新型抗CD47抗体及其用途的制作方法

新型抗cd47抗体及其用途
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月25日提交的国际申请pct/cn2019/113296的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
3.序列表
4.本技术以电子形式与序列表一起提交。序列表的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
5.本技术一般地涉及抗体。更具体地，本技术涉及针对cd47的单克隆抗体，制备其的方法以及该抗体的用途。


背景技术：

6.分化簇47(cd47)，也称为整联蛋白相关蛋白(iap)，是约50kda的免疫球蛋白超家族膜蛋白，其是在大多数正常细胞类型上表达的普遍存在的细胞表面糖蛋白。cd47与其配体—在巨噬细胞上表达的信号调节蛋白α(sirpα)相互作用，然后向巨噬细胞发出抗吞噬或“别吃我”信号，并因此逃避免疫监测[1]。对各种恶性肿瘤的分析表明，cd47在aml、nhl、乳腺癌、nscc和卵巢癌细胞上过表达，且增加的cd47表达与较差的临床预后相关。这些数据表明，通过阻断cd47-sirpα相互作用和关闭“别吃我”信号，cd47可以作为癌症治疗的新免疫检查点。
[0007]
cd47是一种广泛表达的细胞表面蛋白，其通过先天和适应免疫系统的细胞如巨噬细胞和树突细胞，充当吞噬作用的介导物。cd47在多种肿瘤上过表达，包括血液恶性肿瘤和实体瘤。越来越多的研究结果表明，靶向cd47-sirpα信号轴可以作为癌症免疫疗法的新免疫检查点，并且可能具有在单一或联合治疗中的有效的抗肿瘤能力，使得cd47成为多种人恶性癌症中的通用靶标。
[0008]
几种抗cd47单克隆抗体(mab)实现了针对aml、nhl、乳腺细胞和卵巢细胞的有效的涉及巨噬细胞的吞噬作用。此外，抗cd47 mab与批准的抗体(抗肿瘤相关抗原)结合或使用双靶向双特异性抗体具有有效增强的抗肿瘤活性[2-4]。基于这些临床前研究，超过六种抗cd47 mab和三种sirpα融合蛋白正在进行积极的i期或ii期临床试验，涵盖了人血液恶性肿瘤和实体瘤。
[0009]
然而，仍然需要开发能够阻断cd47-sirpα相互作用并诱导肿瘤细胞的有效吞噬作用的新的抗cd47分子，以用于预防或治疗包括癌症在内的各种疾病。
[0010]
发明概述
[0011]
本公开提供了这些和其他目的，其在广义上涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品。本公开提供的益处可以广泛应用于抗体治疗和诊断领域，并可以结合与多种靶标反应的抗体来使用。
[0012]
在本公开中产生了全人抗cd47单克隆抗体。本公开的抗体能以高亲和力结合人cd47或食蟹猴cd47；有效地阻断cd47与其配体sirpα之间的相互作用；显示对人红细胞
(rbc)的弱结合，而不会诱导人rbc的血凝反应；诱导有效的巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用，同时对红细胞的吞噬降低；并且表现出强效肿瘤生长抑制作用。
[0013]
在一些方面，本公开提供了针对cd47的分离的抗体或其抗原结合部分。
[0014]
在一些实施方案中，如本文描述的分离的抗体或其抗原结合部分包含：
[0015]
a)选自下组的一个或多个重链cdr(hcdr)：
[0016]
(i)与seq id no：1所示的hcdr1具有至少90％序列同一性的hcdr1；
[0017]
(ii)与seq id no：2所示的hcdr2具有至少90％序列同一性的hcdr2；和
[0018]
(iii)与seq id no：3所示的hcdr3具有至少90％序列同一性的hcdr3；
[0019]
b)选自下组的一个或多个轻链cdr(lcdr)：
[0020]
(i)与seq id no：4所示的lcdr1具有至少90％序列同一性的lcdr1；
[0021]
(ii)与seq id no：5所示的lcdr2具有至少90％序列同一性的lcdr2；和
[0022]
(iii)与seq id no：6所示的lcdr3具有至少90％序列同一性的lcdr3；或
[0023]
c)a)的一个或多个hcdr和b)的一个或多个lcdr。
[0024]
在一些实施方案中，如本文描述的分离的抗体或其抗原结合部分包含：
[0025]
a)选自下组的一个或多个重链cdr(hcdr)：
[0026]
(i)包含seq id no：1的hcdr1或与该hcdr1相比存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的hcdr1；
[0027]
(ii)包含seq id no：2的hcdr2或与该hcdr2相比存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的hcdr2；和
[0028]
(iii)包含seq id no：3的hcdr3或与该hcdr3相比存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的hcdr3；
[0029]
b)选自下组的一个或多个轻链cdr(lcdr)：
[0030]
(i)包含seq id no：4的lcdr1或与该lcdr1相比存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的lcdr1；
[0031]
(ii)包含seq id no：5的lcdr2或与该lcdr2相比存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的lcdr2；和
[0032]
(iii)包含seq id no：6的lcdr3或与该lcdr3相比存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异的lcdr3；或
[0033]
c)a)的一个或多个hcdr和b)的一个或多个lcdr。
[0034]
在一些实施方案中，如本文描述的分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：
[0035]
a)所述vh包含：
[0036]
(i)包含seq id no：1的hcdr1；
[0037]
(ii)包含seq id no：2的hcdr2；和
[0038]
(iii)包含seq id no：3的hcdr3；和/或
[0039]
(b)所述vl包含：
[0040]
(i)包含seq id no：4的lcdr1；
[0041]
(ii)包含seq id no：5的lcdr2；和
[0042]
(iii)包含seq id no：6的lcdr3。
[0043]
在一些实施方案中，如本文描述的分离的抗体或其抗原结合部分包含：
[0044]
(a)重链可变区，其包含：
[0045]
(i)seq id no：7的氨基酸序列；
[0046]
(ii)与seq id no：7具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或
[0047]
(iii)与seq id no：7相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或
[0048]
(b)轻链可变区，其包含：
[0049]
(i)seq id no：8的氨基酸序列；
[0050]
(ii)与seq id no：8具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或
[0051]
(iii)与seq id no：8相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
[0052]
在一些实施方案中，如本文描述的分离的抗体或其抗原结合部分包含如seq id no：7所示的重链可变区和如seq id no：8所示的轻链可变区。
[0053]
在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分还包含人igg如igg4的fc区。在一些实施方案中，人igg4的fc区包含s228p取代，编号根据eu编号。
[0054]
在一些实施方案中，如本文所公开的分离的抗体或其抗原结合部分具有以下性质中的一种或多种：
[0055]
(a)特异性结合以可溶性蛋白质形式或在细胞表面上表达的人cd47和食蟹猴cd47；
[0056]
(b)有效地阻断cd47与sirpα的结合，例如，抑制率》85％；
[0057]
(c)与红细胞(rbc)微弱结合，避免诱导对人rbc的血凝反应；
[0058]
(d)诱导有效的巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用，同时降低对人rbc的吞噬作用；
[0059]
(e)在肿瘤细胞上不诱导或微弱诱导adcc和cdc活性；
[0060]
(f)具有良好的热稳定性并在人血清中稳定；
[0061]
(g)显著诱导动物肿瘤模型中的体内肿瘤生长抑制作用；和
[0062]
(h)当与其他抗肿瘤分子尤其是帕尼单抗组合施用时，表现出协同效应。
[0063]
在某些实施方案中，如本文公开的分离的抗体或其抗原结合部分有效地阻断cd47与sirpα的结合。例如，cd47和sirpα之间的结合的至少70％，至少75％，至少80％或至少85％可以被本文的抗体或抗原结合部分阻断。同时，本文的抗体或抗原结合部分可导致比基准抗cd47抗体显著更少的人rbc的血凝反应，例如，与基准抗cd47抗体相比，导致小于90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％或更少的人rbc血凝反应。示例性基准抗体包括bmk1，bmk2，bmk4和bmk8抗体，如表2所示。
[0064]
在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。
[0065]
在一些方面，本发明涉及包含编码如本文所公开的抗体或其抗原结合部分的核酸分子的表达载体。
[0066]
在一些方面，本发明涉及包含如本文所公开的表达载体的宿主细胞。
[0067]
在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其
抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
[0068]
在一些方面，本发明涉及一种用于制备抗cd47抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在如本文公开的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分，并从宿主细胞分离抗体或抗原结合部分。
[0069]
在一些方面，本发明涉及一种调节受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答受到调节，任选地所述免疫应答是cd47相关的。
[0070]
在一些方面，本发明涉及一种用于抑制受试者中的肿瘤细胞生长的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
[0071]
在一些方面，本发明涉及一种用于治疗或预防受试者中的增殖性病症例如癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文所公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。
[0072]
在某些实施方案中，如本文公开的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂或治疗性抗体例如帕尼单抗(panitumumab)一起(序贯地或同时地)施用。
[0073]
在一些方面，本发明涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防增殖性病症(例如癌症)的药物中的用途。
[0074]
在一些实施方案中，所述癌症可以是血液癌或实体瘤。血液癌可以选自例如急性淋巴母细胞白血病(all)，t-all，b-all，急性髓性白血病(aml)，非霍奇金淋巴瘤，b淋巴母细胞白血病/淋巴瘤；b细胞慢性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病(cll)，慢性肌细胞白血病(cml)，burkitt淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，sll，cns淋巴瘤，richter综合征，多发性骨髓瘤和免疫母细胞大细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，待治疗的癌症是burkitt淋巴瘤。实体瘤可选自如例如肺癌，胰腺癌，乳腺癌，肝癌，卵巢癌，睾丸癌，肾癌，膀胱癌，脑癌，宫颈癌，结肠/直肠癌，胃肠道癌，皮肤癌，前列腺癌。在一些实施方案中，待治疗的癌症是结肠癌。
[0075]
在一些方面，本发明涉及试剂盒或装置和相关方法，其使用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，或如本文所公开的药物组合物，用于治疗包括癌症在内的疾病。
[0076]
以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。
[0077]
附图简述
[0078]
图1显示前导抗体w3455-4.9.9-uigg4.spl(本文中缩写为“w3455”)与人cd47的结合，如通过elisa测量的。w345-bmk1.uigg4pe.k、w345-bmk2.uigg4.sp和w345-bmk4.uigg4.spk是抗cd47基准抗体。igg4同种型是同种型对照。“neg”栏是空白控制的最大od。
[0079]
图2显示了前导抗体w3455对人cd47表达细胞的结合，如通过facs测量的。“neg”栏是空白控制的最大mfi。
[0080]
图3显示了前导抗体w3455与食蟹猴cd47表达细胞的结合，如通过facs测量的。
[0081]
图4显示了前导抗体w3455对人红细胞的结合，如通过facs测量的。
[0082]
图5显示了前导抗体w3455在人rbc上的血凝反应活性(ha)。
[0083]
图6显示了通过elisa在配体竞争测定法中测定的前导抗体w3455的sirpα阻断活性。“min od”是指最小od450值，“配体”列是指当仅存在配体时的最小od结果。
[0084]
图7显示了在配体竞争测定法中通过facs确定的前导抗体w3455的sirpα阻断活性。“min mfi”是指最小的mfi值，并且“配体”列是指当仅存在配体时的最小mfi结果。
[0085]
图8显示了通过spr测量的前导抗体w3455和基准抗体w345-bmk2.uigg4.sp对人cd47的结合动力学曲线。
[0086]
图9显示了两种不同缓冲液中前导抗体w3455的热稳定性结果，如通过差示扫描荧光测定(dsf)测量的。
[0087]
图10显示了人血清中前导抗体w3455的稳定性，如通过facs测试的。
[0088]
图11a-11c显示了在raji细胞(a)、jurkat细胞(b)和人rbc(c)中由前导抗体w3455诱导的巨噬细胞介导的吞噬作用。
[0089]
图12显示了前导抗体w3455和基准抗体在ccrf-cem和raji细胞上的adcc和cdc活性。
[0090]
图13显示了在用不同浓度的前导抗体w3455或基准抗体治疗后，接种有raji-luc淋巴癌细胞的b-ndg小鼠的体重变化。
[0091]
图14显示了在用不同浓度的前导抗体w3455或基准抗体治疗后，发光信号强度(对应于肿瘤生长)的变化。
[0092]
图15显示了分组后b-ndg小鼠模型中单个动物的实时成像照片。本图中的“bmk2”是指w345-bmk2.uigg4.sp(或缩写为“w345-bmk2”)。
[0093]
图16显示了在分组后第0-32天期间b-ndg小鼠模型中的动物存活率。
[0094]
图17显示了在单独或与帕尼单抗组合施用前导抗体w3455后，接种有ht-29细胞的ncg小鼠中的肿瘤体积变化。
[0095]
图18显示单独或与帕尼单抗组合施用前导抗体w3455后，肿瘤生长抑制(tgi)的百分比。
[0096]
图19a-19b显示了在施用前导抗体w3455、bmk2或bmk8之后，接种有raji细胞的cb-17 scid小鼠中的体重变化(a)和肿瘤体积变化(b)。
[0097]
图20显示了在食蟹猴的pk研究中的前导抗体w3455的血清浓度。
[0098]
图21a-21c显示了在食蟹猴中临床血液学施用前导抗体w3455之后，红细胞计数(a)、血红蛋白水平(b)和网织红细胞计数(c)的变化。
[0099]
发明详述
[0100]
本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些以外，本公开容易进行变化和修改。应理解本公开包括所有这类变化和修改。本公开还包括本说明书中提到或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，单独或共同地，以及任何和所有组合或任何两个或更多个所述步骤或特征。
[0101]
除非在此另外定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除
非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个/种”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个/种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个/种细胞”包括细胞的混合物等。在本技术中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有点。
[0102]
通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如abbas等人,cellular and molecular immunology,6
th ed.,w.b.saunders company(2010)；sambrook j.&russell d.molecular cloning:a laboratory manual,第3版,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.(2000)；ausubel等人,short protocols in molecular biology:a compendium of methods from current protocols in molecular biology,wiley,john&sons,inc.(2002)；harlow和lane using antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.(1998)；和coligan等人,short protocols in protein science,wiley,john&sons,inc.(2003)。与本文描述的分析化学、合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的。此外，本文中使用的所有部分标题仅用于组织目的且不理解为限制所描述的主题。
[0103]
定义
[0104]
为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。
[0105]
如本文使用的，术语“抗体”或“ab”通常指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(h)和两条轻链(l)多肽链的y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“j”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“d”区。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1，ch2和ch3)组成。每条轻链由轻链可变区(v
l
)和轻链恒定区(c
l
)组成。vh和v
l
区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(fr))间隔开的高变区(称为互补决定区(cdr))。每个vh和v
l
由以下顺序的3个cdr和4个fr组成：从n末端到c末端的fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。每个重链/轻链对的可变区(vh和v
l
)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布可遵循kabat sequences of proteins of immunological interest(national institutes of health,bethesda,md.(1987和1991))或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人,(1989)nature 342:878-883或imgt的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如igg(例如igg1、igg2、igg3或igg4亚型)、iga1、iga2、igd、ige或igm抗体。
[0106]
术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”可以在本技术的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合，和/或与全长抗体竞争结合相同的抗原的能力。一般而言，参见fundamental immunology,ch.7(paul,w.编，第二版,raven press,n.y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。
抗体的抗原结合片段可通过重组dna技术或通过酶或化学切割完整抗体而产生。在一些条件下，抗原结合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段，单链抗体(例如scfv)，嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本技术中提供的单克隆抗人cd47抗体)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。
[0107]
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mab”是指单分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
[0108]
如本文所用，术语“人抗体”或“完全人抗体”旨在包括具有以下可变区的抗体，其中框架区和cdr区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的cdr序列嫁接到人框架序列上的抗体。
[0109]
如本文所用，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架和cdr区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。
[0110]
如本文所用，术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的cdr序列被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行另外的框架区修饰。
[0111]
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列来源于一个物种并且恒定区序列来源于另一物种，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体的抗体。
[0112]
如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从对另一物种的免疫球蛋白基因转基因的动物中分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组、组合抗体文库分离的抗体，或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
[0113]
如本文所用，术语“ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的kd值可以使用本领域良好建立的方法来确定。如本文所用，术语“k
d”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从kd与ka的比率(即，kd/ka)获得并且表示为摩尔浓度(m)。确定抗体kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如系统。
[0114]
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性结合于”是指两种分子例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。
[0115]
如本文所用，“抑制结合”或“阻断结合”的能力是指抗体以任何可检测水平抑制两个分子(例如cd47及其配体)之间的结合相互作用。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
[0116]
如本文所用，对于igg抗体的术语“高亲和力”是指抗体针对靶抗原具有1
×
10-7
m或更低，更优选5
×
10-8
m或更低，甚至更优选1
×
10-8
m或更低，甚至更优选5
×
10-9
m或更低，甚
至更优选1
×
10-9
m或更低，甚至更优选5
×
10-10
m或更低，甚至更优选1
×
10-10
m或更低，甚至更优选5
×
10-11
m或更低，甚至更优选4
×
10-11
m或更低，甚至更优选3
×
10-11
m或更低，和甚至更优选2.5
×
10-11
m或更低的kd。
[0117]
如本文所用的术语“ec
50”，也被称为“半数最大有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本技术的上下文中，ec
50
的单位表示为“nm”。
[0118]
如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原上的部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含处于独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象性”表位。参见例如epitope mapping protocols in methods in molecular biology,vol.66,g.e.morris,ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象性表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分开的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如cd47)的抗体。在国际专利申请wo 03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，该方法基于它们的交叉竞争。
[0119]
如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然环境发生变化，或者该物质从天然环境分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从这类天然状态分离的高纯度的相同的多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。
[0120]
如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(yac)，细菌人工染色体(bac)或p1衍生人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如sv40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。
[0121]
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于，培养的细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，例如cho、bhk、nso、sp2/0、yb2/0；或人组织或杂交瘤细胞、酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织中的细胞。该术语不仅包括特定的主题细胞，还包括这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能会在后代中发生某些修饰，因此此类后代可能与亲代细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。
[0122]
如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在computational molecular biology,(lesk,a.m.编),1988,new york:oxford university press；biocomputing informatics and genome projects,(smith,d.w.,编),1993,new york:academic press；computer analysis of sequence data,part i,(griffin,a.m.和griffin,h.g.,编),1994,new jersey:humana press；von heinje,g.,1987,sequence analysis in molecular biology,new york:academic press；sequence analysis primer,(gribskov,m.and devereux,j.,eds.),1991,new york:m.stockton press；和carillo等人,1988,siamj.applied math.48:1073中描述的那些。
[0123]
如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏t淋巴细胞可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够在宿主中成功诱导免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。
[0124]
如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如graham等人,1973,virology 52:456；sambrook等人,2001,molecular cloning:a laboratory manual,同上；davis等人,1986,basic methods in molecular biology,elsevier；chu等人,1981,gene 13:197。
[0125]
如本文所用，术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”可以互换使用。当提及术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”时，它们也包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
[0126]
如本文所用，术语“spr”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用biacore系统(pharmacia biosensor ab，uppsala，sweden和piscataway，nj)。关于详细描述，参见实施例和u.,等人(1993)ann.biol.clin.51:19-26；u.,等人(1991)biotechniques 11:620-627；johnsson,b.,等人(1995)j.mol.recognit.8:125-131；和johnnson,b.,等人(1991)anal.biochem.198:268-277。
[0127]
如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“facs”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(flowmetric.“sorting out fluorescence activated cell sorting”.2017-11-09检索到)。用于进行facs的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括becton dickinson(foster city，ca)的facs star plus、facscan和facsort仪器、来自coulter epics division(hialeah，fl)的epics c和来自cytomation(colorado springs，colorado)的moflo。
[0128]
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(nk)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的fc受体(fcr)结
合的分泌的ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导adcc的主要细胞nk细胞仅表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri，fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达总结在ravetch and kinet,annu.rev.immunol 9:457-92(1991)的464页的表3中。为了评估感兴趣分子的adcc活性，可以进行体外adcc测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的adcc活性可以在体内评估，例如在如clynes等人pnas(usa)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。
[0129]
术语“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(c1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类的)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行cdc测定，例如gazzano-santoro等人,j.immunol.methods 202:163(1996)中所述的。
[0130]
术语“eu编号”是指kabat等人描述的eu编号。kabat编号系统通常用于指代可变结构域中的残基(大概轻链的残基1-107和重链的残基1-113)(例如，kabat等人，sequences of immunological interest.5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“eu编号系统”或“eu索引”(例如，在kabat等人，同上中报道的eu索引)。除非本文另有说明，提及抗体恒定结构域中的残基编号是指按eu编号系统的残基编号。在某些实施方案中，本文公开的抗体包含fc修饰，例如根据eu编号在人igg4 fc区的氨基酸序列的第228位处将丝氨酸(“s”)突变为脯氨酸(“p”)。
[0131]
术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。
[0132]
如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病况的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。
[0133]
如本文在治疗病况的背景中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病况进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病况消退，病况改善和病况治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其一些组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其一些组合。
[0134]
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当在治疗与靶抗原相关的疾病或病况中使用的“有效量”指的是有效治疗所述疾病或病况的抗体或其抗原结合部分的量或浓度。
[0135]
如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病状况的术语“预防”或“预护”是指预防或延缓疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的表现。
[0136]
如本文所用，术语“药学上可接受”是指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。
[0137]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，
remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)，并且包括但不限于ph调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
[0138]
如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至有机体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。
[0139]
i.抗cd47抗体
[0140]
在一些方面，本公开包括抗cd47抗体或其抗原结合部分。
[0141]
在本技术的上下文中，“抗体”可以包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化和灵长类动物化抗体，cdr移植抗体，人抗体，重组产生的抗体，胞内抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，单价抗体，多价抗体，抗独特型抗体，合成抗体，包括其突变蛋白及变体；及其衍生物(包括fc融合蛋白和其他修饰)，以及任何其他免疫反应性分子，只要其表现出与cd47蛋白的优先结合或缔合。此外，除非上下文另外规定，否则该术语还包括所有类别的抗体(即iga，igd，ige，igg和igm)和所有亚类(例如igg1，igg2，igg3，igg4，iga1和iga2)。在一些优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在更优选的实施方案中，抗体是全人单克隆抗体。
[0142]
单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术来制备，包括杂交瘤技术，重组技术，噬菌体展示技术，转基因动物(例如)或其一些组合。例如，可以使用杂交瘤和本领域公认的生物化学和遗传工程技术来生产单克隆抗体，如详细描述于an,zhigiang(ed.)therapeutic monoclonal antibodies:from bench to clinic,john wiley and sons,1
st ed.2009；shire et.al.(eds.)current trends in monoclonal antibody development and manufacturing,springer science business media llc,1
st ed.2010；harlow等人,antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,2nd ed.1988；hammerling,等人,in:monoclonal antibodies and t-cell hybridomas 563-681(elsevier,n.y.,1981)，每篇文献在此通过引用全部并入。应该理解，可以进一步改变选定的结合序列，例如以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。在一些实施方案中，通过使用杂交瘤技术来制备抗人cd47单克隆抗体。杂交瘤的产生是本领域公知的。参见，例如harlow和lane(1988)antibodies,a laboratory manual,cold spring harbor publications,new york。
[0143]
抗cd47抗体的特性
[0144]
本公开的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有以下特性中的一种或多种：
[0145]
(a)特异性结合人cd47和食蟹猴cd47，该cd47表达为可溶性蛋白质或在细胞表面上表达；
[0146]
(b)有效地阻断cd47与sirpα的结合，例如，抑制率》85％；
[0147]
(c)与红细胞(rbc)的弱结合，并避免诱导人类rbc的血凝反应；
[0148]
(d)诱导有效的巨噬细胞介导的对肿瘤细胞的吞噬作用，降低对人rbc的吞噬作用；
[0149]
(e)在肿瘤细胞上诱导弱或无adcc和cdc活性；
[0150]
(f)具有良好的热稳定性并在人血清中稳定；
[0151]
(g)在动物肿瘤模型中体内诱导有效的肿瘤生长抑制；和
[0152]
(h)当与其他抗肿瘤分子尤其是帕尼单抗组合施用时，表现出协同效应。
[0153]
与cd47的特异性结合
[0154]
本公开的抗体以高亲和力结合人和食蟹猴cd47。本公开的抗体与cd47的结合可以使用一种或多种本领域确立的技术例如elisa来评估。本公开的抗体的结合特异性也可以通过监测抗体与表达cd47蛋白的细胞的结合来确定，例如通过流式细胞术。例如，可以通过流式细胞术测定法来测试抗体，其中将抗体与表达人cd47的细胞系，例如已被转染以在其细胞表面表达cd47的cho或chok1细胞反应。另外或备选地，抗体的结合，包括结合动力学(例如，kd值)可以在biacore结合测定法中测试。其他合适的结合测定法包括elisa测定，例如使用重组cd47蛋白。
[0155]
在某些实施方案中，本公开的抗体以不超过0.1nm，不超过0.09nm，不超过0.08nm，不超过0.07nm，不超过0.06nm，不超过0.05nm，或更优选不超过0.04nm的ec
50
结合人cd47，如通过elisa测定的。在某些实施方案中，本公开的抗体以1
×
10-9
m或更低的kd结合人cd47，以5
×
10-10
m或更低的kd结合人cd47，以1
×
10-10
m或更低的kd结合人cd47，以5
×
10-11
m或更低的kd结合人cd47，以4
×
10-11
m或更低的kd结合人cd47，或更优选以3
×
10-11
m或更低的kd结合人cd47，如通过spr测定的。
[0156]
阻断cd47与sirpα的结合
[0157]
信号调节蛋白α(sirpα，也称为cd172a)，主要在巨噬细胞表面上表达，是cd47的受体。本公开的抗体可以调节例如阻断，抑制，减少，拮抗，中和或以其他方式干扰cd47与信号调节蛋白α(sirpα)的结合。已知cd47与sirpα相互作用，因此可以逃避免疫监测。例如，使用如本文所述的抗cd47抗体阻断cd47-sirpα相互作用，可以改善或克服免疫逃逸。
[0158]
如在实施例中所证明的，本文所述的抗cd47抗体可以有效地阻断cd47与sirpα的相互作用。在本公开中，可以通过比较包含抗cd47抗体的阻断样品和仅配体的阻断样品的od450值，来获得抑制率。更高的抑制率对应于更高的阻断能力。例如，抑制率可以是至少70％，至少75％，至少80％或至少85％，即抗cd47抗体可以阻断在没有本文公开的抗cd47抗体的情况下cd47和sirpα之间的相互作用的至少70％，至少75％，至少80％或至少85％。
[0159]
微弱结合人红细胞(rbc)并避免rbc的血凝反应
[0160]
cd47的普遍表达，特别是在rbc上的表达，限制了抗cd47抗体疗法的使用。据报道，许多抗cd47抗体引起人红细胞的血凝反应。在临床前研究中，由于对rbc的清除升高，抗cd47治疗与短暂的溶血性贫血有关。
[0161]
令人惊讶的是，本公开的抗体仅微弱结合人红细胞，避免了血凝反应的不良影响。如实施例中的facs测定中所示，如本文所公开的抗体的ic
50
值和最大mfi值表明其与红细胞的结合显著低于基准抗cd47抗体与红细胞的结合。此外，本文的抗体或抗原结合部分引起
的人rbc的血凝反应显著低于基准抗cd47抗体，例如，低于基准抗cd47抗体引起的血凝反应的90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％或更低。示例性基准抗体包括bmk1，bmk2和bmk4抗体，如表2所示。
[0162]
此外，如在实施例中所示，本文中的抗体在食蟹猴中仅导致温和且短暂的剂量依赖性贫血，并能够在短时间内自发地恢复到正常的基线水平。
[0163]
诱导有效的巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用
[0164]
当cd47与sirpα结合时，sirpα的细胞内免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(itim)被磷酸化，然后募集和活化酪氨酸磷酸酶如shp-1和shp-2。然后，磷酸蛋白底物被去磷酸化，影响下游信号传导途径，传递“别吃我”信号以抑制巨噬细胞的吞噬作用能力。越来越多的证据表明，cd47在许多恶性肿瘤中被上调以逃避免疫攻击，而且其过表达与预后较差相关。此外，对cd47和sirpα结合的破坏在各种恶性肿瘤中促进肿瘤细胞被巨噬细胞吞噬。
[0165]
本公开的抗体能够诱导肿瘤细胞的有效吞噬作用。如本文所公开的，肿瘤细胞包括各种各样的肿瘤细胞，包括来自血液癌或实体瘤的肿瘤细胞。血液癌症可以选自例如，急性淋巴母细胞白血病(all)，t-all，b-all，急性髓性白血病(aml)，非霍奇金淋巴瘤，b淋巴母细胞白血病/淋巴瘤；b细胞慢性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病(cll)，慢性肌细胞白血病(cml)，burkitt淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，sll，cns淋巴瘤，richter综合征，多发性骨髓瘤和免疫母细胞大细胞淋巴瘤。实体瘤可选自如例如，肺癌，胰腺癌，乳腺癌，肝癌，卵巢癌，睾丸癌，肾癌，膀胱癌，脑癌，宫颈癌，结肠/直肠癌，胃肠道癌，皮肤癌，前列腺癌和胃癌等。
[0166]
adcc或cdc活性的介导
[0167]
如上所述，“adcc”是指其中结合于某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤剂(nk)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的fc受体(fcr)的分泌的ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀伤该靶细胞的细胞毒性形式。“cdc”是指在补体存在下裂解靶细胞。
[0168]
本发明人发现，本公开的抗体不会在肿瘤细胞，例如ccrf-cem(急性淋巴母细胞白血病)细胞或raji细胞上介导adcc或cdc活性，。
[0169]
血清中的稳定性
[0170]
稳定性也是抗体的一个重要特性，特别是当抗体用于治疗时。本发明人发现，本公开的抗体在人血清中稳定至少14天。
[0171]
诱导有效的肿瘤生长抑制
[0172]
可以通过测量许多参数来进行肿瘤生长抑制的评估，例如，体重变化，肿瘤体积，与肿瘤生长相关的实时成像值，动物存活时间等。如实施例所示，本文所公开的抗体可以在不同肿瘤模型中实现显著的肿瘤生长抑制。
[0173]
协同作用
[0174]
令人惊讶的是，当与其他抗肿瘤分子尤其是帕尼单抗组合施用时，本公开的抗体表现出协同效果。本公开已经证明，在ncg中的ht-29结肠直肠腺癌模型中，与单独施用前导抗体w3455或帕尼单抗相比，w3455和帕尼单抗的组合施用实现了显著更好的肿瘤生长抑制(如图18和19所示)。
[0175]
抗cd47抗体的cdr
[0176]
在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
[0177]
a)选自下组的一个或多个重链cdr(hcdr)：
[0178]
(i)包含seq id no：1的hcdr1；
[0179]
(ii)包含seq id no：2的hcdr2；和
[0180]
(iii)包含seq id no：3的hcdr3；
[0181]
b)选自下组的一个或多个轻链cdr(lcdr)：
[0182]
(i)包含seq id no：4的lcdr1；
[0183]
(ii)包含seq id no：5的lcdr2；和
[0184]
(iii)包含seq id no：6的lcdr3；或
[0185]
c)a)的一个或多个hcdr和b)的一个或多个lcdr。
[0186]
抗体序列中的可变区和cdr可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在kontermann和dubel编,antibody engineering,springer,new york,ny,2001和dinarello等人,current protocols in immunology,john wiley and sons inc.,hoboken,nj,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“abysis”网站(由department of biochemistry&molecular biology university college london,london,england的a.c.martin维护)和vbase2网站www.vbase2.org，如retter等人,nucl.acids res.,33(database issue):d671-d674(2005)中所述。优选使用abysis数据库分析序列，其整合了来自kabat、imgt和蛋白质数据库(pdb)的序列数据与来自pdb的结构数据，参见dr.andrew c.r.martin所著的书中的章节protein sequence and structure analysis of antibody variable domains.in:antibody engineering lab manual(ed.:duebel,s.和kontermann,r.,springer-ver4-1bb,heidelberg,isbn-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。abysis数据库网站还包括已经开发用于鉴定可以根据本文的教导使用的cdr的一般规则。
[0187]
在一些特定的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中：
[0188]
a)所述vh包含：如seq id no：1所示的hcdr1；如seq id no：2所示的hcdr2；和如seq id no：3所示的hcdr3；和
[0189]
(b)所述vl包含：如seq id no：4所示的lcdr1；如seq id no：5所示的lcdr2；和如seq id no：6所示的lcdr3。
[0190]
抗cd47抗体的可变区
[0191]
在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：
[0192]
(a)重链可变区，其包含：
[0193]
(i)seq id no：7的氨基酸序列；
[0194]
(ii)与seq id no：7具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或
[0195]
(iii)与seq id no：7相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或
[0196]
(b)轻链可变区，其包含：
[0197]
(i)seq id no：8的氨基酸序列；
[0198]
(ii)与seq id no：8具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；或
[0199]
(iii)与seq id no：8相比具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
[0200]
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用e.meyers和w.miller的算法(comput.appl.biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入align程序(版本2.0)，使用pam120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过needleman和wunsch的算法(j.mol.biol.48:444-453(1970))确定，其已并入gcg软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的gap程序中，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0201]
另外地或备选地，本公开的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用altschul,等人(1990)j.moi.biol.215:403-10的xblast程序(版本2.0)来执行。可用xblast程序进行blast蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本公开的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用gapped blast，如altschul等人,(1997)nucleic acids res.25(17):3389-3402中所述的。当使用blast和gapped blast程序时，可以使用各个程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0202]
在一些特定的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分的重链可变区由seq id no：7的氨基酸序列组成，所述分离的抗体或其抗原结合部分的轻链可变区由seq id no：8的氨基酸序列组成。
[0203]
在一些实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列可以与上述相应序列至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。
[0204]
在一些进一步的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分可在重链和/或轻链的可变区中含有保守取代或氨基酸的修饰。在本领域中可以理解，可以进行某些保守的序列修饰，而并不会消除抗原结合。参见，例如brummell等人(1993)biochem 32:1180-8；de wildt等人(1997)prot.eng.10:835-41；komissarov等人(1997)j.biol.chem.272:26864-26870；hall等人(1992)j.immunol.149:1605-12；kelley and o’connell(1993)biochem.32:6862-35；adib-conquy等人(1998)int.immunol.10:341-6 and beers等人(2000)clin.can.res.6:2835-43。
[0205]
如上文所述，本文使用的术语“保守取代”是指以下氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含该氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和pcr介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，包括形成共价键或氢键的能力的化学性质等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应
的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如brummell等人,biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人,protein eng.12(10):879-884(1999)；和burks等人,proc.natl.acad.sci.usa 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
[0206]
fc区
[0207]
优选地，如本文所公开的抗体的fc区是人免疫球蛋白fc区，例如野生型人免疫球蛋白fc区或其变体。fc区可以是任何同种型，包括但不限于igg1，igg2，igg3或igg4。在一些实施方案中，fc区是igg4同种型。
[0208]
与野生型fc区相比，fc区变体可以包含一个或多个氨基酸改变(例如，插入，缺失或取代)，而不改变所需的功能性。例如，本公开的抗体包括在fc区中包含一个或多个修饰，从而导致在fc与fcrn之间具有修饰的结合相互作用(例如增强或减弱)的修饰的fc区。fc修饰的非限制性实例包括例如在人igg4 fc区的氨基酸序列的位置228上丝氨酸(“s”)突变为脯氨酸(“p”)。s228p突变通过稳定igg4分子的核心铰链中的二硫键减少fab臂交换，因此属于igg4稳定化突变，有助于防止半抗体形成。
[0209]
ii.编码抗cd47抗体的核酸分子
[0210]
在一些方面，本公开涉及分离的核酸分子，其包含编码本文公开的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。
[0211]
本公开的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于通过杂交瘤表达的抗体(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cdna。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从基因文库中回收编码这种抗体的核酸。
[0212]
通过将编码vh的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(ch1，ch2和ch3)的另一dna分子，可将编码vh区的分离的核酸转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如kabat等(1991)，同上)，并且通过标准pcr扩增可以获得包含这些区域的dna片段。重链恒定区可以是igg1，igg2，igg3，igg4，iga，ige，igm或igd恒定区，但更优选是igg1或igg4恒定区。
[0213]
通过将编码vl的dna可操作地连接至编码轻链恒定区cl的另一dna分子，可将编码vl区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat等，同上)，并且可以通过标准pcr扩增获得包含这些区域的dna片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
[0214]
一旦获得编码vh和vl区段的dna片段，可以通过标准重组dna技术进一步操作这些dna片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。在这些操作中，编码vl或vh的dna片段与编码另一种蛋白质例如抗体恒定区或柔性接头的另一dna片段可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示两个dna片段连接成使得两个dna片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。
[0215]
在一些实施方案中，本公开涉及分离的核酸分子，其包含编码本文公开的分离的抗体的重链可变区的核酸序列。
[0216]
在一些特定的实施方案中，所述分离的核酸分子编码所述分离的抗体的重链可变
区，并且包含选自下组的核酸序列：
[0217]
(a)编码如seq id no:7所示重链可变区的核酸序列；
[0218]
(b)seq id no:9所示的核酸序列；或
[0219]
(c)在高严格条件下与(a)或(b)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
[0220]
在一些实施方案中，本公开涉及分离的核酸分子，其包含编码本文公开的分离的抗体的轻链可变区的核酸序列。
[0221]
在一些特定的实施方案中，所述分离的核酸分子编码所述分离的抗体的轻链可变区，并且包含选自下组的核酸序列：
[0222]
(a)编码如seq id no:8所示轻链可变区的核酸序列；
[0223]
(b)seq id no:10所示的核酸序列；或
[0224]
(c)在高严格条件下与(a)或(b)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。
[0225]
例如，所述核酸分子由seq id no:9或10组成。备选地，所述核酸分子与seq id no:9或10具有至少80％(例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性。在一些实施方案中，同一性百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。
[0226]
示例性的高严格条件包括在45℃在5x sspe和45％甲酰胺中杂交，以及在65℃在0.1x ssc中进行最终洗涤。本领域理解的是，可以通过改变温度和缓冲液或盐浓度实现等同严格条件，如描述于ausubel等人(编),protocols in molecular biology,john wiley&sons(1994),pp.6.0.3 to 6.4.10的。杂交条件的改变可以凭经验确定或根据探针的长度和鸟苷/胞嘧啶(gc)碱基配对的百分比来精确计算。杂交条件可以按照sambrook等人(编),molecular cloning:a laboratory manual.cold spring harbor laboratory press:cold spring harbor,new york(1989),pp.9.47 to 9.51中描述的计算。
[0227]
iii.宿主细胞
[0228]
本公开中公开的宿主细胞可以是任何适合表达本公开的抗体的细胞，例如哺乳动物细胞。用于表达本公开的抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括dhfr cho细胞，描述于urlaub和chasin，(1980)proc.natl.acad.scl usa 77:4216-4220，使用dhfr选择标记，例如，如r.j.kaufman和p.a.sharp(1982)j.moi.biol.159:601-621所述)、nso骨髓瘤细胞、cos细胞和sp2细胞。特别地，为了与nso骨髓瘤细胞一起使用，另一种表达系统是公开于wo 87/04462、wo 89/01036和ep 338,841中的gs基因表达系统。当将编码抗体的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足够长的时间以允许抗体在宿主细胞中表达或抗体分泌到培养基(宿主细胞在其中生长)中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
[0229]
iv.药物组合物
[0230]
在一些方面，本公开涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
[0231]
组合物的组分
[0232]
药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本公开的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗cd47抗体增强免疫应答。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的
液体、凝胶或固体载体、水性介质、非水性介质、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒的辅助物质、或其他本领域已知的各种组分的组合。
[0233]
合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、edta、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的，在包含抗体或其抗原结合片段的溶剂中，可以还包括了一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸，从而将可能被氧化的抗体或其抗原结合片段还原。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本公开提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本公开进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合，从而可以防止抗体或其抗原结合片段氧化，以延长其保质期和/或增加活性。
[0234]
为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性媒介物如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油，抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(tween-80)，隔绝剂或螯合剂如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以在多剂量容器中添加到药物组合物中，且包括酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，ph缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
[0235]
施用、制剂和剂量
[0236]
本公开的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、颅内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。
[0237]
用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、混悬剂、糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。
[0238]
适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性的等渗、无热原、无菌液体(例如溶液、混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂、和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。适用于此类制剂
的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量、时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期、清除率等)的经验考虑。
[0239]
施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。
[0240]
本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用途径，施用时间，化合物排泄速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病况的严重程度，以及患者的种类、性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到在作用部位处的局部浓度，使得能实现所需效果而不会导致实质性的有害或不利的副作用。
[0241]
通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，每剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，或至少约10mg/kg体重。
[0242]
无论如何，本公开的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员例如主治医生可以基于所治疗病况、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑，确定施用频率。
[0243]
在某些优选的实施方案中，涉及本公开的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用多剂量的所选药物产品。更具体地说，本公开的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用一次。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整时间间隔。
[0244]
在已给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过x射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样品的显微镜检查评估改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如针对前列腺癌的psa)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明显明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。
[0245]
用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的本文公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。
[0246]
v.应用/适应证
[0247]
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如对cd47的检测或增强免疫应答。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。可以调节，例如增强、刺激或上调免疫应答。
[0248]
例如，受试者包括需要提高免疫应答的人类患者。这些方法特别适用于治疗具有通过增强免疫应答(例如，t细胞介导的免疫应答)可以治疗的病症的人患者。在特定实施方案中，该方法特别适合于在体内治疗癌症。为了实现抗原特异性的免疫力增强，可以与感兴趣的抗原以一起施用抗cd47抗体，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者中(例如，携带肿瘤或病毒的受试者)。当将抗cd47抗体与另一药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。
[0249]
本发明进一步提供了用于检测样品中人cd47抗原的存在或测量人cd47抗原的量的方法，包括在允许抗体或其部分与人cd47之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与特异性结合人cd47的人单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，样品之间的复合物形成差异表明样品中存在人cd47抗原。此外，本发明的抗cd47抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人cd47。
[0250]
治疗包括癌症在内的病症
[0251]
在一些方面，本公开提供了治疗哺乳动物中疾病或病症的方法，其包括向需要治疗的受试者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分。所述疾病或病症包括但不限于增殖性病症(例如癌症)。例如，所述病症可以是癌症。
[0252]
可以使用本公开提供的方法治疗或预防多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是否是原发性的或继发性的。这些癌症可以是实体癌或血液恶性肿瘤。这些癌症的实例包括肺癌如支气管癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌和腺癌)、肺泡细胞癌、支气管腺瘤、软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤、软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤、巨细胞瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脊索瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、松果体瘤、骨瘤、血管母细胞瘤、颅咽管瘤、生殖细胞瘤、畸胎瘤、皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症如结肠癌、平滑肌瘤、表皮样癌、腺癌、平滑肌肉瘤、胃腺癌、肠脂肪瘤、肠神经纤维瘤、肠纤维瘤、大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤、血管瘤、肝细胞癌、纤维板层癌、胆管癌、肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌、肾细胞癌、高肾上腺瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液系统癌症如急性淋巴细胞白血病(急性成淋巴细胞白血
病)、急性髓性(髓细胞性、骨髓、成髓细胞性、骨髓单核细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病(例如sezary综合征和毛细胞性白血病)、慢性髓细胞性(髓性、骨髓性、粒细胞性)淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、蕈样真菌病和骨髓增殖性疾病(包括例如真性红细胞增多症、骨髓纤维化、血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤、卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头颈部癌症；与眼相关的癌症，如成视网膜细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生、前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌(宫颈肿瘤)、卵巢癌(卵巢肿瘤)、外阴癌、阴道癌、输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状、滤泡状、间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。在一些特定的实施方案中，癌症是结肠癌。
[0253]
在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级扩散性nhl；高级免疫母细胞nhl；高级淋巴母细胞nhl；高级小型非切割细胞nhl；大块疾病nhl；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom’s macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性淋巴细胞白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴增生性疾病(ptld)，以及与瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)，b细胞增殖性病症和meigs综合征。更具体的例子包括但不限于复发或难治性nhl，前线低级别nhl，iii/iv期nhl，化疗耐受性nhl，前体b淋巴母细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，b细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，b细胞幼淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区b细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区-malt淋巴瘤，淋巴结边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡性淋巴瘤，中级/滤泡性nhl，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡状)、中间级别扩散性nhl、扩散性大b细胞淋巴瘤、侵袭性nhl(包括侵袭性前线nhl和侵袭性复发nhl)，自体干细胞移植后复发或自体干细胞移植难治性的nhl，原发性纵隔大b细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级免疫母细胞nhl，高级成淋巴细胞性nhl，高级小非裂解性细胞nhl，庞大疾病nhl，伯基特淋巴瘤，前体(外周)大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样真菌病和/或塞扎里综合征，皮肤(皮肤性)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，和血管中心性淋巴瘤。
[0254]
在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于b细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于淋巴瘤(例如b细胞非霍奇金淋巴瘤(nhl))和淋巴细胞白血病。这种淋巴瘤和淋巴细胞白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小的非裂解性细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区b细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，malt)，结节边缘区b细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(mcl)，e)大细胞淋巴瘤(包括b细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(dlcl)、弥漫性混合细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺b细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞淋巴瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞白血病(all)，慢性淋巴细胞白血病(cll)/小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)，b细胞幼淋巴细胞性白血病，i)浆细胞赘生，浆细胞性骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞
瘤和/或j)霍奇金氏病。
[0255]
在一些其他实施方案中，所述病症是自身免疫性疾病。可以用本文公开的抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎、红斑狼疮和类风湿性关节炎等。所述抗体或其抗原结合部分也可用于治疗或预防感染性疾病，炎症性疾病(例如过敏性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。
[0256]
刺激免疫应答
[0257]
在一些方面，本公开还提供了增强(例如，刺激)在受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者施用本公开的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答增强。例如，受试者是哺乳动物。在一些具体的实施方案中，受试者是人。
[0258]
术语“增强免疫应答”或其语法变体是指刺激、唤起、增加、改善或增加哺乳动物免疫系统的任何应答。免疫应答可以是细胞应答(即细胞介导的，例如细胞毒性t淋巴细胞介导的)或体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是初级或次级免疫应答。免疫应答增强的例子包括cd4

辅助t细胞活性的增加和溶细胞性t细胞的产生。可以使用本领域技术人员已知的多种体外或体内测量来评估免疫应答的增强，包括但不限于细胞毒性t淋巴细胞测定、细胞因子的释放(例如il-2产生或ifn-γ产生)、肿瘤消退、荷瘤动物的存活、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标志物的表达和细胞毒性。通常，与未治疗的哺乳动物或未使用本文公开的方法治疗的哺乳动物的免疫应答相比，本公开的方法增强哺乳动物的免疫应答。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分用于增强人对微生物病原体(例如病毒)的免疫应答。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分用于增强人对疫苗的免疫应答。在一些实施方案中，该方法增强细胞免疫应答，特别是细胞毒性t细胞应答。在另一个实施方案中，细胞免疫应答是t辅助细胞应答。在又一个实施方案中，免疫应答是细胞因子产生，特别是ifn-γ产生或il-2产生。所述抗体或其抗原结合部分可用于增强人对微生物病原体(例如病毒)或疫苗的免疫应答。
[0259]
所述抗体或其抗原结合部分可以单独使用作为单一疗法，或者可以与化学疗法或放射疗法组合使用。
[0260]
与化疗组合使用
[0261]
抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。
[0262]
术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、减瘤剂、化疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向抗癌剂、brm、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体缔合。更具体而言，在一些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的未配对半胱氨酸以提供工程化的缀合物。因此，这样的工程化缀合物被明确地涵盖在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与如上所述的包含不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。
[0263]
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是来源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于以下的小分子毒素或酶促活性毒素：细菌(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素a)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物
(例如相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，phytolacca mericana蛋白(papi、papii和pap-s)，苦瓜(momordica charantia)抑制剂，麻风树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性rna酶，如胞外胰腺rna酶；dna酶i，包括其片段和/或变体)。
[0264]
为了本公开的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学药剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计为用于抑制癌细胞或可能变成癌性或产生致瘤后代(例如tic)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且组合通常是最有效的，例如在诸如chop或folfiri的方案中。
[0265]
可以与本公开的抗体或其抗原结合部分组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或以未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、cc-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉素类、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、多糖复合物(jhs natural products,eugene,or)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是t-2毒素、维拉库林a(verracurin a)、杆孢菌素a和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(camptosar，cpt-11)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四
氢叶酸；奥沙利铂；pkc-α、raf、h-ras、egfr和vegf-a的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如vegf表达抑制剂和her2表达抑制剂；疫苗，ril-2；拓扑异构酶1抑制剂；rmrh；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0266]
与放射疗法组合使用
[0267]
本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导dna损伤的任何机制，例如γ-照射、x-射线、uv-照射、微波、电子发射等)的组合。还涵盖使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且可以与靶向性的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。
[0268]
vi.药物包装和试剂盒
[0269]
还提供了包括一个或多个容器的药物包装和试剂盒，其中包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在一些实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的ph范围内。或者，在一些实施方案中，组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的抗体或组合物用于治疗选择的疾病或病况。
[0270]
本公开还提供了用于产生抗体以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的抗体或其抗原结合部分。在其他优选实施方案中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含抗体的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本公开的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。
[0271]
更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以针对每种所需试剂具有不同容器。备选地，在施用于患者之前，试剂盒中的抗体和任何任选的抗癌剂可以在不同的容器中分开维持。试剂盒还可以包含用于容纳无菌的药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。
[0272]
当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水性溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。涵盖溶剂也可以提供于另一个容器中。
[0273]
如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针、静脉内注射袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本公开的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。
[0274]
本公开中使用了以下缩写。
[0275][0276][0277]
序列表概述
[0278]
本技术附带有包含前导抗体w3455-4.9.9-uigg4.spl(也缩写为“w3455抗体”)的核酸和氨基酸序列的序列表。下表a、b和c提供了所包含的序列的汇总。
[0279]
表a：cdr氨基酸序列
[0280][0281]
表b：可变区序列
[0282][0283][0284]
表c：重链和轻链的全长序列
[0285]
实施例
[0286]
通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。
[0287]
实施例1
[0288]
材料、基准抗体和细胞系的制备
[0289]
1.1材料的准备
[0290]
表1和2中分别提供了实施例中使用的市售材料和材料编号的信息。
[0291]
表1
[0292][0293]
表2
[0294][0295][0296]
1.2抗原的生成
[0297]
将带有fc标签的人cd47(np_001768.1，ncbi)和食蟹猴cd47(xp_005548289.1，ncbi)细胞外结构域(ecd)基因克隆到表达载体中。然后，根据制造商的指示(expi293f转染试剂盒，invitrogen)将质粒转染到expi293细胞中。将细胞在37℃，8％co2的培养箱中培养，然后在培养5天后收集上清液。使用蛋白质a柱和sec柱纯化抗原蛋白。
[0298]
1.3基准抗体的产生
[0299]
将编码抗cd47抗体bmk1、bmk2、bmk4和bmk8(参见表2，如参考文献[5]-[9]公开的，这些文献通过引用整体并入本文)的可变区的dna序列分别克隆到具有人igg4的恒定区的表达载体中。然后，根据制造商的指示(expi293f转染试剂盒，invitrogen)将质粒转染到expi293细胞中。将细胞在37℃，8％co2的培养箱中培养，然后在培养5天后收集上清液。使用蛋白质a柱和sec柱纯化蛋白质。
[0300]
生成基准抗体“w345-bmk1.uigg4pe.k”、“w345-bmk2.uigg4.sp”、“w345-bmk4.uigg4.spk”和w345-bmk8并在以下实施例中用作对照。它们在本文中还分别被称为w345-bmk1、w345-bmk2、w345-bmk4和bmk8。
[0301]
1.4细胞池/细胞系生成
[0302]
将人cd47(np_001768.1，ncbi)或食蟹猴cd47(xp_005548289.1，ncbi)的全长基因克隆到表达载体中用于形成细胞系。简而言之，使用lipofectamine 2000试剂用人或猴cd47全长质粒转染70-90％汇合的cho-k1细胞。将转染的细胞在37℃，5％co2的培养箱中培养。转染后24小时，使用终浓度为2-10μg/ml的杀稻瘟素蛋白选择稳定的细胞池。然后，通过有限的稀释将阳性池的细胞亚克隆。挑取单个克隆并使用抗cd47抗体通过facs测试。
[0303]
实施例2
[0304]
抗体杂交瘤的生成
[0305]
2.1动物免疫和血清滴度检测
[0306]
从ligand购买四只转基因大鼠，并在iacuc认可的动物设施中饲养。将人cd47(np_942088)或小鼠cd47(q61735)细胞外结构域(ecd)蛋白和cd47全长表达质粒用作免疫原，用于每次以30-100μg/大鼠进行动物免疫。免疫前后从动物中收集血清样品，并根据一般的elisa程序通过elisa测试对靶蛋白的血清滴度。
[0307]
血清滴度结果显示在表3中。选择具有更高血清滴度的1#和2#大鼠用于电促细胞融合。
[0308]
表3.血清滴度汇总
[0309][0310]
2.2杂交瘤生成
[0311]
处死动物，并根据通常的电融合程序将来自脾脏和淋巴结的b细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合。在细胞融合之后，将细胞在具有dmem培养基的96孔板中铺板，该培养基补充有20％fbs和1％hat选择试剂。将平板在37℃，5％co2的培养箱中培养14天，其中在第7天和第10天进行两次培养基更换，然后进行各种筛选。
[0312]
2.3杂交瘤筛选和亚克隆
[0313]
通过针对针对人cd47或食蟹猴cd47蛋白的elisa和facs筛选杂交瘤细胞。通过facs评估cd47抗体与sirpα配体竞争结合cd47蛋白的能力。使用半固体培养基方法亚克隆产生抗体的杂交瘤细胞，并使用如上所述的方法重新筛选亚克隆的杂交瘤细胞。在一系列筛选后，阳性克隆wbp3455-4.9.9被鉴定为前导杂交瘤克隆，并进一步完全表征。
[0314]
2.4杂交瘤测序
[0315]
鉴定前导克隆wbp3455-4.9.9并测序。从杂交瘤细胞中提取rna，使用5'-race试剂盒扩增cdna，然后使用3'-简并引物和3'-衔接子引物进行pcr扩增，然后将pcr片段克隆到pmd18-t载体中用于测序。
[0316]
表4列出了wbp3455-4.9.9的具体的可变结构域氨基酸序列。
[0317]
表4.可变结构域氨基酸序列
[0318][0319]
实施例3
[0320]
前导抗体w3455-4.9.9-uigg4.spl的产生
[0321]
通过将原始克隆w3455-4.9.9的重链和轻链的可变区转化到具有s228p突变的人igg4骨架形式中来构建最终前导抗体，根据制造商的说明(expi293f转染试剂盒，invitrogen)转染到expi293细胞中。收集瞬时细胞上清液并过滤，然后使用蛋白a柱(ge healthcare，175438)或蛋白g柱(ge healthcare，170618)进行纯化过程。
[0322]
所得抗体被命名为“w3455-4.9.9-uigg4.spl”(又称为“wbp3455-4.9.9-uigg4.spl”或“w3455-4.9.9-uigg4l.sp”)。通过280nm的吸光度测定纯化的抗体的浓度。通过sds-page和sec-hplc测试抗体的分子量和纯度；然后储存在-80℃直到使用。
[0323]
表5中总结了前导抗体的分子量和纯化信息。可以看出，前导抗体的纯度高于95％。
[0324]
表5
[0325][0326]
实施例4
[0327]
前导抗体w3455-4.9.9-uigg4.spl的体外表征
[0328]
4.1抗体与人cd47蛋白的结合(elisa)
[0329]
通过elisa测定前导抗体对cd47蛋白的结合。将96孔板用1μg/ml的人cd47 ecd蛋白在4℃过夜包被，并用2％bsa-pbs封闭1小时。然后加入各种浓度的前导抗体并孵育2小时。然后加入山羊抗人igg-fc-hrp二抗并孵育1小时。加入tmb过氧化物酶底物溶液，然后使用2m hcl在12分钟后停止反应。所有孵育步骤在室温进行，并在步骤之间用ph7.4 phst洗涤5次。测试样品的吸光度用多壁板读取器(m5e)在450nm测量。通过使用以
下graphpad prism软件公式分析结合的ec
50
：非线性回归(曲线拟合)-对数(激动剂)vs.响应
‑‑
可变斜率。
[0330]
如图1所示，结果表明，该前导单抗可以以高亲和力结合人cd47 ecd蛋白。结合的ec
50
和最大od在前导单抗和三个基准对照中是相当的。
[0331]
4.2抗体与表达人或食蟹猴cd47的细胞的结合(facs)
[0332]
通过facs测定前导抗体与表达人cd47或食蟹猴cd47的细胞的结合。简而言之，将工程化的cd47表达细胞以1x105个细胞/孔的密度包被到96孔u型底板中，并在4℃以1500rpm离心4分钟，然后去除上清液。然后加入不同浓度的前导抗体，重悬细胞并在4℃孵育1小时。用180μl 1％bsa-pbs洗涤细胞两次。向重悬的细胞加入二抗山羊抗人igg-fc pe，并在4℃避光孵育30分钟，然后用180μl 1％bsa-pbs洗涤。最后，将细胞重新悬浮于100μl 1％bsa-pbs中，通过facs(bd canto ii)测量荧光强度并通过flowjo version软件进行分析。通过使用以下graphpad prism软件公式计算结合的ec
50
：非线性回归(曲线拟合)-对数(激动剂)vs.响应
‑‑
可变斜率。
[0333]
如图2和3所示，结果表明，该前导单抗可以以高亲和力和相当的亲和力结合表达人cd47的细胞和表达食蟹猴cd47的细胞。
[0334]
4.3抗体与人rbc的结合(facs)
[0335]
由于cd47在人红细胞(rbc)上表达，因此通过facs评估w3455-4.9.9-uigg4.spl对人红细胞的结合活性。通过以2000rpm离心10分钟并弃去上清血清，从经过柠檬酸三钠处理的新鲜人血中分离人红细胞。将人rbc细胞以1x105个细胞/孔的密度包被到96孔u型底板中，并在4℃以1500rpm离心4分钟，然后去除上清液。然后加入不同浓度的前导抗体，重悬细胞并在4℃孵育1小时。用180μl 1％bsa-pbs洗涤细胞两次。加入二抗山羊抗人igg-fc pe，重悬细胞并在4℃避光孵育30分钟，然后用180μl1％bsa-pbs洗涤。最后，将细胞重新悬浮于100μl 1％bsa-pbs中，并通过facs(bd cantoii)测量荧光强度和通过flowjo version软件进行分析。通过使用以下graphpad prism软件公式计算结合的ec
50
：非线性回归(曲线拟合)-对数(激动剂)vs.响应
‑‑
可变斜率。
[0336]
如图4所示，结果表明，与基准抗体相比，前导单抗能够以低得多的亲和力与人类rbc结合，这在改善临床试验中的贫血方面可能具有显著的益处。
[0337]
4.4人rbc血凝反应测定(ha)
[0338]
为了评估w3455-4.9.9-uigg4.spl在rbc上的血凝反应活性(ha)，使用人红细胞(hrbc)进行ha。通过以2000rpm离心10分钟并丢弃上清液血清，从经柠檬酸三钠处理的新鲜人血液中分离出人rbc。将25ul用dpbs稀释的hrbc悬浮液加入u形底96孔板(约4
×
106rbc/孔)，然后加入25ul前导抗体(稀释范围为667nm至0.667nm，等于100ug/ml至0.1ug/ml)，然后温和地混合并在37℃孵育1小时。将rbc重新悬浮在dpbs中并在显微镜下检查。
[0339]
rbc簇形成定义为ha阳性，如图5所示(w345-bmk2)，而保持完整和游离条件的rbc被定义为ha阴性(同种型对照)。如图5所示，结果表明，加入前导单抗的rbc仍然是完整和游离形式的，没有任何rbc簇形成，因此被定义为ha阴性，而w345-bmk2.uigg4.sp诱导显著的rbc簇，表明是ha阳性的。
[0340]
4.5人配体竞争测定(elisa)
[0341]
为了评估w3455-4.9.9-uigg4.spl对配体(sirpα)的阻断活性，通过elisa进行了
基于蛋白质的竞争测定。将96孔板用1μg/ml的人cd47 ecd在4℃过夜包被，并用2％bsa-pbs封闭1小时。加入各种浓度的前导抗体和人sirpα(1ug/ml)的混合物并孵育2小时。加入二抗小鼠抗his标签-hrp并孵育1小时。加入tmb过氧化物酶底物溶液，然后在12分钟后使用2m hcl停止反应。所有孵育步骤在室温进行，并在步骤之间用pbst洗涤板。用多壁板读取器在450nm处测量测试样品的吸光度。通过使用以下graphpad prism软件公式计算竞争性结合的ic
50
：非线性回归(曲线拟合)-对数(拮抗剂)vs.响应
‑‑
可变斜率。
[0342]
如图6所示，数据表明，该前导单抗可以竞争性地阻断cd47和sirpα(配体)之间的结合相互作用，抑制率》85％。使用以下等式计算抑制率：[(od450
仅配体-od450
阻断样品
)/od450
仅配体
x 100％]。
[0343]
4.6人配体竞争测定(facs)
[0344]
为了评估w3455-4.9.9-uigg4.spl对配体(sirpα)的阻断活性，使用稳定表达人cd47的细胞进行基于细胞的竞争测定。简而言之，将工程改造的表达人cd47的细胞以1
×
105个细胞/孔涂覆到96孔u形底板上，并在4℃以1500rpm离心4分钟，然后除去上清液。加入各种浓度的前导单抗和人sirpα蛋白(1ug/ml)的混合物并孵育2小时。用200μl 1％bsa-pbs洗涤细胞两次。将小鼠抗his标签-生物素加入到重悬的细胞中并在4℃在黑暗中孵育1小时，然后用200μl 1％bsa-pbs洗涤。将三抗抗链霉亲和素蛋白-pe加入重悬浮的细胞中，并在4℃在黑暗中温育30分钟，然后用200μl 1％bsa-pbs洗涤。最后，将细胞重新悬浮在100μl 1％bsa-pbs中，通过facs(bd canto ii)测量荧光强度并通过flowjo version软件分析。通过使用以下graphpad prism软件公式计算竞争性结合的ic
50
：非线性回归(曲线拟合)-对数(拮抗剂)vs.响应
‑‑
可变斜率。
[0345]
如图7所示，结果表明前导单抗能够竞争性地阻断人cd47对其配体sirpα的结合。
[0346]
4.7人cd47亲和力(spr)
[0347]
使用biacore t200通过spr测定法测量w3455-4.9.9-uigg4.spl的人cd47结合亲和力。在固定有抗人igg fc抗体的cm5传感器芯片(ge)上捕获每种抗体。将不同浓度的人cd47蛋白以30μl/min的流速注射通过传感器芯片，结合阶段为180s，接着是3600s解离。在每个结合循环后，将芯片通过10mm甘氨酸(ph 1.5)再生。从测试传感器图中减去空白表面和缓冲液通道的传感图。使用langmiur分析将实验数据通过1：1模型拟合。使用55kda的分子量来计算分析物抗原的摩尔浓度。
[0348]
亲和力kd值显示在表6中，结合动力学曲线如图8所示。两者均表明前导单抗能够以高亲和力结合人cd47，略好于基准抗体w345-bmk2.uigg4.sp。
[0349]
表6.通过spr测量的前导单抗的人cd47结合亲和力数据
[0350][0351]
4.8热稳定性
[0352]
使用差示扫描荧光测定法(dsf)来评估前导单抗的热稳定性。简而言之，使用quantstudio
tm 7 flex实时pcr系统(applied biosystems)研究了抗体的tm。将19μl抗体溶液与1μl 62.5
×
sypro orange溶液(invitrogen)混合并转移至96孔板(biosystems)。将板以0.9℃/min的速率从26℃加热至95℃，并收集所得的荧光数据。计算相对于不同温度的荧
光变化的负导数，并且将最大值定义为熔解温度tm。如果蛋白质具有多个解折叠转变，则报告前两个tm，命名为tm1和tm2。数据收集和tm计算由操作软件自动进行。
[0353]
如下面的图9和表7所示，结果表明，前导单抗在两种不同的缓冲液中显示出良好的热稳定性。
[0354]
表7通过dsf的前导单抗的热稳定性测试
[0355][0356]
4.9血清稳定性
[0357]
在人血清中进行前导mab的血清稳定性测定。将新鲜收集的人血在不含抗凝剂的聚苯乙烯管中在室温静置30分钟。在将血液以4000rpm离心10分钟后收集血清。将抗体与血清轻轻混合，将血清-抗体混合物在37℃孵育。分别在第0天、第1天、第4天、第7天和第14天收集样品，并在-80℃的指定时间快速冷冻直至使用。使用样品来评估其与人cd47表达细胞的结合能力。简而言之，将连续稀释的抗体添加到cd47表达细胞中，并在4℃孵育1小时。用含有1％bsa的200μl pbs洗涤细胞两次。将缀合有pe的山羊抗人igg fc用facs缓冲液以1:150稀释，添加至细胞中并在4℃温育30分钟。使用200μl facs缓冲液进行两次额外的洗涤步骤，然后在4℃以1500rpm离心4分钟。最后，将细胞重悬浮于100μl facs缓冲液中，通过facs测量荧光值并通过flowjo分析。
[0358]
如图10所示，结果表明血清培养对前导mab与人cd47的结合能力没有影响。前导mab的结合不会随时间而改变，因为前导mab在37℃人血清中至少可稳定14天。
[0359]
4.10非特异性蛋白结合(elisa)
[0360]
通过elisa测试前导单抗对14种不同蛋白质的非特异性结合。将96孔高结合板用1μg/ml的14种不同的蛋白质在4℃过夜包被，并用2％bsa-pbs封闭1小时。加入10μg/ml的前导抗体并孵育2小时。然后加入山羊抗人igg-fc-hrp二抗并孵育1小时。加入tmb过氧化物酶底物溶液，然后使用2m hcl在12分钟后停止反应。所有孵育步骤在室温进行，并在步骤之间用ph7.4 pbst洗涤5次。用多壁板读数器(m5e)在450nm测量测试样品的吸光度。
[0361]
od450值总结在下表8中。数据表明，前导抗体显示与14种测试蛋白质没有特异性结合。
[0362]
表8.通过elisa的前导单抗的非特异性结合测定
[0363][0364]
4.11非特异性细胞结合(facs)
[0365]
通过facs测量前导mab对14种不同的人源肿瘤细胞和鼠来源的cho-k1细胞的非特异性结合。将14种不同的细胞以1
×
105个细胞/孔转移到96孔u形底板中，并在4℃以1500rpm离心4分钟，接着除去上清液。将10μg/ml的前导抗体加入细胞并在4℃孵育1小时。
用180μl 1％bsa/1xpbs洗涤细胞两次。将山羊抗人igg fc pe二抗(jackson，货号109-115-098)加入重新悬浮的细胞，并在4℃在黑暗中孵育30分钟。用180μl1％bsa/1xpbs进行两次进行另外的洗涤步骤，然后在4℃以1500rpm离心4分钟。最后，将细胞重悬于100μl 1％bsa-pbs中，然后通过流式细胞术(bd canto ii)测量荧光强度并通过flowjo分析。
[0366]
mfi值总结在下表中。该数据表明，前导单抗能够与测试的所有14种人源肿瘤细胞结合，但不结合仓鼠来源的cho-k1细胞，表明cd47在人肿瘤细胞上广泛表达。
[0367]
表9.通过facs的前导单抗非特异性结合测定
[0368][0369]
4.12吞噬作用测定(facs)
[0370]
使用人pbmc来源的巨噬细胞以及将jurkat细胞、raji细胞两种肿瘤细胞系和人rbc作为靶细胞，来评估前导单抗的吞噬活性。
[0371]
从新鲜人血中分离人pbmc，通过hcd14微珠从pbmc中分离cd14阳性单核细胞。cd14阳性单核细胞通过在含有100ng/ml rhm-csf的10％fbs rpim1640培养基中培养7天，分化为巨噬细胞。这些单核细胞衍生的巨噬细胞(mdm)变得贴壁，从而允许其他细胞被冲走。刮下mdm并将其接种到96孔板中。选择几种人类肿瘤细胞系或人rbc作为靶细胞类型，因为它们高表达cd47。靶细胞在37℃用1um cfse标记30分钟，然后洗涤并以每个吞噬细胞1:1的肿瘤细胞比例添加到mdm中，并添加不同浓度的cd47抗体。靶细胞的吞噬作用进行2小时，然后用缀合apc的巨噬细胞标志物cd14的抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。通过对fl4阳性(cd14 )的活细胞设门来测量吞噬作用，然后评估fl1(cfse )阳性细胞的百分比。
[0372]
对吞噬肿瘤细胞的巨噬细胞计数并计算为指数：吞噬指数％＝百分比
cfse /cd14-apc
/(百分比
cfse /cd14-apc
百分比
cfse-/cd14-apc
)
×
100％。
[0373]
如图11所示，前导单抗诱导对肿瘤细胞有效的吞噬作用，程度与基准抗体相当，稍好于w345-bmk1.uigg4pe.k和w345-bmk4.uigg4.spk(图11a-b)。令人惊讶的是，对于前导单抗来说，对人红细胞的吞噬作用相对低于w345-bmk2.uigg4.sp(图11c)。
[0374]
4.13 adcc测定和cdc测定
[0375]
在ccrf-cem和raji细胞上评估前导单抗的adcc和cdc活性。使用pbmc作为效应细胞，ccrf-cem或raji用作靶细胞。
[0376]
adcc测定：从新鲜人血液分离人pbmc。在96孔u形板的每个孔中，加入在含有1％fbs的40μl rpmi1640培养基(无苯酚)中的2x104个靶细胞。然后，向每个孔中加入在含有1％fbs的20μl rpmi1640培养基(无苯酚)中的连续稀释抗体。在37℃孵育15分钟后，向每个孔中加入40μl rpmi1640培养基(无苯酚)中的4
×
105个pbmc，产生20：1的e/t比。在37℃温育4小时后，将混合物以1500rpm离心5分钟，并转移70μl上清液用于检测。根据制造商的说明，使用ldh细胞毒性检测试剂盒(roche)评估细胞死亡。
[0377]
cdc测定：在96孔u形板的每个孔中，加入在含有1％fbs的40μl rpmi1640培养基(无苯酚)中的2x104个靶细胞。然后，向每个孔中加入含有1％fbs的20μl rpmi1640培养基(无苯酚)中的连续稀释抗体。在37℃孵育15分钟后，向每个孔中加入在40μl rpmi1640培养
基(无苯酚)中的正常人补体。在37℃温育4小时后，将混合物以1500rpm离心5分钟，并转移70μl上清液用于检测。根据制造商的说明，使用ldh细胞毒性检测试剂盒(roche)评估细胞死亡。
[0378]
如图12所示，结果表明，前导单抗和其他基准抗体在ccrf-cem和raji肿瘤细胞上诱导微弱的或没有adcc和cdc活性。
[0379]
实施例5
[0380]
前导抗体w3455-4.9.9-uigg4.spl的体内表征
[0381]
5.1 b-ndg小鼠模型(raji细胞)中的抗肿瘤疗效
[0382]
使用b-ndg小鼠(biocytogen公司)的raji-luc淋巴癌模型进行了前导单抗功效研究。在补充有10％热灭活的胎牛血清的rpmi1640培养基中，在37℃、5％co2的空气中培养细胞。肿瘤细胞每周常规传代培养两次，伴随0.25％胰蛋白酶-edta处理。收获在指数生长期的细胞并计数用于肿瘤接种。
[0383]
对于治疗模型，每只小鼠静脉内接种raji-luc淋巴癌细胞(5.0
×
105)。通过动物活体成像仪每周两次监测实时成像值作为肿瘤生长。当肿瘤的实时成像信号值达到约1.05
×
106p/秒/cm2/sr时，将动物随机分组成五组，并在3mg/kg和0.5mg/kg两种剂量水平进行研究。动物研究设计如表10所示。分组日被认为是第0天，小鼠每周腹膜内注射两次共计6次，分别在第0天、分组后第4天、第7天、第11天、第14天和第18天。对于所有荷瘤小鼠，每周两次测量小鼠肿瘤的实时成像值和体重。研究中与动物操作、护理和治疗有关的所有程序均根据上海生物模型的机构动物护理和使用委员会(iacuc)批准的指南并遵循国际实验动物评估和认可委员会(aaalac)的指南进行。
[0384]
表10.抗肿瘤功效研究计划
[0385][0386]
每周两次或三次通过动物活体成像仪获得实时发光信号强度(以p/秒/cm2/sr表示的成像值)来监测肿瘤的生长。结果由平均值和标准误差(平均值
±
sem)表示。使用双向anova bonferroni后检验用prism分析数据，p《0.05被认为是统计学显著的。
[0387]
如图13和表11所示，在分组后第18天，与g1(igg4同种型对照，3mg/kg)媒介物组相比，g2组到g5组中的动物的平均体重显示没有显著减少，表明w3455-4.9.9-uigg4l.sp and w345-bmk2.uigg4.sp没有毒性。图13中的黑色箭头表示给药时间。数据表示为均值
±
sem，n＝7。
[0388]
表11.在分组之前和分组后第18天的体重
[0389][0390]
注意：a.均值
±
sem。
[0391]
b.g1组与治疗组之间使用t检验对分组后第18天的平均体重的统计学分析。
[0392]
如图14、图15和表12所示，在分组后第21天，与g1(igg4同种型对照，3mg/kg)媒介物组相比，g2组至g5组的肿瘤生长抑制(tgi％)分别为100.0％、93.2％、100.0％和87.5％。tgi(％)＝[1-(ti-t0)/(vi-v0)]
×
100％，其中ti和vi分别指在给定日治疗组和媒介物组中的平均图像信号值(即发光信号强度)。t0和v0分别指在分组日治疗组和媒介物组中的平均图像信号值。此外，数据显示统计学显著差异(p《0.05)，表明w3455-4.9.9-uigg4l.sp and w345-bmk2.uigg4.sp的明显抗肿瘤效果。图14中的黑色箭头表示给药时间。数据表示为均值
±
sem，n＝7。
[0393]
表12.肿瘤生长抑制分析
[0394]
分组后第21天的肿瘤生长抑制
[0395][0396]
注意：a.均值
±
sem。
[0397]
此外，在分组后第0-25天期间的动物存活率如图16所示。对于3和0.5mg/kg水平的两个wbp3455组和3mg/kg的w345-bmk2组，没有动物死亡。该结果表明，w3455-4.9.9-uigg4l.sp比w345-bmk2.uigg4.sp显示出更好的功效，并且显著延长了荷瘤小鼠的存活时间。
[0398]
总之，前导抗体w3455-4.9.9-uigg4l.sp的治疗显示出显著的抗肿瘤疗效，并且表现出与w345-bmk2.uigg4.sp一样好或更好的结果。此外，wbp3455-4.9.9-uigg4l.sp显著延长了荷瘤小鼠的存活时间。
[0399]
5.2 ncg小鼠模型(ht-29细胞)中的抗肿瘤疗效
[0400]
在ncg小鼠中对ht-29结直肠腺癌模型测试了前导单抗功效。研究中使用了7-8周龄的雌性ncg小鼠(南京银河生物制药有限公司)。亲本ht-29细胞系是从atcc购买的。在补充有10％热灭活的胎牛血清的rpmi1640培养基中，在37℃、5％co2的空气中培养细胞。肿瘤细胞每周常规传代培养2-3次，伴随0.25％胰蛋白酶-edta处理。收获在指数生长期的细胞并计数用于肿瘤接种。
[0401]
对于治疗模型，将ht-29细胞(5.0
×
106个细胞/100μl，在pbs中)皮下接种到ncg小鼠中。对于所有肿瘤研究，称量小鼠并使用卡钳每周测量肿瘤生长两次。研究中与动物操作、护理和治疗有关的所有程序均根据上海sippr-bk实验室动物公司的机构动物护理和使用委员会(iacuc)批准的指南并遵循国际实验动物评估和认可委员会(aaalac)的指南进行。用公式1/2(长度
×
宽度2)计算肿瘤体积。结果由均值和标准误差(均值
±
sem)表示。使用双向rm anova tukey多重比较检验用graphpad prism 6.0分析数据，p《0.05被认为是统计学显著的。
[0402]
如图17所示，最终前导抗体在ncg小鼠中显示出有效的抗ht29肿瘤细胞功效，该肿瘤细胞对帕尼单抗具有抗性。此外，在组合组(wbp3455-4.9.9-uigg4l.sp 帕尼单抗)中观察到协同抗肿瘤效应，在第15天、第17天和第22天的结果具有统计学显著性，如图18所示。
[0403]
5.3 cb-17 scid小鼠模型(raji细胞)中的抗肿瘤疗效
[0404]
在cb-17 scid小鼠中对raji b淋巴癌模型进行了前导单抗的抗肿瘤功效测试。研究中使用了7-8周龄的雌性cb-17 scid小鼠(上海lingchang biotech co.，ltd)。在补充有10％热灭活的胎牛血清的rpmi1640培养基中，在37℃、5％co2的空气中培养细胞。肿瘤细胞每周常规传代培养3次。收获在指数生长期的细胞并计数用于肿瘤接种。
[0405]
对于治疗模型，将raji细胞(1.0
×
106个细胞/200μl，在matrigel/pbs混合物中)皮下接种到cb-17 scid小鼠中。称量体重并使用卡尺测量肿瘤生长。当肿瘤体积达到约110mm3时，将动物随机分组为5组：g1(同种型对照，5mg/kg)组，g2(w345-bmk2，1mg/kg)组，g3(w345-bmk8，1mg/kg)组，g4(w3455-4.9.9-uigg4l.sp，5mg/kg)组和g5(w3455-4.9.9-uigg4l.sp，1mg/kg)组，分组日作为第0天。然后小鼠每周腹膜内注射两次，共计6次，分别在第0天、分组后第4天、第7天、第11天、第14天和第18天。对于所有荷瘤小鼠，每周两次称量体重并使用卡尺测量肿瘤生长。研究中与动物操作、护理和治疗有关的所有程序均根据上海模式生物动物公司的机构动物护理和使用委员会(iacuc)批准的指南并遵循国际实验动物评估和认可委员会(aaalac)的指南进行。
[0406]
用公式1/2(长度
×
宽度2)计算肿瘤体积。结果由均值和标准误差(均值
±
sem)表示。使用双向rm anova tukey多重比较检验用graphpad prism分析数据，p《0.05被认为是统计学显著的。
[0407]
如图19a和表13所示，在分组后第21天，g1组到g5组中的动物的平均体重未显示出明显减少，表明w3455-4.9.9-uigg4l.sp、w345-bmk2和w345-bmk8没有毒性。
[0408]
如图19b和表14所示，在分组后第21天，与g1(同种型对照，5mg/kg)媒介物组相比，g2组至g5组的肿瘤生长抑制(tgi％)分别为94.70％、67.48％、103.32％和94.70％。此外，数据显示出统计学上显著的差异(p《0.05)，表明w3455-4.9.9-uigg4l.sp、w345-bmk2和
w345-bmk8的明显抗肿瘤效果。此外，w3455-4.9.9-uigg4l.sp在1mg/kg的给药水平显示出与w345-bmk2相似的功效，且比w345-bmk8好得多的功效。
[0409]
表13.在分组前和分组后第21天的体重
[0410][0411]
注意：a.均值
±
sem。
[0412]
b.g1组与治疗组之间使用t检验对分组后第21天的平均体重的统计学分析。
[0413]
表14.分组后第21天的肿瘤生长抑制
[0414][0415]
注意：a.均值
±
sem。
[0416]
b.g1组与治疗组之间使用t检验对分组后第21天的平均体重的统计学分析。
[0417]
5.4食蟹猴中的药代动力学和毒理学研究
[0418]
5.4.1药代动力学参数
[0419]
在非野生食蟹猴中评估前导单抗的药代动力学(pk)。将四只雄性猴(2个动物/组)分为2组：低剂量组和高剂量组(15和50mg/kg)。对动物静脉内施用单个剂量(见表15)。在ph 5.0的20mm组氨酸、5％蔗糖溶液中配制抗体。在给药前(日-1)，0.25h，0.5h，1h，4h，8h，24h，第3天，第7天，第14天，第21天和第28天收集血液样品，通过elisa方法测定并用winnonlin软件分析。通过血液分析仪(advia2120)和化学分析仪(hitachi 7180)分别测定针对血液学(cbc)和血清化学的全血样品分析。定期进行总体健康、外观，特别是皮肤刺激的笼侧观察。
[0420]
表15.分组和测试抗体给药信息
[0421][0422]
表16.药代动力学参数分析
[0423][0424]
对于15mg/kg和50mg/kg水平，w3455-4.9.9-uigg4.spl的平均半衰期(t
1/2
)分别为48和86小时，如图20和表16中所示。数据表示为平均值，n＝2。
[0425]
当w3455-4.9.9-uigg4.spl的剂量从15mg/kg增加至50mg/kg时，c
max
代表的系统性暴露增加了2.3倍，而且当剂量从15mg/kg增加至50mg/kg时，auc
0-t
增加了8.7倍。总之，当剂量从15mg/kg增加至50mg/kg时，系统性暴露随着剂量也成比例地增加。
[0426]
5.4.2毒理学研究
[0427]
在pk研究期间，在食蟹猴中评估了前导单抗的血液学作用。计算红细胞(rbc)和网织红细胞的数量，并量化血红蛋白的水平。结果显示在图21中，数据表示为n＝2的平均值。
[0428]
施用w3455-4.9.9-uigg4.spl导致温和的短暂的剂量依赖性贫血。rbc计数和血红蛋白(hgb)的最低点发生在第7天，并且在1-2周内自发地恢复到正常范围，如图21a-b所示。短暂的贫血通过用年轻的rbc替换得到解决，因为早在第3天，网织红细胞(ret)计数明显增加，并补偿了血液中的衰老的rbc的损失(图21c)。
[0429]
因此，我们得出结论，贫血是短暂和普遍耐受性较好的。短暂的贫血在施用的剂量方案下是温和的，且在大约两周后，自发恢复到基线水平。所有4只猴子在28天的试验期间呈现正常行为。
[0430]
本领域技术人员将认识到在不脱离其精神或中心特征的情况下，本公开可以以其他具体形式来实施。由于本公开的前述描述仅公开了其示例性实施方案，其他变化应该被理解为在本发明的范围内。因此，本公开不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本公开的范围和内容。
[0431]
参考文献
[0432]
[1]michael h.kershaw和mark j.smyth.making macrophages eat cancer.science 5 jul 2013 vol 341.
[0433]
[2]chao mp,等人.anti-cd47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosis and eradicate non-hodgkin lymphoma.cell 2010；142:699
–
713.
[0434]
[3]brown ej,frazier wa.integrin-associated protein(cd47)and its ligands.trends cell biol 2001；11:130
–
135
[0435]
[4]chao mp,等人.therapeutic antibody targeting of cd47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia.cancer res 2011；71:1374
–
1384.
[0436]
[5]liu j,等人.pre-clinical development of a humanized anti-cd47 antibody with anti-cancer therapeutic potential.plos one 2015；10:e0137345.(bmk2)
[0437]
[6]专利:wo 2016/109415 a1；jun.17,2016.(bmk1).cd47 antibodies and methods of use thereof.
[0438]
[7]专利:us_9017675_b2；humanized and chimeric monoclonal antibodies to cd47.(bmk2)
[0439]
[8]专利:us 2017/0081407 a1；mar.23,2017.(bmk4).anti-cd47 antibodies andmethods of use.
[0440]
[9]专利:wo 2018/075857 a1；april.26,2018.(bmk8).novel cd47 monoclonal antibodies and uses thereof.