一种牙髓干细胞冻存液及冻存方法与流程

1.本发明涉及一种冻存液，尤其涉及一种牙髓干细胞冻存液及冻存方法。


背景技术：

2.牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年gronthos 等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞。
3.牙髓干细胞具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点，在再生医学领域取得了很大进展。牙髓干细胞的增殖能力强、组织相容性高、储存方便，给现代医学带来极大的便利。
4.细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有可能伴随造成生物性损伤。
5.细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冻存过程对细胞造成的损伤。冻存液中一般含有渗透型的保护液如二甲基亚砜。二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。可以通过降低胞内水的冰点来延缓细胞的冻存过程。同时也能通过提高细胞内离子浓度，来降低细胞内冰晶的形成数量，从而减少细胞损伤。但是二甲基亚砜对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，导致细胞复苏率低。因此，有必要研究一种不添加二甲基亚砜冻存液，提高牙髓干细胞冻存液的安全性。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙髓干细胞冻存液，不添加二甲基亚砜，安全稳定，提高了牙髓干细胞冻存后的活率。
7.本发明的目的之二在于提供一种牙髓干细胞的冻存方法。
8.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种牙髓干细胞冻存液，包括基础培养基，和添加在基础培养基中的以下组分：甘油、玉米须超微粉、异甜菊醇、右旋糖苷-40、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮。
9.进一步地，所述基础培养基为dmem/f12培养基，各组分在培养基中的终浓度为：甘油10-15μg/ml、玉米须超微粉6-10 μg/ml、异甜菊醇14-18 μg/ml、右旋糖苷-40 1-5 mg/ml、透明质酸钠5-10μg/ ml、聚乙烯吡咯烷酮23-29μg/ ml。
10.进一步地，各组分在培养基中的终浓度为：甘油12μg/ml、玉米须超微粉8μg/ml、异
甜菊醇16 μg/ml、透明质酸钠7μg/ ml、右旋糖苷-40 2 mg/ml、聚乙烯吡咯烷酮25μg/ ml。
11.进一步地，所述玉米须超微粉的粒径为100-150目。
12.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种牙髓干细胞的冻存方法，用上述冻存液冻存。
13.进一步地，所述牙髓干细胞的冻存方法，包括以下步骤：（1）制备冻存液：向基础培养基中加入甘油、右旋糖苷-40、玉米须超微粉、异甜菊醇、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀得到冻存液，备用；（2）将待保存的牙髓干细胞采用步骤（1）的冻存液重悬得到细胞悬液，然后分装至无菌冻存管中；（3）将步骤（2）的无菌冻存管程序降温至-80℃，保存20-24h，然后转移至液氮中冻存。
14.进一步地，步骤（2）中细胞悬液中的牙髓干细胞密度为3-8
×
106个/ml。
15.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种牙髓干细胞冻存液，不添加二甲基亚砜。通过在基础培养基中添加的甘油、右旋糖苷-40、玉米须超微粉、异甜菊醇、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮各组分协同作用，提高冻存后牙髓干细胞的活率。其中玉米须超微粉和异甜菊醇的添加降低了甘油的用量，和甘油协同作用在冻存过程中对牙髓干细胞形成保护，降低了冻存过程对牙髓干细胞造成的损伤，提高牙髓干细胞经冻存后的活率，延长牙髓干细胞的保存时间。
16.本发明还提供了一种牙髓干细胞的冻存方法，采用本发明提供的冻存液，易于操作，便于牙髓干细胞的批量化保存。
具体实施方式
17.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
18.本发明冻存的牙髓干细胞通过以下方法制备得到：（1）取儿童换牙过程中自然脱落的乳牙用含2%青霉素-链霉素的pbs冲洗，钻开牙冠，用拔髓针在无菌条件下拔出牙髓组织；（2）将取出的牙髓组织冲洗3次后，加入至含10�s的dmem/f12培养基中，剪成约 1mm3大小，离心，取下层的沉淀组织加入0.25％的i型胶原酶混合均匀，37℃孵育10min，离心去除上清；（3）再次加入含10�s的dmem/f12培养基，接种在培养皿中在37℃，5%co2条件下进行培养，当铺满培养皿底部80%面积后，加入0.25％的胰酶消化2min，离心去上清；（4）用含10％fbs的dmem/f12培养基重悬细胞，调整细胞密度为1
×
104个/ml，接种于培养瓶中进行传代培养，取处于对数生长期的p3代细胞进行冻存。
19.实施例1一种牙髓干细胞冻存液，由基础培养基，和添加在基础培养基中的以下组分组成：甘油、玉米须超微粉、异甜菊醇、右旋糖苷-40、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮；各组分在培养基中的终浓度为：甘油12μg/ml、玉米须超微粉8μg/ml、异甜菊醇16 μg/ml、透明质酸钠7μg/ ml、右旋糖苷-40 2 mg/ml、聚乙烯吡咯烷酮25μg/ ml；玉米须超微粉的粒径为100-150目。
20.一种牙髓干细胞的冻存方法，包括以下步骤：（1）制备冻存液：向基础培养基中加入甘油、右旋糖苷-40、玉米须超微粉、异甜菊醇、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀得到冻存液，备用；（2）将处于对数生长期的p3代牙髓干细胞采用步骤（1）的冻存液重悬得到细胞悬液，细胞悬液中的牙髓干细胞密度为3
×
106个/ml，然后分装至无菌冻存管中；（3）将步骤（2）的无菌冻存管程序降温至-80℃，程序降温过程为：25℃等待，2℃/min降温至-20℃，20℃/min降温至-60℃，10℃/min降温至-80℃，保存20h，然后转移至液氮中冻存。
21.实施例2一种牙髓干细胞冻存液，由基础培养基，和添加在基础培养基中的以下组分组成：甘油、玉米须超微粉、异甜菊醇、右旋糖苷-40、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮；各组分在培养基中的终浓度为：甘油10μg/ml、玉米须超微粉6 μg/ml、异甜菊醇14 μg/ml、右旋糖苷-40 1 mg/ml、透明质酸钠5μg/ ml、聚乙烯吡咯烷酮23μg/ ml；玉米须超微粉的粒径为100-150目。
22.一种牙髓干细胞的冻存方法，包括以下步骤：（1）制备冻存液：向基础培养基中加入甘油、右旋糖苷-40、玉米须超微粉、异甜菊醇、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀得到冻存液，备用；（2）将处于对数生长期的p3代牙髓干细胞采用步骤（1）的冻存液重悬得到细胞悬液，细胞悬液中的牙髓干细胞密度为5
×
106个/ml，然后分装至无菌冻存管中；（3）将步骤（2）的无菌冻存管程序降温至-80℃，程序降温过程为：25℃等待，2℃/min降温至-20℃，20℃/min降温至-60℃，10℃/min降温至-80℃，保存22h，然后转移至液氮中冻存。
23.实施例3一种牙髓干细胞冻存液，由基础培养基，和添加在基础培养基中的以下组分组成：甘油、玉米须超微粉、异甜菊醇、右旋糖苷-40、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮；各组分在培养基中的终浓度为：甘油15μg/ml、玉米须超微粉10 μg/ml、异甜菊醇18 μg/ml、右旋糖苷-40 5 mg/ml、透明质酸钠10μg/ ml、聚乙烯吡咯烷酮29μg/ ml；玉米须超微粉的粒径为100-150目。
24.一种牙髓干细胞的冻存方法，包括以下步骤：（1）制备冻存液：向基础培养基中加入甘油、右旋糖苷-40、玉米须超微粉、异甜菊醇、透明质酸钠、聚乙烯吡咯烷酮，混合均匀得到冻存液，备用；（2）将处于对数生长期的p3代牙髓干细胞采用步骤（1）的冻存液重悬得到细胞悬液，细胞悬液中的牙髓干细胞密度为8
×
106个/ml，然后分装至无菌冻存管中；（3）将步骤（2）的无菌冻存管程序降温至-80℃，程序降温过程为：25℃等待，2℃/min降温至-20℃，20℃/min降温至-60℃，10℃/min降温至-80℃，保存24h，然后转移至液氮中冻存。
25.对比例1对比例1提供一种牙髓干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去玉米超微粉和异甜菊醇，其余均和实施例1相同。
26.对比例2
对比例2提供一种牙髓干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去玉米超微粉，其余均和实施例1相同。
27.对比例3对比例3提供一种牙髓干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去异甜菊醇，其余均和实施例1相同。
28.对比例4对比例4提供一种牙髓干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去玉米超微粉，将异甜菊醇的用量调整为24 μg/ml，其余均和实施例1相同。
29.对比例5对比例5提供一种牙髓干细胞冻存液，和实施例1的区别为：省去异甜菊醇，将玉米超微粉的用量调整为24 μg/ml，其余均和实施例1相同。
30.对比例6对比例6提供一种牙髓干细胞冻存液，和实施例1的区别为：将异甜菊醇替换为甜菊醇，其余均和实施例1相同。
31.分别取冻存3个月、6个月、12个月的牙髓干细胞，将冻存管在37℃的水浴中快速复苏，取样后加入等体积的0.4%台盼蓝混合进行染色，加入血球计数器在显微镜下进行计数，死亡的细胞会被染成蓝色，根据活细胞和死亡细胞的数量计算每组的细胞活率。采用同样的方法统计每组牙髓干细胞冻存前的活率。结果如表1所示。
32.表1由表1可以看出，实施例1至3中冻存的牙髓干细胞在保存12个月复苏后细胞活率均在90%以上，高于对比例1至6。
33.对比例1中省去了玉米超微粉和异甜菊醇，随着保存时间的延长牙髓干细胞活率下降显著。 对比例2和对比例3中分别省去了玉米超微粉和异甜菊醇，对比例4和对比例5中
在省去玉米超微粉和异甜菊醇中的一种后，增加了省去成分的用量，由表1可以看出随着保存时间的延长，细胞活率下降显著，均不及实施例1。说明玉米须超微粉和异甜菊醇的添加，不仅可以避免添加二甲基亚砜，而且降低了甘油的用量，和甘油协同作用在冻存过程中对牙髓干细胞形成保护，降低了冻存过程对牙髓干细胞造成的损伤，提高牙髓干细胞经冻存后的活率，延长牙髓干细胞的保存时间。对比例6中将异甜菊醇替换为甜菊醇，细胞活率虽然比对比例1至5高，但是仍不及实施例1，说明异甜菊醇和玉米超微粉搭配可以更好的发挥作用。
34.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。