基于Fenton-亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法

基于fenton-亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法
技术领域
1.本发明涉及过氧化氢酶活性检测领域，具体涉及一种基于fenton-亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法。


背景技术：

2.cat广泛存在于人体内，如肝脏、肾脏、红细胞、肌肉、小肠等组织，细胞代谢产生的毒性物质h2o2能迅速被cat加以清除。不同个体cat活性不一致，其活性大小可作为某些慢性疾病预防诊断的指标。因此，cat活性测定在临床应用中越来越受人们的重视。文献报道了多种cat活性测定方法，如滴定法、荧光检测法、紫外分光光度法、显色光度法等。近年来，褪色光度法因高灵敏性、低检测限而成为该领域一大亮点，然而基于fenton试剂(h2o2/fe
2
)作用下的亚甲基蓝褪色光度法测定血清过氧化氢酶活性尚无报道。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种基于fenton-亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法，该方法的灵敏性、准确性及稳定性更具优势，并成功用于不同个体血清cat活性分析。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：基于fenton-亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法，基于fenton试剂(h2o2/fe
2
)作用下的亚甲基蓝(methylene blue，mb)褪色体系完成过氧化氢酶(catalase，cat)活性测定。还原型染料亚甲基蓝于665 nm波长处有最大吸收波，摩尔吸光系数达到9.5
×
10
4 l/mol
·
cm，在h2so4介质中，fe
2
催化h2o2氧化亚甲基蓝发生褪色反应，cat分解h2o2引起吸光度回位，基于cat加入前后吸光度变化值
△
a与cat活性的线性关系得到过氧化氢酶活性，其中，
△
a=-0.0012 12.23 e(u/ml)，r=0.9976，最低检测限达到0.0024 u/ml；具体包括如下步骤：取血清样品10 μl于50 ml容量瓶中，加入h2o2底液3.00 ml，30℃恒温反应15 min，立即加入h2so
4 1.00 ml终结酶促反应，充分震荡后依次加入亚甲基蓝溶液5.00 ml，feso
4 1.00 ml，室温反应5 min后定容，蒸馏水作参比，在1 cm吸收池中测定665 nm波长处的吸光度a；同步测定酶空白体系吸光度a0，测定时，取血清样品10 μl于50 ml容量瓶中，加入h2so
4 1.00 ml终结酶促反应，充分震荡后，加入h2o2底液3.00 ml，30℃恒温反应15 min，依次加入亚甲基蓝溶液5.00 ml，feso
4 1.00 ml，室温反应5 min后定容，蒸馏水作参比，在1 cm吸收池中测定665 nm波长处测定酶空白体系吸光度a0；根据
△
a=-0.0012 12.23 e(u/ml)，r=0.9976，计算血清样品cat活性e(u/ml)。
5.本发明利用cat对fe
2
‑ꢀ
h2o
2-mb显色体系的抑制效应，完成了cat活性快速检测，最低检出量可达到0.0024 u/ml，明显优于其它褪色光度法，可成功用于人体血清cat活性
测定，为临床检验工作者提供诊断依据，也为新型cat试剂盒开发研制提供理论保障。
附图说明
6.图1为全波长扫描吸收光谱。
7.图2为不同催化剂的催化作用比较图。
8.图3为亚甲基蓝用量的影响图。
9.图4为硫酸用量的影响图；图中：1-mb h2so4；2-mb h2o2 h2so4。
10.图5为底液h2o2用量的影响图。
11.图6为酶促反应时间的影响图。
具体实施方式
12.为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
13.试验资料1.1 仪器与试剂uv1102 紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。
14.h2o2底液：将0.50 ml 30% h2o2稀释成250 ml，高锰酸钾法测定其浓度，根据测定值二次稀释为1 mmol/l (即1 μmol/ml)。
15.cat标准溶液：1 u/ml。将cat固体和蒸馏水按照1:10000的比列混合配制，高锰酸钾法测定其活性，根据测定结果二次稀释cat标准液。
16.1 mol/l h2so4；0.1 mmol/l亚甲基蓝溶液；0.01 mol/l feso4。
17.血清样品来自于健康群体，由甘肃医学院附属医院提供。
18.测定方法取血清样品10 μl于50 ml容量瓶中，加入h2o2底液3.00 ml，30℃恒温反应15 min，立即加入h2so
4 1.00 ml终结酶促反应，充分震荡后依次加入亚甲基蓝溶液5.00 ml，feso
4 1.00 ml，室温反应5 min后定容，蒸馏水作参比，在1 cm吸收池中测定665 nm波长处的吸光度a。同步测定酶空白体系吸光度a
0 (方法同上，仅改变h2o2底液和h2so4加入顺序，即在h2o2加入前完成酶失活)，根据
△
a (见2.4 cat活性工作曲线)计算血清样品cat活性e(u/ml)。
19.结果讨论2.1吸收光谱图1是全波长扫描吸收光谱。亚甲基蓝在可见光区665 nm处有强吸收(图1曲线a)，摩尔吸光系数达到9.5
×
10
4 l/mol
·
cm；当向亚甲基蓝中加入fe
2
和h2o2时，反应快速完成，10分钟内变为淡蓝色，吸光度趋近于0，但峰位未做改变(图1中的曲线b)，由此说明，亚甲基蓝与h2o2发生了简单的褪色反应；加入cat后，褪色受抑制，吸光度线性递增(图1中的曲线c、d)。后续实验测定波长确定为665 nm。
20.褪色反应条件优化2.2.1催化剂优化选择
取h2o
2 底液3.00 ml，实验考察不同类型催化剂催化性能。结果表明：金属离子fe
2
和fe
3
对h2o2氧化亚甲基蓝褪色反应均有催化作用，但催化程度有差异。在亚甲基蓝基础上(图2中a曲线)；单纯加入h2o2，褪色不明显(图2中b曲线)；fe
3
对h2o2氧化亚甲基蓝褪色反应有微弱促进作用(图2中c曲线)；相对而言，fe
2
作用更为显著，其褪色率是fe
3
的7.5倍(图2中d曲线)。fe
2
有效降低过氧化氢的分解活化能，能产生具有氧化功能的羟自由基。因此实验选择fe
2
作催化剂。
21.亚甲基蓝用量的确定在不存在h2o2和fe
2
的情况下，单纯考察亚甲基蓝溶液吸光度变化情况。体系的a值随着亚甲基蓝体积的增大而逐渐增大，0.1 mmol/l亚甲基蓝溶液在0.00～7.00 ml范围内吸光度与体积有线性关系(图3)，旨在减少测量误差，将体系吸光度测定值控制在0.20～0.80范围内，亚甲基蓝体积确定为5.00 ml，此时亚甲基蓝反应液浓度为1.0
×
10-5 mol/l。
22.硫酸用量的影响取h2o2底液3.00 ml，采用硫酸作反应介质，探讨硫酸体积对亚甲基蓝溶液和亚甲基蓝褪色反应体系吸光度的影响(图4)。结果表明，由于质子化效应影响，亚甲基蓝溶液自身吸光度随酸度增大而递减，但变化幅度不大(图4曲线1)。硫酸加速了褪色反应进程(图4曲线2)，fe
2
水溶性、稳定性增强；当v=1.00 ml时，褪色最明显，相对吸光度变化量达到最大，故1 mol/l h2so4最佳取量为1.00 ml。
[0023] 2 用量的影响取h2o2底液3.00 ml，考察0.01 mol/lfe
2
用量对亚甲基蓝褪色反应的影响。结果表明，v(fe
2
)《0.80 ml，褪色反应体系a值随fe
2
体积的增大而减小；v(fe
2
)》3.00 ml时，反应体系a值随fe
2
体积增大而增大，显然过量fe
2
导致h2o2分解，褪色反应不完全。因此取0.01 mol/l fe
2 1.00 ml作亚甲基蓝褪色反应的催化剂。
[0024]
褪色反应时间优化取h2o
2 底液3.00 ml，对褪色反应时间做进一步考察。结果表明，fe
2
催化反应速度极快，5 min a达到最大，60 min内a保持恒定。因此褪色反应时间确定为15 min。
[0025]
酶促反应条件优化2.3.1底液h2o2用量的确定针对酶空白体系，在最佳褪色反应优化条件下，改变h2o2体积用量，测定吸光度。结果显示体系吸光度随h2o2加入而减小，在0.00~3.00 ml范围内二者有非常理想的线性关系(图5)，当v(h2o2)》3.50 ml时，吸光度递减并趋于恒定，故取h2o
2 底液3.00 ml作酶反应底物。
[0026]
酶促反应时间影响取1 u/ml cat标准溶液3.00 ml作测试液，其它条件不变，改变酶促反应时间，测定
△
a，以时间t为横坐标，
△
a为纵坐标作出酶促反应曲线。由图6可知：酶促反应速度较快，在开始0～5 min内，
△
a与时间成正比，具有一级反应特征；10 min后，
△
a趋于恒定。因此酶促反应时间确定为15 min。
[0027]
活性工作曲线取1 u/ml cat标准溶液0.00、0.50、1.00、0.80、1.50、2.00、2.50、3.00 ml作测试液，在最佳条件下完成
△
a测定，绘制工作曲线。cat活性e(u/ml)在0.00~0.06 u/ml范围内
与
△
a呈良好的线性关系：
△
a=-0.0012 12.23 e(u/ml)，r=0.9976，按实验方法平行测定空白10次，标准偏差s为0.01，3倍的标准偏差除以斜率求得cat活性检测限为0.0024 u/ml。
[0028]
样品分析按“1.2”测定方法完成6例健康人的血清cat活性分析，考察精密度并完成加标回收实验，结果见表1。
[0029]
表1：样品分析及回收率实验结果(n=6)表1显示，儿童和老人血清cat活性明显高于成年人，最高达到63.2 u/ml，加标回收率控制在96.97%~102.2%范围内，相对标准偏差rsd≤3.6%，说明本发明的方法具有较高的准确度和精密度。
[0030]
综上所述，本发明利用cat对fe
2
‑ꢀ
h2o
2-mb显色体系的抑制效应，可以完成cat活性快速检测，最低检出量可达到0.0024 u/ml，明显优于其它褪色光度法，可成功用于人体血清cat活性测定，为临床检验工作者提供诊断依据，也为新型cat试剂盒开发研制提供理论保障。
[0031]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。