基于苯丙氨酸-铜离子配位聚合物的电化学生物传感方法及其应用

1.本发明涉及一种电化学生物传感方法及其应用，尤其是涉及基于苯丙氨酸-铜离子配位聚合物的电化学传感器制备及其在双氧水、焦磷酸盐及碱性磷酸酶分析传感中的应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。


背景技术：

2.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)广泛分布于人体的肝、肾、骨骼、肠和胎盘等组织器官中，能催化核酸、蛋白质和生物碱等生物分子去磷酸化，在调节细胞代谢和参与细胞分裂和分化等信号通路中发挥重要作用。正常成年人血清中alp正常范围为40～150u/l，血清中alp水平升高通常与肝外胆道梗阻、肝内占位性病变、肝硬化、成骨性骨瘤、骨质疏松和软骨病等疾病有关；血清中alp水平降低则与某些代谢紊乱、威尔逊病和白血病等血液系统疾病密切相关。因此，alp的活性检测具有较好的实际意义。与alp相关的焦磷酸盐(p2o
74-，ppi)是生物系统中丰富的磷酸盐物种，在能量转换和代谢过程中起着关键作用，参与许多生物反应过程，如柠檬酸和atp的水解，dna复制，环磷酸腺苷的生成等。因此，实现alp和ppi高效、可靠的检测，对于研究alp和ppi相关的生物学过程和疾病发生发展具有迫切而重要的意义。
3.生物活性物质包括蛋白质、核酸、肽类和氨基酸等，其应用非常广泛，包括工业、农业、环境、食品和生物医药。然而，生物活性物质一般结构脆弱，可重复性差，可重复使用性低，这些不稳定因素对其实际应用有着很大的限制。为解决上述问题，对生物活性物质进行固定化是有效的策略之一，有利于生物活性物质抵抗不利环境的影响，提高其抗逆性，缩短处理所需的时间，也有利于反应后的固液分离，重复使用提高利用率。固定生物活性物质的载体有很多，包括无机纳米颗粒、水凝胶和聚合物等。其中，配位聚合物作为固定生物活性物质的一类新兴载体在分子识别、药物递送和生物成像等方面展示出不可估量的应用前景，已经成为配位化学、材料化学、电化学和生命科学等领域的前沿方向之一。配位聚合物(coordination polymers，cps)是指可以提供孤对电子或不定域电子的有机配体和可以接受电子的金属离子或离子簇间通过配位键相连接而形成的无机-有机杂化化合物，兼具了无机物和有机物的优良性质，如比表面积大、可修饰和良好的热稳定性等；很多金属元素在复杂的生物体中具有特定的功能，使配位聚合物具有易功能化的特性，如o2的递送、基因的活化、酶的催化，可以利用此类金属元素使配位聚合物具有特定的生物学功能。目前，生物活性物质和金属离子形成的配合物十分受欢迎，吸引了科学家的眼球，具有较大的应用空间，广泛用于传感器、分子识别和药物检测等领域。
4.本发明设计了一种基于苯丙氨酸-铜离子配位聚合物的电化学生物传感方法及其应用。该方法采用l-苯丙氨酸作为生物有机配体，铜离子作为金属节点，通过铜离子与氨基酸的配位作用简单合成l-phe-cu(ii)配位聚合物(l-phe-cu(ii)cps)，本专利发现该配位聚合物不仅能够很好地与葫芦脲[7](cb[7])结合，还能较好地电催化双氧水(h2o2)还原，鉴
于此，l-phe-cu(ii)配位聚合物作为修饰材料制备的传感器可以用于h2o2分析检测；另外，ppi与cu(ii)有较高的亲和力，结合能力强，ppi-cu(ii)络合物的形成能够阻碍l-phe-cu(ii)cps的形成，无法较好地实现对h2o2的电催化，因此ppi的妨碍机制使得该方法可以实现ppi的分析检测；随后通过alp催化水解ppi，游离cu(ii)可以与l-phe配位形成l-phe-cu(ii)cps，能够较好地实现对h2o2的电催化；当加入抑制剂钒酸钠(na3vo4)时，alp活性被抑制，无法催化ppi水解，阻碍了l-phe-cu(ii)cps的形成，实现了alp抑制剂的筛选。目前，尚未发现基于苯丙氨酸-铜离子配位聚合物与葫芦脲[7](cb[7])结合能力、苯丙氨酸-铜离子配位聚合物的电催化能力来实现h2o2，ppi及alp的分析检测的报导，具有较好的新颖性。


技术实现要素：

[0005]
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、灵敏度高、特异性好、检测速度快、成本低廉的基于苯丙氨酸-铜离子配位聚合物的电化学生物传感方法及其应用。
[0006]
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于苯丙氨酸-铜离子配位聚合物的电化学生物传感方法及其应用，具体步骤如下：
[0007]
(1)l-phe-cu(ii)cps的制备
[0008]
依次取0.1～1ml浓度为1～25μm的l-苯丙氨酸溶液，0.1～1ml浓度为10～250μm的五水硫酸铜溶液混合成0.1～2ml的溶液，将其在室温下剧烈振荡5～15min，即得到l-phe-cu(ii)cps。
[0009]
(2)电化学生物传感器的制备
[0010]
a.au：将金电极(au，直径为2mm)在麂皮上依次用1、0.3和0.05μm的氧化铝粉末抛光打磨1～5min，之后再依次用水、乙醇超声洗涤1～5min，然后用氮气吹干备用，该电极标记为au。
[0011]
b.cb[7]/au：将au浸入0.1～0.2ml浓度为0.1～2mm的葫芦脲[7]水溶液(cb[7])中10～15h，然后用超纯水缓缓冲洗电极以去除未结合的cb[7]，该电极标记为cb[7]/au。
[0012]
c.cps/cb[7]/au：随后取5～10μl步骤(1)中合成的l-phe-cu(ii)cps滴加在cb[7]/au表面，于室温下静置0.1～2h，用超纯水缓缓冲洗电极以去除未结合的cps，该电极标记为cps/cb[7]/au。随后利用电化学循环伏安法进行测试，设置电位范围为-1.2～0v、扫速0.05～0.1v/s，使用含有一定浓度h2o2的pbs(0.1m，ph 7.4)作为电解质溶液。
[0013]
h2o2分析检测：
[0014]
步骤(2)中c，改变h2o2的浓度(终浓度：0～10mm)，步骤(1)和(2)中其他实验步骤维持不变，基于此能够得到一系列h2o2传感器，并应用于h2o2传感分析。
[0015]
ppi及alp活性的分析检测：
[0016]
对ppi：上述步骤(1)中，依次将0.05～0.1ml ppi(终浓度：0～0.2mm)，0.02～0.05ml cu(ii)溶液(终浓度：0～0.4mm)混合后反应0.1～2h，再将0.02～0.05ml l-phe(终浓度：0～0.05mm)加入并振荡5～15min，加蒸馏水配成总体积为100～200μl的溶液。步骤(1)和(2)中其他实验步骤维持不变，基于此能够得到一系列ppi传感器，并应用于ppi传感分析。
[0017]
对alp：上述步骤(1)中，依次将5～10μl alp(终浓度：0～50mu/ml)，5～10μl ppi(终浓度：0～0.2mm)，5～10μl cu(ii)溶液(终浓度：0～0.4mm)，5～10μl mg(ii)溶液(终浓
的电化学响应，得到三条线性方程：电流响应与h2o2浓度线性相关方程为y＝10.13r2＝0.9930，检测限为0.33μm；电流响应对ppi浓度线性相关方程为y＝-0.54c
ppi
60.81，r2＝0.9937，检测限为0.65μm；电流响应对alp浓度线性相关方程为y＝1.36c
alp
5.682，r2＝0.9962，检测限为0.16mu/ml；说明该传感器可对h2o2、ppi及alp实现高灵敏度检测。
[0025]
(5)高特异性。对h2o2检测，其他对照物质如抗坏血酸(aa)、柠檬酸(ca)、尿酸(ua)、多巴胺(da)、葡萄糖(glu)和蔗糖(suc)对体系均无干扰；对ppi检测，其他对照物质naac、nacl、nano3、na2co3、na3po4、na2hpo4和nah2po4对体系均无干扰；对alp检测，其他对照物质如乙酰胆碱酯酶(ache)、胆固醇氧化酶(chox)、谷胱甘肽(gsh)、l-半胱氨酸(l-cys)、木瓜蛋白酶(papain)、蛋白激酶(pka)和胰蛋白酶(trypsin)对体系均无干扰。
[0026]
(6)结果准确。回收率均在95％～110％之间。
[0027]
综上所述，本发明是构建了一种基于苯丙氨酸-铜离子配位聚合物的电化学生物传感方法并应用于h2o2、ppi及alp的检测，具有操作简单、分析快速、稳定性高、灵敏度高、选择性好、成本低廉等优点，可以实现较低浓度h2o2、ppi及alp的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
[0028]
图1为本发明传感器对h2o2、ppi及alp可行性分析图；
[0029]
图2为本发明传感器对不同浓度h2o2电流响应对浓度的线性关系图；
[0030]
图3为本发明传感器对不同浓度ppi电流响应对浓度的线性关系图；
[0031]
图4为本发明传感器对不同浓度alp电流响应对浓度的线性关系图；
[0032]
图5为本发明传感器对不同浓度na3vo4电流响应对浓度的线性关系图；
[0033]
图6为本发明传感器对h2o2、ppi及alp选择性实验图。
具体实施方式
[0034]
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0035]
实施例1 l-phe-cu(ii)cps的制备
[0036]
取l-苯丙氨酸溶液(22μm，1ml)和五水硫酸铜溶液(200μm，1ml)混合制备配位聚合物，将其在室温下剧烈振荡15min，即得到l-phe-cu(ii)cps。
[0037]
实施例2电化学生物传感器的制备
[0038]
a.au：将金电极(au，直径为2mm)在麂皮上依次用1、0.3和0.05μm的氧化铝粉末抛光打磨2min，之后再依次用水、乙醇超声洗涤5min，然后用氮气吹干备用，该电极标记为au。
[0039]
b.cb[7]/au：将au浸入0.2ml浓度为1mm的葫芦脲[7]水溶液(cb[7])中12h，然后用超纯水缓缓冲洗电极以去除未结合的cb[7]，该电极标记为cb[7]/au。
[0040]
c.cps/cb[7]/au：随后取5μl实施例1中合成的l-phe-cu(ii)cps滴加在cb[7]/au表面，于室温下静置1h，用超纯水缓缓冲洗电极以去除未结合的cps，该电极标记为cps/cb[7]/au。随后利用电化学循环伏安法进行测试，设置电位范围为-1.2～0v、扫速0.05v/s，使用含有5mm h2o2的pbs(0.1m，ph 7.4)作为电解质溶液。
[0041]
可行性实验：
[0042]
d.按上述实施例1中，将100μl ppi(终浓度：0～140μm)，50μl cu(ii)溶液(终浓
度：200μm)混合后反应1h，再将50μl l-phe(终浓度：22μm)加入并振荡15min而后滴加在cb[7]/au电极表面静置1h，用蒸馏水缓缓冲洗电极表面以去除未结合的分子。其他实验步骤维持不变，基于此能够得到一系列ppi传感器，并应用于ppi传感分析。
[0043]
e.另外，将10μl alp(终浓度：0～50mu/ml)，10μl ppi(终浓度：100μm)，10μl cu(ii)溶液(终浓度：200μm)，10μl mg(ii)溶液(终浓度：10μm)，10μl tris-hcl缓冲液(1mm，ph 7.4)混合，剧烈振荡5min使溶液混匀，将上述溶液在37℃下反应5h后置于85℃水浴使酶失活，冷却至室温。随后在上述混合溶液中加入10μl l-phe(终浓度：22μm)，并加蒸馏水配成100μl的溶液，混合均匀后置于37℃下孵育15min。其他实验条件不变，基于此能够得到一系列alp传感器，并应用于alp传感分析。
[0044]
结果如图1，实验现象表明cps修饰的c电极与alp修饰的e电极对h2o2有良好的电化学响应，而裸金a电极，cb[7]修饰的b电极和ppi修饰的d电极对h2o2几乎没有响应。一方面，这证明了l-phe-cu(ii)cps对h2o2的电催化能力较强；另一方面，也证明了ppi与cu(ii)的结合能力较强，以及alp对ppi的催化水解能力，由此证明该实验在理论和技术上是可行的。
[0045]
h2o2分析检测：
[0046]
按上述实例1和实例2中c的传感器制备步骤，采用循环伏安法，通过改变h2o2浓度(终浓度：0～11mm)，其他实验步骤维持不变，基于此得到一系列h2o2传感器，并应用于h2o2传感分析。h2o2浓度与电流的关系如图2，传感器对h2o2的电流响应与浓度呈良好的线性关系，线性相关方程为r2＝0.9930，线性范围为0.001～9mm，检测限为0.33μm。
[0047]
ppi及alp活性的分析检测：
[0048]
对ppi：按上述实施例1、实施例2中d的传感器制备步骤，通过改变ppi浓度(终浓度：0～140μm)，其他实验步骤维持不变，得到一系列ppi传感器，结果如图3，传感器对ppi的电流响应与浓度呈良好的线性关系，电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-0.54c
ppi
60.81，r2＝0.9937，线性范围为2～110μm，检测限为0.65μm。
[0049]
对alp：按上述实施例1、实施例2中e的传感器制备步骤，通过改变alp浓度(终浓度：0～50mu/ml)，其他实验步骤维持不变，得到一系列alp传感器，结果如图4，传感器对alp的电流响应与浓度呈良好的线性关系，电流响应对alp浓度线性相关方程为y＝1.36c
alp
5.682，r2＝0.9962，线性范围为0.5～40mu/ml，检测限为0.16mu/ml。
[0050]
实施例3 alp抑制剂钒酸钠na3vo4的筛选
[0051]
按上述实施例1和实施例2中e的传感器制备步骤，将10μl不同浓度的抑制剂(na3vo4终浓度：0～150μm)与10μl alp(终浓度：50mu/ml)于37℃下震荡5min使之均匀混合。再依次加入10μl ppi(终浓度：100μm)，10μl cu(ii)溶液(终浓度：200μm)，5μl mg(ii)溶液(终浓度：10μm)，5μl tris-hcl缓冲液(1mm，ph 7.4)反应5h后置于85℃水浴使酶失活，冷却至室温。随后在上述混合溶液中加入10μl l-phe(终浓度：22μm)，并加蒸馏水配成100μl的溶液，混合均匀后置于37℃下孵育15min。其他实验步骤维持不变，基于此能够得到一系列na3vo4传感器，并应用于na3vo4传感分析。结果如图5，可以看出随着na3vo4浓度的增大，电流响应减小，说明na3vo4对alp活性具有良好的抑制作用，半抑制浓度为57.4μm。
[0052]
实施例4选择性检测
[0053]
为了验证该传感器的选择性，按上述实施例1和实施例2的传感器制备步骤，在含
h2o2的pbs缓冲溶液中加入与h2o2相同浓度的对照物质，如抗坏血酸(aa)、柠檬酸(ca)、尿酸(ua)、多巴胺(da)、葡萄糖(glu)和蔗糖(suc)；ppi反应液中加入与ppi相同浓度的无机化合物，如naac、nacl、nano3、na2co3、na3po4、na2hpo4和nah2po4；alp反应液中加入与alp相同浓度的生物分子，如乙酰胆碱酯酶(ache)、胆固醇氧化酶(chox)、谷胱甘肽(gsh)、l-半胱氨酸(l-cys)、木瓜蛋白酶(papain)、蛋白激酶(pka)和胰蛋白酶(trypsin)，检测传感器对h2o2、ppi及alp的特异性。结果如图6所示，可以看出传感器对于h2o2、ppi、alp的检测有很好的特异性。
[0054]
还需要说明的是，上述具体实施例并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的相关技术人员在本发明的实质范围内加以变化、改型、添加或替换，也应属于本发明权利要求的保护范围。