发明中，透析液检测样本量分配为：从每个收集到的脑透析液的30 μl中取10 μl用于检测5种神经递质，20 μl用于检测脑内的烟碱及其代谢物的含量。每个收集到的血液透析液的30 μl全部用于检测血中的烟碱及其代谢物的含量。
13.本发明通过hplc-ms联用的定量分析方法测定大鼠血、脑透析液中烟碱及多种代谢物cot、nornic、norcot、oh-cot、nno和cno等的浓度-时间药代动力学曲线。
14.本发明采用高效液相色谱
‒
电化学检测器(hplc-ecd)联用方法测定大鼠脑纹状体中多巴胺(da)、3,4
‒
二羟基苯乙酸(dopac)、高香草酸(hva)、5
‒
羟色胺(5-ht)和5
‒
羟吲哚乙酸(5-hiaa)等神经递质的含量变化。
15.本发明有如下有益效果：所述的基于动物模型评价薄荷醇添加对口含烟烟碱代谢影响的方法，利用口含烟经消化道途径吸收代谢的动物模型评价方法，考察文献报道的有烟碱代谢酶抑制活性的薄荷醇的添加对产品中烟碱生物利用率的影响，比较产品添加薄荷醇前后大鼠血液、脑区的烟碱代谢动力学曲线，以及同时监测的脑区神经递质释放情况。结果检测到薄荷味口含烟组大鼠血和脑中烟碱及烟碱代谢物可替宁的峰下面积都显著高于红茶味口含烟组，并且引起脑中单胺类神经递质含量的变化更明显。表明薄荷组的烟碱和烟碱代谢物可替宁的降解较慢，累计的烟碱含量较高，说明薄荷醇对烟碱和烟碱代谢物可替宁在体内的代谢有一定的抑制作用。此结果与文献中薄荷醇可以作为烟碱和烟碱代谢物可替宁代谢酶的抑制剂，提高血清中烟碱和烟碱代谢物可替宁水平这一结论相同。结果表明薄荷醇可以改变烟碱的代谢机理，提高其生物利用度。并且薄荷组检测到的脑中da的达
峰时间显著早于红茶组的da的达峰时间，与检测到的薄荷组脑中烟碱的达峰时间早于红茶的达峰时间结果相同；薄荷组的da达峰水平远高于红茶组的da的达峰水平，与检测到的薄荷组脑中烟碱的达峰浓度高于红茶的达峰浓度结果相同。证明项目组建立的基于动物模型评价薄荷醇添加对口含烟烟碱代谢影响的方法可较好反应薄荷醇对烟碱在血、脑内的吸收代谢情况及对脑内神经递质的影响。本发明基于动物模型评价薄荷醇添加对口含烟烟碱代谢影响的方法，简单、快速，得到的动物模型与人类使用口含烟时经消化道吸收的情况相符，且可以明确添加薄荷醇对口含烟经消化道吸收的影响。
附图说明
16.图1为血清中两种口含烟烟碱达峰之后的浓度曲线；图2为血清中相比两种产品的烟碱代谢物可替宁的药代动力学曲线；图3为两种产品的脑中烟碱药代动力学曲线；图4为不含薄荷醇的红茶味和薄荷味口含烟经大鼠消化道吸收脑中烟碱代谢物可替宁的药代动力学曲线；图5为红茶组与薄荷组的脑中da的达峰水平比较曲线。
具体实施方式
17.本发明以下结合实施例（附图）做进一步清楚、完整地描述。
18.基于动物模型评价薄荷醇添加对口含烟烟碱代谢影响的方法，包括以下步骤：1.选取200 g左右的雄性大鼠，分为两组，每组6只，0.1 ml/100 g的舒泰50肌肉注射深度麻醉后做脑部微透析套管埋置手术，套管定位于纹状体，坐标为：ap（前后） 0.2 mm，ml（左右）
‑ꢀ
3.0 mm，dv（上下）
‑ꢀ
3.5 mm。自由进食恢复1～2天。
19.2.对步骤1处理后的大鼠进行麻醉，做颈静脉埋置血液微透析探针手术，随后将脑微透析探针插入头部探针导管内，分别连通血、脑微透析管路。采用滤过的复方氯化钠注射液以2.0 μl/min的速度灌流，清醒平衡120 min后开始同时收集脑和血的透析液样品。
20.3.于4 ℃下每15 min收集1管透析液，第4管收集结束时，采用蠕动泵导流，向大鼠胃部灌胃插管的方式向两组大鼠消化道按比例输送口腔模拟溶出物（红茶味和薄荷味），给药时间内蠕动泵匀速灌胃给药，灌胃的同时继续在4 ℃下实时同步自动收集血、脑透析液，至灌胃开始给药后5 h，共24管透析液样品。从每个收集到的脑透析液的30 μl中取10 μl用于hplc-ecd联用方法测定大鼠脑纹状体中da、dopac、hva、5-ht和5-hiaa等神经递质的含量变化；20 μl用于hplc-ms联用的定量分析方法测定大鼠血、脑透析液中烟碱及多种代谢物cot、nornic、norcot、oh-cot、nno和cno等的浓度-时间药代动力学曲线。每个收集到的血液透析液的30 μl用于检测血中的烟碱及其代谢物的含量。
21.4. 此实例的结果：（以下数据均是每组六只大鼠所测的平均值）（1）血清中烟碱及其代谢物：红茶组烟碱的达峰时间为45 min，达峰浓度为107.91 ng/ml，峰下面积auc为18150.293 ng/ml*min。薄荷组烟碱的达峰时间为45 min，达峰浓度为98.87 ng/ml，峰下面积auc为20375.782 ng/ml*min。相比两种产品的烟碱药代动力学曲线，结果显示两组的烟碱的达峰时间相同，但是auc
薄荷
》auc
红茶
，并且薄荷味口含烟组的烟碱达峰之后的浓度一直高于不含薄荷醇的红茶味口含烟组的烟碱浓度（如图1），表明薄荷组
的烟碱的降解较慢，累计的烟碱含量较高，说明薄荷醇对烟碱在体内的代谢有一定的抑制作用。此结果与文献中薄荷醇可以作为尼古丁代谢酶的抑制剂，提高血清中烟碱水平这一结论相同。相比两种产品的烟碱代谢物可替宁的药代动力学曲线（如图2），发现auc
薄荷
为97605.619 ng/ml*min，auc
红茶
为93915.426 ng/ml*min，auc
薄荷
》auc
红茶
，表明薄荷组的可替宁降解较慢，累计的可替宁含量较高，说明薄荷醇对可替宁在体内的代谢有抑制作用。此结果与文献中薄荷醇可以作为可替宁代谢酶的抑制剂，提高血清中可替宁水平这一结论相同。
22.（2）脑中烟碱及其代谢物：通过微透析技术检测不含薄荷醇的红茶味口含烟和薄荷味口含烟经大鼠消化道吸收脑中烟碱的药代动力学曲线，相比两种产品的烟碱药代动力学曲线（如图3），结果显示薄荷组烟碱的达峰时间略快于红茶组，因为薄荷醇抑制烟碱代谢降解，所以薄荷组的达峰时间较早。并且auc
薄荷
》auc
红茶
，表明薄荷组累计的烟碱含量较高，说明薄荷醇对烟碱在体内的代谢有一定的抑制作用。由于薄荷醇降低了烟碱的代谢能力，增加了体内烟碱的全身暴露，并且烟碱可快速通过血脑屏障，所以薄荷组脑中的烟碱含量也较高。图4所示为不含薄荷醇的红茶味和薄荷味口含烟经大鼠消化道吸收脑中烟碱代谢物可替宁的药代动力学曲线，相比两种产品的烟碱代谢物可替宁的药代动力学曲线，发现auc
薄荷
为19085.009 ng/ml*min，auc
红茶
为18077.433 ng/ml*min，auc
薄荷
》auc
红茶
，表明薄荷组的可替宁降解较慢，累计的可替宁含量较高，说明薄荷醇对可替宁在体内的代谢有抑制作用。由于薄荷醇降低了可替宁的降解，增加了体内可替宁的全身暴露，并且可替宁可快速通过血脑屏障，所以薄荷组脑中的可替宁含量也较高。
23.（3）脑中da：薄荷组检测到的脑中da的达峰时间显著早于红茶组的da的达峰时间，薄荷组的da达峰水平也远高于红茶组的da的达峰水平（如图5）。因为薄荷组脑中的烟碱含量较高，并且薄荷醇可以穿过血脑屏障进入脑内，直接与烟碱型乙酰胆碱受体相互作用，表达上调该受体，更多的烟碱与更多的烟碱乙酰胆碱受体相互作用，所以引起da水平更大幅度的升高。
24.本发明的添加薄荷醇的口含烟经消化道吸收的动物模型评价方法利用口含烟经消化道途径的动物模型，评价烟碱含量相同，但有无薄荷醇的不同产品的药代动力学曲线以及同时监测的脑区神经递质释放情况。通过比较，得到薄荷醇对烟碱在体内代谢的潜在影响程度。针对行业重点关注的袋装口含烟产品，针对添加薄荷醇等添加剂搭建可靠的动物评价模型，了解产品使用过程中烟碱在体内代谢和神经递质的释放情况的变化，进而在动物模型的基础上对行业研发的技术改良袋装口含烟产品进行应用评价。有望为推动我国烟草行业口含烟的评价和研发提供重要技术支撑。对持续增强行业自主创新能力，更好地应对国际烟草的挑战具有重要意义。