一种多用途新型细胞保存液制备及应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多用途新型细胞保存液制备及应用，同时本发明还涉及该保存液的应用方法。


背景技术：

2.在细胞学诊断中，需要取脱落的上皮细胞，用于制备液基薄层标本。对用于细胞学检测的保存液，要求能较好的保持细胞形态，抑制微生物生长，保持抗原活性以进行可能的免疫化学测试。目前应用较多的是甲醇类或甲醛类的保存液，其对于细胞固定效果明显，但是完全破坏了细胞表面和深层蛋白结构，并且随着保存时间延长，核酸分子包括dna，rna结构也会出现不可逆转的改变，不利于进行除了细胞学研究之外的其他检测。随着对上皮细胞癌和癌前病变研究的深入，分子机理的揭示和相关基因的发现，分子生物学检测方法因其灵敏度高，标准化和可重复性程度高而成为新的检测方法趋势，然而分子生物学样本保存液保存的样本，不能用于细胞学检测。由于每次取样都会对受试者的心理生理和经济造成一定负担，对现有的细胞保存技术提出了更高要求，细胞保存液不但要维持细胞形态，还要保证核酸和蛋白分子的完整性，可修复性等。


技术实现要素：

3.本发明为解决上述现有技术所存在的不足，提供一种多用途新型细胞保存液制备及应用方法，保存液液含有细胞固定剂、离子缓冲剂、杀菌剂、dna酶抑制剂和粘液去除剂成分。上述改良细胞保存液的具体成分和浓度（质量百分数）如下：细胞固定成分：甲醇，乙醇，乙二醇，异丙醇中一种，浓度为10%-50%；冰醋酸浓度1%-5%；离子缓冲剂：tris盐酸缓冲体系（tris碱和盐酸）、磷酸缓冲体系（pbs缓冲液）、柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸和柠檬酸钠）中的一种，浓度为0.1%-5%，调整ph值在6.5-8.8；杀菌剂：三氯生，氯丁醇，叠氮化钠，beta-丙内酯，聚六甲基胍，proclin300中一种。浓度为0.1%-0.5%；dna酶抑制剂：乙二胺四乙酸盐、二乙基三胺五乙酸盐、三乙基四胺盐、乙二醇双氨乙基醚四乙酸、二乙基二硫代氨基甲酸、乙二胺二琥珀酸三钠，草酸盐、3-羟基-3-羧基戊二酸盐中至少一种，浓度为1.5%-8%；粘液去除剂：二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、乙酰半胱氨酸中一种，浓度为0.1-2%。
4.本发明还提供一种多用途新型细胞保存液应用方法，既可用于细胞学制片染色检测，也可用于分子生物学检测（pcr，测序等）。
5.细胞学制片染色检测：1）取样后样本置于上述保存液瓶内；2）振荡1分钟后转移至试管中进行离心处理；
3）去除上清液,加入细胞清洁液调节细胞浓度；吸取细胞悬液至制片仓；3）自然沉降10分钟或离心甩片1分钟；4）取出玻片可直接进行染色流程镜下检测判读结果。
6.分子生物学检测：1）取样后样本置于上述保存液瓶内；2）振荡1分钟后转移至试管中进行离心处理；3）去除上清液，加入pbs缓冲液洗涤一次（重复离心操作）；4）加入细胞裂解液（各试剂盒提供或自行配制），37
°
c孵育30min；5）加入等体积的酚氯仿抽提核酸；6）转移上层至新管，加入2.5倍体积纯酒精，-20
°
c冷冻一小时；7）高速离心（如12000g）10min；8）去上清，沉淀自然风干，溶解于te缓冲液中即得总核酸；9）可依据后续检测要求进行dna酶或rna酶反应；10）分子生物学检测（pcr，测序等）。
7.本发明的有益积极效果：该保存液不使用醛类成分，并添加dna酶抑制剂，长期保存细胞亦不会造成核酸分子结构改变或降解。细胞形态不丢失，dtt用量温和，后续免疫组化时的抗原复性也很方便。
8.本发明所述细胞保存液配制简便，成分稳定，使用安全，保存效果显著，具有固定细胞，维持渗透压，杀菌，除粘液，防止核酸降解等多项功能，是一种新型多用途且经济的保存液。
9.本发明所述细胞保存液保存的样本，既可用于细胞学制片染色检测，也可用于分子生物学检测（pcr，测序等）。
具体实施方式
10.下面用两个实施例对本发明涉及的新型细胞保存液及应用方法做进一步说明。
11.实施例一：按照以下成分浓度（质量百分比）配制细胞保存液1l：15%乙醇，2%冰醋酸，5%tris-cl，0.5%氯丁醇，2�ta，0.1%dtt，其余为水。
12.将配制好的溶液灌装至保存液瓶（约30ml/瓶），用于保存新鲜取出的食道细胞标本，用于进行rna提取，及抑癌基因p53表达量分析：1）振荡保存液瓶，洗脱细胞；2）取10ml洗脱细胞保存液于15ml离心管中；3）2500rpm离心10min，倒掉上清；4）加入10mlpbs缓冲液清洗细胞一次（打散细胞，离心，倒掉上清）；5）酚氯仿法抽提总核酸；6）dna酶37
°
c消化30min；7）重新抽提rna，并检验完整性；8）逆转录，实时荧光定量pcr检验p53基因表达量。
13.实施例二：
按照以下成分浓度（质量百分比）配制细胞保存液1l：45%乙二醇，5%冰醋酸，5%磷酸缓冲液（nah2po4, na2hpo4, nacl），0.1%三氯生，1.8% 草酸钠，0.5%dtt。
14.将配制好的溶液灌装至保存液瓶（约15ml/瓶），用于保存新鲜取出的宫颈细胞标本，用于进行细胞学检测：1）振荡保存液瓶，洗脱细胞；2）取5-10ml洗脱细胞保存液于15ml离心管中；3）2500rpm离心10min，倒掉上清；4）加入细胞清洁液2-5ml调节细胞浓度5）吸取至制片仓,自然沉降10分钟或离心甩片1分钟6）取出玻片可直接进行染色流程，镜下检测判读结果。
15.上述内容，仅为本发明的较佳实施例，并非用于本限制发明的实施方案，本领域普通技术人员根据本发明的主要构思和精神，可以十分方便地进行相应的变通或修改，故本发明的保护范围应以权利要求书所要求的的保护范围为准。


技术特征：
1.一种多用途新型细胞保存液制备及应用，其特征在于：含有细胞固定剂、离子缓冲剂、杀菌剂、dna酶抑制剂和粘液去除剂：所述细胞固定剂为甲醇，乙醇，乙二醇，异丙醇中至少一种，同时添加少量冰醋酸；所述离子缓冲剂为tris盐酸缓冲液，磷酸缓冲液，柠檬酸缓冲液中至少一种；所述杀菌剂为氯丁醇，叠氮化钠，beta-丙内酯，聚六甲基胍，proclin300中至少一种；所述dna酶抑制剂为乙二胺四乙酸盐、二乙基三胺五乙酸盐、三乙基四胺盐、乙二醇双氨乙基醚四乙酸、二乙基二硫代氨基甲酸、乙二胺二琥珀酸三钠，乙二酸盐、3-羟基-3-羧基戊二酸盐中至少一种；所述去粘液剂为二硫苏糖醇、二硫赤糖醇，三羟甲基氨基甲烷，乙酰半胱氨酸中至少一种。2.根据权利要求1所述的一种多用途新型细胞保存液，其特征在于具体成分和浓度（质量百分数）如下：细胞固定成分：甲醇，乙醇，乙二醇，异丙醇中至少一种，浓度为10%-50%，冰醋酸浓度为1%-5%；离子缓冲剂：tris盐酸缓冲体系（tris碱和盐酸）、磷酸缓冲体系（pbs缓冲液）、柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸和柠檬酸钠）中至少一种，浓度为0.1%-5%；杀菌剂：三氯生，氯丁醇，叠氮化钠，beta-丙内酯，聚六甲基胍，proclin300中至少一种，浓度为0.1%-0.5%；dna酶抑制剂：乙二胺四乙酸盐、二乙基三胺五乙酸盐、三乙基四胺盐、乙二醇双氨乙基醚四乙酸、二乙基二硫代氨基甲酸、乙二胺二琥珀酸三钠，草酸盐、3-羟基-3-羧基戊二酸盐中至少一种，浓度为1.5%-8%；粘液去除剂：二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、乙酰半胱氨酸中至少一种，浓度为0.1-2%。3.根据权利要求1所述的一种多用途新型细胞保存液，其特征在于溶液ph值为6.5~8.8。4.根据权利要求1所述的一种多用途新型细胞保存液，其特征在于保存液保存的样本既可用于细胞学制片染色检测，也可用于分子生物学检测（pcr，测序等）。

技术总结
本发明提供了一种多用途新型细胞保存液及其应用方法，本发明的细胞保存液包含细胞固定剂、离子缓冲剂、杀菌剂、DNA酶抑制剂和粘液去除剂成分，配制简便，成分稳定，使用安全，保存效果显著，具有固定细胞，维持渗透压，杀菌，除粘液，防止核酸降解等多项功能，既可用于细胞学检测，也可用于分子生物学检测，是一种新型多用途且经济的保存液。型多用途且经济的保存液。


技术研发人员：姚斌
受保护的技术使用者：南京福怡科技发展股份有限公司
技术研发日：2020.12.01
技术公布日：2022/6/4