一种联合检测谷胱甘肽和ATP的荧光生物传感器

一种联合检测谷胱甘肽和atp的荧光生物传感器
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种联合检测谷胱甘肽和atp的荧光生物传感器。


背景技术：

2.三磷酸腺苷（atp）是生物体内一种重要的生物分子，是参与细胞合成必不可少的能量来源，对各种生命活动中具有重要影响。谷胱甘肽（gsh）是一种哺乳动物体内含量较为丰富的含巯基的三肽类物质，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，其具有抗氧化、清除自由基以及调控重要的细胞内的生理过程的能力。
3.在癌细胞atp合成过程中，异常数量的活性氧(ros)作为激活氧化应激的副产物产生。为了防止过量ros的致命作用，癌细胞产生大量的谷胱甘肽(gsh)来应对的氧化还原应激，并使肿瘤进展。鉴于atp和gsh之间的相互相关性，能够关联它们检测的工具需要深入了解。
4.目前，检测atp的方法有电化学法、表面增强拉曼散射法等，检测谷胱甘肽的方法有比色法、双光子发射法等，但它们都存在耗时、仪器昂贵、操作复杂等缺点并且少见关联gsh和atp相关性的检测方法。因此，开发一种双变量、快速且灵敏检测atp、谷胱甘肽的方法，对疾病检测具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的问题，本发明提供一种联合检测谷胱甘肽和atp的荧光生物传感器，检测限低、特异性好。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
7.一种联合检测谷胱甘肽和atp的荧光生物传感器，包括：核苷酸序列如seq id no: 1-4所示的连接探针l、挂锁探针m、atp block链、报告探针s和mg
2
、phi29 dna聚合酶、t4 dna连接酶、dntp；所述的挂锁探针m的5’端磷酸化处理；所述atp block链第8位、第9位修饰二硫键，3’端修饰inverted dt；所述报告探针s第13位、第14位为核糖核苷酸；第13位前修饰荧光淬灭基团，第14位后修饰荧光报告基团。
8.优选地，所述连接探针l、挂锁探针m和t4 dna连接酶以环状模板代替。
9.所述环状模板的构建方法，包括以下步骤：将挂锁探针m与连接探针l在t4 dna连接酶缓冲液中杂交，然后加入t4 dna连接酶低温下反应，然后灭活t4 dna连接酶；纯化后得环形模板。
10.优选地，所述生物传感器还包括缓冲溶液；更为优选地，所述缓冲溶液中包含mg
2
。
11.一种包含上述荧光生物传感器的检测谷胱甘肽和atp的试剂盒。
12.优选地，所述试剂盒还包括谷胱甘肽和atp的标准样品。
13.一种采用上述生物传感器或者试剂盒检测谷胱甘肽和atp的方法，包括以下步骤：（1）连接探针l和挂锁探针m在t4 dna连接酶的催化下获得环状模板；（2）环状模板、mg
2
、phi29 dna聚合酶、dntp、atp block链、报告探针s在缓冲液中30℃孵育；然后灭活phi29 dna聚合酶；（3）将待测样品或谷胱甘肽或atp的标准样品的系列浓度溶液加入步骤（2）的体系中，37℃下孵育，然后进行荧光检测。
14.优选地，上述方法中还包括制作谷胱甘肽或atp标准曲线和计算待测样品中目标物浓度的步骤。
15.本发明的检测原理如图1所示：该生物传感器用到以下序列：l：5
’‑
ccggggaaaaaaaaaaaaaacctc-3’m：5
’‑
p-ttttttccccggagcggtcgttgtaaaaaccttcctccgcaatactcccccaggttttt agctagcctggccgaggtttttttt-3’atp block：5
’‑
ctccgcaa/ihs-sh/cccaggtttttagctag-inverted dt-3’s：5
’‑
aaaccggagcgg(dabcyl)/ra//ru/g(fam)gccgaggaaa-3’rca产物：[aaaaaaaacctcggccaggctagctaaaaacctgggggagtattgcggaggaaggtttttacaacgaccgctccggggaaaaaa]n环状模板（即成环状结构的m序列）在phi29聚合酶的作用下进行滚环扩增，环状模板中包含atp适配体的互补序列(下划线标注序列)，劈开的dnazyme互补序列（斜体序列，分布在atp适配体的互补序列两端），所以滚环扩增后的rca产物包含atp适配体序列（下划线部分，即图1rca产物中深色序列）、劈开的dnazyme序列（斜体序列，即图1中rca产物中浅色序列），包含二硫键的atp block链可以与产物中atp适配体序列杂交结合到产物上，避免了atp适配体暴露，防止atp与产物直接结合。基于目标物gsh对二硫键（s-s）的裂解功能，使得atp block链被破坏，从产物上掉落下来，并暴露产物中atp适配体序列，使得另一目标物atp与其适配子结合，拉近atp适配子两端劈开的dnazyme，使dnazyme活性结构形成，在mg
2
辅助下，切割报告探针s，发出荧光，通过检测有无荧光和荧光的强弱可以判断目标物的有无和浓度。
[0016]
本发明具有以下优点：本发明的传感器，利用滚环扩增和dnazyme切割报告探针，起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度。利用gsh的特异性切割二硫键特性和atp与适配体的特异性识别，实现了对双目标物的高特异性联合检测。该传感器的反应条件温和，反应速度快；检测原理的主要过程是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；该传感器的制备方法简单，性质稳定，重复性好，适用于样品中的目标物的检测和生物传感器产业化的实际应用。
[0017]
本发明基于滚环扩增信号放大，gsh切割二硫键，atp与适配体结合，拉近劈开的dnazyme形成活性结构，激活其特异性切割的能力，断裂报告探针，产生荧光信号，构建了光学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，最重要的是，该发明实现了一种方法对双目标物的联合检测，可以弥补现有检测方法的缺陷与不足，实现对快速、准确的定量检测。
附图说明
[0018]
图1为本生物传感器的原理图；图2为报告探针s浓度优化；图3为gsh的工作曲线；图4为atp的工作曲线。
具体实施方式
[0019]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
[0020]
实施例1报告探针s浓度的筛选（1）根据seqidno:1-4所示的序列合成连接探针l、挂锁探针m、atpblock链、报告探针s；并且进行以下修饰：挂锁探针m的5’端磷酸化处理；atpblock链第8位、第9位修饰二硫键，3’端修饰inverteddt；报告探针s第13位、第14位为核糖核苷酸；第12和13位间修饰荧光淬灭基团dabcyl，第14和15位间修饰荧光报告基团fam；（2）按照以下步骤构建环状模板：a）配制含500mmtris-hcl，100mmmgcl2，100mmdtt和10mmatp的10
×
t4dna连接酶缓冲液；b）将39μl灭菌水，6μl挂锁探针m（10μm），6μl连接探针l（10μm）和6μl10
×
的t4dna连接酶缓冲液混匀，95℃变性5min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3μlt4dna连接酶（400u/μl），将其在16℃下反应20h；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活t4dna连接酶，得环状模板，4℃条件下保藏备用；（3）配制含50mmtris-hcl，10mmmgcl2，10mm(nh4)2so4，4mmdtt，ph7.5的缓冲溶液；将3μl环状模板（1μm）、2μldntp（1mm）、3μlphi29dna聚合酶（1u/μl）、9μlatpblock链（3μm）、5μl报告探针s（浓度为0
µ
m、200nm、400nm、600nm、800nm、1
µ
m、1.2
µ
m、1.4
µ
m）在3μl缓冲溶液和5μl灭菌水中加入离心管混匀后37℃恒温反应90min；然后加入5μlatp（3mm），5μlgsh（5mm）混匀后37℃恒温反应60min；（4）将反应后的溶液（40
µ
l）稀释至100
µ
l，设置激发波长为485nm，并在520nm处检测荧光信号变化；结果见图2，从图中可以看出，随着报告探针s浓度的增加，实验得到的荧光强度不断增强，在的浓度达到1.0
µ
m之后，荧光强度基本不变，说明最适的报告探针s浓度是1.0
µ
m。
[0021]
实施例2生物传感器对gsh的检测按照实施例1种的方式进行检测，不同在于，步骤（3）中，报告探针s浓度是1.0
µ
m，gsh的浓度为0
µ
m、100
µ
m、200
µ
m、500
µ
m、1mm、3mm、5mm；步骤（4）中，荧光检测在500-650nm扫描荧光信号变化，并记录520nm处荧光信号；结果见图3，从图中可以看出，检测到的荧光信号随着目标物gsh浓度在0
µ
m-5mm区间内增大而增大，拟合曲线：i=363.88 228.8lgc(mm)（其中c代表了gsh的浓度，r2=0.984）。在100
µ
m的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于95nm时，gsh浓
度的对数与荧光强度大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的荧光强度最低值。因此，可得到该方法检测gsh的下限为95nm。
[0022]
实施例3生物传感器对atp的检测按照实施例1种的方式进行检测，不同在于，步骤（3）中，报告探针s浓度是1.0
µ
m，atp的浓度为0
µ
m、100
µ
m、200
µ
m、500
µ
m、1mm、3mm；步骤（4）中，荧光检测在500-650nm扫描荧光信号变化，并记录520nm处荧光信号；结果见图4，从图中可以看出，检测到的荧光信号随着目标物atp浓度在0
µ
m-3mm区间内增大而增大，拟合曲线：i=632.626 318.75lgc(mm)（其中c代表了atp的浓度，r2=0.991）。在100
µ
m的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于37nm时，atp浓度的对数与荧光强度大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的荧光强度最低值。因此，可得到该方法检测atp的下限为37nm。