微孔滤布及其核酸提取中的应用的制作方法

1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体地，涉及一种微孔滤布及其核酸提取中的应用。


背景技术：

2.在全球疫情爆发的当下，如何科学防疫和科学施治是各国有关机构和专家关注的焦点，其中，检测和发现感染患者是减少携带病毒患者进行人传人的关键一步。而基于核酸检测的诊断技术是进行感染诊断的关键手段。核酸的提取和纯化是分子生物学的最基本的步骤之一。尤其对于质粒，作为基因工程技术领域常规的基因载体，被广泛用于构建克隆细胞的操作中。常用的细胞破碎方法有物理裂解法(机械破碎)、酶解法和化学裂解法。作为化学裂解法中的方法之一，碱裂解法是从细胞中提取获得核酸的经典方法，目前市售的核酸提取试剂盒绝大部分采取碱裂解法。质粒小提是作为提取实验用质粒的常用方法，现有的许多质粒小提试剂盒是采用离心去沉淀的方法。与酚抽提法相比，该方法所用的试剂对人体危害较小，操作也相对简单。但是碱裂解法实验过程中会产生白色絮状沉淀，一般需要通过离心后除去沉淀，分离上清液以获得质粒。通常，实验过程中需将沉淀混合液转移至离心管中，高速离心使沉淀集中于离心管底部，然后小心吸取或倒出上清液进行后续实验操作。该实施方式要求离心机可以达到较高的转速，转速通常会达到12000rpm，时间为10分钟。上述离心除去沉淀的方法存在两方面的问题，一方面是该操作步骤会消耗较长的实验时间，另一方面是对设备要求较高，尤其是大量制备质粒时，对离心设备的要求也更高。
3.因此，本领域亟待设计开发一种可用于分离纯化细胞裂解液中核酸的操作简便、快速高效、节省成本的微孔滤布及其应用。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种微孔滤布及其核酸提取中的应用，不仅便于实验操作、节省时间，还节省了设备成本，不影响核酸提取的纯度。
5.本发明是采用以下技术方案实现的：
6.本发明第一方面提供了一种微孔滤布，所述滤布含有微孔，所述微孔的孔径为3μm-200μm，能够用于过滤细胞裂解液以分离去除大分子物质，滤液中含有核酸分子，所述大分子物质包括细胞内蛋白质。
7.进一步地，所述滤布选自下组中的一种或多种：聚氨酯、聚酰胺酯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、天然纤维；
8.更进一步地，优选自下组中的一种或多种：无纺布、熔喷布、尼龙布、pet薄膜、植物纤维薄膜、聚酯纤维、滤纸，或其改性材料。进一步地，所述微孔滤布的孔径为5μm-150μm。
9.更进一步地，所述微孔滤布的孔径为10μm-100μm。
10.更进一步地，所述微孔滤布的孔径为10μm-20μm。
11.进一步地，在所述滤布表面设置有加强筋，能够提高对所述细胞裂解液的承载量。
12.本发明第二方面提供了一种采用本发明第一方面所提供的微孔滤布制作的用于分离核酸的过滤装置。
13.本发明第三方面提供了第一方面所提供的微孔滤布或本发明第二方面所提供的用于分离核酸的过滤装置在核酸提取中的应用，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含核酸的溶液。
14.进一步地，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含dna的溶液；优选地，所述dna为质粒。
15.进一步地，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含rna的溶液。
16.进一步地，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含mrna的溶液。
17.进一步地，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含rrna的溶液。
18.进一步地，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含mirna的溶液。
19.本发明所取得的技术效果在于：
20.本发明解决了现有技术中存在的缺陷和不足，创新性地将微孔滤布用于过滤细胞裂解液，将蛋白质等大分子物质滞留在滤布上，核酸随溶液进入滤液中。提供了一种操作简便、快速高效、节省成本的，微孔滤布及其核酸提取中的应用。在生物和医学实验中，采用本发明可替代传统的高速离心机，通过简单过滤操作法替代高速离心法，将核酸(包括dna和rna)从细胞裂解液中分离出来，不影响核酸提取的纯度。因此，本发明不仅实验使用方便，也节省了操作人员大量的实验时间，还直接节省了实验室对于高速离心机的购买和使用成本。
附图说明
21.图1为本发明提供的一种用于分离核酸的过滤装置结构示意图。
22.图2为图1侧视图。
23.图3为图2俯视图。
24.图4为本发明提供的另一种用于分离核酸的过滤装置结构示意图。
25.图中，1-收集筒，2-滤网，3-滤网固定部，4-滤网网兜，5-滤网手柄，6-筒盖，7-铰链。
具体实施方式
26.为了更好地阐述本发明，下面结合具体实施方式、实施例1-8和附图1-4对本发明做进一步详细说明。
27.名词或术语：
28.无纺布：英文名为non woven fabric或者nonwoven cloth，又记为不织布，是由定向的或随机的纤维而构成。因具有布的外观和某些性能而称其为布。其主要采用聚丙烯(pp材质)粒料为原料制成。
29.熔喷布：主要以聚丙烯为主要原料，纤维直径可以达到1～5微米。空隙多、结构蓬松、抗褶皱能力好，具有独特的毛细结构的超细纤维增加单位面积纤维的数量和表面积，从而使熔喷布具有很好的过滤性、屏蔽性、绝热性和吸油性。可用于空气、液体过滤材料、隔离材料、吸纳材料、口罩材料、保暖材料、吸油材料及擦拭布等领域。
30.尼龙布：是美国杰出的科学家华莱士
·
卡罗瑟斯(carothers)及其领导下的一个科研小组研制出来的，是世界上出现的第一种合成纤维，尼龙布是由聚酰胺纤维(锦纶)组成。
31.pet：聚对苯二甲酸乙二醇酯，化学式为[coc6h4cooch2ch2o]n。(英文：polyethylene terephthalate，简称pet)，由对苯二甲酸二甲酯与乙二醇酯交换或以对苯二甲酸与乙二醇酯化先合成对苯二甲酸双羟乙酯，然后再进行缩聚反应制得。属结晶型饱和聚酯，为乳白色或浅黄色、高度结晶的聚合物，表面平滑有光泽。生活中常见的一种树脂，可以分为apet、rpet和petg。在较宽的温度范围内具有优良的物理机械性能，长期使用温度可达120℃，电绝缘性优良，甚至在高温高频下，其电性能仍较好，但耐电晕性较差，抗蠕变性，耐疲劳性，耐摩擦性、尺寸稳定性都很好。
[0032]
植物纤维薄膜：由天然植物纤维形成的薄膜，作为一种生物质材料，表面存在着大量的羟基而使得表面极性较高，具有一定通透性，与聚合物的相容性较差。植物纤维包括黄麻纤维、亚麻纤维、苎麻纤维、剑麻纤维，或竹纤维。
[0033]a260
：也称od
260
，而260nm为dna的吸光度，反映的是在波长为260nm时溶液中核酸的浓度。对于纯的样品只要读出260nm的a值即可以算出含量。通常以a值为1相当于50μg/ml双螺旋dna，或者40μg/ml单链dna(rna)，或者20μg/ml寡核苷酸计算。
[0034]a280
：也称od
280
，蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以280nm常用来表示蛋白质吸光度，反映的是在波长为280nm时溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。
[0035]a230
：也称od
230
，是溶液中碳水化合物(糖类)最高吸收峰的吸收波长。
[0036]a260
/a
280
：用于反映dna纯度，理论上，纯dna的该比值约为1.8。
[0037]a260
/a
230
：用于反映dna纯度，比值可进行核酸样品纯度评估，纯dna和rna的该比值约为2.5。
[0038]
本发明第一方面提供了一种微孔滤布，所述滤布含有微孔，所述微孔的孔径为3μm-200μm，能够用于过滤细胞裂解液以分离去除大分子物质，滤液中含有核酸分子，所述大分子物质包括细胞内蛋白质。
[0039]
作为优选，所述滤布选自下组中的一种或多种：聚氨酯、聚酰胺酯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、天然纤维；
[0040]
优选自下组中的一种或多种：无纺布、熔喷布、尼龙布、pet薄膜、植物纤维薄膜、聚酯纤维、滤纸，或其改性材料。
[0041]
作为优选，所述微孔滤布的孔径为5μm-150μm。
[0042]
更优选地，所述微孔滤布的孔径为10μm-100μm。
[0043]
更优选地，所述微孔滤布的孔径为10μm-20μm。
[0044]
作为优选，在所述滤布表面设置有加强筋，能够提高对所述细胞裂解液的承载量。
[0045]
本发明第二方面提供了一种采用本发明第一方面所提供的微孔滤布制作的用于分离核酸的过滤装置。
[0046]
提供了一种用于质粒dna提取的过滤装置，包括滤网2和收集筒1，所述滤网2包括滤网固定部3和网兜4，滤网固定部3与所述收集筒1的顶部开口相吻合，滤网网兜4悬挂于所述收集筒1内腔，用于过滤含有质粒dna的细胞裂解液。滤网网兜4为单层结构或多层结构。
[0047]
作为优选，滤网网兜4为无纺布，或尼龙布，或pet薄膜，或植物纤维薄膜，或其改性
材料。优选地，所述植物纤维包括黄麻纤维、亚麻纤维、苎麻纤维、剑麻纤维，或竹纤维。
[0048]
作为另一种实施方式，滤网网兜4为多层结构时，可选用前述材料的任意组合。滤网网兜4的孔径为3μm-200μm，优选地，为10μm-100μm。滤网固定部3设置有滤网手柄5。收集筒1呈圆柱状或倒圆台状。收集筒1采用耐腐蚀性材料，为一体结构。
[0049]
本发明第三方面提供了第一方面所提供的微孔滤布或本发明第二方面所提供的用于分离核酸的过滤装置在核酸提取中的应用，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含核酸的溶液。
[0050]
作为优选，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含dna的溶液；优选地，所述dna为质粒。
[0051]
作为优选，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含rna的溶液。
[0052]
作为优选，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含mrna的溶液。
[0053]
作为优选，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含rrna的溶液。
[0054]
作为优选，用于过滤去除细胞裂解液中的沉淀物和悬浮物，获得含mirna的溶液。
[0055]
作为优选，滤网网兜4为无纺布，或尼龙布，或pet薄膜，或植物纤维薄膜，或其改性材料。优选地，所述植物纤维包括黄麻纤维、亚麻纤维、苎麻纤维、剑麻纤维，或竹纤维。
[0056]
特别地，采用本发明的滤布过滤技术用于核酸(包括dna和rna)提取的方法，我们称之为“clearflow过滤方法”，或“clearflow过滤技术”或“clearflow滤袋方法”或“clearflow滤袋技术”。
[0057]
实施例1-4：
[0058]
采用包括以下四种不同材料的滤网网兜4作为具体实施例：无纺布、尼龙布、pet薄膜、植物纤维薄膜，依次分别对应实施例1、2、3、4，用于提取质粒dna过程中的过滤环节，依次按如下步骤完成。
[0059]
(1)培养和收集细胞：取300ml过夜培养的大肠杆菌菌液，分别加入到10个离心管中，离心后小心倒掉或吸取去除上清液，菌体沉积在底部。分别向每个离心管中加入40ml菌体悬浮液p1，用移液枪吹吸，使离心沉积的菌体彻底分散并悬浮。
[0060]
(2)裂解细胞：向上述菌体悬浮液中加入50ml细胞裂解液，缓慢翻转离心管使菌体充分裂解。再向离心管中加入70ml结合液p3，缓慢翻转离心管，使溶液充分混匀。此后，离心管内溶液中逐渐产生白色絮状物，直至沉淀堆积，质粒dna则存在于溶液中。
[0061]
(3)过滤、收集质粒：
[0062]
实验组：准备好本发明的过滤装置8个，包括以下四种不同滤网网兜材料：无纺布、尼龙布、pet薄膜、植物纤维薄膜，其中，滤网网兜4为无纺布的4支，尼龙布的2支，pet薄膜的1支、植物纤维薄膜的1支。将圆柱状的收集筒1至于试管架中，滤网2通过滤网固定部3固定在收集筒1的上方开口处，操作时，实验人员一手持滤网手柄5，一手持离心管将所产生的含有白色絮状沉淀的混合液缓慢倒入滤网网兜4中，液体将会快速渗透并滴入收集筒1中。在上述过滤操作中，为了帮助滤液更彻底的通过滤网2，可将通过铰链7铰接到收集筒1的筒盖6盖上，并手动轻轻甩动2-10次，可使液体通过滤网网兜4全部进入下方的收集筒1内。待过滤结束后，弃去滤网网兜4及其内截留的白色沉淀物，将收集筒1内液体收集，保存备用。
[0063]
对照组：常规离心方法：包括对照1和对照2，将步骤(1)中的2支离心管内菌液采用常规离心方法的处理，即采用冷冻离心机，设置转速12000rpm，高速离心10分钟。
[0064]
(4)纯化：向上一步骤过滤得到的滤液中加入10ml磁珠悬浮液，然后充分摇晃，使磁珠分散均匀并与溶液中质粒dna充分结合，静置1-2分钟后，采用外置磁铁或磁力架吸附并固定溶液中结合有质粒dna的磁珠，而后轻轻倒除管内废液。然后加入100ml去蛋白液pr(异丙醇混合溶液)，充分摇晃震荡使磁珠分散，数分钟后再采用外置磁铁或磁力架吸附并固定磁珠，轻轻倒除废液。再加入120ml漂洗液w(乙醇溶液)，充分摇晃震荡使磁珠分散，此后再用外置磁铁或磁力架吸附并固定磁珠，并倒除废液，重复该步骤一次。经前述两次漂洗操作完成后，将漂洗后的磁珠置于磁力装置上，如磁力架(参考专利cn 2020301198158，cn2020204474313)或磁力托盘(参考专利cn2020207257027)，用吹风机吹扫使磁珠充分干燥，然后加入20ml洗脱液eb(溴化乙锭)充分摇晃震荡，再次使磁珠完全分散，数分钟后再将其置于磁吸装置上使磁珠完全被吸附，吸取上清液即得到含有质粒dna的溶液。
[0065]
(5)纯度测试对比：
[0066]
通过分光光度计测定所得质粒溶液的a
260
/a
280
和a
260
/a
230
比值，参阅下表1。通过测定结果可知，本发明的过滤装置都达到了与常规离心方法分离质粒dna同等的纯度水平，a
260
/a
280
达到1.83-1.93，a
260
/a
230
达到1.58-2.04，并且，如尼龙布等个别实施例的纯度已明显优于常规离心方法。
[0067]
表1不同材料的滤网及其与常规离心方法用于质粒提取的对比
[0068]
序号分离方法或滤网a
260
/a
280a260
/a
230
浓度(ng/μl)1尼龙布11.831.5883.72尼龙布21.921.9790.83无纺布11.932.0498.54无纺布21.921.9180.65无纺布31.921.99106.26无纺布41.901.98107.87植物纤维薄膜1.841.94104.38pet薄膜1.901.9492.39对照11.942.05108.510对照21.932.12128.7
[0069]
实施例5-8在rna提取中应用
[0070]
(1)实验方法与步骤参考实施例1-4。
[0071]
(2)实验处理方法：包括实验组和对照组。
[0072]
实验组：采用本发明滤布进行过滤处理，包括尼龙布2组、无纺布2组、植物纤维滤布2组、pet滤布2组。
[0073]
对照组：包括对照1和2，采用正常离心法处理。
[0074]
(3)结果与分析：
[0075]
从表2和图2的结果可知，实验组与对照组没有明显区别，也就是说，用过滤法提取rna与常规离心法没有明显的差别。并且，实验组所采用的尼龙布、无纺布、植物纤维滤布、pet滤布4种不同材料滤布间的差别也不明显。由此说明，本发明达到了与传统离心法分离获取rna相当的效果，实验组与对照组间无显著差异。
[0076]
表2不同材料的滤网及其与常规离心方法在rna提取中的对比
[0077][0078][0079]
显而易见地，上述实施例和附图仅仅是本发明的一些具体实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例和附图获得其他相近或等同的技术方案，由此所获得的新的技术方案均属于本发明的保护范围。