一种包括富血小板血浆的组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种包括富血小板血浆的组合物及其制备方法。


背景技术：

2.骨关节炎是一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。本病多见于中老年人群，好发于负重关节及活动量较多的关节（如，颈椎、腰椎、膝关节、髋关节等）。过度负重或过度使用这些关节，均可促进退行性变化的发生。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。
3.另外关节软骨损伤也会引起关节疼痛、肿胀及功能障碍，严重影响患者的生活质量及身体健康。
4.目前骨关节炎或者关节软骨损伤的常规的治疗以物理治疗、中医治疗、药物治疗、封闭治疗等为主流方向，但疗效不理想，远期疗效更差，也有应用富血小板血浆关节腔注射、玻璃酸钠关节腔注射，各种细胞再生疗法。但现有的富血小板血浆关节腔注射存在富血小板血浆中的细胞因子扩散快的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种包括富血小板血浆的组合物及其制备方法，解决现有技术中富血小板血浆中的细胞因子扩散快的技术问题。
6.为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种包括富血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：将甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和凝血酶溶液在15-30℃下混合得到第一子组合物；将氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆混合得到第二子组合物；将所述第一子组合物与所述第二子组合物混合得到所述组合物。
7.进一步地，所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液由以下步骤制得：将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，之后加入甲基丙烯酸酐在40-50℃下搅拌得到所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液。
8.进一步地，所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液中所述甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖的质量比为0.1-0.2:1。
9.进一步地，所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液的浓度为2%-4%。
10.进一步地，所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为20-40mg/ml。
11.进一步地，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为1-3:1。
12.进一步地，所述第一子组合物与所述第二子组合物的体积比为1-2:1。
13.进一步地，所述氧化石墨烯在所述第二子组合物中的质量浓度为0.01-0.02%。
14.进一步地，所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%-5%。
15.此外，本发明还提出一种包括富血小板血浆的组合物，由上述制备方法制备得到。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆混合得到第二子组合物，氧化石墨烯能够吸附富血小板血浆中的细胞因子，之后与第一子组合物混合，第一子组合物中的甲基丙烯酸酐改性壳聚糖中的甲基丙烯酸酐具有双键能够进一步吸附细胞因子，进一步地，壳聚糖能够将负载细胞因子的氧化石墨烯包覆，从而可减慢细胞因子的释放速度，凝血酶和氯化钙能够促进组合物转变为凝胶，胶原蛋白能够与壳聚糖发生反应促进凝胶的形成，进而加快组合物变为凝胶的速度，从而缩短组合物由液态变为凝胶的时间的同时还减慢了细胞因子的扩散速度。
具体实施方式
17.本具体实施方式提供了一种包括富血小板血浆的组合物的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，之后向所述壳聚糖溶液中加入甲基丙烯酸酐，并在40-50℃下搅拌得到所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液；所述甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖的质量比为0.1-0.2:1；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%-4%；将甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和凝血酶溶液在15-30℃下混合得到第一子组合物；所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和所述凝血酶溶液的体积比为1:1-1.2；将氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆在15-30℃下混合得到第二子组合物；所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为20-40mg/ml；所述氧化石墨烯在所述第二子组合物中的质量浓度为0.01-0.02%；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%-5%，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为1-3:1，所述富血小板血浆在所述第二子组合物中的体积占比为30-50%；将所述第一子组合物与所述第二子组合物按照体积比1-2:1混合得到所述组合物。
18.本具体实施方式还包括一种富血小板血浆的组合物，由上述制备方法制备得到。
19.本具体实施方式中，所述间充质干细胞可来源于脐带血、胎盘组织和自体脂肪组织，采用现有技术的培养方法得到。
20.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
21.需要说明的是，下述实施例中的间充质干细胞由以下步骤制得：用蒸馏水将脐带冲洗干净，然后用酒精棉将脐带表面擦拭干净；依次用0.3％的胰蛋白酶（30 min）和0.3的％胶原酶p（2 h）在37℃、体积分数为5%的co2培养箱中消化； 消化结束后，经100目钢网过滤，1500 r/min离心3min弃去上清液。清洗3次，重悬细胞并计数； 以4.5
×
104个有核细胞平铺于培养瓶中，37℃、5%的co2作为原代smscs培养；24 h后换液，除去未贴壁细胞，继续培养12 d；待细胞达到80％融合时，吸出原有干细胞培养上清，加入10ml生理盐水将残留培养基，洗出；用2ml0.025%胰酶稀释液消化
2min，加入5ml消化终止液，终止胰酶的消化；收集p0间充质干细胞计数，按照细胞数1x10
6 /t175瓶接种于t175培养瓶中进行p1代培养，并再次传代；传代至第4代时，即为可用于治疗的间充质干细胞。
22.下述实施例中凝血酶溶液的活性是10000u/ml。
23.需要说明的是，所述富血小板血浆由以下步骤制得：将全血离心得到血清层、血浆层和红细胞层，取所述血浆层即为所述富血小板血浆。
24.实施例1本实施例提出一种包括富血小板血浆的组合物，由以下步骤制得：将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，之后向所述壳聚糖溶液中加入甲基丙烯酸酐，并在40℃下搅拌得到所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液；所述甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖的质量比为0.1:1；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%；将甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和凝血酶溶液在20℃下混合得到第一子组合物；所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和所述凝血酶溶液的体积比为1:1；将氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆在20℃下混合得到第二子组合物；所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为30mg/ml；所述氧化石墨烯在所述第二子组合物中的质量浓度为0.02%；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为5%，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为2:1，所述富血小板血浆在所述第二子组合物中的体积占比为30%；将所述第一子组合物与所述第二子组合物按照体积比1:1混合得到所述组合物。
25.实施例2本实施例提出一种包括富血小板血浆的组合物，由以下步骤制得：将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，之后向所述壳聚糖溶液中加入甲基丙烯酸酐，并在50℃下搅拌得到所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液；所述甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖的质量比为0.2:1；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为3%；将甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和凝血酶溶液在15℃下混合得到第一子组合物；所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和所述凝血酶溶液的体积比为1:1.2；将氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆在15℃下混合得到第二子组合物；所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为40mg/ml；所述氧化石墨烯在所述第二子组合物中的质量浓度为0.01%；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为1%，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为3:1，所述富血小板血浆在所述第二子组合物中的体积占比为50%；将所述第一子组合物与所述第二子组合物按照体积比1.5:1混合得到所述组合物。
26.实施例3本实施例提出一种包括富血小板血浆的组合物，由以下步骤制得：将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，之后向所述壳聚糖溶液中加入甲基丙烯酸酐，并在45℃下搅拌得到所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液；所述甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖的质量比为0.15:1；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为4%；将甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和凝血酶溶液在30℃下混合得到第一子组合物；
所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和所述凝血酶溶液的体积比为1:1.1；将氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆在20℃下混合得到第二子组合物；所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为25mg/ml；所述氧化石墨烯在所述第二子组合物中的质量浓度为0.01%；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为3%，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为2.5:1，所述富血小板血浆在所述第二子组合物中的体积占比为40%；将所述第一子组合物与所述第二子组合物按照体积比2:1混合得到所述组合物。
27.实施例4本实施例提出一种包括富血小板血浆的组合物，由以下步骤制得：将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，之后向所述壳聚糖溶液中加入甲基丙烯酸酐，并在45℃下搅拌得到所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液；所述甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖的质量比为0.12:1；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为3.5%；将甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和凝血酶溶液在25℃下混合得到第一子组合物；所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和所述凝血酶溶液的体积比为1:1；将氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆在25℃下混合得到第二子组合物；所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为25mg/ml；所述氧化石墨烯在所述第二子组合物中的质量浓度为0.02%；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为2%，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为1:1，所述富血小板血浆在所述第二子组合物中的体积占比为35%；将所述第一子组合物与所述第二子组合物按照体积比1.5:1混合得到所述组合物。
28.对比例1本对比例与实施例1的区别在于：包括富血小板血浆的组合物中没有采用甲基丙烯酸酐来改性壳聚糖溶液，具体地：一种包括富血小板血浆的组合物，由以下步骤制得：将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，并在40℃下搅拌得到壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%；将壳聚糖溶液和凝血酶溶液在20℃下混合得到第一子组合物；所述壳聚糖溶液和所述凝血酶溶液的体积比为1:1；将氯化钙、氧化石墨烯、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆在20℃下混合得到第二子组合物；所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为30mg/ml；所述氧化石墨烯在所述第二子组合物中的质量浓度为0.02%；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为5%，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为2:1，所述富血小板血浆在所述第二子组合物中的体积占比为30%；将所述第一子组合物与所述第二子组合物按照体积比1:1混合得到所述组合物。
29.对比例2本对比例与实施例1的区别在于：包括富血小板血浆的组合物中没有加入氧化石墨烯，具体地：本实施例提出一种包括富血小板血浆的组合物，由以下步骤制得：
将壳聚糖溶解于生理盐水中得到壳聚糖溶液，之后向所述壳聚糖溶液中加入甲基丙烯酸酐，并在40℃下搅拌得到所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液；所述甲基丙烯酸酐与所述壳聚糖的质量比为0.1:1；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2%；将甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和凝血酶溶液在20℃下混合得到第一子组合物；所述甲基丙烯酸酐改性壳聚糖溶液和所述凝血酶溶液的体积比为1:1；将氯化钙、间充质干细胞、胶原蛋白和富血小板血浆在20℃下混合得到第二子组合物；所述氯化钙在所述第二子组合物中的浓度为30mg/ml；所述胶原蛋白在所述第二子组合物中的质量浓度为5%，所述间充质干细胞与所述富血小板血浆的体积比为2:1，所述富血小板血浆在所述第二子组合物中的体积占比为30%；将所述第一子组合物与所述第二子组合物按照体积比1:1混合得到所述组合物。
30.将实施例1-4制得的组合物和对比例1-2制得的组合物在36℃下放置，检测各组合物变为凝胶所需时间，结果如表1所示。
31.表1
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实施例1-4及对比例1-2制得的组合物变为凝胶所需时间 时间（min）实施例110实施例211实施例315实施例413对比例112对比例214从表1可以看出，实施例1-4和对比例1-2制得的组合物都具有较短的变为凝胶所需时间，只需要10-15min即可变为凝胶。
32.将实施例1-4制得的组合物和对比例1-2制得的组合物在36℃下分别放置30min、1h、2h和3h测得不同时间下的细胞因子的含量，即细胞因子的剩余量，之后计算不同时间下的细胞因子的释放率；需要说明的是，释放率为（细胞因子总量-细胞因子剩余量）/细胞因子总量*100%。通过elisa分析检测细胞因子的含量，检测结果如表2所示。
33.表2
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实施例1-4及对比例1-2不同时间下的细胞因子的释放率 30min释放率（%）1h释放率（%）2h释放率（%）3h释放率（%）实施例115.845.581.995.4实施例216.448.186.396.3实施例317.353.789.198.5实施例416.251.688.297.4对比例180.296.299.399.5对比例283.797.399.499.6从表2可以看出实施例1-4制得的组合物在放置30min的释放率只有15.8%-17.3%，而对比例1-2制得的组合和在放置30min的释放率高达83.7%，细胞因子几乎释放完全，而实施例1-4提出的组合物需要经过3个小时才几乎释放完全，可见，本发明提出的实施例1-4明显减慢了细胞生长因子的扩散速度，延缓了组合物的释放时间。
34.将实施例1-4和对比例1-2制得的组合物用于治疗骨关节炎和修复软骨损伤，具体
地，选取60个年龄在50-60岁具有骨关节炎和/或软骨损伤的患者进行相关试验，分为6组，每个实施例对应一组，注射组合物的用量为4毫升/次，2次/疗程，间隔四周注射一次，从注射起始日算起两个月后回访患者，治疗改善效果如表3所示。改善率为每组中治疗效果明显的人数占总人数（10人）的占比。
35.表3
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实施例1-4及对比例1-2的组合物对患者的骨关节炎或者软骨损伤的治疗情况 改善率(%)实施例1100实施例2100实施例3100实施例4100对比例160对比例270从表3可以看出，实施例1-4制得的组合物对于骨关节炎或者软骨损伤都有较好的改善作用，而对比例1和2制得的组合物对于骨关节炎或者软骨损伤的改善情况相对较差。
36.以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。