光敏通道蛋白在空间学习记忆障碍的哺乳动物中的用途

1.本发明涉及光遗传技术领域，具体涉及经激活的光敏通道蛋白(如chr2光敏通道蛋白)在空间学习记忆障碍的哺乳动物中的用途、一种改善哺乳动物空间学习记忆障碍的药物组合物以及一种改善哺乳动物空间学习记忆障碍的系统。


背景技术：

2.微波辐射广泛应用于通讯、医疗、工业和军事等领域，人类受到人造微波辐射的机会越来越多。众多研究表明，微波辐射可引起脑认知功能障碍。其中，学习和记忆是脑认知功能的基础和前提，通过流行病学调查和动物行为实验研究发现，微波辐射可引起人和动物学习和记忆能力的下降，但相关机制尚未阐明。
3.空间学习和记忆是脑学习和记忆功能的重要形式，也是动物体很多复杂行为的基本组成部分，如觅食、归巢、躲避天敌等。因此，空间学习和记忆对于情景式记忆的形成、导航和动物生存等具有重要的生理意义。众多研究表明，海马是负责空间学习和记忆的关键脑区。海马全区包括海马回ca1、ca2、ca3和齿状回(dentategyrus，dg)。海马神经元突触结构和功能可塑性，后者包括长时程增强(long-term potentiation，ltp)和长时程抑制(long-term depression，ltd)，是对空间学习和记忆进行表征的神经生物学基础。
4.空间学习和记忆受到多条信号通路、多种因子以及多种外界环境的复杂调节。目前，提高空间学习和记忆能力的药物和非药物方法十分有限。并且，报道可改善微波辐射引起的空间学习和记忆功能障碍的方法更为有限。
5.因此，亟需开发一种用于改善微波辐射引起的空间学习和记忆功能障碍的方法和药物。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供经激活的光敏通道蛋白(如chr2光敏通道蛋白，channelrhodopsin-2)在空间学习记忆障碍的哺乳动物中的用途、一种改善哺乳动物空间学习记忆障碍的药物组合物以及一种改善哺乳动物空间学习记忆障碍的系统。通过在经过微波辐射引起的空间学习记忆障碍的哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达光敏通道蛋白，在特定的光遗传刺激下，进一步激活光敏通道蛋白，促进多巴胺能神经元中多巴胺的分泌，从而改善哺乳动物空间学习记忆障碍。
7.为此，本发明第一方面提供光敏通道蛋白在空间学习记忆障碍的哺乳动物中的用途。根据本发明的实施方案，所述光敏通道蛋白在所述哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达，所述光敏通道蛋白经激活后能够引起所述多巴胺能神经元兴奋。
8.众多研究表明，微波辐射可引起脑认知功能障碍。发明人发现，对哺乳动物(如小鼠)进行微波辐射后，会引起小鼠空间学习记忆障碍。随着科技的不断发展，人类受到人造微波辐射的机会越来越多，因此寻找缓解微波辐射引起的空间学习记忆障碍的药物和方法
成为亟待解决的问题。发明人创造性的发现，哺乳动物经历微波辐射后，海马中的多巴胺递质释放水平会降低，而在其大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达光敏通道蛋白，且在特定的光遗传刺激条件下，进一步激活光敏通道蛋白，促进脑蓝斑核多巴胺能神经元通过释放多巴胺递质，参与调控记忆、情绪等多种认知过程，从而能够改善哺乳动物空间学习记忆障碍。
9.在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白选自c1v1、chr2光敏通道蛋白或其功能类似物。
10.本发明第二方面提供经激活的光敏通道蛋白在空间学习记忆障碍的哺乳动物中的用途。根据本发明的实施方案，所述光敏通道蛋白在所述哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达，所述光敏通道蛋白经激活后能够引起所述多巴胺能神经元兴奋。
11.在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白选自c1v1、chr2光敏通道蛋白或其功能类似物。在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白为chr2光敏通道蛋白，所述chr2光敏通道蛋白通过蓝光激活。
12.发明人发现，哺乳动物经历微波辐射后，大脑海马释放的多巴胺水平会降低，通过在大脑蓝斑核的多巴胺能神经元的细胞膜结构上表达光敏感通道蛋白(如chr2光敏通道蛋白)，然后通过特定波长光的照射控制光敏感通道蛋白的激活与关闭，达到精确控制特定神经元激活或抑制的目的。例如chr2光敏通道蛋白，通过特定蓝光条件下，激活多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白，促进多巴胺能神经元释放多巴胺递质，从而改善哺乳动物空间学习记忆障碍。其中，光敏通道蛋白chr2被特定的蓝光激活后，引起阳离子(如钠离子)内流和膜电位去极化，从而引起细胞选择性兴奋，进而激活神经元释放多巴胺递质。
13.在本发明的另一些实施方案中，所述蓝光的调制参数：
14.波长460-480nm，功率8-12mw，频率18-22hz，占空比9-12％，脉冲串宽度0.4-0.6s，脉冲串间隔25-35s。
15.上述蓝光调制参数下，对多巴胺能神经元上的chr2光敏感通道蛋白激活效率较高，能够进一步提高多巴胺能神经元释放多巴胺递质，并且不会对哺乳动物造成生理伤害，是符合哺乳动物生理水平的比较安全的参数范围。而当不在上述蓝光调制参数范围内时，会导致光敏感通道蛋白激活效率偏低，无法达到改善哺乳动物空间学习记忆障碍所需的多巴胺水平，当通过加大功率来弥补时，则又会带来光毒性。
16.本发明第三方面提供一种药物组合物。根据本发明的实施方案，所述药物组合物含有能够在哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达光敏通道蛋白的载体，所述光敏通道蛋白经激活后能够引起所述多巴胺能神经元兴奋。
17.发明人发现，当向经过微波辐射引起的空间学习记忆障碍的哺乳动物施用能够在其大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达光敏通道蛋白的载体(即本发明的药物组合物)后，哺乳动物的多巴胺能神经元细胞膜上表达光敏感通道蛋白，通过特定光遗传刺激后，激活多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白，促进多巴胺能神经元释放多巴胺递质，从而改善哺乳动物空间学习记忆障碍。在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白选自c1v1、chr2光敏通道蛋白或其功能类似物。
18.本发明第四方面提供能够表达光敏通道蛋白的载体在制备药物中的用途。根据本
发明的实施方案，所述药物含有能够在哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达光敏通道蛋白的载体，所述光敏通道蛋白经激活后能够引起所述多巴胺能神经元兴奋。
19.在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白选自c1v1、chr2光敏通道蛋白或其功能类似物。
20.本发明第五方面提供一种改善哺乳动物空间学习记忆障碍的系统。根据本发明的实施方案，所述系统包括：
21.1)药物准备装置，所述药物准备装置用于准备向空间学习记忆障碍的哺乳动物施用的药物；
22.2)施用装置，所述施用装置与所述药物准备装置相连，用于将位于所述药物准备装置中的药物施用于所述空间学习记忆障碍的哺乳动物；
23.3)激活装置，所述激活装置与所述施用装置相连，所述激活装置适于在光遗传刺激下，激活光敏通道蛋白；
24.其中，所述向空间学习记忆障碍的哺乳动物施用的药物为第三方面所述的药物组合物，或者第四方面所述的用途中的药物。
25.在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白为chr2光敏通道蛋白或其功能类似物，所述激活装置发射的蓝光的调制参数：
26.波长460-480nm，功率8-12mw，频率18-22hz，占空比9-12％，脉冲串宽度0.4-0.6s，脉冲串间隔25-35s。
27.在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白为c1v1光敏通道蛋白或其功能类似物，所述激活装置发射红光。
28.本发明第六方面提供第三方面所述的药物组合物、激活装置在第五方面所述的改善哺乳动物空间学习记忆障碍的系统中的用途。
29.在本发明的一些实施方案中，所述激活装置适于在光遗传刺激下，激活光敏通道蛋白。
30.在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白为chr2光敏通道蛋白或其功能类似物，所述激活装置发射的蓝光的调制参数：
31.波长460-480nm，功率8-12mw，频率18-22hz，占空比9-12％，脉冲串宽度0.4-0.6s，脉冲串间隔25-35s。上述蓝光调制参数下，对多巴胺能神经元上的chr2光敏感通道蛋白激活效率较高，能够进一步提高多巴胺能神经元释放多巴胺递质，并且不会对哺乳动物造成生理伤害，是符合哺乳动物生理水平的比较安全的参数范围。而当不在上述蓝光调制参数范围内时，会导致光敏感通道蛋白激活效率偏低，无法达到改善哺乳动物空间学习记忆障碍所需的多巴胺水平，当通过加大功率来弥补时，则又会带来光毒性。
32.在本发明的一些实施方案中，所述光敏通道蛋白为c1v1光敏通道蛋白或其功能类似物，所述激活装置发射红光。
33.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
34.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
35.图1显示了微波辐射装置的示意图；
36.图2显示了频率为2.856ghz、平均功率密度为8mw/cm2的微波暴露后小鼠的空间学习和记忆能力的检测结果：其中，图a为巴恩斯迷宫示意图；图b为微波暴露1d和7d后小鼠在巴恩斯迷宫测试中的逃避潜伏期；图c为y迷宫结构示意图；图d展示了小鼠微波暴露1d和7d后在y迷宫新异臂测试中的新异臂停留时间占比，其中，con是指对照组，exp是指8mw/cm2微波暴露组；
37.图3显示了构建基因模式小鼠的打靶策略：图a为slc6a-icre模式小鼠的基因打靶载体示意图；图b为rose26-chr2模式小鼠的基因打靶载体示意图；
38.图4显示了光遗传刺激参数和光遗传刺激对小鼠y迷宫新异臂测试的影响：图a为蓝色光遗传系统与小鼠连接方式示意图；图b为光遗传刺激参数；图c为各组小鼠在y迷宫新异臂的移动距离占比；图d为各组小鼠在y迷宫新异臂的停留时间占比，其中，图c和d中各组小鼠均为slc6a-icre
/-：rose26-chr2
/-双杂合小鼠，遗传背景相同。
具体实施方式
39.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
40.实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。
41.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
42.根据本发明的一个实施方案，本发明提供光敏通道蛋白或经激活的光敏通道蛋白在空间学习记忆障碍的哺乳动物中的用途，其中，光敏通道蛋白在哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达，光敏通道蛋白经激活后能够引起多巴胺能神经元兴奋。
43.哺乳动物经历微波辐射后，大脑海马释放的多巴胺水平会降低，通过在大脑蓝斑核的多巴胺能神经元的细胞膜结构上表达光敏感通道蛋白，然后通过特定波长光的照射控制光敏感通道蛋白的激活与关闭，达到精确控制特定神经元激活或抑制的目的。例如chr2光敏通道蛋白，通过特定蓝光条件下，激活多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白，其中，光敏通道蛋白chr2被特定的蓝光激活后，引起阳离子(如钠离子)内流和膜电位去极化，从而引起细胞选择性兴奋，进而激活神经元释放多巴胺递质。
44.根据本发明的一个实施方案，光敏通道蛋白选自c1v1、chr2光敏通道蛋白或其功能类似物。“功能类似物”是指具有相似功能的物质，其结构不限定相同，只要具有相同或类似的功能即可。
45.根据本发明的一个具体的实施方案，光敏通道蛋白例如可以是chr2光敏通道蛋白或chr2光敏通道蛋白的突变体，chr2光敏通道蛋白的突变体需要维持与野生型chr2光敏通道蛋白类似的生物学功能，如在蓝光下能够被激活，引起阳离子(如钠离子)内流和膜电位
去极化，从而引起多巴胺能神经元兴奋，进而释放神经递质。满足条件的chr2光敏通道蛋白的突变体，例如chr2(h134r)、chr2(c128s/d156a)、chr2(e123t/t159c)、cheta等。
46.根据本发明的一个具体实施方案，光敏通道蛋白例如可以是c1v1或c1v1的功能类似物，c1v1的功能类似物例如可以是c1v1的突变体，该c1v1的突变体需要维持与野生型c1v1光敏通道蛋白类似的生物学功能，即在红色激光刺激下打开通道，引起多巴胺能神经元兴奋，进而释放神经递质。
47.需要说明的是，本发明中的光敏通道蛋白除了可以是c1v1光敏通道蛋白、c1v1的功能类似物或者chr2光敏通道蛋白、chr2的功能类似物之外，也可以是其他的光敏通道蛋白，只要满足在某些光遗传刺激条件下能够打开离子通道，刺激多巴胺能神经元兴奋，提升海马中多巴胺水平即可。
48.根据本发明的一个实施方案，本发明提及的哺乳动物例如可以是人类、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、犬、猫。哺乳动物的种类不限于此，还可以是除了上述动物之外的空间学习记忆障碍的其他哺乳动物，或者由微波辐射引起的空间学习记忆障碍的其他哺乳动物。
49.需要说明的是，本发明提供的光敏通道蛋白应用于空间学习记忆障碍的哺乳动物中，也可以用于构建在哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达光敏通道蛋白的动物模型，以用于科学研究。
50.在本发明的一些优选的实施方案中，当光敏通道蛋白为chr2光敏通道蛋白时，chr2光敏通道蛋白通过蓝光激活。蓝光的调制参数：波长460-480nm，功率8-12mw，频率18-22hz，占空比9-12％，脉冲串宽度0.4-0.6s，脉冲串间隔25-35s。上述蓝光调制参数下，对多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白激活效率较高，能够进一步提高多巴胺能神经元释放多巴胺递质，并且不会对哺乳动物造成生理伤害，是符合哺乳动物生理水平的比较安全的参数范围。而当不在上述蓝光调制参数范围内时，会导致光敏感通道蛋白激活效率偏低，无法达到改善哺乳动物空间学习记忆障碍所需的多巴胺水平，当通过加大功率来弥补时，则又会带来光毒性。
51.在本发明的一些优选的实施方案中，蓝光的调制参数：波长470-475nm，功率8-10mw，频率19-21hz，占空比9-11％，脉冲串宽度0.4-0.6s，脉冲串间隔28-32s。在本发明的更为优选的实施方案中，当蓝光的调制参数为波长473nm，功率10mw，频率20hz，占空比10％，脉冲串宽度0.5s，脉冲串间隔30s时，对多巴胺能神经元上的chr2光敏感通道蛋白激活效率是最高的，能够进一步提高多巴胺能神经元释放多巴胺递质，缓解因微波辐射引起的多巴胺水平降低，并且不会对哺乳动物造成生理伤害。
52.发明人发现，哺乳动物经历微波辐射后，大脑释放的多巴胺水平会降低，通过在大脑蓝斑核的多巴胺能神经元的细胞膜结构上表达光敏感通道蛋白(例如，chr2光敏通道蛋白)，然后通过蓝光的照射控制光敏感通道蛋白的激活与关闭，达到精确控制多巴胺能神经元激活或抑制的目的。通过本发明特定的蓝光条件，激活多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白，引起阳离子(如钠离子)内流和膜电位去极化，从而引起细胞选择性兴奋，进而激活神经元释放多巴胺递质，从而改善哺乳动物空间学习记忆障碍。
53.在本发明的一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有能够在哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达光敏通道蛋白(例如，chr2光敏通道蛋白)的载体。
54.需要说明的是，药物组合物中“含有”为开放式表达，表明药物组合物中除了具有必需的能够在哺乳动物的大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表光敏通道蛋白的载体之外，不排除含有其他，例如可以含有药品中含有的赋形剂、稳定剂等。
55.当向经过微波辐射引起的空间学习记忆障碍的哺乳动物施用能够在其大脑蓝斑核的多巴胺能神经元中特异性表达chr2光敏通道蛋白的载体后，哺乳动物的多巴胺能神经元细胞膜上表达chr2光敏感通道蛋白，通过特定条件蓝光的照射，激活多巴胺能神经元上的光敏感通道蛋白，促进多巴胺能神经元释放多巴胺递质，从而改善哺乳动物空间学习记忆障碍。
56.在本发明的一些实施方案中，本发明提供一种改善哺乳动物空间学习记忆障碍的系统，包括：
57.1)药物准备装置，用于准备向空间学习记忆障碍的哺乳动物施用的药物；
58.2)施用装置，施用装置与药物准备装置相连，用于将位于药物准备装置中的药物施用于空间学习记忆障碍的哺乳动物；
59.3)激活装置，激活装置与施用装置相连，激活装置适于在光遗传刺激下，激活光敏通道蛋白；
60.其中，向空间学习记忆障碍的哺乳动物施用的药物为上述的药物组合物。
61.在本发明的一些实施方案中，光敏通道蛋白为chr2光敏通道蛋白或其功能类似物，激活装置发射的蓝光的调制参数：
62.波长460-480nm，功率8-12mw，频率18-22hz，占空比9-12％，脉冲串宽度0.4-0.6s，脉冲串间隔25-35s。
63.在本发明的另一些实施方案中，光敏通道蛋白可以是c1v1光敏通道蛋白或其功能类似物，相应地，激活装置发射红光来激活c1v1光敏通道蛋白或其功能类似物。
64.下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
65.实施例1对小鼠进行微波暴露
66.采用8周龄的雄性c57bl/6n小鼠(维通利华公司，北京)，随机分为2组：对照组(con)和8mw/cm2微波暴露组(exp)。将exp组小鼠放入方形盒(不含金属)中进行固定，置于辐射平台之上，微波发射天线位于平台的正上方，由上而下进行全身暴露，微波频率为2.856ghz，平均功率密度为8mw/cm2，辐射时间为单次15min；con组小鼠置于辐射盒中，微波源处于关闭状态，其他条件与exp组相同，微波辐射装置示意图见图1。
67.实施例2小鼠空间学习记忆能力检测
68.分别采用巴恩斯迷宫和y迷宫新异臂实验检测实施例1中微波暴露后小鼠空间学习和记忆能力的变化。
69.1、巴恩斯迷宫实验：
70.巴恩斯迷宫测试系统(上海欣软信息科技有限公司，中国)，主要由特级有机板制成的圆形平台、摄像机和配套软件组成，其中圆形平台直径92cm，距地面84cm，平台周围有20个等距离洞口，直径5cm，其中一个洞口与一暗箱相联，即为目标洞(target hole)，其他
洞为假洞。摄像机位于平台正上方，以浅色布帘遮挡平台，对应平台四个方位的布帘上各粘附形状颜色各不同的标志物，同时保证光线柔和均匀，四周景物、摆式保持不变，环境保持安静。巴恩斯迷宫示意图见图2中的a图。
71.于微波暴露前3d进行环境适应和巴恩斯迷宫训练，每天固定时间点训练一次，首先，将小鼠置于目标洞内适应4min；然后，将小鼠置于迷宫中央塑料桶内限制活动5s，随后移开塑料桶并计时，若小鼠四肢均进入目标洞，则记为一次成功逃避，并使其在目标洞内停留30s。每次训练时间为4min，若小鼠4min内未找到目标洞，则引导小鼠进入目标洞内并停留30s。
72.分别于微波暴露后1d和7d进行巴恩斯迷宫测试，将小鼠置于迷宫中央塑料桶限制活动5s，随后移开塑料桶并计时，小鼠四肢均进入目标洞，则计为一次成功逃避并记录潜伏期；如果小鼠4min内找不到目标洞，则将小鼠从迷宫移开，逃避潜伏期记为4min。
73.图2中的b图展示了小鼠微波暴露1d和7d后在巴恩斯迷宫测试中的逃避潜伏期。由图2中的b图可知，与con组比，8mw/cm2微波暴露后exp组小鼠的逃避潜伏期显著延长(p＜0.05)，表明微波暴露引起小鼠空间学习和记忆能力障碍。
74.2、y迷宫新异臂实验：
75.y迷宫测试系统(上海欣软信息科技有限公司，中国)，主要由特级有机板制成的y字形状平台、摄像机和配套软件组成，其中平台有三个等长的臂，各臂夹角为120度，中间为三角形区域，每一臂尺寸为长12cm
×
宽3.5cm
×
高6cm，三个臂分别设置为新异臂(novel arm)、起始臂(start arm)和其他臂(other arm)，在三个臂内壁布设不同颜色和形状的空间标记，迷宫正上方安置摄像头记录小鼠运动轨迹，以浅色布帘遮挡平台，保持光线柔和，环境安静。y迷宫结构示意图见图2中的c图。
76.于微波暴露后1d和7d，对小鼠进行y迷宫新异臂实验测试。首先是学习和记忆获得阶段，封闭新异臂，将小鼠从起始臂放入y迷宫，自由探索5min；然后为测试阶段，打开新异臂，将小鼠从起始臂重新放入y迷宫，自由探索5min，记录和分析小鼠在新异臂的停留时间和路程等。
77.图2中的d图展示了小鼠微波暴露1d和7d后在y迷宫新异臂测试中的新异臂停留时间占比。由图2中的d图可见，与con组相比，8mw/cm2微波暴露后exp组小鼠在新异臂的停留时间占比显著降低(p＜0.05或p＜0.01)，表明微波暴露引起小鼠空间学习和记忆能力降低。
78.实施例3构建基因模式小鼠
79.采用基因编辑技术(百奥赛图医药科技股份有限公司，中国)构建2种基因模式小鼠slc6a-icre和rose26-chr2。通过两种模式小鼠杂交获得slc6a-icre
/-：rose26-chr2
/-的双杂合小鼠，由于双杂合小鼠中含有在多巴胺能神经元中特异性表达的slc6a基因，且由于icre的存在，该双杂合小鼠可选择性的在多巴胺能神经元表达chr2光敏通道蛋白。
80.1、slc6a-icre基因模式小鼠的制备
81.在ege-zqq-023基因(在13号染色体正链上，全长43.1kb，gene id:13162)终止密码子前插入p2a-icre-p2a-tdtomato。5'端和3'端的同源臂(homologous arm)分别约为2kb。使用百奥赛图公司基于crispr/cas9开发的ege系统制备敲进小鼠。打靶载体示意图见图3中的a图。
82.2、rose26-chr2基因模式小鼠的制备
83.在rosa26位点插入cag-loxp-stop-loxp-chr2 egfp-wpre-pa(其中，cag是指图3的b图中的cag pr(即cag启动子)，loxp-stop-loxp为调控元件，chr2 egfp-wpre-pa为表达元件)。5'端和3'端的同源臂分别约为2kb。采用百奥赛图公司基于crispr/cas9开发的ege系统制备模式小鼠。sgrna被设计在插入位置周围。打靶载体示意图见图3中的b图。
84.实施例4光遗传技术对slc6a-icre
/-：rose26-chr2
/-双杂合小鼠的空间学习和记忆的影响
85.采用8周龄slc6a-icre
/-：rose26-chr2
/-模式小鼠，通过脑立体定位仪在蓝斑(ap：-5.40mm，ml：0.875mm，dv：-3.75mm)埋植陶瓷插芯，手术恢复后用于下一步检测。将上述小鼠随机分为3组：对照组 无蓝光刺激(con blue off)，微波暴露组 无蓝光刺激(exp blue off)，微波暴露组 有蓝光刺激(exp blue on)。其中，exp组给予频率为2.856ghz、平均功率密度为8mw/cm2的微波辐射，con组给予相同条件的假辐射，微波暴露方法同实施例1。
86.首先进行光纤适应训练，将小鼠头部陶瓷插芯与光纤连接后放入方形的旷场箱中，不给予蓝光刺激，每次5min，持续3d。
87.于微波暴露后1d开展y迷宫新异臂实验。在学习记忆获得阶段，将小鼠头部预埋陶瓷插芯与蓝色光遗传系统相连接，由起始臂放入y迷宫，此时新异臂处于封闭状态，自由探索5min，exp blue on组接受蓝光刺激，con blue off和exp blue off两组小鼠不给予蓝光刺激信号，其中，光遗传系统与小鼠连接方式见图4中的a图，光遗传蓝光调制参数为波长(wave length)473nm，功率(power)10mw，频率(frequency)20hz，占空比(duty cycle)10％，脉冲串宽度(burst duration)0.5s，脉冲串间隔(burst interval)30s，见图4中的b图；在测试阶段，拔除小鼠头部光纤连接线，打开新异臂挡板，将小鼠从起始臂重新放入y迷宫，自由探索5min，记录并分析小鼠在新异臂的移动距离占比和停留时间占比。
88.由图4中的c图和d图可知，与con blue off组相比，exp blue off组小鼠在新异臂的移动距离占比以及停留时间占比均显著降低(p＜0.05)，表明微波辐射引起小鼠空间学习和记忆能力降低；与exp blue off组相比，exp blue on组小鼠在新异臂移动距离占比以及停留时间占比均显著升高(p＜0.05)，表明光遗传激活蓝斑多巴胺能神经元可改善微波暴露引起的小鼠空间学习记忆障碍。
89.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
90.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。