一种快速检测人体唾液中的舒芬太尼含量的方法

1.本发明涉及毒品检测领域，具体涉及一种脉冲直流电喷雾离子源，用于快速检测人体 唾液中的舒芬太尼含量。


背景技术：

2.舒芬太尼(n-(4-甲氧甲基-1-[2-(2-噻吩)乙基]-4-哌啶基)-n-苯基丙酰胺)是一种合成阿 片类受体激动剂，其结构是在芬太尼的4位上引入极性基团的n-4取代衍生物，广泛应用于 临床麻醉和镇痛。舒芬太尼镇痛效果强，比芬太尼强5到10倍，是吗啡的1000倍。滥用芬 太尼类药物会对健康造成严重危害，其不良反应包括头晕、恶心、呼吸抑制、昏迷等，甚至 造成死亡。另一方面，由于其具有亲脂性，便于进入中枢神经系统激活人体内的阿片受体， 而具有欢快和舒适刺激作用，会引起镇痛和快感，很容易上瘾，因而产生重大的社会和医学 问题。因此，为了减少与芬太尼类药物有关的发病率和犯罪率，快速、准确测量芬太尼类药 物浓度对于公共安全和临床都具有重要意义。
[0003]
目前针对唾液中舒芬太尼的测定方法主要有气相色谱质谱法和液相色谱质谱法。中华 人民共和国司法行政行业标准中采用液液萃取后富集浓缩的方法将唾液进行处理，然后用液 相色谱-串联质谱仪进行检测。文献中报道采用超高效液相色谱-串联质谱对唾液中的芬太尼 类药物进行分析，如中国专利公开号cn112782305a公开了一种灵敏快速适合药动学研究的 血浆中舒芬太尼浓度分析方法，采用：1.前处理；2.色谱分离；3.质谱检测的方法对血浆中的 舒芬太尼进行检测。这类分析方法往往需要采用固相萃取、富集浓缩等复杂的样品前处理方 法，同时色谱分离也需要较长时间，无法满足非法药物现场、快速、准确、高通量的分析需 求。另外，采用的仪器设备比较昂贵，不利于方法的普及和推广。


技术实现要素：

[0004]
本发明是为了克服现有检测技术前处理复杂，分析时间长，难以普及和推广的问题， 提供一种快速检测人体唾液中的舒芬太尼含量的方法，具有分析速度快、操作简便、可实时 原位、成本低、灵敏度高和特异性好等优点。可以实现痕量样品(皮升级)的长期，稳定， 高强度电离，并满足小批量样品的分析要求。
[0005]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种快速检测人体唾液中的舒芬太尼含量的方法，包括以下步骤：(1)定性离子、定量离子的选择；(2)标准曲线的构建；(3)唾液样品的前处理：(a)取唾液样品，加入内标配成阳性唾液，加入碱液调节ph；(b) 加入无水硫酸镁，涡旋，加入乙酸乙酯，离心，提取上清液；(c)在上清液中加入 0.03-0.08μl/μl上清液的甲醇，得到待测样品液；(4)脉冲直流电喷雾离子源质谱测定待测样品液中的舒芬太尼含量。
[0006]
脉冲直流电喷雾离子源质谱技术是一种新型的质谱分析技术，可以在现场，原位
且仅 需少量预处理即可快速进行质谱分析。脉冲直流电喷雾离子源是便携式离子源，致力于对吸、 贩毒者进行快速筛查和药物分析。脉冲直流电喷雾技术可以在三十秒内完成对生物样品进行 采样，注入，电离和得到质谱图，从所得到产物的质谱图来分析该样品的化学组成和结构。 该方法具有分析速度快、操作简便、可实时原位、成本低、灵敏度高和特异性好等优点。离 子源设计有一个一次性采样套件，该套件易于操作并消除了交叉感染。它可以实现痕量样品 (皮升级)的长期，稳定，高强度电离，并满足小批量样品的分析要求。
[0007]
对于质谱检测技术而言，针对不同样品及检测物质，必须对待测样品进行适当的前处 理步骤，才能保证后续质谱检测顺利进行，得到理想的结果。同时，不同质谱检测技术对样 品的前处理要求也有一定差异。针对本发明采用的脉冲直流电喷雾离子源质谱技术，对于唾 液样品而言，其环境中的物质相对复杂，其中主要的有机成分为蛋白质，可能会对物质的检 测造成干扰，因此必须采取适合的前处理后才能进行检测。发明人经过大量实验后发现，通 过调节ph保证样品及内标的稳定性，通过加入无水硫酸镁无机盐对样品中的蛋白质进行沉 淀，减少干扰，通过加入甲醇减小样品极性，有利于样品在后续过程中充分电离，提高检测 精度。该前处理方法步骤清晰，操作简单，可以使得唾液样品在脉冲直流电喷雾离子源质谱 中取得理想的检测效果。
[0008]
作为优选，步骤(a)中，所述碱液为8-12％氢氧化钠溶液，所述ph范围为11-13。
[0009]
作为优选，步骤(a)中，阳性唾液中内标的浓度为80-120ng/ml。
[0010]
作为优选，步骤(b)中，无水硫酸镁的用量为0.4-0.6mg/μl上清液；乙酸乙酯的用 量为0.2-0.4μl/μl上清液。
[0011]
作为优选，步骤(b)中，涡旋时间为40-80s，离心时间为2-4min，离心转速为 12000-15000r/min。
[0012]
作为优选，步骤(c)中，甲醇的加入量为0.04-0.06μl/μl上清液。
[0013]
作为优选，所述脉冲直流电喷雾离子源质谱检测的条件为：扫描模式：正离子选择扫 描模式；电喷雾电压：3-5kv；传输毛细管温度：250-300℃；传输毛细管电压：30-40v；离 子提取透镜电压：100-120v；碰撞气：高纯氦气；碰撞能量为20-40ev。
[0014]
作为优选，所述脉冲直流电喷雾离子源质谱检测的条件为：扫描模式：正离子选择扫 描模式；电喷雾电压：4kv；传输毛细管温度：275℃；传输毛细管电压：35v；离子提取透 镜电压：110v；碰撞气：高纯氦气；碰撞能量为30ev。
[0015]
作为优选，所述定性离子为舒芬太尼的定性离子，所述定量离子为舒芬太尼的定量离 子和d5-芬太尼的定量离子。
[0016]
作为优选，所述舒芬太尼的定性离子为m/z 355.30，所述舒芬太尼的定量离子为m/z238.20，所述d5-芬太尼的定量离子为m/z 188.10。
[0017]
因此，本发明具有如下有益效果：(1)针对唾液样本中的质谱检测开发了一种简便的 前处理方法，可以有效排除唾液中的杂质干扰，增大检测灵敏度和稳定性，适用于样品的快 速检测；(2)开发了完整的通过脉冲直流电喷雾离子源质谱检测唾液样品中舒芬太尼含量的 方法，分析速度快、操作简便。
附图说明
[0018]
图1是舒芬太尼标准品(50ng/ml)的二级质谱图。
[0019]
图2是舒芬太尼标准品(50ng/ml)的选择离子流图。
[0020]
图3是d5-芬太尼标准品(50ng/ml)的二级质谱图。
[0021]
图4是d5-芬太尼标准品(50ng/ml)的选择离子流图。
[0022]
图5是阳性唾液的二级质谱图。
[0023]
图6是阳性唾液的选择离子流图。
[0024]
图7是舒芬太尼的低浓度工作曲线。
[0025]
图8为舒芬太尼的高浓度工作曲线。
具体实施方式
[0026]
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
[0027]
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实 施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0028]
总实施例一种快速检测人体唾液中的舒芬太尼含量的方法，包括以下步骤：(1)定性离子、定量离子的选择：用纳升电喷雾喷头吸取微量体积的30-70ng/ml的舒芬太 尼标准溶液进样，用质谱仪在线检测，得到舒芬太尼标准品的前体离子和碎片离子，在碎片 离子中选择定量离子和定性离子，以d5-芬太尼为内标物，用纳升电喷雾喷头吸取微量体积 的30-70ng/ml的d5-芬太尼标准溶液进样，用质谱仪在线检测，得到d5-芬太尼标准品的前 体离子和碎片离子，在碎片离子中选择定量离子；(2)标准曲线的构建：利用质谱检测不同浓度的含分析物舒芬太尼和d5-芬太尼的若干组标 准工作溶液，质谱为正离子选择扫描模式的脉冲直流电喷雾离子源质谱，得到样品的前体离 子和碎片离子，与标准品质谱图对照进行定性，然后以分析物和内标物的定量离子的峰强度 之比平均值为y轴，以分析物在唾液中的浓度为x轴，通过对多组实验数据求平均，构建标 准曲线；(3)唾液样品的前处理：(a)取唾液样品，加入内标配成浓度为80-120ng/ml的阳性唾液， 加入质量分数为8-12％的氢氧化钠溶液调节ph至11-13；(b)加入0.4-0.6mg/μl上清液的 无水硫酸镁，涡旋40-80s，加入0.2-0.4μl/μl上清液的乙酸乙酯，离心2-4min，离心转速 为12000-15000r/min，提取上清液；(c)在上清液中加入0.03-0.08μl/μl上清液的甲醇， 得到待测样品液；(4)脉冲直流电喷雾离子源质谱测定待测样品液中的舒芬太尼含量。脉冲直流电喷雾离子源 质谱检测的条件为：扫描模式：正离子选择扫描模式；电喷雾电压：3-5kv；传输毛细管温 度：250-300℃；传输毛细管电压：30-40v；离子提取透镜电压：100-120v；碰撞气：高纯 氦气；碰撞能量为20-40ev。将分析物和内标物的定量离子的峰强度之比代入到所得标准曲 线中，计算得到唾液中的舒芬太尼含量。
[0029]
实施例1步骤一、标准溶液制备用含有0.1％甲酸的甲醇对舒芬太尼和d5-芬太尼的标准溶液进行系列稀释，其中舒芬太尼标 准溶液稀释成5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、5μg/ml，d5-芬太尼的标准溶 液稀释成100ng/ml。舒芬太尼的化学结构式如下所示：
步骤二、阴性唾液处理及工作溶液制备准备八个相同规格的离心管，各自吸取人体阴性唾液400μl放入离心管中，随后分别加入8 μl5ng/ml、4μl50ng/ml、8μl50ng/ml、8μl100ng/ml、4μl500ng/ml、8μl500 ng/ml、4μl5μg/ml、8μl5μg/ml的舒芬太尼标准溶液于不同的离心管中，其中每个离 心管中都加入8μl100ng/ml的d5-芬太尼标准溶液，随后加入200μl乙酸乙酯，最后涡 旋60秒，13500r/min离心3分钟，取上层得到八个不同浓度的含有内标的舒芬太尼标准工 作溶液(0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml) 用于构建工作曲线，内标溶液的浓度保持不变(2ng/ml)。分析之前，所有加标的样品溶液 均是新鲜制备的。
[0030]
步骤三、舒芬太尼的定性和定量离子的选择用纳升电喷雾喷头吸取微量体积的50ng/ml的舒芬太尼标准溶液，工作时，将一个金属电极 插入纳升电喷雾喷头内部，电极与溶液之间并不直接接触，保持有约5mm的距离，将喷头 与质谱锥口相对准，在电极通电后，喷头发生脉冲式电喷雾，溶液中物质发生离子化，用质 谱仪在线检测，得到如图1所示的舒芬太尼的二级质谱图，根据质谱检测结果在碎片离子中 选择采用信噪比最高的m/z 238.20作为定量离子，m/z 355.30作为定性离子，结构如图1所 示。图2为舒芬太尼标准品的选择离子流图。
[0031]
步骤四、d5-芬太尼的定量离子的选择用纳升电喷雾喷头吸取微量体积的50ng/ml的d5-芬太尼标准溶液，工作时，将一个金属电 极插入纳升电喷雾喷头内部，电极与溶液之间并不直接接触，保持有约5mm的距离，将喷 头与质谱锥口相对准，在电极通电后，喷头发生脉冲式电喷雾，溶液中物质发生离子化，用 质谱仪在线检测，得到如图3所示的d5-芬太尼的二级质谱图，根据质谱检测结果在碎片离 子中选择采用信噪比最高的m/z 188.10作为定量离子，结构如图3所示。图4为d5-芬太尼 的选择离子流图。
[0032]
步骤五、方法学考察(1)检出限和定量限通过比较步骤三中确定的舒芬太尼定性和定量离子m/z 238.20和m/z 355.30在不同浓度的工 作溶液中与空白基质中的信噪比，确定检出限(lod)和定量限(loq)。空白基质为不添加 任何标准品但前处理方法一致的空白样品。lod和loq被定义为信噪比分别达到3和10时 分析物的浓度。
[0033]
(2)制备工作曲线以分析物和内标物的定量离子的响应值之比的平均值为y轴，以分析物在唾液中的浓度(0.1 ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)为x轴， 每条曲线至少包含5个校准点，通过对三组平行实验数据进行平均，分别在0.1-5ng/ml与 2-100ng/ml构建了工作曲线，结果如图7、图8所示。最后通过线性回归得到线性回归方程。
[0034]
(3)准确度和精密度
取低，中和高浓度的工作溶液(0.1ng/ml，2ng/ml，100ng/ml)日内精密度：分早中晚三次实验，每次实验将每种浓度的工作溶液做五个平行，每个浓度进 一针，准确度定义为测量浓度(cm)与样品中分析物实际浓度(ca)，计算如下：(cm/ca)
ꢀ×
100％，精密度用相对标准差(rsd)表示，分别求出高中低三个浓度的精密度。
[0035]
日间精密度：六天内对同一被测物进行重复测量所得结果间的一致程度。
[0036]
所述质谱条件为：扫描模式：正离子选择扫描模式；电喷雾电压：4kv；传输毛细管 温度：275℃；传输毛细管电压：35v；离子提取透镜电压：110v；碰撞气：高纯氦气；碰 撞能量为30ev。
[0037]
考察该方法的线性、检出限和定量限等参数，结果见表1。从表1中可以看到，舒芬 太尼在0.1-100ng/ml范围内线性良好，r2(相关系数)令人满意。
[0038]
表1舒芬太尼的线性、检出限和定量限结果考察该方法的重现性和精密度，结果见表2。从表2中可以看到，舒芬太尼的重现性和精密 度良好，低中高三个浓度的rsd均在10％之内。
[0039]
表2舒芬太尼的重现性和精密度考察该方法的加标回收率，结果见表3。从表3中可以看到，舒芬太尼的加标回收率都在 91.22％-107.75％之间。
[0040]
表3舒芬太尼的加标回收率
ꢀꢀ
添加浓度(ng/ml)平均实测浓度(ng/ml)平均加标回收率％ 0.10.10163003101.63％day121.9233628396.17％ 100100.979818100.98％ 0.10.10541307105.41％day222.07040418103.52％ 100107.754696107.75％ 0.10.0971546697.15％day322.09330565104.67％ 100102.203024102.20％ 0.10.0984996498.50％day421.9932212199.66％ 100100.641587100.64％ 0.10.10352368103.52％
day522.14843015107.42％ 10098.073796898.07％ 0.10.10333338103.33％day621.9208441296.04％ 10091.224329691.22％结合表1、2和3的结果，认为该方法准确性良好，可以用来快速检测人体唾液中的舒芬太尼 含量。
[0041]
步骤六、阳性唾液样本中舒芬太尼的检测分析对阳性唾液样本进行如下步骤前处理：(a)吸取600μl唾液样品，加入内标配成阳性唾液，加入氢氧化钠溶液调节ph至12；(b)加入过量无水硫酸镁，涡旋1min，加入200μl乙酸乙酯，13500r/min离心3min，提 取上清液；(c)在上清液中加入30μl甲醇，得到待测样品液。
[0042]
用纳升电喷雾头吸取待测样品液进样，进样步骤与步骤三相同，用脉冲直流电喷雾离 子源质谱快速检测，得到如图5所示的阳性唾液的二级质谱图和如图6所示的阳性唾液的选 择离子流图；与阴性唾液的质谱图和标准品的定性离子对进行对比定性，采用内标法定量， 结果见表4。
[0043]
表4实际样本检测结果 样本阴性样本阳性样本浓度(ng/ml)未检出8.68表4说明本发明提供的检测方法可以检出唾液样本中的舒芬太尼含量。
[0044]
实施例2本实施例与实施例1的区别在于，质谱的条件为：电喷雾电压：3kv；传输毛细管温度：250℃； 传输毛细管电压：40v；离子提取透镜电压：100v；碰撞气：高纯氦气；碰撞能量为40ev。
[0045]
实施例3本实施例与实施例1的区别在于，质谱的条件为：电喷雾电压：5kv；传输毛细管温度：300℃； 传输毛细管电压：30v；离子提取透镜电压：120v；碰撞气：高纯氦气；碰撞能量为20ev。
[0046]
对比例1(前处理不调整ph)本对比例与实施例1的区别在于，步骤六中的前处理方法为：(a)吸取600μl唾液样品，加入内标配成阳性唾液；(b)加入过量无水硫酸镁，涡旋1min， 加入200μl乙酸乙酯，13500r/min离心3min，提取上清液；(c)在上清液中加入30μl甲 醇，得到待测样品液。
[0047]
对比例2(前处理不加无水硫酸镁)本对比例与实施例1的区别在于，步骤六中的前处理方法为：(a)吸取600μl唾液样品，加入内标配成阳性唾液，加入氢氧化钠溶液调节ph至12；(b) 加入200μl乙酸乙酯，13500r/min离心3min，提取上清液；(c)在上清液中加入30μl甲 醇，得到待测样品液。
[0048]
对比例3(前处理不加甲醇)本对比例与实施例1的区别在于，步骤六中的前处理方法为：(a)吸取600μl唾液样品，加入内标配成阳性唾液，加入氢氧化钠溶液调节ph至12；(b) 加入过量无水硫酸镁，涡旋1min，加入200μl乙酸乙酯，13500r/min离心3min，提取上清 液，得到待测样品液。
[0049]
对比例4(前处理加入少量甲醇)本对比例与实施例1的区别在于，步骤六中的前处理方法为：(a)吸取600μl唾液样品，加入内标配成阳性唾液，加入氢氧化钠溶液调节ph至12；(b) 加入过量无水硫酸镁，涡旋1min，加入200μl乙酸乙酯，13500r/min离心3min，提取上清 液；(c)在上清液中加入5μl甲醇，得到待测样品液。
[0050]
对比例5(前处理加入大量甲醇)本对比例与实施例1的区别在于，步骤六中的前处理方法为：(a)吸取600μl唾液样品，加入内标配成阳性唾液，加入氢氧化钠溶液调节ph至12；(b) 加入过量无水硫酸镁，涡旋1min，加入200μl乙酸乙酯，13500r/min离心3min，提取上清 液；(c)在上清液中加入100μl甲醇，得到待测样品液。
[0051]
取舒芬太尼添加浓度为10ng/ml的唾液若干，分别在实施例1-3和对比例1-3的质谱 参数条件下进行舒芬太尼浓度测定，每组实验做五个平行样，最终结果取平均值来比较不同 质谱参数条件下10ng/ml的唾液中定性离子m/z 238.20的响应值及信噪比。
[0052]
表5不同仪器参数下10ng/ml的唾液中定性离子(m/z 238.20)的响应值及信噪比 组别背景m/z 238.20响应值信噪比实施例164.124571393.92实施例226620475329.18实施例365.3470772.08对比例166.523700356.39对比例267.423800353.12对比例366.521100317.29对比例463.920098314.52对比例567.117100267.61对于质谱检测技术而言，针对不同样品及检测物质，必须对待测样品进行适当的前处理步骤， 才能保证后续质谱检测顺利进行，得到理想的结果。实施例1通过质谱参数的优化与适当的 简单前处理步骤，避免了十分复杂的样品前处理过程，利用脉冲直流电喷雾离子源质谱法可 快速、高灵敏度高地检测出人体唾液中的舒芬太尼含量，检测方法具有良好的精密度和准确 度。对比例1在前处理过程中未进行ph调整，使得样品稳定性降低，导致后续检测过程中 信噪比降低。对比例2在前处理过程中未沉淀蛋白质，因此蛋白质容易在后续的质谱检测过 程中对舒芬太尼的检测造成干扰，使得结果出现一定误差。对比例3在前处理过程中未加入 甲醇，对比例3的舒芬太尼检测信噪比及响应值均远低于实施例1，其原因可能在于甲醇可 以减小唾液样本的极性，使得唾液样本在检测过程中更容易发生电离，提高检测精度和准确 性。对比例4在前处理过程中仅加入少量甲醇，对舒芬太尼检测响应值明显低于实施例1， 同样说明甲醇的加入对于检测精度的重要性。对比例5在前处理过
程中加入大量甲醇，过量 甲醇的加入使得信噪比降低，同样不利于精确检测舒芬太尼的含量。
[0053]
在脉冲直流电喷雾离子源质谱的参数设置中，存在多组互相配合的可调参数，针对不 同样品种类和检测物质，其参数设置存在较大差异。并且质谱中的各组可调参数间彼此存在 较大影响，因此需要对不同的样品和检测物质开发特定的检测方法。实施例1通过质谱参数 的优化与适当的简单前处理步骤，避免了十分复杂的样品前处理过程，利用脉冲直流电喷雾 离子源质谱法可快速、高灵敏度高地检测出人体唾液中的舒芬太尼含量，检测方法具有良好 的精密度和准确度。实施例2与实施例3对质谱参数进行了较小调整，对舒芬太尼检测的响 应值及信噪比均低于实施例1，证明了质谱参数的合理设置对舒芬太尼的检测有重要影响， 实施例1的检测参数是发明人经过大量调试得到的结果。
[0054]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技 术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的 保护范围。