一种口蹄疫病毒O型、A型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用与流程

一种口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物易患的一种热性、急性、高度接触性传染病。该病传播迅速，发病率高，该病的爆发和流行给全球养殖业带来了巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(oie)和联合国粮农组织(fao)将其列为a类烈性传染病之首，我国将其列为一类传染病第一位。口蹄疫病毒分为7个血清型和80多个亚型，极易发生变异，其中7个血清型包括a型、o型、asia i型、c型、sat1型、sat2型、和sat3型，以o型、a型口蹄疫病毒流行最为广泛。按遗传分类，o型口蹄疫病毒主要流行三种遗传拓扑型(topotype)，分别属于cathay型(中国型)、me-sa型(中东-南亚型)和sea型(东南亚型)。由于不同型的疫苗之间无交叉免疫保护作用，作为同一血清型o型内不同亚型的抗原性也有不同程度的差别，其产生的抗体的血清学交叉反应的程度也各不相同，这就要求抗体检测方法必须特异和稳定。
3.目前，对口蹄疫的防控主要是疫苗免疫为主，对疫苗免疫后抗体水平的监测是控制疫苗免疫效果的必要措施。市场上常用的口蹄疫血清学检测方法主要有：病毒中和试验(vnt)、液相阻断elisa方法(lpb-elisa)，其中，病毒中和试验是抗体测定的金标准，但该方法需要动用活病毒，且只能在特定的高级别实验室中才能操作，操作相对复杂、耗时约5天且存在生物安全风险；液相阻断elisa试剂盒为商品化试剂盒，应用相对较多，但操作步骤繁琐、耗时约4小时，批次间检测结果不稳定，且该试剂盒的捕获抗体和酶标抗体使用的都是多抗，多抗血清经常出现品质不均匀，影响检测结果。此外上述方法均为单指标检测，一次只能检测一种抗体，样品检测量大且耗时耗力。因此，开发一种能将抗原直接固相制备抗原板，且一次可以同时检测fmdv o型、a型抗体的试剂盒，并解决重复性不佳的问题，提高敏感性与特异性，对该病的诊断和预防具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒，其中，所述抗体联检试剂盒包括一个或多个口蹄疫病毒o型、a型抗体检测芯片、酶标试剂，所述口蹄疫病毒o型、a型抗体检测芯片上的点样点，分别包被有口蹄疫病毒o型抗原、口蹄疫病毒a型抗原、质控品、空白对照；所述o型口蹄疫病毒抗原为o型口蹄疫病毒样颗粒，所述a型口蹄疫病毒抗原为a型口蹄疫病毒样颗粒，所述质控品为羊抗鼠多克隆抗体，所述空白对照为点样液，所述酶标试剂为含有酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体和酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体的溶液，所述酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体为酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体7d2或酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体6g6、所述酶标记a型口蹄疫病毒单克
隆抗体为酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体3b4或酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体2e11。
5.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述o型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点；所述a型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点；o型口蹄疫病毒单克隆抗体7d2的重链可变区如seq.id no.7或其简并序列编码，轻链可变区如seq.id no.8或其简并序列编码；o型口蹄疫病毒单克隆抗体6g6的重链可变区如seq.id no.5或其简并序列编码，轻链可变区如seq.id no.6或其简并序列编码；a型口蹄疫病毒单克隆抗体3b4的重链可变区如seq.id no.3或其简并序列编码，轻链可变区如seq.id no.4或其简并序列编码；a型口蹄疫病毒单克隆抗体2e11的重链可变区如seq.id no.1或其简并序列编码，轻链可变区如seq.id no.2或其简并序列编码；所述酶标试剂所用的缓冲液为含有体积比20％胎牛血清的pbs溶液，其中所述酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体7d2、酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体3b4的终浓度分别为100ng/ml、75ng/ml；所述酶标试剂所标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-d-半乳糖苷酶；所述质控品点样于质控品点1～3，所述质控品点1的包被量为大于等于1ng/点而小于4ng/点；所述质控品点2的包被量为4ng/点；所述质控品点3的包被量为大于4ng/点而小于等于6ng/点；所述点样液为5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、dmso溶液、pbs(ph6.8)溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀而成。
6.通过对上述抗原包被量进一步优化选择，保证了检测的高灵敏度。
7.本发明经实验研究，限定特定的a型口蹄疫病毒抗原包被量、特定的o型口蹄疫病毒抗原包被量、特定的羊抗鼠多克隆抗体的包被量、特定的酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体含量、特定的酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体含量，实现了对样品中血清抗体的高灵敏度检测。
8.与传统elisa试剂盒均设有阴性对照、阳性对照或标准品作为试剂盒内质控品相比，本发明所述联检试剂盒通过技术提升，在反应载体上设有质控品，且该质控品为商品化羊抗鼠多克隆抗体，不需要再在试剂盒中设有阴性对照、阳性对照，也就是说不仅不需要提前筛选动物进行免疫或攻毒、采集血清等繁琐的制备步骤和人力、动物试验场地成本，还大大提升试剂盒操作便捷性及准确性。特别地，避免了一类传染病病毒即口蹄疫病毒必须在高级别实验室操作的麻烦。本发明经研究发现特定含量的羊抗鼠多克隆抗体可作为质控品，无需设阴性对照、阳性对照，羊抗鼠多克隆抗体的作用在于作为单个检测孔内无抗体反应时的反应对照，用于评估试验的有效性，体现无阻断时酶标试剂的反应程度。而羊抗鼠多克隆抗体可以商业上购买或通过常规方法制备，操作简便。本发明经研究发现特定含量及成分的样品稀释液，提高了试剂盒的检测灵敏度及特异性。
9.作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述o型口蹄疫病毒抗原包被量为8～32ng/点；所述a型口蹄疫病毒抗原的包被量为16～64ng/点；所述质控品点1～3的羊抗鼠多克隆抗体包被量分别为2ng/点、4ng/点和6ng/点。
10.作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述o型口蹄疫病毒抗原包被量为16ng/点。
11.作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述a型口蹄疫病毒抗原包被量为32ng/点。
12.作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述口蹄
疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒中所述口蹄疫病毒o型抗原的包被量为16ng/点，所述口蹄疫病毒a型抗原的包被量为32ng/点。
13.作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述酶标试剂为含有酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体7d2、酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体3b4的溶液。
14.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述试剂盒还包含样品稀释液、底物液、洗涤液；所述样品稀释液为含10％v/v胎牛血清、0.05％～0.2％v/v triton-100、0.1％v/v proclin300的pbs溶液；所述底物液为tmb(3,3',5,5'-四甲联苯胺)溶液；所述洗涤液为含1％v/v吐温20的pbs溶液。
15.作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述样品稀释液为含10％v/v胎牛血清、0.1％v/v triton-100、0.1％v/v proclin300的pbs溶液。
16.所述样品处理液中所含triton-100的含量可以为0.05％v/v、0.06％v/v、0.07％v/v、0.08％v/v、0.09％v/v、0.1％v/v、0.11％v/v、0.12％v/v、0.13％v/v、0.14％v/v、0.15％v/v、0.16％v/v、0.17％v/v、0.18％v/v、0.19％v/v、0.2％v/v。
17.本发明通过对底物液、洗涤液中组份和含量的进一步优化选择，保证了检测的更高灵敏度。
18.作为本发明的一种实施方式，本发明所述的抗体联检试剂盒中，所述检测芯片中质控品点(1)、质控品点(2)、质控品点(3)的所述羊抗鼠多克隆抗体包被量分别是2ng/点、4ng/点、以及6ng/点、空白对照点样点(4)为背景检测点样点，所述口蹄疫病毒a型抗原点样于点样点(5)，所述口蹄疫病毒o型抗原点样于点样点(6)；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点样点(4)点样点分别位于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角，所述点(5)、(6)可以分别位于所述检测芯片其他位置，所述点样点(1)至(6)中点与点边缘之间的距离为≥700μm；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点样点(4)到检测芯片亚单元上边缘、下边缘的距离≥8mm，到检测芯片亚单元左边缘、右边缘的距离≥5mm；所述抗体联检试剂盒包括一个或多个所述口蹄疫病毒o型、a型抗体检测芯片的亚单元，由底端、上格栅、设置于其间由所述底端、上格栅夹紧的检测芯片组成独立的检测孔，所述一个检测孔对应于一个所述检测芯片亚单元，当所述抗体联检试剂盒包括多个所述口蹄疫病毒o型、a型抗体检测芯片亚单元时，各个所述独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片。
19.本发明还提供了一种制备所述口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)分别制备口蹄疫病毒o型抗原、口蹄疫病毒a型抗原，连同羊抗鼠多克隆抗体分别用点样液稀释，点样于膜上，以制备口蹄疫病毒o型、a型的抗体检测芯片；步骤(2)以底端、上格栅、以及设置于其间的所述步骤(1)的抗体检测芯片组成独立的检测孔，所述抗体检测芯片设置于底端、上格栅之间，由所述底端、上格栅夹紧，所述一个检测孔对应于一个所述检测芯片亚单元，当所述抗体联检试剂盒包括多个口蹄疫病毒o型、a型的抗体检测芯片亚单元时，各个所述独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片；步骤(3)用酶分别标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体7d2、a型口蹄疫病毒单克隆抗体3b4，按终浓度分别为100ng/ml、75ng/ml用酶标稀释液稀释后混匀，作为酶标试剂，所述酶标稀释液为含终体积20％v/v胎牛血清的pbs溶液；步骤(4)配制样品稀释液、洗涤液、底物液；以及步骤(5)将所
述步骤(2)制备的口蹄疫病毒o型、a型的抗体检测芯片亚单元或其亚单元微阵列芯片、步骤(3)制备的所述酶标试剂及步骤(4)制备的所述样品稀释液、所述洗涤液、所述底物液组装成所述抗体联检试剂盒。
20.作为本发明的一种实施方式，本发明制备所述口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒的方法中，所述步骤(1)中所述点样液为5％甘油溶液、5％山梨醇溶液、0.05％曲拉通溶液、dmso溶液、pbs(ph6.8)溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀而成；用所述点样液将所述羊抗鼠多克隆抗体分别稀释至100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml，作为质控点点样液，分别点样于点(1)、(2)、(3)；用所述点样液作为空白对照点样于点(4)，所述口蹄疫病毒a型抗原点样于点样点(5)，所述口蹄疫病毒o型抗原点样于点样点(6)；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点样点(4)分别位于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角，所述点(5)、(6)可以分别点样于所述检测芯片其他位置，所述点样点(1)至(6)中点与点边缘之间的距离≥700μm；所述质控品点(1)、所述质控品点(2)、所述质控品点(3)、所述空白对照点(4)到检测芯片亚单元上边缘、下边缘的距离≥8mm，到检测芯片亚单元左边缘、右边缘的距离≥5mm；所述步骤(3)的所述酶标稀释液为含20％v/v胎牛血清的pbs溶液；所述步骤(4)的所述样品稀释液为含10％v/v胎牛血清、0.05％～0.2％v/v triton-100、0.1％v/v proclin300的pbs溶液；所述洗涤液为含1％v/v吐温20的pbs溶液，所述底物液为tmb(3,3',5,5'-四甲联苯胺)溶液。
21.所述a型口蹄疫病毒抗原、o型口蹄疫病毒抗原的点样体积为20nl/点。
22.作为本发明的一种优选实施方式，本发明制备所述口蹄疫病毒o型、a型的抗体联检试剂盒的方法中，所述样品稀释液为含10％v/v胎牛血清、0.1％v/v triton-100、0.1％v/v proclin300的pbs溶液。
23.本发明还提供了所述抗体联检试剂盒在制备非免疫诊断中的应用。
24.作为本发明的一种实施方式，本发明所述抗体联检试剂盒在制备非免疫诊断中的应用中，所述非免疫诊断中的应用包括流行病学分析、对离体血清进行定性口蹄疫病毒o型、a型抗体检测、国际生猪、牛、羊贸易、进出口检验检疫、口蹄疫病毒o型、a型疫苗质量控制。
25.本发明还提供了所述联检试剂盒的应用方法，所述应用方法包括：
26.步骤(1)样品预稀释，将血清样品用样品稀释液10倍稀释；
27.步骤(2)编号，将芯片孔按样品顺序编号；
28.步骤(3)浸润，加洗涤液300μl/孔，浸润3分钟后弃液、拍干；
29.步骤(4)加样，加稀释后的样品50～100μl/孔，置恒温振荡器37℃、500转/分钟温育30分钟；
30.步骤(5)加酶标试剂，加入酶标试剂50～100μl/孔，置恒温振荡器37℃、500转/分钟温育30分钟；弃液，加洗涤液300μl/孔，浸泡10～20秒，弃液，反复洗涤5遍，最后一次拍干；
31.步骤(6)显色，加入底物液100μl/孔，置37℃温育15分钟；
32.步骤(7)测定，垂直弃液，甩净，去芯片上盖后，倒扣至无尘纸上，轻轻按压，并于10分钟内用微孔盘芯片影像仪测定结果，导出阻断率(1-样品灰度值/质控点灰度值)。
33.试验有效性判定：质控点灰度值应≥10000、空白对照点灰度值应≤3000，否则试
验无效，该判定通过内部数据处理分析系统自行完成。结果判定(该判定也通过内部一键式智能化数据处理分析系统自行完成，不需要技术人员再进行数据运算及统计分析)标准如下：
34.阻断率的计算：阻断率＝(1-样品灰度值/质控点灰度值)
×
100％
35.阳性判定：阻断率≥50％时fmdv o、a抗体为阳性；
36.阴性判定：阻断率＜50％时fmdv o、a抗体为阴性。
37.本发明的优势在于：
38.与传统elisa试剂盒不同，本发明所述试剂盒通过技术提升，在反应载体上设有质控品，且该质控品为商品化羊抗鼠多克隆抗体，不需要再在试剂盒中另外设置阴性对照、阴性对照，也就是说不仅不需要提前筛选动物进行免疫或攻毒、采集血清等繁琐的制备步骤和人力、动物试验场地成本，还大大提升试剂盒操作便捷性及准确性。
39.本发明制备的联检试剂盒检测项目高度集成，快速检测，操作简便，一键式智能化数据处理，免除了常规方法检测后繁琐的数据处理及大量数据分析，更轻松地把控猪群健康状况，便于养殖业进行集约化管理。
40.本发明制备的联检试剂盒结果准确可靠，重复性好，检测耗时仅需约1.5小时，可用于检测疫苗免疫后收集的系列血清，评估疫苗免疫保护效果，可用于同时检测临床上猪、牛、羊血清中的o型、a型抗体，用于流行病学调查。
附图说明
41.图1为o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片上每个芯片孔的点样模式示意图，图1中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j分别表示了不同的点样模式，且在同一图中5、6在检测芯片上的具体位置可互换；
42.图2为三种具有不同数量的o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片亚单元的试剂盒，其局部放大图显示了一个o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片亚单元的检测芯片，图2中o、p、q分别为具有一个、三个、多个抗体检测芯片亚单元的试剂盒。
43.附图标记
44.1为质控点1、2为质控点2、3为质控点3、4为空白对照点、5为a型口蹄疫病毒抗原检测点，6为o型口蹄疫病毒抗原检测点。
具体实施方式
45.定义
46.术语“羊抗鼠多克隆抗体”与羊抗鼠二抗、羊抗鼠igg抗体可互换使用。
47.术语“酶”包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-d-半乳糖苷酶。其中，辣根过氧化物酶所使用的底物为邻苯二胺(opd)、四甲基联苯胺(tmb)，优选为四甲基联苯胺(tmb)；碱性磷酸酶所使用的底物为对-硝基苯磷酸酯(p-npp)；β-d-半乳糖苷酶所使用的底物为4-甲基伞形酮-β-d半乳糖苷(4mug)。
48.术语“病毒样颗粒”，病毒样颗粒(vlps)是一种在体外和/或体内表达时能够自主包装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但不具有病毒复制能力的假病毒，不含病毒核酸的，其通常由病毒衣壳蛋白或其变体或片段组成。由于vlp在结
构上与天然的病毒颗粒十分相似，因此，其具有很强的免疫原性和免疫反应性。同时，由于vlp不含病毒的遗传物质，不具有感染能力，具有高的生物安全性。
49.术语“羊抗鼠多抗”为羊抗鼠多克隆抗体，又称羊抗鼠二抗或羊抗鼠igg。
50.术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链n末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链n末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猫泛白细胞减少症病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
51.术语“微阵列芯片”是指以阵列方式设定在基片上能够并行处理和分析样本中生物或化学信息的微型器件，点阵排布点径在500μπι以内，相邻两点中心间距最小距离以不产生信号交叉为准(参见gb/t 27990-2011《生物芯片基本术语》)。
52.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
53.本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液除有另外的说明，均为ph值7.4的pbs，其1l体积配方为：nacl 8.0g、kcl 0.2g、na2hpo4·
12h2o 2.9g、kh2po
4 0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。羊抗鼠多克隆抗体可以商业上获得，也可以通过常规方法制备。
54.本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
55.实施例1口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒原料的制备
56.1.1抗原
57.a型口蹄疫病毒抗原：a型口蹄疫病毒样颗粒，制备及鉴定方法详见中国专利cn105566449a。
58.o型口蹄疫病毒抗原：o型口蹄疫病毒样颗粒，制备及鉴定方法详见中国专利cn105566449a。
59.1.2抗体
60.a型口蹄疫病毒单克隆抗体：2e11(其重链可变区核苷酸序列为seq id no.1、重链可变区核苷酸序列为seq id no.2)、3b4(其重链可变区核苷酸序列为seq id no.3、重链可变区核苷酸序列为seq id no.4)。
61.o型口蹄疫病毒单克隆抗体：6g6(其重链可变区核苷酸序列为seq id no.5、重链可变区核苷酸序列为seq id no.6)、7d2(其重链可变区核苷酸序列为seq id no.7、重链可变区核苷酸序列为seq id no.8)。
62.质控：羊抗鼠多抗。
63.1.3酶标抗体的制备及鉴定
64.1.3.1制备
65.采用改良过碘酸钠法对a型口蹄疫病毒单克隆抗体2e11、3b4以及o型口蹄疫病毒单克隆抗体6g6、7d2分别进行辣根过氧化物酶(hrp)的标记。
66.称取20mg辣根过氧化物酶(hrp)溶于1ml超纯水中，加入1ml新鲜配制的naio4溶液(30mg naio4溶于1ml超纯水)，混匀，4℃避光作用30分钟；在上述溶液中加入40μl乙二醇，4℃避光作用30分钟；按照1mg纯化的单克隆抗体加100μl上述混合液的比例，将两者混匀后，加入到透析袋中，混匀，用cb缓冲液透析6小时。整个操作需避光进行；将透析后的混合液转移至1.5ml ep管中，加入10μl新鲜配制的nabh4溶液(20mg nabh4溶于1ml超纯水)，室温作用2小时，每隔30分钟混匀一次；加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后，4℃作用15分钟。12000转/分钟离心10分钟，弃上清。将沉淀用与纯化抗体等体积的pbs与甘油的混合液(v∶v＝1∶1)吹悬。
67.1.3.2鉴定
68.外观：室温下，为红棕色液体，未见絮状物沉淀。
69.质量评价：用紫外分光光度计检测酶标抗体在403nm和280nm的吸光值a。按照公式计算相应的酶参数：
70.酶量(mg/ml)＝a
403nm
×
0.4
×
稀释倍数。
71.igg量(mg/ml)＝(a
280nm-a
403nm
×
0.3)
×
0.62
×
稀释倍数。
72.克分子比值(e/p)＝酶量
×
4/igg量。
73.标记率＝a
403nm
/a
280nm
。
74.经过吸光值检测和计算，具体结果见表1：
75.表1不同酶标抗体的质量评价
[0076][0077]
实施例2口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒的制备
[0078]
2.1点样液的配制
[0079]
5％甘油溶液的配制：精密称定5.00g甘油置100ml容量瓶中，加少量纯化水轻轻旋转使其溶解充分，避免产生过多气泡，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
[0080]
5％山梨醇溶液的配制：精密称定5.00g山梨醇置250ml烧杯中，加适量纯化水并搅拌使其完全溶解，再完全转移至100ml容量瓶中，加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
[0081]
0.05％曲拉通溶液的配制：用移液枪量取50μl曲拉通置100ml容量瓶中，加适量纯化水使其完全溶解，再加纯化水置刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
[0082]
dmso溶液：直接采用dmso试剂即可；
[0083]
pbs(ph6.8)溶液配制：先配置0.2mol/l的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/l的磷酸二氢钠溶液，再将两者按照49:51的体积比进行混合，得到ph值为6.8的磷酸盐缓冲液；
[0084]
将上述溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀，作为点样液。
[0085]
2.2联检试剂盒的制备
[0086]
口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片：用实施例2.1制备的点样液将实施例1制备的o型口蹄疫病毒抗原稀释至适当浓度，作为检测点fmdv o点样液；用实施例2.1制备的点样液将实施例1制备的a型口蹄疫病毒抗原稀释至适当浓度，作为检测点fmdv a点样液；用点样液将羊抗鼠多克隆抗体分别稀释至100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml，作为质控点点样液，分别点样于图1中点1、2、3，设定3个浓度，是便于根据调试结果选择对应的质控点进行数据统计分析；将实施例2.1制备的点样液作为空白对照点点样液点样于点4。开启点样仪，设定程序和点样参数，按照20nl/点的体积点样，将检测点fmdv a点样液点样于点5、检测点fmdv o点样液点样于点6、质控点点样液点样于图1中的1、2、3、空白对照点点样液点样于图1中的4。将已点样的膜取出置芯片底板中部，加上盖板压紧，两边卡上固定边条，组装成口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片，封装，2～8℃保存。除点1、2、3、4分别固定于检测芯片的左上角、左下角、右下角、右上角外，点5、6可以分别点样于检测芯片其他任意位置，只需与其他点的边缘相距≥700μm，而任意点与点之间的最短距离也为≥700μm。质控品点1、质控品点2、质控品点3、空白对照点样点4到检测芯片亚单元上边缘、下边缘的距离≥8mm，到检测芯片亚单元左边缘、右边缘的距离≥5mm。
[0087]
抗体联检试剂盒包括一个或多个口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片亚单元，由底端、上格栅、设置于其间由所述底端、上格栅夹紧的检测芯片组成独立的检测孔组成，所述一个检测孔对应于一个所述检测芯片亚单元，当所述抗体联检试剂盒包括多个口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片亚单元时，各个所述独立的检测芯片亚单元集成为微阵列芯片。图2显示了具有不同数量口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片亚单元的试剂盒，图2中o、p、q分别为具有一个、三个、多个抗体检测芯片亚单元的试剂盒，其局部放大图显示了一个口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片亚单元中检测芯片上的点样点。
[0088]
酶标试剂：取pbs溶液、胎牛血清200ml混匀并补加pbs定容为1l作为酶标稀释液。将实施例1制备的酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体2e11、3b4以及o型口蹄疫病毒单克隆抗体6g6、7d2，按酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体与酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体终体积分别为0.0025％v/v、0.005％v/v用所述酶标稀释液稀释后混匀(a型、o型酶标单抗浓度分别为75ng/ml、100ng/ml)，0.22μm过滤，无菌分装。
[0089]
样品稀释液：含10％v/v胎牛血清、0.05％～0.2％v/v triton-100、0.1％v/v proclin300的pbs溶液。
[0090]
洗涤液：含1％v/v吐温20的pbs溶液经0.22μm过滤，无菌分装。检测时用纯化水稀释20倍。
[0091]
底物液：tmb(3,3',5,5'-四甲联苯胺)溶液，商品化产品，无菌分装。
[0092]
2.3检测方法建立
[0093]
操作步骤如下：
[0094]
(1)样品预稀释，将血清样品用样品稀释液10倍稀释(如10μl样品 90μl样品稀释液)。
[0095]
(2)编号，将芯片孔按样品顺序编号。
[0096]
(3)浸润，加洗涤液300μl/孔，浸润3分钟后弃液、拍干。
[0097]
(4)加样，加稀释后的样品50-100μl/孔，置微孔盘恒温振荡器37℃、500转/分钟温育30分钟。
[0098]
(5)加酶标试剂，加入酶标试剂50-100μl/孔，置微孔盘恒温振荡器37℃、500转/分钟温育30分钟；弃液，加洗涤液300μl/孔，浸泡10～20秒，弃液。反复洗涤5遍，最后一次拍干。
[0099]
(6)显色，加入底物液100μl/孔，置37℃温育15分钟。
[0100]
(7)测定，垂直弃液，甩净，去芯片上盖，倒扣至无尘纸上，轻轻压干，并于10分钟内用微孔盘芯片影像仪测定结果，导出阻断率(1-样品s值/质控点n值)。
[0101]
试验有效性判定：质控点灰度值应≥10000、空白对照点灰度值应≤3000，否则试验无效，该判定通过内部数据处理分析系统自行完成。结果判定(该判定也通过内部一键式智能化数据处理分析系统自行完成，不需要技术人员再进行数据运算及统计分析)标准如下：
[0102]
阻断率的计算：阻断率＝(1-样品灰度值/质控点灰度值)
×
100％
[0103]
阳性判定：阻断率≥50％时fmdv o、a抗体为阳性；
[0104]
阴性判定：阻断率＜50％时fmdv o、a抗体为阴性。
[0105]
为了便于阐述，本试剂盒均以75μl/孔加样量为例介绍。
[0106]
2.4口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片抗原包被量的确定
[0107]
血清样品如下：
[0108]
fmdv o抗体阳性且fmdv a抗体阴性的猪血清(简称p1)：经兰兽研口蹄疫病毒o型抗体液相阻断elisa检测试剂盒测定结果为阳性，抗体效价为1∶360；且经兰兽研口蹄疫病毒a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒测定结果为阴性，抗体效价为1∶16。
[0109]
fmdv a抗体阳性且fmdv o抗体阴性的猪血清(简称p2)：经兰兽研口蹄疫病毒a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒测定结果为阳性，抗体效价为1∶256；且经兰兽研口蹄疫病毒o型抗体液相阻断elisa检测试剂盒测定结果为阴性，抗体效价为1∶8。
[0110]
fmdv o抗体阴性且fmdv a抗体阴性的猪血清(简称n)：经兰兽研口蹄疫病毒o型抗体液相阻断elisa检测试剂盒与兰兽研口蹄疫病毒a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒测定结果均为阴性，抗体效价均为1∶8。
[0111]
用上述血清选择口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片抗原包被量，因本方法原理为酶联免疫固相竞争法，因而通过计算n/p值，并选择n/p值最大时对应的抗原包被条件，作为筛选最适抗原固相条件，详情如下：
[0112]
2.4.1 o型口蹄疫病毒抗原包被量的选择
[0113]
按照实施例2.1所示将实施例1o型口蹄疫病毒抗原用点样液稀释至适当浓度，点样体积为20nl，使得点样于膜上的o型口蹄疫病毒抗原的最终包被量分别如表2所示，其它均不变。用p1、n血清按照实施例2.3的方法进行检测，结果(见表2)：a型口蹄疫病毒抗原包被量不变的情况下检测均为阴性(表2未体现)；n/p1在o型口蹄疫病毒抗原包被量偏低时数值小，随着包被浓度的增加而增大，在包被量8～32ng/点时n/p值＞2.9，而后再增加包被浓度n/p1值开始降低，而n/p1值的大小对应该方法分辨阴性、阳性能力的高低，数据越大，则
检测条件越适宜。因此，当o型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点时n/p1值为2.33～3.32均可满足检测，但当包被量为8～32ng/点时n/p1值略优(为2.97～3.32)，包被量为16ng/点时n/p1值为最优(为3.32)。
[0114]
表2 o型口蹄疫病毒抗原包被量优化结果
[0115][0116]
2.4.2 a型口蹄疫病毒抗原包被量的选择
[0117]
按照实施例2.1所示将实施例1a型口蹄疫病毒抗原用点样液稀释至适当浓度，点样体积为20nl，使得点样于膜上的a型口蹄疫病毒抗原的最终包被量分别如表3所示，其它均不变。用p2、n血清按照实施例2.3的方法进行检测，结果(见表3)：o型口蹄疫病毒抗原包被量不变的情况下检测均为阴性(表3未体现)；n/p2在a型口蹄疫病毒抗原包被量偏低时数值小，随着包被浓度的增加而增大，在包被量16～64ng/点时n/p2值＞3.1，而后再增加包被浓度n/p2值开始降低，而n/p2值的大小对应该方法分辨阴性、阳性能力的高低，数据越大，则检测条件越适宜。因此，当a型口蹄疫病毒抗原的包被量为1～128ng/点时n/p2值为2.08～3.45均可满足检测，但当包被量为16～64ng/点时n/p2值略优(为3.14～3.45)，包被量为32ng/点时n/p2值为最优(为3.45)。
[0118]
表3 a型口蹄疫病毒抗原包被量优化结果
[0119][0120]
2.4.3 o型、a型口蹄疫病毒抗原包被量的验证
[0121]
为验证o型、a型口蹄疫病毒抗原在检测对应抗体时是否存在交叉反应，选取背景清晰的且经商品化试剂盒检测的样品对o型、a型口蹄疫病毒抗原包被量进一步验证。根据上述试验结果，将o型口蹄疫病毒抗原按16ng/点及a型口蹄疫病毒抗原按32ng/点点样制备口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片。并对口蹄疫病毒o型亚单位疫苗免疫后血清3份、口蹄疫病毒a型亚单位疫苗免疫后血清3份、特异性检验用血清6份(包括pcv2阳性血清1份、csfv阳性血清1份、ppv阳性血清1份、prrsv阳性血清1份、健康猪血清1份、prv阳性血清1份)，共12份分别检测，结果与标准符合为12/12即符合率为100％时对应的包被量为最佳包被量。结果(见表4)：制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片检测12份样品与商品化试剂盒的结果一致，符合率均为100％。
[0122]
表4最优抗原包被量制备口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片的评价结果及
与商业试剂盒比较
[0123][0124]
2.5酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体的选择
[0125]
用2.4.3制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片，将实施例1酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体6g6与7d2分别稀释至100ng/ml(1∶20000)。用p1、n血清按照实施例2.3的方法进行检测，结果(见表5)：2种酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体溶液相比7d2检测的n/p1结果优于6g6，表明单克隆抗体7d2识别o型口蹄疫病毒的表位比6g6识别的表位更有优势。后续试验将用酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体7d2进行试剂盒的生产。
[0126]
表5酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体选择的结果
[0127]
标记单抗6g67d2n3651238129p1102456891n/p13.565.53
[0128]
2.6酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体的选择
[0129]
用2.4.3制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片，将实施例1酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体2e11与3b4分别稀释至75ng/ml(1∶40000)。用p2、n血清按照实施例2.3的方法进行检测，结果(见表6)：2种酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体溶液相比3b4检测的n/p2结果优于2e11，表明单克隆抗体3b4识别a型口蹄疫病毒的表位比2e11识别的表位更有优势。后续试验将用酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体3b4进行试剂盒的生产。
[0130]
表6酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体选择的结果
[0131]
标记单抗2e113b4n3251633813p2108137917n/p23.014.27
[0132]
2.7样品稀释液的选择
[0133]
将口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片、酶标试剂，连同表7配制样品稀释液，对n、p1、p2样品进行检测，结果(见表7)：7种样品处理液处理样品后，相比而言样品稀释液4处理样品后检测n/p1及n/p2的数值均最大，效果最佳。
[0134]
表7不同样品稀释液的检测结果
[0135][0136][0137]
为评价样品稀释液中triton-100的含量，将其他成分保持不变，triton-100含量调整为0.025％、0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％v/v以制备样品稀释液并进行检测，结果：当样品处理液中所含triton-100为0.025％时检测fmdv o、a抗体的灵敏度下降20～60倍；当样品处理液中所含triton-100为0.4％、0.8％时检测fmdv o、a抗体的特异性不佳；而当样品处理液中triton-100含量为0.05％、0.2％时制备的样品稀释液检测灵敏度和特异性与样品稀释液4的结果相当，故而将样品稀释液中triton-100的含量设定为0.05％～0.2％v/v。
[0138]
为便于后续评价，将口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检检测芯片(fmdv o包被量16ng/点、fmdv a包被量32ng/点)、酶标试剂(酶标记o型口蹄疫病毒单克隆抗体7d2、酶标记a型口蹄疫病毒单克隆抗体3b4的终体积分别为1∶20000、1∶40000稀释的混合液)、样品稀释
液4(含10％v/v胎牛血清、0.1％v/v triton-100、0.1％v/v proclin300的pbs溶液)连同底物液、洗涤液制备试剂盒以进行后续检测。
[0139]
实施例3联检试剂盒的应用
[0140]
3.1敏感性
[0141]
将东南亚o型口蹄疫病毒抗体阳性血清(经oie推荐方法标定抗体效价为1：5760)进行2倍梯度稀释，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒进行测定，确定该试剂盒对东南亚o型阳性血清的灵敏度，结果见表8。
[0142]
表8对梯度稀释的东南亚o型阳性血清的灵敏度试验
[0143]
稀释倍数阻断率(％)结果判定1∶898.1 1∶1696.2 1∶3291.3 1∶6485.1 1∶12876.8 1∶25661.2 1∶51242.5－
[0144]
结果显示，试剂盒检测梯度稀释的东南亚o型阳性血清，检测效价达到1∶256。
[0145]
将中国型o型口蹄疫病毒抗体阳性血清(经oie推荐方法标定抗体效价为1：5760)进行2倍梯度稀释，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒进行测定，确定该试剂盒对中国型o型阳性血清的灵敏度，结果见表9。
[0146]
表9对梯度稀释的中国型o型阳性血清的灵敏度试验
[0147][0148][0149]
结果显示，试剂盒检测梯度稀释的东南亚o型阳性血清，检测效价达到1∶256。
[0150]
将a型口蹄疫病毒抗体阳性血清(经oie推荐方法标定抗体效价为1：2880)进行2倍梯度稀释，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒进行测定，确定该试剂盒对阳性血清的灵敏度，结果见表10。
[0151]
表10对梯度稀释的a型阳性血清的灵敏度试验
[0152]
稀释倍数阻断率(％)结果判定1∶896.1 1∶1694.3 1∶3285.6 1∶6472.9 1∶12853.7 1∶25636.8－
[0153]
结果显示，试剂盒检测梯度稀释的a型阳性血清，检测效价达到1∶128。
[0154]
以上结果表明，本发明的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒灵敏度较高，不仅能对口蹄疫病毒o型、a型抗体进行高灵敏度检测，还能对不同亚型(东南亚型、中国型)的口蹄疫病毒o型抗体进行高灵敏度检测。
[0155]
3.2特异性
[0156]
用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒对3份fmdv o型抗体阳性血清(a型阴性)、3份fmdv a型抗体阳性血清(o型阴性)、3份口蹄疫o、a型抗体均为阴性血清、1份猪瘟病毒(csfv)抗体阳性血清、1份猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)抗体阳性血清、1份猪塞尼卡古病毒(svv)抗体阳性血清与1份大肠杆菌(e.coli)抗体阳性血清进行检测，评价其特异性。结果见表11。
[0157]
表11特异性评价结果
[0158][0159]
结果显示，本发明试剂盒检测3份fmdv o抗体阳性血清o型抗体均为阳性、a型抗体均为阴性；检测3份fmdv a抗体阳性血清a型抗体均为阳性、o型抗体均为阴性；检测3份fmdv
阴性血清o、a抗体均为阴性；表明试剂盒检测o型、a型抗体无交叉反应，特异性较好。试剂盒检测其它猪病病毒抗体阳性血清o、a抗体均为阴性，表明试剂盒与其它病毒抗体均无交叉反应，试剂盒特异性较好。
[0160]
3.3重复性
[0161]
使用3个不同批次的芯片板，在一块板上进行批内重复性试验，在3个不同批次板上进行批间重复性试验，测定灰度值与阻断率，计算变异系数。变异系数《15％，说明试剂盒重复性和稳定性好。结果表明，3个不同批次的芯片板，批内和批间检测结果一致，变异系数均《10％，说明试剂盒重复性好。
[0162]
变异系数(cv)计算公式：
[0163]
cv(％)＝(标准差/平均值)
×
100％
[0164]
3.3临床应用
[0165]
将东南亚o型口蹄疫为阳性、a型口蹄疫为阴性(经oie推荐方法标定)的血清191份，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒三个批次和商品化液相阻断试剂盒三个批次分别进行对比检测。结果见表12。
[0166]
表12试剂盒对东南亚o型口蹄疫检测比对实验结果
[0167][0168]
结果显示，本发明试剂盒三个批次均能100％检出东南亚o型口蹄疫抗体阳性，而商品化液相阻断试剂盒三个批次检测结果有差异，最低96.3％，最高97.9％，不仅灵敏度较低且批间有差异。
[0169]
将中国型o型口蹄疫为阳性、a型口蹄疫为阴性(经oie推荐方法标定)的血清172份，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒三个批次和商品化液相阻断试剂盒三个批次分别进行对比检测。结果见表13。
[0170]
表13试剂盒对中国型o型口蹄疫检测比对实验结果
[0171][0172]
结果显示，本发明试剂盒三个批次均能100％检出中国型o型口蹄疫抗体阳性，而商品化液相阻断试剂盒三个批次检测结果有差异，最低94.2％，最高97.7％，不仅灵敏度较低且批间有差异。
[0173]
将a型口蹄疫为阳性、o型口蹄疫为阴性(经oie推荐方法标定)的血清183份，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒三个批次和商品化液相阻断试剂盒三个批次分别进行对比检测。结果见表14。
[0174]
表14试剂盒对a型口蹄疫检测比对实验结果
[0175][0176][0177]
结果显示，本发明试剂盒三个批次均能100％检出a型口蹄疫抗体阳性，而液相阻
断试剂盒三个批次检测结果有差异，最低93.4％，最高97.8％，不仅灵敏度较低且批间有差异。
[0178]
将口蹄疫o型、a型均为阳性的(经oie推荐方法标定)血清149份(其中东南亚o型89份、中国型o型60份)，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒三个批次和商品化液相阻断试剂盒三个批次分别进行对比检测。结果见表15。
[0179]
表15试剂盒对口蹄疫o型、a型阳性样品检测比对实验结果
[0180][0181]
结果显示，本发明试剂盒三个批次检测口蹄疫阴性血清o型、a型抗体均为100％阳性，特异性好。而商品化液相阻断试剂盒三个批次检测结果均低于100％，且批间有差异。
[0182]
将口蹄疫o型、a型均为阴性的(经oie推荐方法标定)血清151份，用本发明制备的口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒三个批次和商品化液相阻断试剂盒三个批次分别进行对比检测。结果见表16。
[0183]
表16试剂盒对口蹄疫o型、a型阴性样品检测比对实验结果
[0184][0185]
结果显示，本发明试剂盒三个批次检测口蹄疫阴性血清o型、a型抗体均为100％阴性，特异性好。而商品化液相阻断试剂盒三个批次检测结果不稳定且有的低于100％。
[0186]
综上所述，本发明口蹄疫病毒o型、a型抗体二联检试剂盒针对不同遗传拓扑型抗体均有较好检测能力，也能较好解决目前液相阻断elisa试剂盒批间差异较大、稳定性差的问题。
[0187]
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。